CN101912496B - 一种槟榔总生物碱的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种槟榔总生物碱的制备方法，尤其是采用大孔树脂分离纯化槟榔乙醇水提取物中的生物碱的方法，包括药材的处理、生物碱的粗提、提取液浓缩、上柱、洗脱和干燥等步骤。由于槟榔碱性质不稳定，易随水蒸汽挥发，加热对槟榔碱有明显的影响，加热时间越长，温度越高，槟榔碱损失越大。因此在本发明的药材提取流程中采用了超声萃取方法，在300W功率条件下，30-40分钟的超声萃取不会引起温度的显著上升。得到洗脱液后，随即加酸形成槟榔碱的磷酸盐形式，保证了槟榔碱的稳定性。采用大孔树脂分离纯化，以乙醇水溶液为洗脱剂，整个工艺流程中所用的溶剂只涉及到水和乙醇，乙醇和水为中药提取中首选溶剂，具有无毒安全的特点。

Description

一种槟榔总生物碱的制备方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分的提取分离方法，尤其是从中药槟榔提取物中分离总生物碱的方法。

背景领域

棕榈科槟榔(Areca catechu L.)为多年生乔木，原产热带、亚热带地区，是典型的热带雨林植物，在我国广东、福建、海南、台湾和云南等地均有栽培。槟榔(Areca nut)是其成熟种子，我国南方及东南亚等地居民都有嚼食槟榔的习惯。除了嚼食外，槟榔具有良好的药用价值。槟榔味苦、性辛、温，具有杀虫消积，降气，行水，截疟的功效，是中医常用的驱虫、消积药物，被列为五大南药之首。生物碱是槟榔的主要保健和药理活性成分，槟榔中生物碱(arecaalkaloid)的含量为0.3％-0.6％，其中槟榔碱(arecoline)的含量为0.1％-0.5％，其余分别为槟榔次碱、去槟榔碱、去甲基槟榔碱、槟榔副碱、高槟榔碱，它们均与鞣酸结合而存在。嚼食槟榔可以增强记忆功能在民间是家喻户晓的事，研究证实槟榔中的槟榔碱做为一种类胆碱功能的药物成分对老龄鼠的时间知觉损伤有削弱作用，能够改善阿尔茨海默老年性痴呆症。临床注射槟榔碱能改善AD病人的认知能力，改善他们的记忆力。槟榔生物碱有显著的杀虫灭螺的功效，对猪肉、牛肉绦虫有强的致瘫痪作用，对棘球蚴虫有杀伤作用。槟榔碱对钉螺也有杀灭作用，槟榔碱与化学灭螺药合用后，降低了钉螺对药物刺激的敏感性，钉螺上爬率明显降低，灭螺效果显著增强。

我国是世界槟榔的重要产地之一，我国海南的槟榔种植面积、年产量、收购量均占大陆的90％以上；在台湾，槟榔产值仅次于稻米，而成为第二大宗农产品，形成了新兴的槟榔产业。近十几年来，采取一系列措施发展生产，扩大种植面积，使槟榔产量稳步增长。湖南省的槟榔加工企业以精选槟榔干果为原料，将其制作成最具地方特色的大众化咀嚼物，已发展成为当地一大产业。槟榔除了制成干果销售外，对槟榔中主要保健和药理活性成分槟榔生物碱进行提取分离，进而加工成药品，将更进一步延伸槟榔产业链、提升科技含量、增加产品附加值。

槟榔生物碱的提取最常用的是有机溶剂，通常采用乙醇、乙醚或氯仿提取。由于槟榔果中生物碱与鞣酸结合在一起，提取时可先用氨水浸泡。另外采用较多的是水或酸水提取，用水或磷酸对槟榔粉末进行回流提取。或采用微波、超声辅助提取以及超临界CO₂萃取，但提取物中生物碱含量较低、杂质成分复杂，需要进行分离、纯化，以提高提取物中槟榔生物碱的含量。大孔树脂分离技术是一种易于实现工业化扩大生产的分离纯化方法，具有选择性好、吸附容量大、再生处理方便及吸附迅速、解吸容易等优点，可用于生物碱活性部位的有效富集。而到目前为止，尚未见有关槟榔生物碱采用大孔树脂法富集、纯化及工业化生产的报道。

大孔树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附剂，一般为白色颗粒状，粒度多为20-60目，理化性质稳定。它具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附及离子交换吸附从溶液中有选择地吸附有机物。按照树脂与吸附组分间作用力不同，可分为大孔吸附树脂和大孔离子交换树脂。大孔树脂还有多种优点：耐溶胀，不易碎裂，耐氧化，耐磨损，耐热及耐温度变化，以及对有机大分子物质较易吸附和交换，因而抗污染力强，并较容易再生。

发明内容

本发明的目的是提供一种槟榔总生物碱的制备方法，尤其是采用大孔树脂分离纯化槟榔乙醇水提取物中的生物碱的方法，在天然产物分离纯化方面，大孔树脂法与普通硅胶柱色谱相比，具有选择性的吸附待分离的物质、工艺简单、可重复使用，易于工业放大等优点。

本发明的技术方案依次包括药材的处理、生物碱的粗提、提取液浓缩、上柱、洗脱和干燥等步骤，是通过如下方案得到的：

(1)槟榔果实的干燥和粉碎：干燥温度为40～60℃，筛目数为20～40目，得到槟榔粉末；

(2)槟榔中生物碱的粗提：称取槟榔粉末，加入乙醇水溶液后浸没于25℃水浴中超声萃取30-40min，萃取时间2min，间隔时间1min，功率300W，过滤，重复萃取2-3次，

合并滤液；其中乙醇水溶液浓度为70-90％，料液比为1∶5-1∶10；

(3)浓缩：滤液在60℃下减压浓缩至原体积1/4，得浓缩液；

(4)上样：所购买的树脂依次用去离子水、95％乙醇浸泡、洗涤处理后，抽干待用，取上述预处理好的树脂，加乙醇使其充分溶胀后，湿法装于吸附柱中；将步骤(3)得到的浓缩液采用5％氢氧化钠调至pH至7.0-9.0之间，以1-3倍树脂床体积/小时的流速连续流过树脂柱，所用树脂重量为生药重量的1/3-1/5，其中所述的大孔吸附树脂为D101，AB-8，XAD-7，XAD-4，DA201，D151；优选D151树脂；

(5)洗脱：先以4-6倍树脂床体积蒸馏水洗柱，除去水溶性杂质后，再采用乙醇或80-90％乙醇水溶液洗脱吸附的生物碱，至流出液中检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0之间，减压浓缩得到浸膏；

(6)干燥：将所得浸膏冷冻干燥得到槟榔生物碱成品，其中生物碱含量大于78％。

将上述大孔树脂采用70-90％乙醇水溶液梯度洗脱后再生，可重复使用，本发明分离纯化槟榔生物碱的洗脱液可以为纯乙醇溶液、乙醇-水(90∶10，v/v)溶液、乙醇-水(80∶20，v/v)溶液，洗脱操作简单易行，且可用于规模化生产。完成洗脱后的树脂，采用70-90％的乙醇进行梯度洗脱可以再生而重复使用。

本发明的技术路线适合于槟榔果实中总生物碱的制备。由于槟榔碱性质不稳定，易随水蒸汽挥发，加热对槟榔碱有明显的影响，加热时间越长，温度越高，槟榔碱损失越大。因此在本发明的药材提取流程中采用了超声萃取方法，由于浸没于25℃水浴中，在300W功率条件下，30-40分钟的超声萃取不会引起温度的显著上升。得到洗脱液后，随即加酸形成槟榔碱的磷酸盐形式，保证了槟榔碱的稳定性。采用大孔树脂分离纯化，以乙醇水溶液为洗脱剂，整个工艺流程中所用的溶剂只涉及到水和乙醇，乙醇和水为中药提取中首选溶剂，具有无毒安全的特点。

具体实施方式

实施例1不同树脂吸附与解吸能力的比较

称取预处理好的不同类型的树脂0.5g，置于100mL具塞三角瓶内，加入10mL乙醇使其充分溶胀，然后分别加入50mL不同浓度的槟榔生物碱乙醇溶液，将三角瓶置于30℃恒温振荡器内振荡，使树脂充分吸附，采用溴钾酚绿分光光度法分析吸附液中槟榔生物碱含量，至槟榔生物碱浓度不再变化。根据式(1)计算平衡吸附量。

q^*＝v(c₀-c_e)/w                        (1)

q^*为平衡吸附量(mg/g)；c₀为槟榔生物碱溶液起始浓度(mg/mL)；c_e为槟榔生物碱的平衡浓度(mg/mL)；v溶液体积(mL)；w为干树脂重量(g)。

树脂充分吸附平衡后，分离出槟榔生物碱母液，用水快速洗涤树脂3次，再加入纯乙醇30℃下恒温振荡充分解吸，测定解吸液中槟榔生物碱的含量，根据式(2)计算解吸率。

$D(\%)=\frac{\mathrm{cv}}{m}\×100\%---\left(2\right)$

D为解吸率；c为洗脱液中槟榔生物碱的浓度(mg/mL)；v为洗脱液的体积(mL)；m为树脂吸附的槟榔生物碱总量。

对7种不同树脂：D101，X-5，AB-8，XAD-7，XAD-4，DA201，D151进行吸附和解吸槟榔生物碱的能力测定结果见表1。

由表1可见，D151、AB-8和XAD-7树脂的平衡吸附量较高都达到了110mg/g；其次为D101、XAD-4和DA201，平衡吸附量在88-95mg/g之间；平衡吸附量最低的为X-5仅有62.2mg/g。实验所用的7种树脂中以D151的平衡吸附量为最大，解吸效果也最好；此外，XAD-7和AB-8也具有较好的吸附与解吸能力。因此，D151树脂可作为槟榔提取物中分离、富集槟榔生物碱的首选树脂。

表1不同树脂的吸附与解吸能力(30℃)

实施例2槟榔生物碱制备例1

槟榔果实100g，在50℃烘干，粉碎成20目粉末，加入500mL的70％乙醇水溶液，25℃水浴超声萃取30min，过滤，收集滤液，滤渣重复萃取2次，合并提取液；在60℃下减压浓缩至400mL；称取33g处理好的D151树脂用乙醇充分溶胀后，湿法装柱；浓缩液以5％氢氧化钠调pH至8.0，以每小时1.5倍树脂床体积的流速通过D151树脂柱后；用6倍树脂床体积的蒸馏水以同样速度通过树脂柱，再用100％乙醇洗脱至检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0之间，60℃下减压浓缩的浸膏，浸膏冷冻干燥得0.41g槟榔生物碱粉末，分析得到的生物碱纯度为85.47％。D151树脂柱分别以的90％乙醇水溶液洗至清亮后，再以80％乙醇水溶液洗涤，用70％乙醇水溶液再生。

实施例3槟榔生物碱制备例2

槟榔果实100g，在60℃烘干，粉碎成40目粉末，加入600mL的90％乙醇水溶液，25℃水浴超声萃取40min，过滤，收集滤液，滤渣重复萃取2次，合并提取液；在60℃下减压浓缩至450mL；称取25g处理好的D151树脂用乙醇充分溶胀后，湿法装柱；滤液以5％氢氧化钠调pH至7.0，以每小时2倍树脂床体积的流速通过D151树脂柱后；用5倍树脂床体积的蒸馏水以同样速度通过树脂柱，再用90％乙醇洗脱至检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0之间，60℃下减压浓缩的浸膏，浸膏冷冻干燥得槟榔生物碱粉末，分析得到的生物碱纯度80.54％。D151树脂柱分别以的80％乙醇水溶液洗至清亮后，用70％乙醇水溶液再生。

实施例4：槟榔生物碱制备例3

槟榔果实100g，在40℃烘干，粉碎成20目粉末，加入800mL的80％乙醇水溶液，25℃水浴超声萃取30min，过滤，收集滤液，滤渣重复萃取2次，合并提取液；在60℃下减压浓缩至600mL；称取30g处理好的D151树脂用乙醇充分溶胀后，湿法装柱；滤液以5％氢氧化钠调pH至7.0，以每小时2.5倍树脂床体积的流速通过D151树脂柱；用5倍树脂床体积的蒸馏水以同样速度通过树脂柱，再用80％乙醇洗脱至检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0之间，60℃下减压浓缩的浸膏，浸膏冷冻干燥得0.49g槟榔生物碱粉末，分析得到的生物碱纯度78.1％。D151树脂柱用70％乙醇水溶液完成再生。

实施例5槟榔生物碱制备例4

槟榔果实100g，在60℃烘干，粉碎成40目粉末，加入600mL的90％乙醇水溶液，25℃水浴超声萃取40min，过滤，收集滤液，滤渣重复萃取3次，合并提取液；在60℃下减压浓缩至800mL；称取25g处理好的XAD-7树脂用乙醇充分溶胀后，湿法装柱；滤液以5％氢氧化钠调pH至7.0，以每小时2倍树脂床体积的流速通过XAD-7树脂柱后；用5倍树脂床体积的蒸馏水以同样速度通过树脂柱，再用90％乙醇洗脱至检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0之间，60℃下减压浓缩的浸膏，浸膏冷冻干燥得槟榔生物碱粉末，分析得到的生物碱纯度78.94％。XAD-7树脂柱分别以的80％乙醇水溶液洗至清亮后，用70％乙醇水溶液完成树脂再生。

Claims (2)

1.一种槟榔总生物碱的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

(1)槟榔果实的干燥和粉碎：干燥温度为40～60℃，筛目数为20～40目，得到槟榔粉末；

(2)槟榔中生物碱的粗提：称取槟榔粉末，加入乙醇水溶液后浸没于25℃水浴中超声萃取30-40min，萃取时间2min，间隔时间1min，功率300W，过滤，重复萃取2-3次，合并滤液；其中乙醇水溶液浓度为70-90％，料液比为1∶5-1∶10；

(3)浓缩：滤液在60℃下减压浓缩至原体积1/4，得浓缩液；

(4)上样：将所购买的大孔树脂依次用去离子水、95％乙醇浸泡、洗涤处理后，抽干待用，取上述预处理好的树脂，加乙醇使其充分溶胀后，湿法装于吸附柱中；将步骤(3)得到的浓缩液采用5％氢氧化钠调至pH至7.0-9.0，以1-3倍树脂床体积/小时的流速连续流过树脂柱，所用树脂重量为生药重量的1/3-1/5，其中所述的大孔吸附树脂为D101、AB-8、XAD-7、XAD-4、DA201或D151树脂；

(5)洗脱：先以4-6倍树脂床体积蒸馏水洗柱，除去水溶性杂质后，再采用乙醇或80-90％乙醇水溶液洗脱吸附的生物碱，至流出液中检测不出生物碱为止；收集洗脱液，以1％的磷酸溶液调pH至5.0-7.0，减压浓缩得到浸膏；

(6)干燥：将所得浸膏冷冻干燥得到槟榔生物碱成品，其中生物碱含量大于78％。

2.根据权利要求1所述的一种槟榔总生物碱的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为D151树脂。