CN101601702A - 抗老化剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血管新生抑制剂以及抗老化剂,其特征在于,含有欧芹提取物。
Description
本申请是申请日为2003年6月18日,申请号为03814925.7,发明名称为“抗老化剂”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗老化剂、特别是抗老化皮肤外用剂,其特征在于,含有显示TSP-1诱导活性、且通过诱导血管内皮细胞死亡而抑制血管新生的特定药剂的血管新生抑制剂以及含有通过显示血管新生抑制活性而发挥抗老化作用、特别是抗光老化作用的特定药剂作为有效成分。
背景技术
近年来,对于皮肤老化的研究有了很大的进展。皮肤老化的原因虽然从宏观上看年龄的增加是重要的因素,但是除此之外,作为与皮肤老化有关的直接的因素也可以列举干燥、氧化、太阳光(紫外线)等的影响。作为皮肤老化的具体现象,已知有以透明质酸为主的粘多糖类的减少、胶原的交联反应、紫外线导致的细胞损伤等。
另外,进行了以抑制、改善皮肤伤害为原因、或者由于暴露在紫外线下导致的皮肤老化为原因的皮肤的皱纹、细纹、松弛等为目的的各种研究,明确了例如促进透明质酸的产生(特开2001-163794号公报)、抑制基质金属蛋白酶(MMP)的产生·活性(特表2000-503660号公报)、促进胶原的产生、抑制酯酶的活性(特开平11-335235号公报)是有效的。而且,作为这些研究的成果,发现透明质酸或氨基酸、各种多元醇、糖类、进而各种各样的植物提取物对抑制、改善皮肤老化是有效的。
该研究主要关注表皮或表皮细胞、谋求抑制、改善皱纹等,但与此不同的是,最近有报告显示在皮肤的血管系统中的内皮细胞也与皮肤的老化有关。
本发明的目的在于从皮肤血管系内皮细胞与皮肤老化的关系的观点出发找出新的对皮肤老化的预防或抑制有效的药剂。
发明内容
本发明者深入研究的结果发现,特定的生药、即、枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物和蚕丝提取物能抑制血管新生、结果能有效地预防或抑制老化。
因此,本发明提供一种血管新生抑制剂,其特征在于,含有选自枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物组成的组中的1种或多种的药剂。
更详细地说,本发明提供一种抗老化剂,其特征在于,含有选自枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物组成的组中的1种或多种的药剂。这种抗老化剂能防止或抑制皱纹的形成、特别是通过光老化的皱纹的形成,是非常有效的。
本发明进一步涉及抑制老化的方法,该方法包括在皮肤上涂布上述血管新生抑制剂或抗老化剂。
皮肤的血管系为了维持正常皮肤的结构和机能是必须的。除此之外,皮肤的血管系分别在控制毛发生长、镇静紫外线引起的皮肤损伤、年龄增加导致的皮肤老化、对于刺激和炎症的皮肤反应以及修复组织中扮演着重要的角色。血管在正常的成人皮肤内稳定的工作着,但是对于异常的刺激迅速的活化、进而进行血管扩张并伴随有从已有的血管形成新的毛细血管的血管新生反应。这些变化在前血管新生分子(血管新生促进因子)和抗血管新生分子(血管新生抑制因子)两者间存在平衡。而且,明确了正常皮肤中内在性的血管新生抑制因子比血管新生促进因子更优先地作用。
血管内皮生长因子(VEGF),虽然已知作为血管通透因子,但在最近的研究中表明,也是人皮肤内主要的血管新生促进因子。在正常的皮肤中,VEGF由角化细胞少量分泌、与真皮的微血管内皮细胞上的特异受体结合,由此确保内皮细胞的生存能力、从而维持上部的网状结构的血管。在炎症或创伤愈合时的肥厚表皮中VEGF非常高度地表达,正因为如此,可以导出由于血管没有表皮,因此用真皮进行血管增加和营养供应。
与VEGF相对照,作为正常皮肤中的血管新生抑制因子起主要作用的是细胞外基质蛋白质的血小板凝血酶敏感蛋白(TSP)系的两种,TSP-1和TSP-2。TSP通过基底层的含有角化细胞的多种皮肤细胞表达,堆积在真皮-表皮间的基底膜区域、作为防止表皮的血管新生的自然的抗血管新生屏障作用。另外,还判明在血管新生和血管的退化之间,TSP的表达被调节。
使用TSP-1、TSP-2等的血管新生抑制因子基因敲除模型、或者在皮肤中过量表达血管新生促进因子VEGF或血管新生抑制因子的转基因模型的体内研究显示,这些血管新生促进因子或血管新生抑制因子的水平调节对紫外线引起的损伤和皮肤的皱纹的程度、刺激性的皮肤反应、以及皮肤损伤的修复有显著的影响。
如果对小鼠长时间照射紫外线能形成显著的皱纹,但是令人震惊的是,此时皮下血管的显著生长可看到伴随着血管的扩大和分支的增大。另外,若对小鼠长时间照射紫外线,发现了血管内皮生长因子的表达也亢进。由此明确了,紫外线照射等的皮肤伤害引起皱纹的形成与血管内皮细胞的新生有关,换言之、明确了抑制血管内皮细胞的新生、并且诱导血管内皮细胞的细胞死亡,可以抑制皱纹的形成。
因此,利用基于诱导血管新生抑制因子TSP-1的抑制血管新生和基于诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的抑制血管新生这两者的机理,筛选作为抑制皮肤老化候补药剂的多种生药的结果,发现了存在几种具有诱导TSP-1、且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡活性的生药。这些生药中,枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物和蚕丝提取物显示血管新生抑制作用或抗老化作用、特别是抗光老化作用在现有的技术中是完全未知的,而且也没有暗示。
附图的简单说明
图1显示TSP-1诱导剂的筛选结果。
图2显示编程性细胞死亡诱导剂的筛选结果。
具体实施方案
诱导血管新生抑制因子TSP-1的药剂的筛选在下述的实施例、实验1中有详细的记载,使各种候补药剂与导入了DNA构建体的HaCat细胞株作用,该DNA构建体为在TSP-1启动子的下游结合了荧光素酶作为报告基因的DNA构建体,进行荧光素酶活性的测定,将该荧光酶活性作为TSP-1启动子活性,来选定具有TSP-1启动子活性的药剂作为有效药剂。
TSP-1诱导剂未必诱导血管内皮细胞死亡。例如,TSP-1诱导物质的阳性对照成纤维细胞生长因子(bFGF)或组织纤溶酶原激活物(TPA)在血管内皮细胞内不诱导细胞死亡。因此,为了鉴定不仅可进行TSP-1诱导,而且还发挥TSP-1机能(血管内皮细胞的细胞死亡)的药剂,实施对诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂的筛选作为二次筛选。
诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂的筛选用对细胞测定编程性细胞死亡活性的常用的方法、具体的在下述的实施例、实验2中进行了详细地记载,使候补药剂与适当的细胞培养培养基中的血管内皮细胞作用、测定该细胞的细胞死亡、选择能增强该细胞的细胞死亡的药剂作为有效药剂。
结果发现,以下的药剂可以诱导TSP-1、而且可诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡并抑制血管新生。
枣提取物:枣的果实提取液。作为主成分,除了含有皂苷或果糖等的糖类、有机酸类以外,还含有作为核酸相关物质的称为环AMP的物质。该环AMP具有皮肤组织蛋白质的新生(再生)或皮脂分泌调节等的作用。
朝鲜人参提取物:别名高丽参的提取液。作为主成分,含有人参皂苷、人参醇、β-榄香烯等。人参皂苷具有蛋白质、DNA合成促进作用。
白花春黄菊提取物:原产于欧洲的1年草的提取液。作为主成分,含有萜烯醇、母菊薁、壬酸等。干燥的头状花具有抗炎、促进食欲的作用。
小球藻提取物:从在淡水中生存的单细胞植物得到的提取液。作为主成分,大多含有氨基酸、维生素。具有细胞分裂作用、抗肿瘤作用等。
芹菜提取物:原产于南欧的1年草的提取液。作为主成分,含有称为芹菜甙的黄酮配糖体、甘露糖醇、香柠檬脑、肌醇等。芹菜提取物具有降压作用。
欧芹提取物:原产于欧洲的多年草的提取液。作为主成分,含有芹菜脑、肉豆蔻醚等。该芹菜脑具有利尿作用。
薏苡仁提取物:薏苡的种子提取液。作为主成分,除了谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸等氨基酸以外,还含有薏苡仁酯。该薏苡仁酯作为抗肿瘤成分起作用。
蚕丝提取物:从家蚕得到的丝纤维的提取液。作为主成分,含有大约20种的氨基酸。作为功能,具有细胞的再生、新陈代谢的促进等作用。
上述提取物可以通过常规方法得到,例如将成为各提取物起源的植物和提取溶剂一起浸渍或加热回流后、过滤、浓缩得到。作为提取溶剂,只要是通常提取中使用的溶剂则可以任意的使用,例如可以单独或组合使用水,甲醇、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等的醇类,含水醇类,氯仿,二氯乙烷,四氯化碳,丙酮,乙酸乙酯,己烷等的有机溶剂等。可以直接使用用上述溶剂提取得到的提取物、或者将浓缩的提取物用吸附法,例如使用离子交换树脂除去杂质的提取物,或者用多孔聚合物(例如アンバ一ライトXAD-2)的柱子吸附后、用甲醇或乙醇洗脱,浓缩后得到的提取物。另外,也可以使用通过分配法、例如用水/乙酸乙酯提取的提取物。
本发明涉及的药剂对于预防、抑制以血管内皮细胞的新生、成长、增殖为原因的老化非常有效。以血管内皮细胞的新生、成长、增殖为原因的老化意味着皮肤伤害或者暴露在紫外线下引起的光老化等。本发明涉及的药剂对于防止、抑制光老化特别有效。
光老化一般意味着,作为反复被日光照射的结果可看到皮肤外观以及机能的变化。作为日光构成要素的紫外线(UV)、特别是中波UV(称为UVB、波长290~320nm)主要引起光老化。引起光老化的必要的UVB的照射量现在还不知道。但是,对于引起红斑或晒黑水平的UVB反复的照射,通常与光老化相关。临床上,光老化可特定为皮肤粗糙、形成皱纹、色斑、土色化、形成松弛、毛细管扩张病的发病、痣的产生、紫癜的产生、容易受伤、萎缩、纤维变性的去除色素区域的产生、前恶性肿瘤以及恶性肿瘤的发病等。光老化一般发生在脸、耳、头、颈和手等习惯上暴露在日光下的皮肤。
本发明的血管新生抑制剂或抑制抗老化剂中的抑制血管新生的药剂的配合量,在血管新生抑制剂总量中、作为干燥物为0.0001~20.0质量%、优选为0.0001~10.0质量%。
另外,在本发明的血管新生抑制剂或抗老化剂中,除了上述必须成分以外,根据需要也可以适当配合通常在化妆品或药品等的皮肤外用剂中使用的成分、例如、美白剂、保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色素、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
此外,也可以适当地配合依地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等的金属阻断剂,咖啡因、鞣酸、异搏定、凝血酸及其衍生物,甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热水提取物、各种生药、醋酸生育酚、甘草皂苷及其衍生物或其盐等的药剂,维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的美白剂,葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类,视黄酸、视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇棕榈酸酯等的维生素A类等。
本发明的血管新生抑制剂或抗老化剂只要是例如软膏、霜剂、乳液、洗剂、面膜、洗浴用剂等现有的皮肤外用剂的话即可,对剂型没有特别限制。
实施例
以下,通过实施例进一步详细地说明本发明。另外,本发明并不仅限于以下的实施例。配合量为质量%。
实验1.(一次筛选)
TSP-1诱导剂的筛选
使用在HaCat细胞株中稳定地导入了再TSP-1启动子的下游结合了荧光素酶编码基因作为报告基因的DNA构建体的细胞株。将上述细胞株悬浮在DMEM/F12(Invitrogen公司)(含有10%的FBS以及1mg/mL的潮霉素B(Invitrogen公司))培养基中,在24孔板上每孔播种4×104个细胞。大约30小时后,将培养基换为无血清DMEM/F12培养基,在5%CO2、37℃下培养25小时。然后,将作为候补药剂的各种植物提取物干燥物溶解于DMSO(和光纯药工业)中达到2质量%的物质以培养液的1/1000、1/10000或者1/100000的容量加入,培养24小时。除去培养上清液后,用PBS洗涤细胞,使用荧光素酶检测系统(Promega公司)进行荧光素酶的活性测定。以其荧光素酶活性作为TSP-1启动子活性。结果表明,实验的各种植物提取物中,包括枣提取物(1)、朝鲜人参提取物(2)、白花春黄菊提取物(3)、小球藻提取物(4)、芹菜提取物(5)、欧芹提取物(6)、薏苡仁提取物(7)以及蚕丝提取物(8)(全部来自一丸フアルコス公司)等任几个具有有效的TSP-1启动子活性。使用这些生药的实验结果如图1所示。对照是代替候补药剂使DMSO作用的实验。
如上所述,TSP-1诱导剂不一定诱导血管内皮细胞死亡。因此,为了筛选不仅发挥TSP-1诱导功能、还发挥TSP-1机能(血管内皮细胞的细胞死亡)的药剂,我们进一步实施了2次筛选。
实验2(二次筛选)
编程性细胞死亡诱导剂的筛选
在细胞培养玻片(chamber slide)上培养至大约70%融合的血管内皮细胞HMVEC(三光纯药)中添加在一次筛选中添加药剂(1/1000)培养24小时后的培养上清液后,培养24小时,研究血管内皮细胞的细胞死亡诱导。细胞死亡的检测使用ApopTag Plus Fluorescein In Situ ApoptosisDetection Kit,细胞死亡诱导计算是分别计算引起各种药剂添加组和对照组的细胞死亡的细胞比率来进行的。计算方法是从各种药剂添加组和对照组的玻片用数码相机得到3处图像,在各个画像中计算对于核数的细胞死亡信号数、作为比率(%)。
结果表明,实验的各种植物提取物中,枣提取物(1)、朝鲜人参提取物(2)、白花春黄菊提取物(3)、小球藻提取物(4)、芹菜提取物(5)、欧芹提取物(6)、薏苡仁提取物(7)以及蚕丝提取物(8)能有效地诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡。使用这些生药的实验结果如图2所示。作为比较例,也显示了只用培养基(图中,右棒:1/10000;左棒:1/1000)、DMSO(图中,右棒:1/10000;左棒图:1/1000)或者TSP-1(1/1000)(Haematologic Technologies,Inc.)代替候补药剂作用的实验结果。
以上两种筛选的结果表明,枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物在诱导TSP-1、且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡中是有效的。
产业上的可利用性
枣提取物、朝鲜人参提取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物等的诱导TSP-1、而且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂,在抑制老化上是有效的。
Claims (4)
1.一种血管新生抑制剂,其特征在于,含有欧芹提取物(Petroselinumsativum Hoffman)。
2.一种抗老化剂,其特征在于,含有欧芹提取物。
3.如权利要求2所述的抗老化剂,防止或抑制皱纹的形成。
4.一种非治疗目的的用于抑制由于暴露在紫外线下导致的皮肤老化的方法,包括在皮肤上涂布权利要求2所述的抗老化剂。
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