CN101969942A - 基于积雪草酸及其特定盐的治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度的积雪草苷、医药级纯度的积雪草酸，以及它们的提纯和制备；本发明还涉及相应的积雪草酸盐及其制备；本发明进一步涉及用上述积雪草酸盐制备的药用组合物，这些组合物可用于治疗关节炎、银屑病以及其它炎症，还可用于治疗肺纤维化、糖尿病肾病等纤维化疾病。

Description

基于积雪草酸及其特定盐的治疗剂

优先权要求

本申请要求以下美国临时申请的优先权：申请号为61/006,432，申请日为2008年1月11日，并在此全文引用并结合于本申请中。

背景技术

Bontems，Bull.Sci.Pharmacol.49：186-91(1941)，首次报道了积雪草酸及其三糖皂甙能够从积雪草中提取而得。积雪草是伞形科莳萝属一年生小型草本植物，产自亚洲-环太平洋地区。积雪草酸及积雪草苷的化学结构如下所示：

积雪草酸

积雪草苷

参见：Polonsky，Compt.Rend.232：1878-80(1951)；和Bull.Soc.Chim.173-80(1953).

积雪草提取物中含有积雪草酸和积雪草苷，已知可用于治疗皮肤疤痕和慢性溃疡。在有关方面，文献也披露了使用积雪草提取物治疗与结核病或麻风病相关的皮肤畸形。比如可参见：Boiteau et al.，Bull.Soc.Chim.31：46-51(1949).

此类伤口愈合的药理作用方式与诱发角质化有关，参见：May，Eur.J.Pharmacol.4：331-39(1968)，特别是通过促进皮肤纤维原细胞增殖和包括Ⅰ型胶原蛋白在内的细胞外基质的合成。比如可参阅：Lu et al.，Int’lJ.Dermatol.43：801-07(2004)；Skukla et al.，J.Ethnopharmacol.65：1-11(1999)。根据Bonte等人报道，Bonte et al.，Planta Med.60：133-35(1994)，通过将积雪草苷和积雪草酸进行对比发现，前者分子中的糖部分对于其生物活性来说，似乎并非不可或缺。并且正如Grimaldi et al.，J.Ethnopharmacol.28：235-41(1990)中所论述，在人体口服之后，积雪草苷完全转化成血浆积雪草酸。

基于对这些伤口愈合特性的认识，美国专利No.5,834,437中提出了包含积雪草酸或其衍生物的皮肤病制剂的方案。此外，也可参见美国专利No.6,417,349，其中，在肝纤维化动物模型中，通过腹腔给药积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物，达到了缓解症状的效果，其中所述的羟基积雪草苷也是由积雪草产生的一个相关化合物。除了愈合伤口和抗纤维化的功能以外，另据报道，在标准的(胶原诱导)关节炎啮齿动物模型中，试验证实，口服积雪草苷还降低了脾细胞和炎症分子的水平，包括COX-2，PGE2，TNF-α和IL-6，以及由此抑制或降低了多种关节炎参数，比如足爪肿胀、关节炎评分以及滑膜增生。参见：Li et al.，Yao Xue Xue Bao(Acta Pharma.Sinica)42：698-703(2007)。

尽管这些和其他的披露信息都提示了积雪草酸和积雪草苷的治疗潜力，然而该潜力的实现却面临着很大的障碍。主要问题在于，这两种化合物的提取都很困难，获得的收率和纯度都相对偏低。此外，对于用于治疗性组合物中的积雪草酸盐的制备，人们还知之甚少。在美国专利No.6,891,063中曾报道过某些适用于局部治疗的积雪草酸盐，主要是一些铵盐。

发明内容

本发明提供了高纯度的积雪草酸。在一实施例中，该积雪草酸为医药级，优选纯度约98％。

本发明还提供了由高纯度积雪草酸制备的盐。该盐可以为碱金属盐、碱土金属盐或任意取代的铵盐。具体的可以为钾盐、钠盐或由氨基丁三醇形成的铵盐。本发明还提供了一种包含上述任意一种或多种盐的固体制剂。

本发明进一步提供了高纯度积雪草酸的衍生物。所述的衍生物可以是酰胺或酯。优选的衍生物为积雪草苷。

本发明还提供了一种治疗性组合物，该组合物由以下步骤制备而得：将高纯度的积雪草酸或积雪草苷和药学上可接受的载体配制成含有治疗有效量的积雪草酸或积雪草苷的剂型。

本发明还进一步提供了一种治疗或预防纤维化疾病的方法。该方法包括给已患病或存在患病风险的受试者施用上述治疗性组合物。本发明中所涉及的典型的纤维化疾病是放射性肺炎及纤维化、特发性肺纤维化、糖尿病、肾病以及慢性阻塞性肺病(COPD)。

本发明还提供了一种治疗或预防炎症疾病的方法，包括给已患病或存在患病风险的受试者施用上述治疗性组合物。这些炎症性疾病类型可以为关节炎、炎症性肠病以及银屑病。

附图说明

图1为积雪草酸及其盐的叠加谱图。

图2为积雪草酸(Lot071109)及其钠盐(AJF09，99b)的¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)谱图。

图3为积雪草酸(Lot071109)及其钠盐(AJF09，99b)的¹³C-NMR(300MHz，DMSO-d₆)谱图。

图4为积雪草酸(Lot071109)及其钠盐(AJF09，99b)在化学位移11-41ppm部分的¹³C-NMR(300MHz，DMSO-d₆)谱图。

图4a为积雪草酸在DMSO-d₆中的完整¹H-NMR谱图。

图4b为积雪草酸¹H-NMR谱的放大图。

图4c为积雪草酸钠盐(AJF09，99b)的完整¹H-NMR谱图。

图4d为积雪草酸¹H-NMR谱的放大图。

图4e为积雪草酸在DMSO-d₆中的完整¹³C-NMR谱图。

图4f为积雪草酸¹³C-NMR谱的放大图。

图4g为积雪草酸钠盐在DMSO-d₆中的完整¹³C-NMR谱图。

图4h为积雪草酸钠盐¹³C-NMR谱的放大图。

图5a为积雪草酸的PXRD谱图。

图5b为积雪草酸钠盐的PXRD谱图。

图6为积雪草酸的FTIR谱图。

图7为积雪草酸钠盐(AJF09，82)的FTIR谱图。

图8为积雪草酸钠盐(AJF09，99b)的FTIR谱图。

图9为积雪草酸钠盐(AJF09，99a)的FTIR谱图。

图10为积雪草酸的热重分析(TGA)图。

图11为积雪草酸钠盐(AJF09，82)的热重分析(TGA)图。

图12为积雪草酸钠盐(AJF09，99b)的热重分析(TGA)图。

图13为标准线形曲线。

图14为制备积雪草苷的过程的图示表征。

图15为医药级纯度的积雪草酸的制备过程的图示表征。

图16a为积雪草酸钾盐的¹H-NMR谱图。

图16b为积雪草酸与氨基丁三醇所成盐的¹H-NMR谱图。

图16c为积雪草酸磷酸酯的钠盐的¹H-NMR谱图。

图16d为积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物的¹H-NMR谱图。

图17a为积雪草酸钾盐的质谱图。

图17b为积雪草酸与氨基丁三醇所成盐的质谱图。

图17c为积雪草酸磷酸酯的钠盐的质谱图。

图17d为积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物的质谱图。

具体实施方式

根据上述问题，本发明人发展了一种易于实现的获得高纯度适合药理学研究的积雪草苷和积雪草酸的方法。此外，他们还制备和鉴定了积雪草酸盐。这些盐的物理性质均能达到制剂要求，且符合治疗炎症和纤维化疾病的要求。

Ⅰ.制备医药级纯度的积雪草酸

A.制备纯度为92％的积雪草苷

粗品积雪草苷粉末可以从市面购得，比如从广西昌洲天然产物开发有限公司(www.changzhou-centella.com)购买。

首先向粗品积雪草苷粉末中加入4×60％(V/W)EtOH，然后将混合物加热至70～90℃(例如，80℃)，保持体系回流，直至固体溶解。待溶液冷却后，于5℃冷藏室内放置16小时，使其结晶。体系中有无定型沉淀生成，过滤，回收的沉淀用60％的乙醇洗涤，直至颜色变白。再将该沉淀于55～70℃(例如，60℃)、压力-0.09～-0.11MPa(例如，-0.10MPa)下烘干。

向上述所得干燥固体中，加入30×80％(V/W)丙酮水溶液，加热回流1小时，至固体溶解。过滤，将滤液置于10℃冷藏室内结晶24小时。体系中产生无定型沉淀，过滤，将回收的沉淀用80％的丙酮洗涤，直至颜色变白。将该沉淀干燥后碾碎，即得积雪草苷粉末。图14为本操作过程的简图。

B.制备纯度为98％的积雪草酸

将200g用上述方法制得的积雪草苷(纯度约92％)溶解于8×(V/W)4％NaOH/50％EtOH溶液中(1600ml)，所得溶液于80℃水浴中加热回流3～4小时，冷却至室温或者接近室温。

然后，通过在搅拌下分批少量(例如，每次加10ml左右)加入稀盐酸(预稀释1～2倍)，调节该溶液的pH至4～5。在此过程中，不断有沉淀生成，最后，整个体系成为粘稠的糊状。

将该糊状物用直径为200mm的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，沉淀用水多次减压洗涤，直至洗涤液接近无色。再用30％的乙醇洗涤，直至洗涤液接近无色。两次的洗涤液均弃去。

向上述滤渣中加入8×(V/W)无水乙醇(约1600ml)，将体系于80℃水浴中加热回流，直至固体完全溶解。再加入2×活性炭(约400g)，继续回流30分钟。用直径为200mm的布氏漏斗趁热抽滤，除去活性炭。弃去用过的活性炭，再向滤液中加入与前次等量的活性炭，回流30分钟，用直径为200mm的布氏漏斗趁热抽滤。

滤液冷至室温，向其中分批加入水，每次约100-200ml，直至不再产生白色沉淀，所需水的总体积约为4000ml。用直径为200mm的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，将漏斗内的白色固体干燥后碾碎，即得纯度为98％(W/W)的积雪草酸。图15为本操作过程的简图。

Ⅱ.积雪草酸的药理活性

用博莱霉素处理大鼠是建立纤维化动物模型的优选方法。如下更详细的描述，本发明所述的积雪草酸和积雪草苷组合物显著提高了博莱霉素处理大鼠的存活率，而不管处理是在博莱霉素给药后一天还是七天开始。由于传统的用于治疗肺纤维化的药物地塞米松在同样的实验条件下并不能显著提高大鼠的存活率，因此这结果是意料不到的。

由于地塞米松主要作用于炎症途径，所以本发明的实验结果表明积雪草酸和积雪草苷除了具有对炎症反应的抑制作用以外，还对与纤维化相关或者直接涉及纤维化的其它途径发挥作用。比如，如肺组织病理学的测定结果，积雪草酸降低了博莱霉素诱导的肺纤维化程度。博莱霉素损伤后七天开始用积雪草酸处理比用地塞米松处理更有效，表明积雪草酸不仅靶向炎症反应，而且比地塞米松更直接地作用于纤维化。

比地塞米松好得多，不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是七天开始，积雪草酸和积雪草苷都显著降低博莱霉素诱导的肺纤维化，该肺纤维化通过肺重体重比来衡量。

通过测定血清中羟脯氨酸(胶原蛋白的前体)和Ⅲ型胶原蛋白的水平，积雪草酸和积雪草苷也能显著降低博莱霉素诱导的纤维化。不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是七天开始，积雪草酸的效果都与地塞米松相当或者略优于地塞米松。

不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是七天开始，积雪草酸都显著降低博莱霉素诱导的介导纤维化的细胞因子转化生长因子β(TGF-β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的血清水平，这和地塞米松相当。

Ⅲ.治疗适应症和剂型

实验结果充分显示，按照本发明所述的方法制备的医药级纯度的积雪草酸和高纯度的积雪草苷在治疗炎症相关疾病以及纤维原细胞和细胞基质积累相关疾病(“纤维化疾病”)中的有效性。这些炎症疾病例如为：银屑病、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)以及关节炎(包括风湿性关节炎、骨性关节炎和银屑病关节炎)。此类疾病的特点在于机体免疫系统活动异常和炎症分子(如COX-2、某些细胞因子和前列腺素)水平的提高。这类纤维化疾病例如为：放射性肺炎及纤维化、特发性肺纤维化以及糖尿病肾病(特征在于肾脏纤维化)。

因此，本发明的目的之一就是提供一种治疗性组合物，其是由高纯度的积雪草酸或积雪草苷和其它常规使用的成分配制而成的药剂，尤其适合内用。本发明的治疗性组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体、赋行剂或稳定剂，具体的请参见Remington-The Science and Practice of Pharmacy 21^sted.(2005)，只要积雪草酸或积雪草苷的抗纤维效果不受组合物中其它成分不利影响。

根据所需的给药方式，本发明的治疗性组合物可以是针剂，用于胃肠道外给药。为此，本发明的治疗性组合物可以制备成水溶液，包含生理上可相容的缓冲溶液，如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或者生理盐水。

本发明另外提供了一种固体制剂，该制剂可以由一种积雪草酸盐(见下一部分)和药学上可接受的固体基质混合而成，适于口服、口含、舌下、直肠或阴道给药。可以将高纯度的积雪草酸、积雪草苷或积雪草酸盐和一种或多种固体赋行剂混合，可能有时在加入适当的辅料后，还选择研磨所得的混合物，再接着处理该混合物，从而制成本发明的治疗性组合物的片剂或糖衣丸。合适的赋形剂为填充剂，如糖类(乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等)和纤维素类，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、凝胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP：povidone)。还可以加入崩解剂，如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或褐藻酸盐(如褐藻酸钠盐)。

糖衣丸具有适当的包衣，可以使用浓缩糖溶液，其可以选择性地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇(PEG)，和/或二氧化钛、漆溶液、和适当的有机溶剂或混合溶剂。药片或糖衣中可加入染料或色素，用来区分或识别不同剂量活性成分的组合物。

本发明所涉及的治疗性组合物中，适于口服的有：明胶制成的硬胶囊以及用明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊，来装载用高纯度积雪草酸或积雪草苷制成的固体制剂。上文所述的硬胶囊可以含有活性成分和填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)，并选择性加入一种或多种稳定剂。在软胶囊中，活性成分的存在方式可以是溶液或悬浮在适当的液体中的悬浮液，该适当的液体可为脂肪油、液体石蜡或液体的聚乙二醇(PEG)，并选择性加入一种或多种稳定剂。

本发明所涉及的治疗性组合物另一种给药方式为吸入或吹入，直接给药到呼吸道。例如可参见美国专利No.5,607,915以及已公开的PCT申请WO 97/39745和WO 99/47196。因此本发明拟提供一种液体制剂，该制剂适合通过喷雾器、液体喷雾装置、或电(EHD)喷雾装置给药。

在一实施例中，该组合物可以含有一种药学上可接受的液态载体，比如醇、水、聚乙二醇或全氟化碳。还可选择性加入其它原料以改变该活性成分的溶液或悬浮液的喷雾特性。所述的其它原料可以是液体，如乙醇、乙二醇、聚乙二醇或脂肪酸。根据本发明，其它的方法也可用于配制适合喷雾装置使用的溶液或悬浮液。参见：美国专利No.5,112,598和No.5,556,611.

本发明的活吸入制剂可采用适合干粉吸入器的的干粉载体。所述的载体可以是单糖(如果糖、甘露醇、阿拉伯塘、木糖醇和葡萄糖)及其水合物，二糖(如乳糖、麦芽糖、和蔗糖)和多糖(如淀粉、糊精和葡聚糖)。例如，本发明的积雪草酸盐可以如美国专利No.5,376,386所述，和一种或多种上述载体在超微粉碎机中制成干粉。

Ⅳ.可药用积雪草酸盐的制备与表征

考虑到积雪草酸能够较好地溶于甲醇，本发明计划制备积雪草酸盐，例如通过分别将积雪草酸溶于氢氧化钠、碳酸钠和氢氧化铵的甲醇溶液来制备。关于积雪草酸盐的制备与表征，下文中将详细叙述。

A.积雪草酸盐的筛选

由于积雪草酸易溶于甲醇(见下文)，因此，可分别将积雪草酸溶于氢氧化钠、碳酸钠和氢氧化铵的甲醇溶液中来制备相应的盐。

1.积雪草酸与碳酸钠反应(AJF09，82)

0.992g积雪草酸溶于27.5ml甲醇，向该溶液中加入2.0043g无水碳酸钠，剧烈摇动。再将该甲醇-积雪草酸溶液转移至圆底烧瓶中蒸干，生成白色精细粉末状积雪草酸钠盐，将其于100℃真空干燥2小时，得约1g样品。

2.积雪草酸与氢氧化铵的甲醇溶液作用(AJF09，99a)

向0.4923g积雪草酸中逐滴加入约6ml氢氧化铵的甲醇溶液，大部分积雪草酸溶解，体系内开始出现新的片状物，再加入1ml氢氧化铵的甲醇溶液，搅拌过夜。体系内有沉淀生成，过滤后得0.0741g积雪草酸铵盐。

3.积雪草酸与氢氧化钠的甲醇溶液作用(AJF09，99b)

0.4961g积雪草酸加入到7.0ml 0.2M的氢氧化钠的甲醇溶液中，固体全部溶解后，向体系内逐滴加入饱和氯化钠溶液至体系浑浊且有沉淀生成，加入7.0ml去离子水使析出的氯化钠溶解。过滤，滤渣于100℃真空干燥后2h后，得0.4938g积雪草酸钠盐。

4.积雪草酸钾盐

如式4所示，4g(8.196mmol)积雪草酸加入到30ml甲醇中，加热，使固体全部溶解。向体系内加入由0.56g(8.187mmol)氢氧化钾和20ml甲醇配成的溶液，直到体系的pH变为8～9。将溶液用活性炭脱色后浓缩。再向浓缩液中加入足量丙酮使体系均匀。冷却，有沉淀生成，过滤后得到3.5g积雪草酸钾盐，为灰白色晶体。图16a所示为该产物的¹H-NMR谱图。图17a所示为该产物的质谱图。

5.积雪草酸氨基丁三醇盐

如式5所示，2g(4.09mmol)积雪草酸和0.59g(4.623mmol)氨基丁三醇加入到30ml甲醇中，室温下搅拌24小时后，再回流0.5小时。将体系浓缩，再加入少量水。有沉淀生成，过滤，将滤饼置于适量甲醇中，加热使之溶解，过滤，除去不溶物，浓缩。向浓缩液中加入足量丙酮使体系均匀。冷却，有沉淀生成，过滤后所得固体于50℃下干燥，得到1.5g积雪草酸氨基丁三醇盐，为米色固体。图16b所示为该产物的¹H-NMR谱图。图17b所示为该产物的质谱图。

6.积雪草酸磷酸酯的钠盐

如式6中第一步反应所示，12ml吡啶于冰盐浴中冷却至-10℃，向其中逐滴加入2.2g(0.01435mol)POH。两分钟后，向其中逐滴加入由2g(0.004098mol)积雪草酸和6ml吡啶配成的溶液，搅拌反应1.5小时。向体系内缓慢加入40ml冰水，室温下搅拌过夜。蒸去大部分溶剂，得到固体，真空干燥。将该固体加入到20ml 4N的盐酸中，得到胶状沉淀，过滤，滤饼用水洗涤，从而得到粗产品。将其溶于甲醇，用活性炭脱色，浓缩，再向浓缩液中加入足量丙酮使体系均匀。体系中有沉淀生成，过滤，得到胶状的磷酸酯。

如式6中最后一步反应所示，将上步反应的粗产物溶于甲醇，加入1N的氢氧化钠甲醇溶液，直到体系的pH变为8～9。用活性炭脱色，浓缩，再向浓缩液中加入足量丙酮使体系均匀。冷却，体系内出现沉淀，过滤后所得固体于50℃下干燥，得到2.2g米色固体，即为积雪草酸磷酸酯的钠盐。图16c所示为该化合物的¹H-NMR谱图。图17c所示为该化合物的质谱图。

7.积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物

如式7中第一步反应所示，搅拌下，将5g积雪草酸溶于10ml吡啶中，冷至10℃，加入15ml乙酸酐，室温下搅拌20小时。向体系中加入200ml冰水，有沉淀生成。过滤，水洗，所得固体于50℃下干燥。得到6.28g积雪草酸三乙酸酯白色粉末。

如式7中第二步反应所示，将6.5g(0.01058mol)积雪草酸三乙酸酯加入到100ml二氯甲烷中，冰水浴冷却，向其中加入1.2g(0.01186mol)三乙胺、1.55g(0.0111mol)甘氨酸乙酯盐酸盐和0.2g(0.00164mol)4-二甲基氨基吡啶，反应混合物在0～5℃下反应0.5小时。再向体系内逐滴加入2.37g(0.0115mol)DCC的50ml二氯甲烷溶液，控制滴加速度，0.5小时加完。加完后，保持0～5℃搅拌反应2小时，再于室温下搅拌反应24小时。过滤，滤液依次用1N的盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤至中性pH。减压蒸去溶剂，得到9g胶状积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物。

将上述胶状粗产物置于硅胶柱上，以二氯甲烷/丙酮(20∶1)为淋洗剂进行柱层析，收集所需组分并浓缩。过滤，除去固体，滤液减压抽干，得到2.82g白色晶体。图16d所示为该化合物的¹H-NMR谱图。图17d所示为该化合物的质谱图。

B.积雪草酸盐的HPLC分析

将按照上文所述方法制得的某些积雪草酸盐进行HPLC分析。

·标准样品的制备

向25ml容量瓶中加入约5mg积雪草酸，再加入1ml甲醇，使固体全部溶解。然后用流动相稀释至刻度，充分混合。

·色谱参数

色谱柱：	Agilent，Zorbax Eclipse XDBC8，250mm×4.6mm
		流动相：	KH2PO4(3g/L)pH2.5/乙腈(55∶45)
流速：	1.0mL/min
		波长：	204nm
进样量：	10μL
		柱温：	30℃
测试时间：	20分钟

·系统的适应性

每次测试，都用标准溶液(200μg/mL的积雪草酸甲醇溶液)重复进样6次，以此证明系统的可重复性。并计算重复进样的相对标准偏差的百分比(％RSD)。标准溶液首次进样后，计算对于积雪草酸的拖尾因子以及理论塔板数，来计算RSD。

系统合格的标准

·六次重复进样的测试结果中，第一个峰面积相应的相对标准偏差的百分比(％RSD)不大于3.0％。

·理论塔板数不少于10000。

·拖尾因子应当不大于1.5。

·分辨率不小于2.0。

测试结果

	积雪草酸
		相对标准偏差(％RSD)	0.5
理论塔板数	15322
		拖尾因子	1.0
分辨率	2.7

计算积雪草酸及其盐的回收率(表1)。积雪草酸及其各种盐的保留时间相同，证实了盐相对于积雪草酸没有发生结构的重大变化(图1)。

表1.积雪草酸及其盐的回收

在水和甲醇中的溶解度

溶解度的实验结果取自积雪草酸及其一种钠盐(AJF09，99b)在水和甲醇中的溶解度。具体数据见表2。积雪草酸仅仅微溶于水(0.03mg/ml)，而其钠盐在水中的溶解度比它大228倍。这对于盐的生成是强有力的证据，并且对于剂型制备来说，极大地的增加了药物的应用。

样品制备

分别将积雪草酸及其盐的甲醇和水的饱和溶液过滤，除积雪草酸的水溶液以外，其余均用流动相稀释。除了钠盐的甲醇溶液制备2份样品以外，其余同种样品均制备3份。

表2.溶解度实验结果

样品名称	响应面积(μV*sec)	溶解度(mg/ml)
			积雪草酸1A(水)	121575.00	0.03
积雪草酸1B(水)	181180.00	0.04
			积雪草酸1C(水)	84600.00	0.02
积雪草酸1A(甲醇)	600450.00	34.87
			积雪草酸1B(甲醇)	468690.00	27.22
积雪草酸1C(甲醇)	640580.00	37.20
			积雪草酸钠盐1A(水)	210980.00	6.86
积雪草酸钠盐1B(水)	195600.00	6.36
			积雪草酸钠盐1C(水)	224970.00	7.32
积雪草酸钠盐1A(甲醇)	438105.00	25.44
			积雪草酸钠盐1B(甲醇)	414550.00	24.08

C.核磁共振(NMR)谱图

积雪草酸及其钠盐(AJF09，99b)的¹H-NMR及¹³C-NMR谱图的初步测定是在氘代DMSO溶液中，于Varian 300MHz核磁共振仪上进行的。总的说来，所得到的NMR谱图中质子的化学位移和裂分方式(多重性)与积雪草酸的结构相符(见图2)。通过比较积雪草酸及其盐的谱图可以发现，一些峰的化学位移发生了变化，尤其是在4.0～4.6ppm之间，这与盐的形成导致电子发生变化的结果是一致的。

¹³C-NMR谱图中碳的化学位移与积雪草酸的结构也是一致的。图3和图4分别为积雪草酸及其钠盐的¹³C-NMR谱图。积雪草酸的¹³C-NMR谱图中，碳的化学位移在36，24和17ppm的信号，在相应的钠盐的¹³C-NMR谱图中发生了变化，这也表明了盐的生成。

进一步的NMR分析测试是在400MHz的核磁共振仪上进行的，以便获取更加确切的细节信息，同时也对初步测试的结果进行证实。通过对所得¹H-NMR和¹³C-NMR谱图(见图4a～h)进行细致分析，可以看出，除了由于生成羧酸钠盐所引起的化学位移变化以外，钠盐的结构相对于酸来说，没有发生变化。最显著的能够支持盐生成的化学位移的变化在于：

a.积雪草酸的¹H-NMR谱图中，在11.9ppm的位置有一个氢的信号，通常对应羧基中的氢。而在其钠盐的谱图中没有该信号。

b.在¹³C-NMR谱图中，羧基中碳原子的信号也发生了变化，这种变化可以用盐的生成来解释。

D.X-射线粉末衍射

X-射线衍射实验所用仪器为Shimadzu Lab X，，XRD-6000，测试标准参见：美国药典(USP)<941>。图5a为积雪草酸的衍射图，图中的宽峰为非晶体的特征峰。而按照前文Ⅳ.A.3中所述的方法，将钠盐的制备规模放大到2g，通过HPLC分析，获得如前述Ⅳ.B中的结果，并且该钠盐的X-射线粉末衍射谱图与晶体的特征一致(参见图5b)。

E.傅立叶变换红外光谱图

将积雪草酸、积雪草酸钠盐(AJF09，82和AJF09，99b)和积雪草酸铵盐(AJF09，99a)进行傅立叶变换红外光谱测试。图6为所得到的积雪草酸的红外光谱图，其中1697cm^-1附近的峰为典型的羧酸特征峰。

钠盐AJF09，82(图7)和AJF09，99b(图8)的红外谱图清楚地显示了1697cm^-1附近羧酸特征峰的强度的减弱，以及1545cm^-1和1390cm^-1附近峰的出现。产生这种变化的原因在于与羧酸基团不同的羧酸盐基团的存在。这是支持积雪草酸盐生成的光谱学证据。铵盐(AJF09，99a)的红外谱图(图9)中存在1390cm^-1附近的特征峰，同样证实了羧酸盐的存在，该图中1690cm^-1附近还存在羧酸的特征峰，这是由于从酸到盐转化不完全所造成的。

F.热重分析(TGA)

本发明中的TGA在Q5000型热分析仪上进行。仪器的校准参照美国药典(USP)<891>，用镍标样进行。将积雪草酸和两种钠盐AJF09，82和AJF09，99b进行热重分析(实验结果见图10～12)。从图中可以看出，积雪草酸在400℃开始分解，而两种钠盐则显示了较佳的耐热性，这种现象在生成盐的变化中是比较常见的。

G.钠含量的测定

测定钠含量所用仪器为Perkin ElmerAAnalyst 300型原子吸收分光光度计，其中装有HGA 850型石墨炉，使用氧化空气-乙炔火焰，在波长为589nm处进行检测。通过1000mg/L的氯化钠溶液配制钠的标准溶液。用本方法测定钠含量时，通常在碱金属(如铯)的存在下进行，以便控制离子化的程度。因此，应首先用实验来确定铯(以氯化铯的形式存在)的用量，这对于提高仪器对钠的敏感度非常必要。经实验确定，将0.3％的氯化铯用于本发明的所有样品和标准品。

标准氯化钠溶液1(1000ppm Na)

将精确称重的2.53g氯化钠置于1.0L的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶解，再用去离子水稀释至刻度，即得所需氯化钠标准溶液。

3％的氯化铯溶液

将精确称重的3g氯化铯置于100mL的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶解，再用去离子水稀释至刻度，即得所需氯化铯溶液。

0.3％的氯化铯溶液(稀溶液)

将精确称重的6g氯化铯置于2.0L的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶解，再用去离子水稀释至刻度，即得所需浓度的氯化铯溶液。

稀释液1(含100ppm Na的0.3％的氯化铯溶液)

将10.0ml标准氯化钠溶液1(1000ppm Na)和10.0ml浓度为3％的氯化铯溶液移至100ml容量瓶中，再用去离子水稀释至刻度。

稀释液2(含10ppm Na的0.3％的氯化铯溶液)

将10.0ml稀释液1(含100ppm Na的0.3％的氯化铯溶液)转移至100ml容量瓶中，用0.3％的氯化铯溶液(稀溶液)稀释至刻度。

系统响应的线性

测试系统的线性是指在一定范围内，该系统能够给出与测试样品的浓度成比例的测试结果的特性。本发明中首先测定了吸光度和钠浓度的关系。在测试前，先配制好氯化纳标准溶液，配制过程如下：分别精确转移2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml稀释液2(含10ppm Na的0.3％的氯化铯溶液)至5个独立的50ml容量瓶中，用0.3％的氯化铯溶液分别稀释至刻度，从而制得浓度分别为0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1.0ppm和1.2ppm的标准溶液。在测试中，每种浓度的样品读数3次，以其读数的平均值作为该浓度的吸光度。以样品的吸光度对其浓度作图，即可得到线性曲线(图13)。

积雪草酸钠盐AJF09，82和AJF09，99b的测试结果如表3所示

表3.积雪草酸盐中钠的含量

如果假定每个积雪草酸盐分子对应一个钠离子，那么样品中钠的含量应该为4.5％。

下面用实施例进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响

1.目的

为了观察积雪草酸和积雪草苷对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响，分别在疾病动物模型建立以后的第二天和第七天给药。

2.材料和方法

动物：SD大鼠(雄性)，体重250～300g，由上海SLACC有限公司提供；

TFG-βKit，人96T ELISA Kit购自上海晶美；

TNF-αKit，人96T ELISA Kit购自上海晶美；

积雪草苷(纯度≥92％)；

积雪草酸(纯度≥98％)

注射用博莱霉素，规格：8mg/Ap，由天津太河制药有限公司提供；

地塞米松，规格：5mg/Ap，由上海信谊药业提供。

3.剂量和给药途径

积雪草酸    3、9和27mg/kg    口服(p.o.)×28天

积雪草苷    36mg/kg          p.o.×28天

地塞米松    0.6mg/kg         p.o.×28天

博莱霉素    5mg/kg           p.o.×28天

4.方法

雄性SD大鼠，体重250～300g，用3％的西可巴比妥麻醉后，平放，固定在手术台上。将其颈部用乙醇消毒，切开，露出气管。将注射针插入气管环之间的空隙中，注入5mg/kg博莱霉素。保持大鼠竖立、旋转，使溶液均匀分散在肺中。缝合切口。

待大鼠恢复意识后，随机分成两组：(i)动物模型建立后的第二天接受施药；(ii)动物模型建立后七天接受施药。两组中再分成以下各小组：27、9和3mg/kg p.o.×28天积雪草酸组；0.6mg/kg p.o.×28天地塞米松组；36mg/kg p.o.×28天积雪草苷组；模型组和空白组。对模型组和空白组施用生理盐水。在施用积雪草酸和积雪草苷后第28天，计算大鼠的存活率以及肺的重量占体重的百分比，并进行病理检查和血清检查。

表4.试验第7-28天大鼠的死亡率

积雪草酸处理对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺重指数的影响

大鼠的体重和肺重在其死后测定。

肺重比＝(肺的重量/体重)×100％

结果见表5和表6。在下表中，一颗星(*)表示和模型组相比区别较明显(P＜0.05)；两颗星(**)表示区别非常明显(P＜0.01)

表5.积雪草酸给药28天后的肺重指数(模型建立后第二天开始给药)

表6.积雪草酸给药28天后的肺重指数(模型建立后第7天开始给药)

如表5和表6所示，建模后第二天或第七天开始给药的高、中、低剂量积雪草酸组的大鼠的肺重指数均明显低于模型组。积雪草苷组的实验结果与积雪草酸组类似。地塞米松组的肺重指数相对较高，很可能是由于地塞米松引起的体重降低造成的。

积雪草酸处理对于博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠的细胞因子的血清学影响

按照标准操作程序制备血清样本(样本采集后3000rpm离心10分钟)，储存于-20℃。按照试剂盒上的说明进行测试，结果见表7。

表7.积雪草酸的血清试验结果

积雪草酸对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠的影响的病理分析

肺组织在10％的福尔马林溶液中固定一周，其下叶经脱水和浸蜡后，进行石蜡包埋和切片，切片厚度为3～4μm。再进行常规的苏木精-伊红(HE)染色。进行胶原纤维和弹性纤维双重特殊染色，以便确定纤维化的程度。观察两组切片的染色状况，结果如下。

组1(博莱霉素建模后第二天开始给药)

空白组

动物肺组织形态结构完整，没有出现出血、增生或水肿的现象。然而，在大多数动物的肺组织中存在炎症细胞的浸润。在一些动物中情况比较严重并伴随局部充血。

胶原纤维和弹性纤维双重染色显示，肺泡隔轻度增厚，并有少数成纤维细胞增生。

模型组

实验动物的肺部组织中存在炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞)和肺泡隔增生。在增厚病灶中，存在从中度到严重的肺泡隔局部增厚和成纤维细胞的中度增生。此外，还存在着严重的肺泡炎，可能在终末细支气管周边部位发生纤维组织增生，以致在一些区域几乎没有肺泡存在。在肺胸膜下还存在轻微的肺泡萎缩和肺气肿。

胶原纤维和弹性纤维双重染色显示，在肺组织中有大量胶原纤维和弹性纤维增生。在某些区域几乎没有肺泡。一些气管壁上也具有胶原纤维和弹性纤维增生。内腔变小，并且血管周围具有大量胶原纤维和弹性纤维的增生。

地塞米松组

肺组织中存在轻微的炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞)。在肺泡中有少量炎症细胞浸润，并且肺泡隔具有现轻微增生。成纤维细胞略有增生，有肺大泡形成，并且在肺胸膜下还存在轻微的肺萎缩和肺气肿。

胶原纤维和弹性纤维染色显示，肺组织中有少量胶原纤维和弹性纤维增生。

积雪草苷组

肺组织有轻微炎症和肺泡炎(主要是淋巴细胞)。肺泡隔略有增生，肺泡隔下发现轻微的肺萎缩和肺气肿症状。以上病理变化的程度和范围与地塞米松组类似，但是没有模型组严重。

胶原纤维和弹性纤维染色结果与地塞米松组相似。

积雪草酸低剂量组

肺组织具有轻微炎症和肺泡炎(主要是淋巴细胞)。肺泡隔略有增生，且有少许增厚，少量成纤维细胞增生，肺泡隔下有轻微的肺萎缩和肺气肿症状。以上病理变化的程度和范围与积雪草苷组类似。

胶原纤维和弹性纤维染色结果与地塞米松组相似。

积雪草酸中等剂量组

肺组织具有轻微的炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞)。炎症蔓延到肺泡，肺泡隔略有增厚和增生。成纤维细胞少量增生，肺泡隔下有轻微的肺泡萎缩和肺气肿症状。

胶原纤维和弹性纤维染色显示纤维组织增生，但比模型组明显轻微。病理变化的程度和范围在大部分大鼠中与低剂量组类似，但在该组的少量大鼠中比低剂量组轻微。

积雪草酸高剂量组

肺组织中具有轻微的炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞)。炎症蔓延到肺泡，肺泡隔略有增厚。成纤维细胞少量增生，肺胸膜下有轻微的肺泡萎缩和肺气肿症状。

胶原纤维和弹性纤维染色显示仅有少量纤维组织增生，这在一些方面与空白组类似。该组的病理变化轻于低剂量组、中剂量组和积雪草苷组。

组2(博莱霉素建模后七天开始给药)

空白组和模型组的情况与组1(建模后第二天开始给药)中相同组的类似。

地塞米松组

肺组织具有轻微的炎症细胞浸润(主要是淋巴细胞)。在肺泡中有少量炎症细胞浸润，肺泡隔略微增厚。成纤维细胞轻微增生，有很多肺大泡形成，肺胸膜下存在轻微的肺萎缩和肺气肿症状。病理变化明显比建模后第二天开始接受地塞米松组严重很多。

胶原纤维和弹性纤维染色显示，肺组织具有纤维组织增生，且肺泡壁的厚度以及纤维化程度都比建模后第二天开始接受地塞米松组严重很多。

不同剂量的积雪草苷组和积雪草酸组的情况与博莱霉素建模后第二天开始接受给药的组类似。

5.分析

博莱霉素诱导肺纤维化是一种用于研究肺纤维化机理和发现抗纤维化、抗炎症治疗剂的“黄金标准”模型。许多动物经博莱霉素处理后肺发生的生物化学和形态变化看上去与人类非常相似。

博莱霉素处理激活的炎症和纤维化途径与炎症和纤维化疾病中的类似，如糖尿病肾病(肾纤维化)。此外，Gauldie等人(Proc.Am.Thorac.Soc.3：696-702，2006)证实慢性阻塞性肺病(COPD)，包括肺气肿，依赖相同的一些不良调节途径。因此，本发明提供如前文所述的治疗性组合物，用于治疗炎症和纤维化疾病，如关节炎、炎症性肠病、银屑病、糖尿病肾病以及COPD。

由于博莱霉素引起的肺炎以及之后的肺纤维化非常严重，模型组中50～70％动物死亡。动物死亡应当与慢性炎症和纤维化引起的呼吸衰竭有关。地塞米松并不能使大鼠免于博莱霉素引起的死亡，令人惊讶的是，积雪草苷和积雪草酸却在很大程度上阻止了博莱霉素引起的死亡。

结果也表明，积雪草酸能够降低TNF-α和TGF-β的水平，在最高剂量时，更加有效。

采用了常规的苏木精-伊红(HE)染色。还进行了胶原纤维和弹性纤维双重染色，以更好的观察抗纤维化效果。病理结果表明，积雪草酸有效对抗了博莱霉素诱导的肺纤维化，其效果与剂量有关。高剂量积雪草酸组的效果优于积雪草苷组，而中、低剂量积雪草酸组的效果与积雪草苷类似。有趣的是，在建模后第二天和第七天开始地塞米松给药的两个组之间有明显的病理区别：在第二天开始给药肺纤维化缓解更加显著。原因可能是由于地塞米松通过抑制炎症发挥了抗纤维化作用。一旦发生了早期的炎症，地塞米松的效果就降低。而积雪草酸和积雪草苷在初期的炎症阶段和后期的纤维化阶段都起作用，因此，在损伤后第二天和第七天给药的这些组之间的效果变化不大。

因此，纯的积雪草酸和积雪草苷显示了对博莱霉素诱导的炎症和纤维化的反作用。

经博莱霉素处理七天后开始给药，能够影响地塞米松的药效，但是并不能显著影响积雪草酸和积雪草苷的效果，这表明积雪草酸和积雪草苷并不仅仅通过抑制发生在博莱霉素处理后不久的炎症发挥作用。相反的，实验数据表明，积雪草酸和积雪草苷对于炎症和纤维化过程都有直接的抑制作用。

表8.积雪草酸抗纤维化实验中羟脯氨酸的测定值

表9.Ⅲ型胶原的含量(建模后第七天开始积雪草酸给药)

Claims (12)

1.积雪草酸，其特征在于，纯度约为98％。

2.一种治疗性组合物，其由包括以下步骤制备而得：(A)提供如权利要求1所述的积雪草酸，然后；(B)将所述的积雪草酸与药学上可接受的载体制成含有治疗有效量积雪草酸的剂型。

3.一种预防或治疗纤维化疾病的方法，其特征在于，包括对受试者施用：(A)如权利要求1所述的积雪草酸，或(B)如权利要求2所述的治疗性组合物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的纤维化疾病选自放射性肺纤维化、特发性肺纤维化，以及糖尿病肾病。

5.一种预防或治疗炎症性疾病的方法，其特征在于，包括对受试者施用：(A)如权利要求1所述的积雪草酸，或(B)如权利要求2所述的治疗性组合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的炎症性疾病选自关节炎、炎症性肠病，以及银屑病。

7.一种如权利要求1所述的积雪草酸制备而成的盐。

8.如权利要求7所述的盐，其特征在于，所述的盐选自碱金属盐、碱土金属盐，以及任意取代的铵盐。

9.如权利要求8所述的盐，其特征在于，所述的盐选自钠盐、钾盐、铵盐，以及氨基丁三醇盐。

10.一种含有如权利要求7所述的盐的固体制剂。

11.一种如权利要求1所述的积雪草酸的衍生物，其特征在于，所述的衍生物为酰胺或酯。

12.如权利要求11所述的积雪草酸的衍生物，其特征在于，所述的衍生物为积雪草苷。

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