KR20140139448A - 진귤 과피 효소 처리물 또는 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진귤 과피 효소 처리물 또는 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 피부 조직 재성 활성, 피부 주름 개선 활성 및 피부 미백 활성을 가지는 진귤 과피 효소 처리물 또는 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물을 개시한다.

Description

진귤 과피 효소 처리물 또는 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물{Cosmetic Composition Using Enzyme Treatments of Citrus sunki Rind and Those Extracts}

본 발명은 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka) 과피(이하 "진피") 효소 처리물 또는 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물에 관한 것이다.

진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)은 제주도에 분포하고 있는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과에 속하는 귤나무이다. 열매의 향과 맛이 독특하여 지난날 세금으로 바치던 지방 특산물 중에서도 상품에 속했다. 제주도에서 감귤을 재배하기 시작한 것이 언제인지 단정할 수는 없으나, 감귤에 관한 문헌상의 기록으로 1052년(고려 문종 6)에 세공귤자를 100포로 정한다고 하였으니, 이미 11세기부터 제주도에서 감귤을 진상하고 있었다. 그렇다면 그 이전부터 감귤이 재배되었을 것이므로 제주 감귤의 재배 역사는 매우 오래되었다고 볼 수 있다. 전통적으로는 진귤(陳橘-제주감귤농협자료, 山橘-조선왕조실록, 산물-제주방언, 酸橘-중국, Sunki-일본어발음, Citrus sunki Hort. ex Tanaka)의 묵은 과피가 약용으로 사용되어 왔다. 조선시대 숙종 조 탐라순력도(耽羅巡歷圖)의 감귤봉진(柑橘封進)에는 한약재로 따로 진상한 귤껍질이 적혀 있는데, 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)의 껍질를 진피(陳皮)로 기록하고 있다.

한편 천연물의 생리 활성을 증진시키기 위하여 사용되고 있는 생물전환(bioconversion) 기술은 대표적으로 효소 처리와 유용 미생물을 이용한 발효를 들 수 있다. 이들 생물전환 기술은 천연물 내의 특정 화합물의 분자 구조를 바꾸어 특정 생리활성이 특히 우수한 화합물을 생성하기 위한 것이다.

본 발명은 진피 효소 처리물 등이 피부 관련 여러 생리활성에 있어서 우수한 활성을 나타냄을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 진피 효소 처리물이나 그것의 추출물을 이용한 화장품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 피부 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 진피에 당질 분해 효소, 단백질 분해효소, 섬유질 분해효소 등을 처리하고 그 처리물을 에탄올 또는 물로 추출하여 얻은 추출물이 섬유아세포(Fibroblast)의 증식을 촉진하고 PPAR-α 활성을 촉진하며, 세균 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주에 처리될 때 염증성 인자인 NO 생성을 억제하는 활성을 가질 뿐만 아니라 섬유아세포에서 제1형(타입 Ⅰ) 콜라겐의 생성 촉진 활성을 가짐을 확인하였다.

피부 부피의 대부분을 차지하는 피부 진피 내 결체조직의 주성분은 제1형 콜라겐으로 알려져 있고 이 제1형 콜라겐은 섬유아세포에 의해서 생성되는 것으로 알려져 있으며(J. Clin. Immunol. 2005, 25, 592), 각질형성세포에 존재하는 상기 PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)-α은 그 리간드(ligand)와 결합하여 활성화되면 각질형성세포의 분화를 촉진시켜 손상된 피부 장벽을 재구성하는 효과가 있다고 알려져 있다(J. Invest. Dermatol., 110, pp368-375, 1998; J. Invest. Dermatol., 115, pp353-360, 2000). 또한 LPS(lipopolysaccharide) 등의 세균의 내독소에 의해 그 발현이 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 생성되는 NO는 세포독성, 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

본 발명의 피부 조직 재생용 조성물은 전술한 바에 기초하여 제공되는 것으로, 진피의 효소 처리물 또는 그 효소 처리물의 추출물을 유효성분을 포함함을 특징으로 한다.

*본 명세서에서, "피부 조직 재생용"은 노화, 염증, 자외선, 외부의 물리적 자극 등에 의해 발생한 피부 조직 손상의 회복을 의미하며, 구체적으로 피부 진피 내 결체 조직 손실의 회복 또는 피부 상처(또는 창상) 치유를 의미한다.

또 본 명세서에서, "효소"는 다당류, 유당, 배당체 등의 당질 분해효소, 단백질 분해효소, 또는 이들의 혼합된 효소를 의미하며, 구체적으로 α-아밀라아제(α-amylase), β-아밀라아제(β-amylase), 글루코아밀라아제(gluco-amylase), 프로테아제(protease), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), α-글로코시다아제(α-glucosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루카나아제(β-glucanase) 등을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 추출물은 추출 대상인 효소 처리물을 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 물, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 분획된 분획물을 포함하는 의미로서 이해된다. 여기서 추출 방법은 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 방법과 추출 대상을 추출 용매로 증류시키는 방법을 모두 포함한다. 또한 침지를 통한 추출 방법에는 냉침, 가온, 초음파, 환류 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 그럼에도 상기 "추출물"은 바람직하게는 그 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출(냉침, 열수 추출 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다. 또 본 명세서의 "추출물"의 의미에는 여과 등을 통하여 정제된 형태의 추출물, 추출 용매가 일부 제거된 액상의 농축된 추출물 그리고 추출 용매가 완전히 제거된 분말상의 추출물이 포함된다.

또 본 명세서에서, 달리 정의하지 않는 한 "%"는 부피 백분율에 의한 농도(v/v) 표현으로서, 당업계에 알려진 바와 같이 일정 부피의 용액 중에 녹아 있는 일정 부피의 용질을 의미한다. 예컨대 30%(v/v)는 용액 100㎖에 용질 30㎖가 용해되어 있다는 것이 된다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 피부 조직 재생용 조성물은 그것의 피부 조직 재생 효과가 섬유아세포 증식 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 진피의 β-갈락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물) 또는 진피의 β-글루카나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)인 것이 바람직하다. 그것은 아래의 [표 5]가 보여주는 바와 같이, 상기 추출물의 섬유아세포 증식 활성이 여타 추출물의 섬유아세포 증식 활성보다 높기 때문이다.

또 본 발명의 피부 조직 재생용 조성물은 그것의 피부 조직 재생 효과가 PPAR-α의 활성화 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 아래의 [표 7]에서 확인되는 바와 같이 진피의 β-아밀라아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 진피의 프로테아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 진피의 β-갈락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)인 것이 바람직하다. 특히 아래의 [표 14]는 이들 추출물 모두를 혼합하여 사용할 경우 PPAR-α의 활성화도가 더 상승함을 보여준다는 점에서, 더 바람직하게는 이들 효소 처리물 및/또는 추출물 모두가 본 발명의 피부 조직 재생용 조성물의 유효성분으로 포함되는 경우이다.

또 본 발명의 피부 조직 재생용 조성물은 그것의 피부 조직 재생 효과가 항염증 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 아래의 [표 7]에서 확인되는 바와 같이 진피의 β-아밀라아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올 추출물), 진피의 프로테아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올 추출물), 또는 진피의 β-갈락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올 추출물)인 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 조직 재생용 조성물은 그것의 피부 조직 재생 효과가 제1형 콜라겐 생합성 촉진 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 아래의 [표 10]에서 확인되는 바와 같이 진피의 폴리칼락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 진피의 α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 및 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 아래의 [표 17]에서 확인되는 바와 같이, 그 유효성분이 (i) 진피의 폴리칼락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)과 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물이나 (ii) 진피의 α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)과 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물인 경우이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

아래의 실시예 및 실험예는 진피의 효소 처리 추출물이 섬유아세포에서 제1형(타입 Ⅰ) 콜라겐의 생합성을 촉진할 뿐만 아니라 자외선 조사에 의해 그 발현이 유도된 MMP(matrixmetalloproteinase, MMP)-1의 발현을 억제하고 항산화 활성을 가짐을 보여준다.

상기 MMP-1은 콜라겐을 기질로 하는 콜라게나제로서 자외선, 산화적 스트레스 등에 의하여 그 발현이 활성화될 경우 피부 탄력 유지력과 수분 보유력을 가진 콜라겐이 분해되어 피부 주름이 발생하고 피부가 건조하고 거칠어지게 되는 것으로 알려져 있으며(J Ginseng Res 31(2):86-92, 2007; Toxicol Appl Pharmacol 195: 298-308, 2004), 산화적 스트레스는 세포막, 단백질, DNA, 효소 등을 손상시키는 등 세포와 조직에 해로운 반응을 일으켜 암 및 동맥경화 등의 질병을 유발하고 MMP-1의 발현을 유도하여 콜라겐 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Age 16: 55-58, 1993; Biol. Pharm. Bull. 30: 719-723, 2007).

본 발명의 피부 주름 개선용 조성물은 전술한 바에 기초하여 제공되는 것으로 진피의 효소 처리물 또는 그 효소 처리물의 추출물을 유효성분을 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "주름 개선"은 주름 발생 예방 또는 주름 제거의 의미이다.

본 발명의 피부 주름 개선용 조성물은 그것의 피부 주름 개선 효과가 제1형 콜라겐 생합성 촉진 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 아래의 [표 10]에서 확인되는 바와 같이 진피의 폴리칼락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 진피의 α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 및 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 아래의 [표 17]에서 확인되는 바와 같이, 그 유효성분이 (i) 진피의 폴리칼락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)과 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물이나 (ii) 진피의 α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)과 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물인 경우이다.

또 본 발명의 피부 주름 개선용 조성물이 그것의 피부 주름 개선 효과가 MMP-1 발현 억제 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 특히 글루코아밀라아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 또는 β-글루카나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)이 바람직하며, 아래의 [표 16]이 보여주듯이 (i) 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물) 및 β-글루카나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물이나, (ii) 글루코아밀라아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물) 및 β-글루카나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물이 바람직하다.

또 본 발명의 피부 주름 개선용 조성물이 그것의 피부 주름 개선 효과가 항산화 기전에 의한 것이라면, 그 유효성분은 아래의 [표 11]이 보여주는 바와 같이 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물) 또는 β-글루카나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)이 바람직하다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 피부 미백용 조성물(또는 피부 과색소 침착증 개선용 조성물)에 관한 것이다.

아래의 실시예 및 실험예는 진피의 효소 처리물이나 그 추출물이 α-MSH로 자극된 흑색종 세포에 처리될 때 멜라닌 생성 억제 활성을 가짐을 보여준다.

본 명세서에서, "피부 과색소 침작증 개선"이란 기미, 주근깨, 검버섯 등 멜라닌의 비정상적인 피부 침작에 의한 질환인 피부 과색소 침착증의 예방, 치료 또는 증상의 경감을 의미한다.

바람직한 관점에서 보면, 본 발명의 피부 미백용 조성물(또는 피부 과색소 침착증 개선용 조성물)은 아래의 [표 12]가 보여주듯이 그 유효성분은 진피의 프로테아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물), 또는 진피의 β-갈락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)인 것이 바람직하며, 특히 아래의 [표 20]이 보여주듯이 α-글루코시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물) 및 진피의 β-갈락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물(특히 에탄올, 물 또는 이들의 혼합 용매 추출물)의 혼합물인 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 조직 재생용 조성물, 피부 주름 개선용 조성물 또는 피부 미백용 조성물(이하 통칭하여 "본 발명의 조성물")은 그 유효성분을 피부 조직 재생 활성, 피부 주름 개선 활성, 피부 미백 활성 등을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 피부 조직 재생 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 미백 효과 등을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 화장품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장품의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수 연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 기능성을 향상시키기 위하여 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 분말 또는 추출물, 지치 분말 또는 추출물, 노근 분말 또는 추출물, 계피 분말 또는 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 진피 효소 처리물이나 그것의 추출물의 피부 조직 재생 활성, 피부 주름 개선 활성, 피부 미백 활성을 갖는 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 화장품, 약품, 식품 등으로 제품화될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 밀 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ] 진피 효소 처리 추출물의 제조

[실시예 1] 진피 효소 처리 파우더 제조

완전 건조된 진피 50g을 10mesh로 분쇄하여 1^stD.W 950g을 가하고 효소를 처리하였다. 온도 및 pH를 아래의 [표 1]의 조건으로 설정하고 각각 20시간씩 진탕 배양기(LSB.045S, KOR)를 이용하여 효소 처리하였다. 효소 처리액을 -80℃ 초저온냉동고(ilshinbiobase 905, KOR)에서 24시간 동결한 뒤 동결건조기(ilshinbiobase PVTFD20R, KOR)를 이용하여 48시간 동결건조 하여 10종의 효소 처리 파우더를 제조하였다.

결과를 아래의 [표 1]에 나타내었다.

진피 효소 처리 파우더 제조 조건

시료번호	진귤 과피(g)	1stD.W(g)	효소(처리량)	온도, pH, 시간
1	50	950	α-amylase 0.3%(3g)	70, pH7.0, 20hr
2	50	950	β-amylase 0.5%(5g)	50, pH5.0, 20hr
3	50	950	Gluco-amylase 0.3%(3g)	70, pH4.5, 20hr
4	50	950	Protease 0.5%(5g)	45, pH6.0, 20hr
5	50	950	Cellulase 1%(10g)	50, pH5.0, 20hr
6	50	950	Pectinase 0.03%(0.3g)	20, pH5.5, 20hr
7	50	950	Polygalacturonase 0.5%(5g)	20, pH5.5, 20hr
8	50	950	α-glucosidase 0.5%(5g)	30, pH7.0, 20hr
9	50	950	β-galactosidase 0.5%(5g)	30, pH7.0, 20hr
10	50	950	β-glucanase 0.5%(5g)	30, pH7.0, 20hr

[실시예 2] 진피 효소 처리물의 에탄올(주정) 추출물 제조

위 [실시예 1]의 효소 처리 파우더 10종 각각을 70% 에탄올(주정)을 부피 비로 20배 가한 후 상온에서 20시간 동안 진탕배양기를 이용하여 교반 하면서 추출하였다. Hyundai micro NO.100(3㎛) filter paper를 이용하여 여과하고 감압 농축기를 이용하여 여액 중의 용매를 증류 제거하고 동결건조하여 고형분을 얻었다.

추출 조건 및 추출량을 아래 [표 2]에 나타내었다.

추출 조건 및 추출량

시료번호	시료량(g)	70% 에탄올(주정) 사용량	추출량(g)
1-1	18.9	378ml	7.8
2-1	18.1	362ml	5.5
3-1	18	360ml	4.8
4-1	18	360ml	3.4
5-1	18	360ml	5.8
6-1	16	320ml	7.6
7-1	16	320ml	9.2
8-1	19.8	396ml	6
9-1	20	400ml	9.1
10-1	21.7	434ml	8.7

[실시예 3] 진피 효소 처리물의 열수 추출물 제조

위 [실시예 1]의 효소 처리 파우더 10종 각각을 1^stD.W를 부피 비로 20배 가한 후 60℃에서 20시간 동안 교반하면서 추출하였다. Hyundai micro NO.20(5um) filter paper를 이용하여 여과하고 여액을 동결건조하여 고형분을 얻었다.

추출 조건과 추출량을 아래의 [표 3]에 나타내었다.

추출 조건과 추출량

시료번호	시료량(g)	60℃ 1stD.W사용량	추출량(g)
1-2	19	380ml	6.8
2-2	21	420ml	9
3-2	21.3	426ml	7.6
4-2	22	440ml	8.3
5-2	23.5	470ml	11
6-2	18.9	378ml	11.2
7-2	20.5	410ml	14.5
8-2	20.05	401ml	8.2
9-2	20.7	414ml	6.6
10-2	20.65	413ml	9.3

[ 시험예 ] 피부 관련 활성 실험

[시험예 1] Fibroblast 세포주를 이용한 피부 재생 효과 평가

상기 실시예의 진피 효소 처리 추출물의 사용에 따른 피부 재생 효과 정도를 하기와 같은 방법으로 평가하였다.

먼저 fibroblast 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Welgen)가 함유된 FBM(Fibroblast Basal Medium)을 사용하여 96 well plate에 1 X 10³cell/well(최종 부피 100 l)로 넣고 37 ℃, 5% CO₂ incubator(MCO - 20AIC,Sanyo)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 배지를 FBS가 제거된 FBM 배지로 교체하여 기아상태로 배양하였다. 이때, 비교를 위하여 대조군은 10% FBS가 함유된 배지를 사용하여 배양하였다. 비교 대조군은 10% FBS가 함유된 FBM 배지에서 배양한 세포와 FBS가 함유되지 않은 배지에서 배양한 세포 두 개로 하였다. 배양 후, 실시예의 각 시료를 농도별로 처리하고 48시간 배양하였다. 48시간 후 EZ-Cytox kit(두젠 생명공학연구소)를 이용하여 세포의 증식 정도를 확인하였다.

결과는 무처리군(시료와 FBS가 함유되지 않은 배지 처리군) 대비 백분율로 아래의 [표 4]에 나타내었다.

Fibroblast 세포주의 증식 정도

시료	처리 농도		시료	처리 농도
	10㎍/㎖	100㎍/㎖		10㎍/㎖	10㎍/㎖
10% FBS	155		배지(무처리군)	100
1-1	105	106	1-2	102	103
2-1	106	104	2-2	102	101
3-1	100	101	3-2	98	103
4-1	98	109	4-2	105	105
5-1	105	106	5-2	103	105
6-1	112	131	6-2	109	127
7-1	105	104	7-2	104	104
8-1	124	137	8-2	114	129
9-1	106	110	9-2	104	112
10-1	107	128	10-2	115	131

상기 [표 4]의 결과를 보면, 실시예의 진피 효소 처리 추출물 중 Pectinase 효소 처리물(시료 번호 6-1 & 6-2), α-glucosidase 효소 처리물(시료 번호 8-1 & 8-2), β -glucanase 효소 처리물(시료 번호 10-1 & 10-2)의 경우 그 추출 용매가 에탄올인지 물인지를 불문하고 세포의 증식 정도가 높음을 확인할 수 있다.

[시험예 2] PPAR -α 활성화 실험

아프리카 원숭이 신장 상피 세포주인 CV-1세포(ATCC CCL 70)를 10% 우태아 혈청과 100unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Medium)에 넣고 37℃, 5% CO2에서 계대배양하였고, 페놀 레드(phenol red)의 에스트로겐에 의한 효과를 제거하기 위해 무-페놀 레드 배지를 사용하였다.

플라스미드는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모터(universal promoter) 뒤에 PPAR-α 유전자를 지닌 플라스미드, 리간드 결합형의 PPARs가 결합하여 활성화되는 PPARs 반응 요소((PPARs Response Element, "PPRE")를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로서 역할을 하는 반디불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 지닌 것, 참조(reference)로 사용될 유니버설 프로모터에 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드를 사용하였다.

CV-1 세포를 9x10⁴cells/cm²의 농도로 24웰형 플레이트에 분주한 후 24시간 배양하고 상기 세 종류의 플라스미드 유전자를 일시적 주입법(transient transfection)으로 트랜스펙션시켰다. 그 후 24시간 배양하고 1×PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 상기 실시예의 각 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 다음 1×PBS로 세척하고, 1×PLB(Passive Lysis Buffer)로 세포를 파괴하고 세포 용출액을 마이크로 튜브로 옮긴 다음 12,000rpm으로 3분간 원심분리하여 세포 잔여물을 분리하고 순수한 세포 용출액을 얻었다. 세포 용출액에 루시퍼라제 기질(Luciferase substrate, Promega)을 처리한 후 Dual-Luciferase Reporter Assay System kit를 사용하여 시료 처리군와 참조의 루시퍼라제 활성을 측정하였으며, 시료 처리군의 PPAR-α 활성도는 시료 처리군의 트랜스펙션 효율을 나타내는 참조의 루시퍼라제 활성도를 통하여 보정하였다.

본 실험에서 양성 대조군은 PPAR-α의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643을 사용하였고, 음성 대조군은 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올 처리군과 무처리군으로 구분하였다.

결과를 [표 5]에 나타내었다.

PPAR-α의 활성화도(루시페라제의 활성)

처리 시료	처리 농도		처리 시료	처리 농도
	10㎍/㎖	100㎍/㎖		10㎍/㎖	100㎍/㎖
1-1	0.21	0.24	1-2	0.22	0.23
2-1	0.43	0.71	2-2	0.27	0.34
3-1	0.22	0.21	3-2	0.23	0.20
4-1	0.38	0.68	4-2	0.29	0.59
5-1	0.21	0.22	5-2	0.18	0.20
6-1	0.45	0.72	6-2	0.23	0.38
7-1	0.17	0.26	7-2	0.22	0.24
8-1	0.21	0.21	8-2	0.20	0.21
9-1	0.42	0.79	9-2	0.31	0.38
10-1	0.20	0.20	10-2	0.19	0.20
에탄올	0.2
배지(무처리군)	0.2
Wy-14,643 0.5uM	0.45
Wy-14,643 1uM	1.25

상기 [표 5]을 참조하여 보면, 실시예의 진피 효소 처리 추출물 중 β-amylase 효소 처리물(시료 번호 2-1 & 2-2), protease 효소 처리물(시료 번호 4-1 & 4-2), pectinase 효소 처리물(시료 번호 6-1 & 6-2), β-galactosidase 효소 처리물(시료 번호 9-1 & 9-2)이 높은 활성화도를 보임을 확인할 수 있었으며, 에탄올 추출물이 물 추출물에 비하여 높은 PPAR-α의 활성화도를 보임을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 산화질소( nitric oxide ) 생성 억제 활성 실험( NO assay )

상기 [시험예 2]의 PPAR-α 활성 촉진 실험에서 효능이 높은 시료를 대상으로 항염 활성 실험을 진행하였다.

본 실험에 사용된 쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포(한국세포주은행)는 10% FBS(Gibco/BRL, USA)를 첨가한 DMEM 배지(Gibco/BRL, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 배양하였다. 상기 세포가 배양 접시의 약 80% 정도가 되면 PBS(pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 세척하고, 배지를 3ml 정도 넣고 scraper로 긁어서 계대 배양하였다.

RAW 264.7 세포를 12well plate에 1 X 10⁶cell/well이 되도록 1ml씩 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 LPS(lipopolysaccharide, SIGMA, USA)가 100ng/ml로 첨가된 배지로 교체하고 1시간 배양한 후 실시예의 각 시료들을 100ug/ml로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포 배양액을 각 well에서 50ul씩 회수하여 새로운 96well plate에 옮기고 50ul의 1% sulfanilamide(in 5% H₃PO₄,SIGMA,USA)를 넣고 암실에서 10분간 반응시킨 후 50ul의 0.1% naphtyl-ethylendiamine dihydrochloride(in H₂O,SIGMA,USA)를 첨가하여 다시 암실에서 10분간 반응시켜 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아무것도 넣지 않은 배양액을 대조군(무처리군)으로 사용하였다.

NO의 농도는 NaNO₂를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 결과를 [표 6]에 나타내었다.

NO 생성량

Sample(100ug/ml)	대조군	LPS	2-1	4-1	6-1	9-1
LPS(100ng/ml)	-	+	+	+	+	+
Nitric oxide(uM)	0	55.7	39.8	32.5	34.7	40.2

[표 6]을 참조하여 보면, 진피 효소 처리 추출물은 LPS를 처리한 군에 비하여 NO 생성 억제 효과가 매우 높게 나타났다. 이러한 결과는 β-amylase 효소 처리물(시료 번호 2-1), protease 효소 처리물(시료 번호 4-1), pectinase 효소 처리물(시료 번호 6-1), β-galactosidase 효소 처리물(시료 번호 9-1)의 에탄올 추출물이 항염 활성을 가짐을 보여준다고 할 수 있다.

[시험예 4] MMP -1 분석

정상 표피의 지방층을 제거하고 잘게 잘라 콜라게나제(collagenase)로 표피와 진피를 분리한 후, 표피와 진피조직을 각각 0.25% 트립신(trypsin) 용액에 넣고 37℃, 5% CO₂배양기에서 10분간 처리하였다. 이후 보텍스(vortex)를 시행하여 각질형성세포와 섬유아세포를 각각 유리시켰다. 유리된 세포를 모아 세척한 후 각질형성세포는 KGM(keratinocyte growth medium, Clonetics, USA)에 1×10⁴cells/cm²농도로 배양하였으며, 섬유아세포는 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대 배양한 세포를 실험에 이용하였다.

진피 효소 처리 추출물의 피부 기질의 분해에 관련된 자외선에 의한 MMP-1의 생합성을 감소시켜 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여, MMP-1 분석을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

세포의 MMP-1 양을 측정하기 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 하루 동안 기아(starvation)상태로 하였다. 이후 PBS로 2회 세척한 다음 PBS를 100㎕씩 넣어준 상태에서 플레이트(plate)의 뚜껑을 열고 자외선 A(UVA 필터가 장치된 Dermlight cube 401, UVAtec, USA)를 15J/cm²로 조사하였다. 조사 직후 다시 PBS로 1회 세척하였다. 이후 상기 각 실시예의 시료가 농도별로 포함되고 우태아 혈청은 포함되지 아니한 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배지 중에 유리된 MMP-1의 양을 MMP-1 인간 ELISA 시스템(human ELISA system)(RPN2610, Amersham Pharmacia Biothch, UK)을 이용하여 측정하였고, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정 하였다. 이때 자외선 A를 조사하지 않고 시료도 처리하지 않은 군을 음성 대조군으로 하였으며, 자외선 A를 조사하고 시료를 처리하지 않은 군을 UVA 처리군으로 하였다.

결과를 음성 대조군 대비 백분율로 아래의 [표 7]에 나타내었다.

MMP-1 발현량(%)

시료	처리 농도			처리 농도
	10ug/ml	100ug/ml		10ug/ml	100ug/ml
1-1	134	123	1-2	136	129
2-1	130	124	2-2	132	126
3-1	97	73	3-2	106	84
4-1	137	136	4-2	129	123
5-1	133	127	5-2	134	136
6-1	128	109	6-2	130	117
7-1	85	68	7-2	90	77
8-1	101	71	8-2	106	78
9-1	124	107	9-2	131	111
10-1	92	65	10-2	89	74
음성 대조군	100	100	-	-	-
대조군(UVA 처리)	135	137	-	-	-

상기 [표 7]의 결과는 실시예의 진피 효소 처리 추출물이 MMP-1의 발현을 억제함을 보여준다. 진피 효소 처리 추출물 중에서는 에탄올 추출물의 활성이 대체로 더 높은 것으로 나타났으며, 특히 gluco-amylase 효소 처리물(시료 번호 3-1 & 3-2), polygalacturonase 효소 처리물(시료 번호 7-1 & 7-2), α-glucosidase 효소 처리물(시료 번호 8-1 & 8-2), β-glucanase 효소 처리물(시료 번호 10-1 & 10-2)의 경우 추출 용매를 불문하고 다른 효소 처리물에 비해서 높은 MMP-1의 발현 억제 활성을 보였다.

[시험예 5] 프로콜라겐 생합성 촉진 활성 실험

상기 진피 효소 처리 추출물의 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 정량 실험의 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

세포의 프로콜라겐의 양을 측정하기 위하여 섬유아세포를 48well plate에 90% 이상 배양한 후 하루 동안 기아(starvation)상태로 하였다. 자외선 조사 없이 상기 각 실시예의 시료를 농도별로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐 타입-1 C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과를 음성 대조군(무처리군) 대비 백분율로 아래의 [표 8]에 나타내었다.

프로콜라겐의 생성율(%)

시료	처리 농도		시료	처리 농도
	10ug/ml	100ug/ml		10ug/ml	100ug/ml
대조군	100	100	대조군	100	100
1-1	101	100	1-2	99	102
2-1	100	101	2-2	103	101
3-1	101	108	3-2	106	111
4-1	107	116	4-2	104	113
5-1	103	109	5-2	104	106
6-1	108	119	6-2	105	113
7-1	115	131	7-2	109	121
8-1	109	127	8-2	105	118
9-1	114	137	9-2	101	111
10-1	102	105	10-2	103	101

상기 [표 8]의 결과는 특히 polygalacturonase(시료 번호 7-1 & 7-2), α-glucosidase(시료 번호 8-1 & 8-2), β-galactosidase 효소 처리 추출물(시료 번호9-1 & 9-2)의 경우 높은 프로콜라겐 생성 촉진 활성이 있음을 보여준다.

[시험예 6] 항산화 활성 실험

상기 각 실시예의 진피 효소 처리물의 추출물의 자외선에 의해 생성되는 활성산소 생성 억제 효과를 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96well black plate에 웰당 2.0×10⁴cells로 분주하고, 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 상기 각 실시예의 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution, Gibco, USA)로 세척하여 남아있는 배지를 제거한 다음, HCSS에 20M로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100 가하고, 37, 5% CO₂조건에서 20분간 배양하였다. 이후 각 시료가 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(30mJ/cm2)를 조사하고 처리 직후의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 측정하였다. 시료와 UVB를 모두 처리하지 않은 군을 음성 대조군으로 하였다.

음성 대조군 대비 백분율로 처리 직후의 결과를 [표 9]에 나타내었다.

항산화 활성(%)

시료	처리 농도		시료	처리 농도
	10uM	100uM		10uM	100uM
무처리군	100	100	대조군(UVB 처리)	135	135
1-1	129.11	121.36	1-2	129.0	124.43
2-1	111.14	103.33	2-2	120.1	107.61
3-1	131.10	126.14	3-2	127.88	119.6
4-1	116.62	102.25	4-2	122.64	104.54
5-1	109.58	95.22	5-2	119.04	108.52
6-1	98.21	77.65	6-2	100.94	85.51
7-1	85.18	63.52	7-2	97.49	86.18
8-1	92.32	72.4	8-2	99.02	83.99
9-1	90.04	69.91	9-2	100.6	91.22
10-1	94.18	83.9	10-2	104.6	86.03

상기 [표 9]의 결과는 실시예의 진피 효소 처리 추출물이 항산화 활성이 있음을 보여주며, 특히 pectinase 효소 처리물(시료 번호 6-1 & 6-2), polygalacturonase 효소 처리물(시료 번호 7-1 & 7-2), α-glucosidase 효소 처리물(시료 번호 8-1 & 8-2), β-galactosidase 효소 처리물(시료 번호 9-1 & 9-2), β-glucanase 효소 처리물(시료 번호 10-1 & 10-2) 이 활성이 더 우수함을 보여준다.

[시험예 7] B16F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제능 평가

상기 실시예의 자외선에 의해 생성되는 활성산소 생성 억제 효과를 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 실시예의 시험 물질로 하여 멜라닌 생성 억제능을 확인하기 위하여, B16/F10 흑색종 세포(한국세포주은행)를 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM으로 6 well plate에 2×10⁴cell/웰(최종 부피 3ml)로 넣고 37℃, 5% CO₂인큐베이터(MCO-20AIC, Sanyo)에서 24시간 배양하였다.

이후 배지를 제거하고, 10% FBS, 2μM α-MSH(Melanocyte stimulating hormone), 2mM 테오필린이 함유된 DMEM 배지로 교체한 다음 배지에 각 실시예의 시료를 농도별로 첨가하여 3일간 매일 처리하였다. 5일째에 6 웰 플레이트에서 배양된 배지를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA(Sigma Chemical Co.) 용액을 처리하여 세포 펠렛을 회수하고 1.5ml 튜브로 옮겨 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 펠렛을 60℃에서 건조시킨 후 1N NaOH 100μl를 넣어 세포 내 멜라닌을 녹였다. 이 용액을 PBS로 희석시킨 다음 ELISA 판독기 475nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 멜라닌 생성저해율을 구하였다. 상기 추출물을 첨가하지 않은 세포를 음성대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하여 미백효과를 측정하였다.

결과를 아래의 식에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 아래의 [표 10]에 나타내었다. 코지산 및 멜라솔브는 양성 대조군으로 사용되었다.

멜라닌 생성 억제율=100-[(각 시험물질의 흡광도/(대조군의 흡광도)×100]

멜라닌 생성 억제율(%)

시료	처리 농도		시료	처리 농도
	10uM	100uM		10uM	100uM
대조군	-	-	대조군	-	-
코지산	32.8	53.7	코지산	32.8	53.7
알부틴	46.2	67.2	알부틴	46.2	67.2
1-1	2.7	3.6	1-2	1.5	1.6
2-1	6.8	12.4	2-2	4.2	7.9
3-1	11.3	19.6	3-2	5.6	10.4
4-1	10.5	18.2	4-2	4.6	8.4
5-1	18.6	29.3	5-2	12.1	19.2
6-1	27.6	36.4	6-2	18.2	26.6
7-1	16.2	24.5	7-2	15.4	22.3
8-1	26.3	40.1	8-2	20.8	33.2
9-1	25.4	38.1	9-2	19.4	35.8
10-1	9.5	16.8	10-2	3.5	10.4

상기 [표 10]의 결과는 pectinase 효소 처리물(시료 번호 6-1 & 6-2), α-glucosidase 효소 처리물(시료 번호 8-1 & 8-2), β-galactosidase 효소 처리물(시료 번호 9-1 & 9-2)이 특히 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 가짐을 보여준다.

[시험예 8] 복합 시료의 피부 관련 활성 실험

상기 실험 결과, 피부 관련 활성이 우수한 효소 처리 추출물을 다양하게 혼합하여 이들 혼합물의 피부 관련 활성에서 있어서 상승 효과를 가지는가를 실험하였다.

[시험예 8-1] PPAR -α 활성화 실험

시료는 아래의 [표 11]과 같이 복합한 시료를 사용하였고, 실험 방법은 상기 [시험예 2]와 동일하며 처리 농도는 100uM 고농도이며, 실험 결과는 아래의 [표 12]와 같다.

복합에 사용한 시료 및 복합 비율(중량비)

구분	2-1	4-1	6-1	9-1
제조예 1	1	1
제조예 2	1		1
제조예 3	1			1
제조예 4		1	1
제조예 5		1		1
제조예 6			1	1
제조예 7	1	1	1
제조예 8	1	1		1
제조예 9	1		1	1
제조예 10		1	1	1
제조예 11	1	1	1	1

참고로 상기 [표 11]에서 복합에 사용한 시료는 β-amylase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 2-1), protease 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 4-1), pectinase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 6-1), β-galactosidase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 9-1)이다.

PPAR-α의 활성화도(루시페라제의 활성)

배지(무처리군)	0.21
Wy-14,643(0.5 M)	0.47
Wy-14,643(1 M)	1.31
제조예 1	0.64
제조예 2	0.78
제조예 3	0.52
제조예 4	0.52
제조예 5	0.83
제조예 6	0.41
제조예 7	0.32
제조예 8	0.88
제조예 9	0.61
제조예 10	0.73
제조예 11	0.90

PPAR-α의 활성 실험 결과를 보면, 복합 시료 중 제조예 11의 시료가 가장 활성이 우수하고, 그 다음으로 제조예 8의 시료가 활성이 우수함을 확인할 수 있다.

[시험예 8-2] MMP -1 분석

시료는 아래의 [표 13]과 같이 복합한 시료를 사용하였고, 실험 방법은 상기 [시험예 4]와 동일하며 처리 농도는 100uM 고농도이며, 실험 결과는 아래의 [표 14]와 같다.

복합에 사용한 시료 및 복합 비율(중량비)

구분	3-1	7-1	8-1	10-1
제조예 1	1	1
제조예 2	1		1
제조예 3	1			1
제조예 4		1	1
제조예 5		1		1
제조예 6			1	1
제조예 7	1	1	1
제조예 8	1	1		1
제조예 9	1		1	1
제조예 10		1	1	1
제조예 11	1	1	1	1

참고로 상기 [표 13]에서 복합에 사용한 시료는 gluco-amylase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 3-1), polygalacturonase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 7-1), α-glucosidase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 8-1), β-glucanase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 10-1)이다.

MMP-1 발현량(%)

무처리(UVA처리안함)	100
무처리+UVA	158
제조예 1	79
제조예 2	96
제조예 3	92
제조예 4	77
제조예 5	98
제조예 6	91
제조예 7	93
제조예 8	62
제조예 9	97
제조예 10	55
제조예 11	93

상기 [표 14]의 결과는 MMP-1의 발현은 제조예 10의 복합 시료를 처리했을 때 가장 많이 억제되는 것을 보여준다. 또한, 제조예 8의 복합 시료를 처리한 경우에도 다른 제조예의 복합 시료를 처리한 경우에 비해 MMP-1의 발현을 많이 억제하는 것을 알 수 있다.

[시험예 8-3] 프로콜라겐 생합성 촉진 활성 실험

시료는 아래의 [표 15]과 같이 복합한 시료를 사용하였고, 실험 방법은 상기 [시험예 5]와 동일하며 처리 농도는 100uM 고농도이며, 실험 결과는 아래의 [표 16]과 같다.

복합에 사용한 시료 및 복합 비율(중량비)

	7-1	8-1	9-1
제조예 1	1	1
제조예 2	1		1
제조예 3		1	1
제조예 4	1	1	1

참고로 상기 [표 15]의 시료는 polygalacturonase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 7-1), α-glucosidase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 8-1), β-galactosidase 효소 처리 추출 에탄올 추출물(시료 번호 9-1)이다.

프로콜라겐의 생성율(%)

10% FBS	163
배지	100
제조예 1	139
제조예 2	132
제조예 3	110
제조예 4	119

상기 [표 16]에서 보듯이, 제조예 1과 제조예 2의 복합 시료가 프로콜라겐 생합성 촉진 활성이 특히 우수함을 알 수 있다.

[시험예 8-4] B16F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제능 평가

시료는 아래의 [표 17]과 같이 복합한 시료를 사용하였고, 실험 방법은 상기 [시험예 7]과 동일하며 처리 농도는 100uM 고농도이며, 실험 결과는 아래의 [표 18]과 같다.

복합에 사용한 시료 및 복합 비율(중량비)

구분	6-1	8-1	9-1
제조예 1	1	1
제조예 2	1		1
제조예 3		1	1
제조예 4	1	1	1

상기 [표 17]의 시료는 pectinase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 6-1), α-glucosidase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 8-1), β-galactosidase 효소 처리 에탄올 추출물(시료 번호 9-1)이다.

멜라닌 생성 억제율(%)

대조군	-
알부틴(100M)	70.4
코지산(100M)	51.6
제조예 1	34.5
제조예 2	36.1
제조예 3	47.6
제조예 4	40.3

상기 [표 18]을 참조하여 보면, 제조예 3과 제조예 4의 복합 시료가 멜라닌 생성 억제 효과가 우수한 것으로 나타냈다.

Claims (8)

1. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 생성 촉진용 화장품 조성물.
   
2. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 생성 촉진용 식품 조성물.
   
3. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 생성 촉진용 약제학적 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 화장품 조성물.
   
6. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물.
   
7. (a) 진피의 폴리갈락투로나아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 및 (b) 진피의 β-칼락토시다아제 효소 처리물이나 그것의 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 약제학적 조성물.
   
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는 조성물.