CN101871002A - 一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒 - Google Patents
一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测临床样品中21号染色体数目异常的试剂盒，特别是涉及以多重杂交特异扩增技术通过检测母血浆中胎儿游离核酸多态性来实现无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒。本试剂盒可以快速、准确、无创性地进行21-三体筛查。
Description
技术领域
本发明涉及检测临床样品中21号染色体数目异常的试剂盒，特别是涉及以多重杂交特异扩增技术通过检测母血浆中胎儿游离核酸多态性来实现无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒。
背景技术
21-三体综合征是胎儿最常见的染色体病，在新生儿中的发病率约为1/800，占小儿染色体病的70-80％，发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的患者，平均20分钟就有一例21-三体综合征患儿出生，全国每年出生的21-三体综合征患儿可多达27万例左右。21-三体综合征患者由于多了1条第21号染色体，主要表现为智力低下，发育迟缓和特殊面容。由于21-三体综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛苦和沉重的精神负担，因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在进行产前诊断时，必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织，尽管这些创伤性的手段相对比较安全，但是对胎儿和母亲仍然存在一定的风险，因此临床上只对可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险，在过去几十年中，人们一直广泛应用的方法是从母血中分离胎儿有核红细胞，但是由于胎儿有核红细胞在母血中含量稀少，需要进行细胞富集等种种操作程序限制了该方法的发展和实际应用。
2000年，Poon等发现了母血浆中存在胎儿游离核糖核酸(RNA)。目前研究发现母血浆胎儿RNA的稳定存在可能是由于合体滋养层微颗粒的保护而避免了血浆中RNA酶的消化作用，同时研究也发现胎盘是游离胎儿RNA主要的来源，并且来源于胎盘的RNA容易被检测到。母血浆中一些胎儿游离RNA同性别无关，且母亲自身无表达，如位于21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4基因。由于在一个正常胎儿，人类染色体的二倍体性使得杂合性SNP(单核苷酸多态性)其等位基因剂量比例将会出现1∶1，而对于一个21-三体的患儿，其等位基因的剂量比例将会为1∶2或者2∶1。对于基因编码区的SNP位点而言，每条染色体上特定基因携带的这些SNP位点必将随着转录而传递到mRNA(信使RNA)上，成为“RNA-SNP”，杂合性的RNA-SNP位点的基因剂量比例也必定符合基因组DNA杂合性SNP剂量的比例情况，因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA来无创性的评估胎盘细胞染色体数目异常与否，也就可以评估胎儿染色体数目异常与否。
多重杂交特异扩增技术(Multiplex Hybri dization-specific Amplification，MHSA)，是一种灵敏度极高的相对定量技术，它利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应体系内检测多达40个不同核酸序列拷贝数变化，最低只需要20ng核酸样本并且可以检测到序列内单个核苷酸的变化，可用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳或毛细管电泳等方法进行检测。
MHSA的原理是将制备的长型探针和短型探针同目的基因序列杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接。所有被连接的DNA序列都有共同的5’和3’末端，因此可以仅仅用一对引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列。由于长型探针有片段大小可变的中间序列，因此每对MHSA探针组可以扩增出特定片段大小的一段序列。通过电泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。该技术目前广泛应用于染色体疾病、SNP位点检测和mRNA表达研究。
本发明人应用多重杂交特异扩增技术并结合电泳，通过精确定量母血浆中胎儿21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4的SNP剂量比例，建立一种可以快速、准确、无创性筛查21-三体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒，该试剂盒以多重杂交特异扩增技术(MHSA)检测母血浆中胎儿游离核酸，通过扩增21号染色体特异性的SNP位点，并根据扩增产物剂量的差异分析染色体数目异常。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
(1)设计一个五重复合杂交-连接-扩增体系，以扩增染色体特异性的SNP位点；
(2)针对一组特异性染色体的的SNP位点进行检测和分析；
(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。
基于以上技术方案发明的试剂盒，包括(1)提供包括(a)逆转录酶系及逆转录反应液、(b)杂交反应液、(c)耐热的连接酶和连接反应液、(d)可热启动的耐热DNA聚合酶和PCR反应体系、(e)质控品；(2)通过多重扩增体系一次扩增所说的多个SNP位点；(3)扩增后应用电泳的方法，检测各位点不同的等位基因片段大小和数目，分析累计产物发出的荧光量来检测靶多核苷酸的存在和相对量。
根据本发明的一个优选实施方案，杂交反应液包括1.5M KCl和20mM Tris-Cl及探针混合物，特征在于其中使用的探针混合物的序列分别为，针对rs8130833位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAAAGCCTGTGTCCACTGTGGA-3’(SEQ ID NO：1)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCA-3’(SEQID NO：2)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTAAGCAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCT-3’(SEQ IDNO：3)；
针对rs7844位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATATTGTCATCCGCTTGCTGTGCTGTGGGG-3’(SEQID NO：4)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAG-3’(SEQID NO：5)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCCAGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAT-3’(SEQ IDNO：6)；
针对rs9015位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATCACTGCGCCTACTATACGCAAAAGGGCCCCTGG-3’(SEQ ID NO：7)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAA-3’(SEQID NO：8)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAACTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAT-3’(SEQ ID NO：9)；
针对rs13643位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGACCCAGTTCTGTAAATAACTTGAATCCAGTTGTCTTGTATA-3’(SEQ ID NO：10)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTA-3’(SEQ IDNO：11)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGGGTCATTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTG-3’(SEQ ID NO：12)；
针对rs9305729位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGATTTAAAATGGTTAAAATGGCTTTAAATGGTGACCAGCTTTGCATG-3’(SEQ IDNO：13)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTA-3’(SEQID NO：14)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTGGTACCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTG-3’(SEQ ID NO：15)。
根据本发明的一个优选实施方案，PCR反应体系包括20mM Tris-Cl，20mM KCl，2mMMgCl2，荧光染料标记的上游、下游寡核苷酸引物，其中上游和下游寡核苷酸引物的序列分别是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGA-3’(SEQ IDNO：16)、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTG-3’(SEQ ID NO：17)。
根据本发明的一个优选实施方案，杂交反应液中探针混合物浓度范围为0.01fM-100fM，优选范围为0.1fM-10fM。PCR反应体系中上游、下游引物浓度范围为0.05μM-10.0μM，优选范围为0.1μM-1.8μM。
根据本发明的一个优选实施方案，可以使用合成的特异性探针与染色体特异性SNP位点杂交，这些探针同SNP位点两侧毗邻的特异性区域进行杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接。可以使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸探针，并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化，然后进行氨解处理。
根据本发明的一个优选实施方案，可以应用荧光染料、生物素、放射性同位素、稀土金属元素等标记引物进行扩增，用于扩增后产物的分离，优选应用荧光染料标记。可以使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化，然后进行氨解处理。氨解处理后分别在引物5’端标记荧光发生基团，包括6-FAM或者HEX但不限于这些荧光染料发光基团。以FPLC层析法纯化荧光标记的引物，然后可以使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物。
根据本发明的一个优选实施方案，每人份PCR反应体系中加入2单位耐热DNA聚合酶，其中耐热DNA聚合酶优选可热启动的耐热DNA聚合酶。
根据本发明的一个优选实施方案，逆转录反应液包括50mM Tris-HCl，50mM KCl，4mMMgCl2，10mM DTT及20pM市售的随机引物，每人份逆转录反应液中加入100单位逆转录酶。
根据本发明的一个优选实施方案，连接反应液包括20mM Tris-HCl，24mM NaAC，15mMMgCl2，每人份连接反应液中加入1单位连接酶。
根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒可使用的待检样品是可疑染色体数目异常的临床样品。本试剂盒旨在检测所说可疑临床样本的染色体数目异常是指21号染色体数目异常，包括但不只限于21号染色体数目异常等疾病。临床样本可以来源于人体各种组织和体液。用来检测染色体数目异常的RNA来自母血浆中胎儿游离RNA。
根据本发明的一个优选实施方案，其中的质控品包括21三体阳性标准品和阴性对照，其中阴性对照为正常人DNA，21三体阳性标准品为21三体患者的DNA。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的多重扩增体系包括：一个混合多种成分在单个eppendorf管内的逆转录反应体系；一个混合多种成分在单个eppendorf管内的杂交反应体系；制备一个混合多种成分在单个eppendorf管内的连接反应体系；一个混合多种成分在单个eppendorf管内的扩增反应体系；来源于母血浆中胎儿游离RNA作为模板。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的多重扩增体系是杂交-连接-扩增体系，杂交-连接-扩增体系可以同时扩增至少两个染色体特异性SNP位点，优选五个SNP位点，包括rs8130833、rs7844、rs9015、rs13643、rs9305729进行五重复合杂交-连接-扩增。五重复合杂交-连接-扩增体系的扩增产物由两个或者两个以上的DNA扩增片段构成，扩增产物的量同各自位点的起始浓度成正比例。
根据本发明的一个优选实施方案，杂交-连接-扩增体系可以同时扩增两个或者两个以上的染色体特异性核酸位点，包括以上SNP位点但不限于SNP位点，也可以对其他核酸片段进行复合扩增。扩增产物由两个或者两个以上的核酸片段构成，产物的量同各自位点的起始浓度成正比例。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交-连接-扩增体系扩增反应的循环数是15-35循环。
根据本发明的一个优选实施方案，可以用荧光染料标记扩增引物。标记引物进行扩增后，可以用扩增产物的累计荧光值定量分析染色体特异性SNP位点扩增产物的基因剂量。
根据本发明的一个优选实施方案，可以根据SNP位点扩增产物等位基因的数目和等位基因扩增产物的相对浓度来分析所选染色体的数目是否存在异常。
根据本发明的一个优选实施方案，针对染色体遗传标记SNP位点进行多重复合杂交-连接-扩增。选用的SNP位点是存在于胚胎或者胎儿细胞的遗传物质，在人群中存在多态性，所扩增的产物片段在50-1000bp之间，优选在90-500bp之间。应用复合杂交-连接-扩增体系对SNP位点进行多重扩增，检测SNP位点等位基因数目的差别和基因剂量的差别，为染色体数目异常性疾病的分析提供依据。
根据本发明的一个优选实施方案，根据扩增产物片段大小来分析样本中SNP数目和剂量变化。任何可以分离核酸片段大小的方法例如过滤，高效液相色谱，电泳，亲和收集等方法均可用于本发明。根据本发明的一个优选实施方案，通过凝胶电泳的方法对扩增片段进行分离并定量，优选使用毛细管电泳法分离染色体特异性SNP位点并相对定量。
根据本发明的一个优选实施方案，可以至少用一个SNP位点rs8130833或rs7844或rs9015位点来分析21号染色体三体综合征，优选rs8130833、rs7844和rs9015位点两个或者两个以上进行联合检测。
根据本发明的一个优选实施方案，可以根据引物扩增产物的累计荧光值定量检测染色体特异性SNP位点扩增产物的相对量，并通过计算每个SNP位点扩增产物的数目和每个SNP位点扩增相对剂量来分析所选染色体的是否存在染色体数目异常。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的染色体数目异常是指人体21号染色体数目异常。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的21号染色体数目异常是指21号染色体三体和单体，选用21号染色体特异性的遗传标记位点，其中在21号染色体上的位点rs8130833、rs7844、rs9015、rs13643、rs9305729。
简单地说，本发明的试剂盒包括逆转录体系、杂交体系、连接体系、PCR反应体系；选择来源于母血浆的胎儿RNA作为模板；将胎儿RNA逆转录为cDNA；在相互配对的杂交探针中，至少有1对以上的杂交探针。探针由长短两条构成，将制备的长型探针和短型探针同目的基因序列杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接；长型探针有片段大小可变的中间序列，因此每对探针组可以扩增出特定片段大小的序列；所有被连接而成DNA序列都有共同的5’和3’术端，因此可以仅仅用一对引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列；而且PCR缓冲液和扩增反应需要的Taq酶必须能够进行扩增反应。
值得特别说明的是，本试剂盒采用一个五重的杂交-连接-扩增体系，可以同时包括21号染色体的五个SNP位点。通过体系优化，可以对正常样本中所选的五个位点进行均衡扩增，也可以对异常样本中可能存在的21-三体异常同时进行分析和筛查。为了确保本发明试剂盒的准确性，我们还应用21三体患者的DNA作为阳性参考品。借助这些额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本发明试剂盒的附加的质量控制标准。
附图说明
图1显示两个正常样本多重扩增产物的电泳图。图1A显示一个正常男性样本扩增电泳图。图1B显示一个正常女性样本扩增电泳图。
图2显示两个21-三体异常样本多重扩增产物的电泳图。其中图2A显示一个女性21-三体样本扩增电泳图。图2B显示一个男性21-三体样本扩增电泳图。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：检测试剂盒及其使用
(1)制备包括下列组成成分的试剂盒：逆转录酶系1管(100μl/管)、逆转录反应液1管(650μl/管)、杂交反应液1管(250μl/管)、连接反应液1管(1950μl/管)、连接酶1管(50μl/管)、PCR反应液1管(1950μl/管)、Taq酶1管(50μl/管)、21三体阳性标准品1管(25μl/管)、阴性对照1管(25μl/管)。
(2)标本采集、运送和保存：
1.标本采集：标本为母体血液。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
2.保存：可立即检测，4℃保存一周。
3.运输：标本运送应采用0℃冰壶。
(3)检测步骤和结果分析：
一、母血浆的收集和处理：收集的血样先用EDTA抗凝，4℃，1600g离心10min；仔细转移血浆到平底聚丙烯管中再次4℃，16000g离心10min。收集上清到新聚丙烯管中同TRIzol LS试剂混合。所有样本-80℃保存直到提取RNA。
二、RNA提取及纯化：RNA提取建议使用Invitrogen的TRIzol LS及Qiagen的RNeasy MicroKit提取试剂盒。具体步骤如下：1.6ml血浆混合2ml TRIzol LS(Invitrogen)和0.4mi氯仿，4℃12000g离心15min，上清转移到新的聚丙烯管中，用70％的乙醇溶液等体积混合上清溶液，混合后应用RNeasy minicolumn(Qiagen)按照说明书进行处理。总RNA溶解后用RNase-Free DNase Set(Qiagen)处理去除基因组DNA的污染。
三、五重的杂交-连接-扩增反应，设置阴阳性对照。
1、逆转录反应
组 分 反应体积
逆转录反应液 13μl
逆转录酶系 4μl
RNA样品 5μl(＜5μg)
反应体系总量 20μl
逆转录条件：50℃反应30分钟，94℃反应5分钟。
2、杂交反应
组 分 反应体积
杂交反应液 5μl
逆转录产物 5μl
反应体系总量 10μl
杂交条件：98℃反应5分钟，60℃杂交16小时(过夜杂交)。
3、连接反应
组 分 反应体积
连接反应液 39μl
连接酶 1μl
杂交产物 10μl
反应体系总量 50μl
连接条件：54℃反应15分钟，98℃反应5分钟。
4、PCR反应
组 分 反应体积
PCR反应液 39μl
Taq酶 1μl
连接产物 10μl
反应体系总量 50μl
PCR反应条件：95℃预变性15分钟，然后94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共26个循环；最后72℃10分钟。
四、扩增产物电泳
对于每一个分析，1μl PCR产物和13.5μl Hi-DiTM formamide、0.5μl GeneScan ROX-500Size standard混合。95℃加热变性混合物5分钟，放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。上样ABI310/ABI3100遗传分析仪，然后应用软件进行结果分析。结果图谱如图1A，图1B，图2A，图2B，所示。其中图1A，图1B为正常男性和正常女性的结果分析图谱。
实施例2：通过MHSA扩增21号染色体上的SNP位点检测21-三体综合征
选取2份母体血浆，其胎儿疑似21-三体综合征，应用实施例1的试剂盒按照上述标准程序进行RNA提取纯化。每个样本RNA使用DEPC水溶解，进行扩增反应并上样分析。最后的PCR体系同时扩增rs8130833，rs7844，rs9015，rs13643，rs9305729等五个位点，上样结果的分析图谱如图2A，图2B。如图所示，21号染色体上的两个位点rs8130833，rs7844，扩增分析位点的基因型，由于形成2∶1的峰(面积)或者1∶2的荧光峰(面积)，因此可判断为为21-三体综合征，本试剂盒可实现快速无创检测21-三体综合征。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒
<140>
<141>
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<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交的探针。
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gtgccacaatctagagggagaaagcctgtgtccactgtgga
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交的探针。
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交的探针。
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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gtgccacaatctagagggaga
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<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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gggttccctaagcaatcgttg
Claims (10)
1.一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒，试剂盒包括：(a)逆转录酶系及逆转录反应液、(b)杂交反应液、(c)耐热的连接酶和连接反应液、(d)可热启动的耐热DNA聚合酶和PCR反应体系、(e)质控品，其特征在于杂交反应液包括1.5M KCl和20mM Tris-Cl及探针混合物，其中使用的探针混合物的序列分别为，针对rs8130833位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAAAGCCTGTGTCCACTGTGGA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTAAGCAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCT-3’；
针对rs7844位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATATTGTCATCCGCTTGCTGTGCTGTGGGG-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAG-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCCAGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAT-3’；
针对rs9015位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATCACTGCGCCTACTATACGCAAAAGGGCCCCTGG-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAACTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAT-3’；
针对rs13643位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGACCCAGTTCTGTAAATAACTTGAATCCAGTTGTCTTGTATA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGGGTCATTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTG-3’；针对rs9305729位点的是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGATTTAAAATGGTTAAAATGGCTTTAAATGGTGACCAGCTTTGCATG-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTGGTACCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTG-3’。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系包括20mM Tris-Cl，20mM KCl，2mMMgCl2，荧光染料标记的上游、下游寡核苷酸引物，其中上游和下游寡核苷酸引物的序列分别是：
5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGA-3’、
5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTG-3’。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交反应液中探针混合物浓度范围0.01fM-100fM。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系中上游、下游引物浓度范围为0.05μM-10.0μM。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于每人份PCR反应体系中加入2单位耐热DNA聚合酶’。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于逆转录反应液包括50mM Tris-HCl，50mMKCl，4mM MgCl2，10mM DTT及20pM市售的随机引物，每人份逆转录反应液中加入100单位逆转录酶。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于连接反应液包括20mM Tris-HCl，24mMNaAC，15mM MgCl2，每人份连接反应液中加入1单位连接酶。
8.根据权利要求1的试剂盒，特征还在于试剂盒通过多重扩增体系一次扩增所说的多个SNP位点；扩增后应用电泳的方法，检测各位点不同的等位基因片段大小和数目，分析累计产物发出的荧光量来检测靶多核苷酸的存在和相对量。
9.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于多重扩增体系是杂交-连接-扩增体系，杂交-连接-扩增体系可以同时扩增至少两个染色体特异性SNP位点。
10.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交-连接-扩增体系扩增反应的循环数是15-35循环。
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