CN101511368B - 用于促进抗癌疗法活性的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制癌细胞生长的方法。该方法包括将所述癌细胞暴露于抗癌疗法及有效量的甾体皂苷的步骤。

Description

用于促进抗癌疗法活性的组合物
本申请要求2006年8月3日提交的澳大利亚临时专利申请No.200604193的优先权，其内容通过参考并入本文。 
技术领域
本发明涉及用于抑制癌细胞生长的方法及组合物。 
背景技术
尽管手术提供了对癌症进行物理切除的手段，但化学疗法和放射疗法仍然是癌症治疗的主要方法。近来，已经开发了生物制剂(如抗体)用作抗癌疗法。 
许多抗癌剂和放射疗法的应用是基于如下前提，即用这些抗癌疗法进行治疗所导致的细胞死亡会启动最终导致癌细胞被破坏的生物过程。 
这些过程之一是凋亡。凋亡是自我破坏的复杂细胞程序，它由多种导致自我破坏的刺激所触发，其中濒死的细胞收缩、凝聚并随即片段化，释放出小的膜包覆的凋亡小体，所述凋亡小体通常被另外的细胞(如吞噬细胞)所吞入。 
常规的化疗药剂与DNA共价键合以形成加合物，从而引起DNA损伤并触发凋亡。传统的化疗药剂存在两个主要缺点：(i)它们引起严重的副作用，因为它们也影响健康的增殖细胞；以及(ii)癌细胞对该药剂的抗性提高。就这一点而言，癌细胞能够逐渐产生对化疗药剂的抗性，并最终可能产生多药抗性。 
耐药性肿瘤中对凋亡的抑制不仅影响该药物诱导死亡的活性，而且还使细胞在DNA损伤后可能获得其他突变。一般而言，这些诱变细胞的恶性程度可变得更高，并且对后续的治疗甚至更不敏感，这使得对含有抗凋亡病变的高抗性肿瘤进行治疗可能弊大于利。 
癌细胞的标志之一是它们逃避了凋亡。凋亡途径的破坏对化学疗法 的临床结果具有重要的影响。为了使化疗药剂有效，细胞必须能够发生凋亡。因为许多抗癌药通过诱导凋亡来发挥其针对癌细胞的最初抗肿瘤作用，所以凋亡是癌症化学疗法中一个极其重要的现象。 
然而，不仅某些化疗药物在很短时间后便抑制凋亡，而且许多肿瘤也具有存在缺陷的凋亡途径并因此固有地对化学疗法具有更高的抗性。此外，尽管肿瘤组织中的凋亡率未必很高，但对凋亡的诱导与癌症患者中的肿瘤应答及临床结果有关。 
在多种类型癌症的治疗中，一个主要的障碍是发生或存在对化疗药剂的抗性，例如在非小细胞肺癌中存在的情况。例如，发生顺铂抗性是导致治疗失败的一个主要原因。几种机制已暗示与顺铂抗性有关，其中之一是癌基因(如Bcl-2)的表达改变，其继而阻抑凋亡途径并可能促成抗性的产生。 
因此，需要可与抗癌疗法联合使用以增强其抗癌细胞之活性的药剂。本发明涉及甾体皂苷(steroid saponin)用于促进抗癌剂及抗癌疗法之活性的用途。 
本文中引用专利文献或其他材料作为现有技术并不意味着承认该文献或其他材料是已知的，或是承认其包含的信息在任何权利要求的优先权日是公知常识的一部分。 
发明概述 
本发明源自对甾体皂苷抑制癌细胞生长的能力所进行的研究。具体而言，发现甾体皂苷增强了多种化疗药剂及抗癌剂抑制癌细胞生长的活性。 
不限于任何理论，甾体皂苷增强这些药剂抗癌活性的能力可能是由于所述甾体皂苷在与抗癌疗法一起使用时能在癌细胞中促进凋亡所致。甾体皂苷促进凋亡之能力的一种机制可能是所述甾体皂苷能够靶向或抑制原本可在癌细胞中阻抑凋亡的分子。 
因此，本发明可用于促进抗癌剂(例如化疗药剂)的活性以及促进抗癌治疗(例如放射疗法)的活性。 
因此，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包括将癌细胞暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于抑制受试者中癌细胞生长之药物中的用途。 
本发明还提供了促进受试者中抗癌疗法活性的方法，该方法包括将所述受试者暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于促进受试者中抗癌疗法活性之药物中的用途。 
本发明还提供了抑制受试者中肿瘤形成和/或生长的方法，该方法包括将所述受试者暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于抑制受试者中肿瘤形成和/或生长之药物中的用途。 
本发明还提供了预防和/或治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括将所述受试者暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于预防和/或治疗受试者中癌症之药物中的用途。 
本发明还提供了组合产品，其包含： 
甾体皂苷；和 
抗癌剂； 
其中所述甾体皂苷和所述抗癌剂以向受试者共施用的形式提供，或以向受试者分开施用的形式提供。 
本发明还提供了抗癌组合物，该组合物包含抗癌剂和甾体皂苷。 
本发明还提供了降低为在受试者中预防和/或治疗癌症而向受试者提供的抗癌疗法的量的方法，该方法包括将所述受试者暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于降低为在受试者中预防和/或治疗癌症而向受试者提供的抗癌疗法的量之药物中的用途。 
本发明还提供了预防和/或治疗对抗癌治疗抗性提高的受试者中的癌症的方法，该方法包括将所述受试者暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于预防和/或治疗对抗癌治疗抗性提高的受试者中的癌症之药物中的用途。 
本发明还提供了降低癌细胞对抗癌疗法产生抗性的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于降低癌细胞对抗癌疗法产生抗性之药物中的用途。 
本发明还提供了促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡之药物中的用途。 
本发明还提供了包含三角叶薯蓣皂苷(deltonin)的药物组合物。 
本发明还提供了三角叶薯蓣皂苷在制备药物中的用途。 
本发明还提供了包含前皂苷配基A(prosapogenin A)的药物组合物。 
本发明还提供了前皂苷配基A在制备药物中的用途。 
本发明还提供了包含穗菝葜甾苷(asperin)的药物组合物。 
本发明还提供了穗菝葜甾苷在制备药物中的用途。 
本说明书全文中使用的各个术语具有本领域技术人员所熟知的含义。然而，为了便于参考，现对其中某些术语进行定义。     
本说明书全文中使用的术语“糖苷”应理解为指如下化合物，其包含与三萜或甾类或甾体生物碱糖苷配基(非糖)组分相连的糖部分(单 糖、二糖或多糖)。在大多数情况下，所述糖部分与所述糖苷配基的C-3位连接，但其他连接方式也在本发明的范围之内。例如，呋喃甾醇糖苷(furostanol glycoside)(其包含附着于C-26位的糖)和螺甾醇糖苷(spirostanol glycoside)都是甾体皂苷的亚类。 
本说明书全文中使用的术语“皂苷”应理解为指如下糖苷，其包含附着于糖苷配基的糖，通常通过该糖苷配基的C-3位进行附着。 
本说明书全文中使用的术语“甾体皂苷”应理解为指如下糖苷，其包含附着于不含氮原子之糖苷配基的一个或多个糖单元(包括一个或多个单糖、二糖或多糖单元)。 
对于这一点，应当理解，术语“甾体皂苷”的范围包括就其增强抗癌疗法活性的能力而言在功能上等同的该化合物之任何盐或任何其他衍生物。 
甾类“糖苷配基”也称为“苷配基(genin)”或“皂苷配基(sapogenin)”，这些术语在本说明书全文中可互换使用，并且其均应理解为指皂苷分子的非糖部分。 
本说明书全文中使用的术语“糖A-(1→n)-糖B”应理解为指糖A通过其C-1与糖B的C-n连接，n为整数。 
例如，俗名为“马铃薯三糖(chacotriose)”的多糖是α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷。本文使用的根据IUPAC推荐的命名法缩写形式为Rha 2，[Rha 4]，Glc。 
本说明书全文中使用的术语“抗癌疗法”应理解为指抗癌剂，例如化疗药剂(如顺铂)或生物制剂(如抗体)，或者指抗癌治疗(例如放射疗法)。 
本说明书全文中使用的术语“受试者”应理解为指任何人或动物受试者。对于这一点，应当理解，本发明的范围包括兽医应用。例如，动物受试者可以是哺乳动物、灵长类、家畜动物(如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(如狗、猫)、实验动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、鸟)、具有兽医意义的动物或者具有经济意义的动物。 
本说明书全文中使用的术语“治疗”及其变化形式应理解为指使用有效量的甾体皂苷进行治疗性介入。例如，该术语的范围包括具有一种或多种以下结果的治疗性介入：(i)抑制或阻止受试者中原发肿瘤的生长，包括降低切除后原发肿瘤的生长；(ii)抑制或阻止受试者中一种或多种继发肿瘤的生长和形成；(iii)与未治疗状态相比提高受试者的预期寿命；以及(iv)与未治疗状态相比改善受试者的生活质量。 
本说明书全文中使用的术语“抑制”应理解为指降低过程的进展，包括过程的开始、速率、概率、持续或终止中的任何一种或多种。 
本说明书全文中提及细胞时所使用的术语“癌细胞”应理解为指永生化并且其生长不受其他细胞接触抑制的细胞。癌细胞还可能不再显示对外源性生长因子的依赖性和/或锚着依赖性生长。 
本说明书全文中使用的术语“生物系统”应理解为指任何多细胞系统，其包括分离的细胞群直至整个生物。例如，所述生物系统可以是组织培养细胞、组织或器官或者受癌细胞的不期望或失控生长影响的整个人受试者。 
附图说明
图1显示三角叶薯蓣皂苷与5-氟尿嘧啶的组合在皮下引入HT29人前列腺癌细胞的小鼠中对肿瘤体积的影响。 
发明一般性描述 
如上所述，在一个实施方案中，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
本发明是基于甾体皂苷能够促进抗癌疗法活性这一发现。因此，甾体皂苷可以与抗癌疗法组合使用，以抑制癌细胞的生长。 
本发明多个实施方案中的癌细胞可以是人或动物的细胞。 
所述癌细胞可以是体内或体外的癌细胞。例如，所述癌细胞可以是体外细胞培养物中存在的癌细胞。 
对于体外细胞的情况，所述癌细胞可以是原代细胞，例如分离自或 源自受试者中肿瘤的癌细胞。或者，所述癌细胞可以是源自癌细胞系的细胞。癌细胞系的实例包括人黑素瘤、结肠腺癌(WiDr)、乳腺癌(MCF7)、小鼠T细胞淋巴瘤(WEHI-7)、小鼠纤维肉瘤(WEHI-164/IC)、SKMel28(黑素瘤)、HT29(结肠)、CI80-13S(卵巢)、A549(肺)、DU145(前列腺-激素非依赖性)、PC3(前列腺-激素非依赖性)、LNCap(前列腺-激素依赖性)、K562(人红白血病)和MM96L(黑素瘤)。 
本发明中多种形式的癌细胞也可以是存在于生物系统中的细胞，例如体内存在的癌细胞，包括与受试者中原发肿瘤和/或一种或多种继发肿瘤相关的癌细胞。 
就这一点而言，术语“生物系统”应理解为指任何多细胞系统，包括分离的细胞群直至完整生物。例如，所述生物系统可以是组织或器官或者完整受试者(包括患有癌症的受试者)。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了抑制生物系统中癌细胞生长的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
对于存在于受试者中的癌细胞的情况，所述癌细胞可以是例如与一种或多种如下癌症相关的癌细胞：癌瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌(包括结肠、直肠、肛门和阑尾的癌症)、食道癌、霍奇金病、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、痣和发育不良痣(dysplastic nevus)、多发性骨髓瘤、肌癌(muscular cancer)、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、畸胎瘤、甲状腺癌和子宫癌。 
在一个实施方案中，所述抗癌疗法是将癌细胞暴露于抗癌剂(例如化疗药剂或生物制剂)。 
在另一实施方案中，所述抗癌疗法是将癌细胞暴露于抗癌治疗(例如放射疗法)。 
本发明还提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于抑制受试者中癌细胞生长之药物中的用途。 
如上文所述，本发明可用于通过将受试者暴露于甾体皂苷而促进该受试者中抗癌疗法的活性。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了促进受试者中抗癌疗法活性的方法，该方法包括将所述受试者暴露于有效量的甾体皂苷。 
甾体皂苷还可用于制备促进抗癌剂活性的药物。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷在制备用于促进受试者中抗癌剂活性之药物中的用途。 
本发明还可用于抑制受试者中肿瘤的形成和/或生长。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了抑制受试者中肿瘤形成和/或生长的方法，该方法包括将所述受试者暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
甾体皂苷和抗癌剂还可用于制备抑制受试者中肿瘤形成和/或生长的药物。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于抑制受试者中肿瘤生长和/或形成之药物中的用途。 
本发明所述多个实施方案中的肿瘤可以是原发肿瘤或继发肿瘤。因此，本发明还可用于抑制受试者中原发肿瘤的形成和生长和/或用于抑制转移瘤的形成和/或生长。 
用于评估肿瘤形成和/或生长的方法为本领域已知。 
本发明还可用于预防和/或治疗受试者中的癌症。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了预防和/或治疗受试者中癌症的方法，该方法包括将所述受试者暴露于抗癌疗法以及有效量的甾体皂苷。 
甾体皂苷和抗癌剂还可用于制备预防和/或治疗受试者中癌症的药物。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于预防和/或治疗受试者中癌症之药物中的用途。 
本发明多个实施方案中的受试者可以是人或哺乳动物受试者。 
例如，所述动物受试者可以是哺乳动物、灵长类、家畜动物(如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(如狗、猫)、实验动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、鸟)、具有兽医意义的动物或者具有经济意义的动物 
在一个实施方案中，所述受试者是人受试者。 
本发明多个实施方案中对癌细胞生长的抑制可以是对该细胞增殖的任何形式的抑制。例如，对增殖的抑制可包括抑制细胞开始增殖、继续增殖的能力，或者降低特定细胞开始或继续增殖的概率。 
本发明多个实施方案中对癌细胞生长的抑制可通过本领域已知的方法进行评估。 
例如，就体外的癌细胞而言，癌细胞的生长可通过适当的增殖测定来测定，或者通过评估在给定时间中经氚标记的胸苷掺入细胞DNA中的程度的方法来测定。 
就体内存在的癌细胞而言，癌细胞的生长可通过例如本领域已知的适当成像方法来测定。 
如上文所述，所述抗癌疗法可以是暴露于抗癌剂和/或暴露于抗癌治疗。 
在一个实施方案中，所述抗癌剂是将该药剂暴露于细胞后促进细胞凋亡的药剂。确定药剂促进凋亡之能力的方法为本领域已知。 
在一个具体实施方案中，所述抗癌剂抑制癌细胞中凋亡抑制因子(例如存活素(survivin)、XIAP、Bcl-2或Bcl-XL)的活性。 
在另一实施方案中，所述抗癌剂是化疗药剂，例如烷化剂，包括BCNU(卡莫司汀)、白消安(bisulfan)、CCNU(洛莫司汀)、苯丁酸氮芥、顺铂、oxiplatin、美法仑(melphan)、丝裂霉素C和塞替派(thio-tepa)；抗有丝分裂剂，包括泰素(紫杉醇)、多西紫杉醇、硫酸 长春碱和硫酸长春新碱；拓扑异构酶抑制剂，包括多柔比星、柔红霉素、m-AMSA(安吖啶)、米托蒽醌和VP-16(依托泊苷)；RNA/DNA抗代谢物，包括5-氟尿嘧啶和甲氨喋呤；DNA抗代谢物，包括Ara-C(阿糖胞苷)、羟基脲和硫鸟嘌呤。 
在另一实施方案中，所述抗癌剂是细胞过程靶向剂，例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和吉非替尼(gefitinib)。 
抗癌剂的给药途径、剂量和治疗方案的详细情况为本领域已知，例如描述于“Cancer Clinical Pharmacology”(2005)，Jan H.M.Schellens，Howard L.McLeod和David R.Newell编辑，Oxford University Press。 
皂苷通常分为三个大类：(i)三萜糖苷；(ii)甾体糖苷；和(iii)甾体生物碱糖苷。它们均具有一个或多个糖单元附着(通常在C-3位)于糖苷配基。甾体皂苷一般性地描述于Hostettmann K和Marston A(2005).Chemistry&pharmacology of natural products：Saponins.Cambridge University Press。 
如上文所述，甾体皂苷在糖苷配基部分中不包含氮原子。 
应当理解，本发明多个实施方案中的甾体皂苷包括天然的甾体皂苷和非天然的甾体皂苷(即化学合成的甾体皂苷)。此外，还应当理解，本发明多个实施方案中的甾体皂苷还包括所述甾体皂苷的前药、所述甾体皂苷的衍生物，其包括例如任何酯、酮、羧酸、盐、取代形式、卤化形式或其他含有杂原子的形式、不饱和形式或任何其他功能性衍生物。 
本发明多个实施方案中甾体皂苷的糖部分可包括一个或多个糖单元，例如单糖、二糖单元或多糖单元。 
应当理解，本发明多个实施方案中的甾体皂苷还可包括这样的糖苷配基：其包含附着至该糖苷配基部分的一个或多个位置的糖。 
在一个实施方案中，所述甾体皂苷包含附着至该甾体皂苷的皂苷配基组分之单个位置的糖。 
如上所述，所述糖单元可以是单糖、二糖或多糖。所述糖可由适 当的单糖构成，所述单糖例如D-葡萄糖(Glc)、L-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-葡糖醛酸(GlcA)、D-木糖(Xyl)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-岩藻糖(Fuc)、D-半乳糖醛酸(GalA)。所述糖单元还可以是取代糖，例如氨基糖、硫酸化糖(sulphated sugar)、酰化糖、N-酰化糖以及任何上述单糖的功能性衍生物。 
类似地，二糖可以是上述两个单糖的任何组合。 
本发明多个实施方案中的多糖可以是线性或分支的，并包括两个或多个单糖(包括上文所述单糖)的任意组合。 
在一个实施方案中，上述多糖由1至6个单糖单元构成。 
就这一点而言，并且如上文所述，通常根据组成单糖的排列来描述多糖。 
在一个实施方案中，甾体皂苷中的糖由一个单糖单元构成。单糖的一个实例是化学名为β-D-吡喃葡萄糖苷的葡萄糖，当其通过C-3位附着至薯蓣皂苷配基这种糖苷配基时的俗名为“延龄草皂苷(trillin)”。 
在另一实施方案中，甾体皂苷中的糖由两个单糖单元(即二糖)构成。二糖的一个实例是化学名为α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡糖苷的Rha 2，Glc，当其通过C-3位附着至薯蓣皂苷配基这种糖苷配基时的俗名为“前皂苷配基A”。 
在另一实施方案中，甾体皂苷中的糖由三个糖单元构成(即三糖)。马铃薯三糖苷(chacotrioside)是三糖单元的一个常见实例，其中三个糖的糖基中包含两个与葡萄糖单元连接的鼠李糖单元，该葡萄糖单元又进而通过糖苷键与皂苷配基的C-3位连接。马铃薯三糖是α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，而本文使用的根据IUPAC推荐命名法的缩写形式为Rha 2，[Rha 4]，Glc。 
类似地，茄三糖苷是三个糖的糖基，其包括一个鼠李糖单元和一个非鼠李糖单元，它们各自与第三糖单元连接，所述第三糖单元又进而通过糖苷键与皂苷配基的C-3位连接。 
四糖的一个实例是[Rha 4，Rha 4]，Rha 2，Glc，其化学名为[α-L- 吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-吡喃葡糖苷，当其通过C-3位附着至薯蓣皂苷配基这种糖苷配基时的俗名为“穗菝葜甾苷”。 
四糖的另一个实例是Glc 4，[Xyl 3]，Rha 2，Ara，其化学名为β-D-吡喃葡糖基(1→4)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷。 
如上文所述，甾体皂苷在糖苷配基部分中不含有氮原子。 
因此，应当理解，本发明多个实施方案中的甾体皂苷在皂苷配基部分中不会含有氮基团，例如在皂苷配基的E和/或F环中不合有氮。 
在一个实施方案中，本发明多个实施方案中的甾体皂苷基于具有以下化学式I或II的皂苷配基，或者其可药用盐或其衍生物： 
Figure G2007800327115D00121
其中 
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15和R17独立地为H、OH、＝O、可药用酯基或可药用醚基； 
当C-5、C-6为单键时，R5是H，当C-5、C-6为双键时R5则不存在； 
当B为CH2时A是O，或者当A为CH2时B是O； 
当R27B为CH3时R27A是H，或者当R27B为H时R27A是CH3； 
R3包含通过氧原子与甾体皂苷在C-3相连的糖基。 
Figure G2007800327115D00131
其中 
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15和R17独立地为H、OH、＝O、可药用酯基或可药用醚基； 
当C-5、C-6为单键时，R5是H，当C-5、C-6为双键时R5则不存在； 
当C-20、C-22为单键时，R22是羟基或烷氧基，或者当C-20、C-22为双键时R22则不存在； 
当R27B为CH3时R27A是H，或者当R27B为H时R27A是CH3； 
R28是H或糖，或其可药用盐或衍生物； 
R3包含通过氧原子与甾体皂苷在C-3相连的糖基。 
甾体皂苷的实例包括螺甾醇糖苷配基，例如薯蓣皂苷配基、亚莫皂苷配基(yamogenin)(新薯蓣皂苷配基(neodiosgenin))、丝兰皂苷配基(yuccagenin)、洋菝葜皂苷配基(sarsasapogenin)、提果皂苷配基(tigogenin)、异菝葜皂苷配基(smilagenin)、龙舌兰皂苷配基(hecogenin)、芰皂配基(gitogenin)、欧铃兰皂苷配基(convallamarogenin)、新鲁斯可皂苷配基(neoruscogenin)和茄苷皂元(solagenin)；以及呋喃甾醇糖苷配基，例如原薯蓣皂苷配基 (protoyamogenin)、假原薯蓣皂苷配基(pseudoprotodiosgenin)、甲基原薯蓣皂苷配基(methyl protodiosgenin)、原亚莫皂苷配基(protoyamogenin)和甲基原亚莫皂苷配基(methyl protoyamogenin)。 
在一个实施方案中，所述甾体皂苷是马铃薯三糖苷-甾体皂苷或茄三糖苷-甾体皂苷。 
马铃薯三糖苷-甾体皂苷的实例包括“薯蓣皂苷”，它由以下组成：通过C-3位与马铃薯三糖连接的皂苷配基“薯蓣皂苷配基”、通过C-3位与另一马铃薯三糖苷连接的薯蓣皂苷配基、通过C-3位与马铃薯三糖苷连接的提果皂苷配基、通过C-3位与马铃薯三糖苷连接的洋菝葜皂苷配基、通过C-3位与马铃薯三糖苷连接的异菝葜皂苷配基、通过C-3位与马铃薯三糖苷连接的丝兰皂苷配基以及通过C-3位与马铃薯三糖苷连接的亚莫皂苷配基。 
茄三糖苷甾体皂苷的实例包括“纤细薯蓣皂苷(gracillin)”(通过C-3位与茄三糖苷(Rha 2，[Glc 3]，Glc)连接的薯蓣皂苷配基)；“三角叶薯蓣皂苷”(通过C-3位与茄三糖苷Rha 2，[Glc 4]，Glc连接的薯蓣皂苷配基)；通过C-3位与茄三糖苷(Rha 2，[Glc 3]，Gal)连接的薯蓣皂苷配基(在这种情况下，与(Rha 2，[Glc 3]，Gal)连接的薯蓣皂苷配基称为“薯蓣皂苷配基茄三糖”)；通过C-3位与另一茄三糖苷连接的薯蓣皂苷配基；通过C-3位与茄三糖苷连接的提果皂苷配基；通过C-3位与茄三糖苷连接的洋菝葜皂苷配基；通过C-3位与茄三糖苷连接的异菝葜皂苷配基；通过C-3位与茄三糖苷连接的丝兰皂苷配基以及通过C-3位与茄三糖苷连接的亚莫皂苷配基。 
简单的单糖甾体皂苷在植物界中广泛存在。所述单糖一般通过C-3位与糖苷配基连接，实例包括“延龄草皂苷”(其中薯蓣皂苷配基通过C-3位与葡萄糖连接)。其他通过C-3位与葡萄糖连接的皂苷配基包括洋菝葜皂苷配基、万年青皂苷配基(rhodeasapogenin)和亚莫皂苷配基。某些皂苷配基通过C-3位与另一单糖(如阿拉伯糖)连接(例如杨诺皂苷配基(yonogenin)和铃兰皂苷配基(convallagenin))，或者通过C-3位与半乳糖连接，等等。 
二糖甾体皂苷的实例包括洋菝葜皂苷配基通过C-3位与例如(Xyl 2，Gal)、(Glc 2，Glc)、(Glc 3，Glc)连接；异菝葜皂苷配基通过C-3位与(Glc 2，Glc)、(Glc 2，Gal)连接；沙莫皂苷配基(samogenin)、提果皂苷配基、芰皂配基、alliogenin、鲁斯可皂苷配基(ruscogenin)、喷闹皂苷配基(pennogenin)、cepagenin以及薯蓣皂苷配基通过C-3位与(Rha 2，Glc)连接。 
来自薯蓣属(Dioscorea)的薯蓣皂苷配基糖苷作为甾类激素的起始材料而具有很高的商业意义。薯蓣皂苷配基及其C-25异构体亚莫皂苷配基的糖苷是报道最多的螺甾醇皂苷。表1列出了B环中具有C-5、C-6双键的天然甾体螺甾醇皂苷配基的实例： 
表1 
  R1  R2  R12  R27A  R27B
薯蓣皂苷配基 H  H  H  H  CH3
亚莫皂苷配基 H  H  H  CH3  H
丝兰皂苷配基 H  OH  H  H  CH3
静特诺皂苷配基 H  H  ＝O  H  CH3
鲁斯可皂苷配基 OH  H  H  H  CH3
表2列出了B环中具有C-5、C-6单键的天然甾体螺甾醇皂苷配基的实例： 
Figure G2007800327115D00161
表2 
  R2  H5  R6  R12  R15  R28  R29
异菝葜皂苷配基 H  β  H  H  H  H  CH3
提果皂苷配基 H  α  H  H  H  H  CH3
洋菝葜皂苷配基 H  β  H  H  H  CH3  H
芰皂配基 OH  β  H  H  H  H  CH3
龙舌兰皂苷配基 H  α  H  ＝O  H  H  CH3
绿莲皂苷配基 H  α  OH(α)  H  H  H  CH3
洋地黄皂苷配基 OH(α)  α  H  H  OH(β)  H  CH3
地盖诺皂苷配基 H  α  H  H  OH(β)  H  CH3
表3列出了B环中具有C-5、C-6双键并且E环中具有C-20、C-22单键的原螺甾烷(protospirostane)型天然甾体呋喃甾醇皂苷配基的实例： 
Figure G2007800327115D00162
表3 
  R22
原薯蓣皂苷配基 H
甲基原薯蓣皂苷配基 CH3
B环中具有C-5、C-6单键并且E环中具有C-20、C-22单键的原螺甾烷型天然甾体呋喃甾醇皂苷配基的一个实例是原提果皂苷配基(prototigogenin)。 
B环中具有C-5、C-6双键并且E环中具有C-20、C-22双键的假螺甾烷(pseudospirostane)型天然甾体呋喃甾醇皂苷配基的一个实例是假薯蓣皂苷配基(pseudodiosgenin)。 
B环中具有C-5、C-6双键并且E环中具有C-20、C-22双键的假原螺甾烷(pseudoprotospirostane)型天然甾体呋喃甾醇皂苷配基的一个实例是假原薯蓣皂苷配基(pseudoprotodiosgenin)。 
在一个实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与一个或多个单糖单元连接的薯蓣皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是薯蓣皂苷或纤细薯蓣皂苷，其中薯蓣皂苷是通过C-3位与马铃薯三糖(Rha 2，[Rha 4]，Glc)连接的薯蓣皂苷配基，纤细薯蓣皂苷是通过C-3位与茄三糖(Rha 2，[Glc 3]，Glc)连接的薯蓣皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与茄三糖(Rha 2，[Glc 3]，Gal)连接的薯蓣皂苷配基。在这种情况下，薯蓣皂苷配基与(Rha2，[Glc 3]，Gal)连接称为“薯蓣皂苷配基茄三糖”。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的薯蓣皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的提果皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的洋菝 葜皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的异菝葜皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的丝兰皂苷配基。 
在另一实施方案中，所述甾体皂苷是通过C-3位与糖连接的亚莫皂苷配基。 
在一个具体实施方案中，所述甾体皂苷选自三角叶薯蓣皂苷(薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc)、薯蓣皂苷(薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc)、前皂苷配基A(薯蓣皂苷配基Rha2，Glc)和穗菝葜甾苷(薯蓣皂苷配基[Rha 4，Rha 4]，Rha 2，Glc)。 
对于三角叶薯蓣皂苷、前皂苷配基A和穗菝葜甾苷的情况，可将这些甾体皂苷中的任一种制备到药物组合物中。 
因此，这些甾体皂苷可用于制备药物。 
这样的药物可用于以下一种或多种用途：抑制癌细胞生长；抑制肿瘤的形成和/或生长；预防和/或治疗癌症，包括对抗癌疗法的抗性提高的癌症；促进抗癌疗法的活性；降低向受试者提供的抗癌疗法的量；促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡；降低癌细胞中产生对抗癌疗法的抗性。 
如上文所述，本发明多个实施方案中的甾体皂苷可得自天然来源、通过合成方法制备或者对天然化合物或中间产物进行部分合成或修饰而制备。 
本发明多个实施方案中对甾体皂苷的提取、分离和鉴定可通过本领域已知的方法来实现。 
例如，一些甾体皂苷可从植物来源获得。甾体皂苷的另一些来源可容易地从文献中获得，例如描述于Hostettmann K和Marston A(2005).Chemistry&pharmacology of natural products：Saponins. Cambridge University Press，第1-3章和第6章。甾体皂苷的俗名根据上文内容以及Dictionary of Natural Products，Chapman和Hall，CRC，(2004)来使用。 
本领域已知在体外和体内将癌细胞暴露于抗癌剂和抗癌治疗的方法。 
本领域还已知在体外和体内将甾体皂苷暴露于癌细胞的方法。 
在体外将甾体皂苷暴露于癌细胞的一种适当方法是通过将所述甾体皂苷直接暴露于癌细胞来实现。 
对于癌细胞在受试者中的情况，将所述癌细胞暴露于甾体皂苷的一种适当方法是通过对该受试者施用所述皂苷来实现。 
抗癌剂的有效量和抗癌治疗的有效水平为本领域已知。在体外和体内将癌细胞暴露于抗癌剂和治疗的方法为本领域已知。 
本发明多个实施方案中待暴露于癌细胞的甾体皂苷的有效量无特殊限制。通常，甾体皂苷的有效浓度为0.1μM至20μM。 
对于使用甾体皂苷来增强受试者中抗癌剂活性的情况，所述甾体皂苷和所述抗癌剂可以适当形式分别对该受试者施用，或者也可以适当形式对该受试者共施用。 
例如，所述甾体皂苷和所述抗癌剂可包含在组合产品中，用于对受试者分开施用或共施用。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了包含甾体皂苷和抗癌剂的组合产品，所述甾体皂苷和所述抗癌剂以用于对受试者共施用的形式提供，或以用于对受试者分开施用的形式提供。 
所述组合产品适用于例如抑制癌细胞生长、用于抑制肿瘤形成和生长(原发和/或继发肿瘤)以及用于预防和/或治疗癌症。 
所述组合产品的组分可以多剂量形式或单位剂型分别包装或一起包装在适当灭菌的容器中，例如安瓿、瓶或小瓶中。所述容器通常是密封的。用于包装组分的方法是本领域已知的。 
如上文所述，甾体皂苷与抗癌剂的共施用可以依次进行或同时进行，这一般意味着本发明的药剂在特定的时间间隔中存在于受试者中。通常，如果在第一药剂的半衰期内施用第二药剂，则认为这两种药剂是共施用的。 
用于施用甾体皂苷的合适给药方案可由本领域技术人员来选择。例如，可以在受试者暴露于抗癌疗法之前、同时或之后对该受试者施用甾体皂苷。 
在一个实施方案中，在对受试者施用抗癌剂的同时或在该受试者暴露于抗癌治疗的同时对该受试者施用甾体皂苷。 
在一个具体实施方案中，所述甾体皂苷和抗癌剂可以包含在施用于受试者的单一组合物中。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了包含甾体皂苷和抗癌剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物为抗癌组合物。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了包含抗癌剂和甾体皂苷的抗癌组合物。 
该组合物可用于例如在体外或体内抑制癌细胞生长。 
该组合物还可用于抑制受试者中肿瘤形成和生长(原发和/或继发肿瘤)以及用于预防和/或治疗癌症。 
待施用于受试者的甾体皂苷的有效量以及抗癌剂或抗癌治疗的有效量无特殊限制，只要它是通常显示有用或治疗性效果的量及形式即可。术语“治疗有效量”是当施用于有此需要的受试者时改善该受试者的预后和/或健康状态的量。待施用于受试者的量将取决于以下一种或多种具体特征：待抑制其生长的癌细胞、所治疗的癌症、给药模式以及受试者的特征(例如总体健康状况、其他疾病、年龄、性别、基因型和体重)。本领域技术人员将能够根据这些因素及其他因素来确定合适的剂量。 
就这一点而言，抗癌剂和放射疗法治疗的给药途径、剂量和治疗方案为本领域已知，例如描述于“Cancer Clinical Pharmacology” (2005)，J.H.M.Schellens，H.L.McLeod和D.R.Newell编辑，OxfordUniversity Press以及“Cancer and its management”(2005)，第五版，R.Souhami和J.Tobias，Blackwell Publishing。 
如上文所述，本发明组合物的给药和递送可通过例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、口服或外用途径来实现，或者通过在进行其他治疗形式(如手术)之前、期间或之后注射到原发肿瘤部位来实现。大多数情况下，给药模式和途径将取决于受治肿瘤的类型。 
给药的剂型、频率和量将取决于给药模式及途径。通常，注射用组合物将以5mg/m2～500mg/m2、通常为10mg/m2～200mg/m2的量施用。口服给药的组合物一般以5mg～5g、优选50mg～1g的量施用。 
例如，甾体皂苷的有效量一般为约0.1mg/千克体重/天～约1000mg/千克体重/天，以一种形式时为1mg/千克体重/天～100mg/千克体重/天。 
如上所述，虑及待施用甾体皂苷的具体物理、微生物及化学特性，施用包含甾体皂苷的组合物还可包括使用一种或多种可药用添加剂，包括可药用的盐、氨基酸、多肽、聚合物、溶剂、缓冲剂、赋形剂、防腐剂和填充剂。 
例如，所述甾体皂苷可以诸如水溶液、油制备物、脂肪乳剂、乳剂、用于重构的冻干粉剂等形式制备成多种可药用组合物，并可作为以下形式给药：无菌且无热原的肌内或皮下注射剂，或注射至器官的注射剂，或植入式制剂，或者通过鼻腔、直肠、子宫、阴道、肺等给药的透粘膜制剂。所述组合物可以口服制剂(例如固体制剂如片剂、囊片(caplet)、胶囊剂、颗粒剂或粉剂；液体制剂如糖浆剂、乳剂、分散型或混悬剂)的形式来施用。 
含有所述甾体皂苷的组合物还可含有一种或多种可药用的防腐剂、缓冲剂、稀释剂、稳定剂、螯合剂、粘度增强剂、分散剂、pH控制剂或等渗剂。这些赋形剂为本领域技术人员所熟知。 
合适的防腐剂实例包括对羟基苯甲酸、苯酚、苯乙醇或苯甲醇的苯甲酸酯。合适的缓冲剂实例包括磷酸钠盐、柠檬酸、酒石酸等。合适 的稳定剂实例包括抗氧化剂例如醋酸α-生育酚、α-硫代甘油、焦亚硫酸钠、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、8-羟基喹啉，以及螯合剂例如依地酸二钠。合适的粘度增强剂、助悬剂、增溶剂或分散剂的实例包括取代的纤维素醚、取代的纤维素酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、卡波姆、聚丙二醇、单油酸脱水山梨糖醇酯、倍半油酸脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60。 
合适的pH控制剂实例包括盐酸、氢氧化钠、缓冲剂等。合适的等渗剂实例包括葡萄糖、D-山梨糖醇或D-甘露醇、氯化钠。 
在本发明多个实施方案中，虑及所施用甾体皂苷的物理、化学及微生物学特性，还可以组合物的形式来施用所述甾体皂苷，所述组合物包含可药用的载体、稀释剂、赋形剂、助悬剂、润滑剂、佐剂、运载体、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、助流剂、抗粘附剂、粘合剂、调味剂或增甜剂。 
为了这些目的，该组合物可作为含有常规无毒可药用载体的剂型制剂或任何其他方便的剂型来通过以下方式施用，例如口服、肠胃外、吸入喷雾剂、吸附、吸收、外用、经直肠、经鼻、经口腔、经阴道、心室内、经由植入式药盒(implanted reservoir)。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内的注射或输注技术。 
当肠胃外给药时，所述组合物通常为单位剂量的无菌无热原注射形式(溶液、混悬剂或乳剂，它们可在使用前重构)，其优选使用可药用载体与受者的血液等渗。这些无菌注射形式的实例包括无菌的注射用水混悬剂或油混悬剂。可以使用合适的运载体、分散剂或润湿剂、络合剂、聚合物、增溶剂和助悬剂，根据本领域已知的技术来配制这些混悬剂。所述无菌注射形式还可以是肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可药用运载体和溶剂包括水、乙醇、甘油、盐水、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、林格液、葡萄糖溶液、等渗氯化钠溶液和Hank’s液。此外，常规地使用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何无刺激的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯、玉米油、棉籽油、花生油和芝麻油。在制备注射剂中可使用脂肪酸(例如油 酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯以及油酸及其甘油酯衍生物，包括橄榄油和蓖麻油(尤其以其聚氧乙烯化(polyoxyethylated)的形式))。这些油溶液或悬液还可含有长链醇稀释剂或分散剂。 
该载体还可含有添加剂，如增强溶解度、等渗性和化学稳定性的物质，例如抗氧化剂、缓冲剂和防腐剂。 
此外，含有甾体皂苷的组合物可以采用在施用前进行重构的形式。实例包括进行冻干、喷雾干燥等以产生合适的固体形式，用于在施用前以可药用溶剂重构。 
组合物可包含一种或多种缓冲剂、填充剂、等渗剂以及冷冻保护剂和冻干保护剂(lyoprotectant)。赋形剂的实例包括磷酸盐、柠檬酸、非还原糖如蔗糖或海藻糖、多羟基醇、氨基酸、甲胺以及易溶盐(lyotropic salt)，它们要优于还原糖(如麦芽糖或乳糖)。 
口服给药时，通常使用本领域已知的常规设备和技术将甾体皂苷配制成单位剂型，例如片剂、囊片、扁囊剂、粉剂、颗粒剂、珠子、咀嚼锭剂、胶囊剂、液体剂、含水混悬剂或溶液剂或者类似的剂型。这些制剂一般包括固体、半固体或液体载体。示例性载体包括赋形剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可脂、可可油(theobroma)、藻酸酯、黄蓍胶、明胶、糖浆、取代的纤维素醚、聚氧乙烯单月桂酸脱水山梨醇酯、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁等。 
片剂可以通过对甾体皂苷(任选地与一种或多种助剂一起)进行压制或模制来制备。压制片剂可通过在合适的机器中压制自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性成分来制备，所述活性成分任选地混有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂。可通过在合适的机器中对粉末状活性成分与用惰性液体稀释剂润湿的适当载体的混合物进行模塑来制备模制片剂。 
甾体皂苷药剂的施用还可利用控释技术。 
就外用给药而言，本发明的组合物可以采用溶液、喷雾剂、洗剂、霜剂(例如非离子型霜剂)、凝胶剂、糊剂或软膏剂的形式。或者，所 述组合物可以通过脂质体、纳米体(nanosome)、核糖体或营养扩散体(nutri-diffuser)运载体来递送。外用给药可用于治疗癌症(如黑素瘤)。 
应当理解，对于还包含抗癌剂的药物组合物，上文所述的考虑因素也类似地适用于该组合物的配制。 
本发明还可用于降低为预防和/或治疗癌症而向受试者提供的抗癌剂或抗癌治疗的量。 
就这一点而言，可利用甾体皂苷提高抗癌疗法活性水平的能力来降低为实现期望治疗水平而暴露于受试者的抗癌疗法的剂量。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了降低为预防和/或治疗受试者的癌症而向该受试者提供的抗癌疗法的量的方法，该方法包括将该受试者暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于降低为预防和/或治疗癌症而向受试者提供的抗癌疗法的量之药物中的用途。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷在制备用于降低为预防和/或治疗癌症而向受试者提供的抗癌疗法的量之药物中的用途。 
本发明还可用于促进由癌细胞暴露于抗癌剂所致的癌细胞凋亡。例如，所述甾体皂苷可用于促进暴露于化疗药剂的细胞发生凋亡。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡之药物中的用途。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷在制备用于促进由癌细胞暴露于抗癌疗法所致的癌细胞凋亡之药物中的用途。 
本发明还可用于降低癌细胞对抗癌剂的抗性水平。 
例如，将癌细胞暴露于抗癌剂(例如化疗药物)导致该细胞对该化疗药物的抗性水平提高。最终，这可能导致产生多药抗性的癌症。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了降低癌细胞对抗癌疗法产生抗性的方法，该方法包括将所述癌细胞暴露于有效量的甾体皂苷。 
本发明还提供了甾体皂苷在制备用于降低癌细胞对抗癌疗法产生抗性之药物中的用途。 
因此，在另一实施方案中，本发明还提供了甾体皂苷在制备用于降低癌细胞对抗癌疗法产生抗性之药物中的用途。 
本发明还提供了甾体皂苷和抗癌剂在制备用于降低癌细胞对凋亡剂的抗性水平之药物中的用途。 
因此，在另一实施方案中，本发明提供了甾体皂苷在制备用于降低癌细胞对抗癌剂的抗性水平之药物中的用途。 
制备药物组合物的方法为本领域已知，例如描述于Remington’sPharmaceutical Sciences，第十八版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；U.S.Pharmacopeia：National Formulary，1984，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.以及M.E.Aulton，Pharmaceutics，The Science ofDosage Form Design，第二版，Churchill Livingstone，Edinburgh，2002。 
生物分子的治疗性递送一般性描述于Bladon，C.(2002)“Pharmaceutical Chemistry：Therapeutic Aspects of Biomolecules”John Wiley&Sons Ltd。 
具体实施方案描述 
现参考体现本发明上述一般原理的实验。然而，应当理解，下文的描述不会限制以上描述的一般原则。 
实施例1
通用试剂及方法 
(i)甾体皂苷和抗癌剂 
薯蓣皂苷配基、薯蓣皂苷：薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc以及三角叶薯蓣皂苷：薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc购自NingboHanpharm Biotech Co Ltd，纤细薯蓣皂苷来自ChromaDex，延龄草皂苷来自Aktin Chemicals。 
前皂苷配基A：薯蓣皂苷配基Rha2，Glc根据Li等Carbohydr.Res.，(2001)331，1-7所述方法合成。薯蓣皂苷和前皂苷配基A分离自七叶一枝花(Paris polyphylla)。 
将甾体皂苷溶于二甲亚砜(DMSO)，得到10mM或1mM的原液，按各个实验所需从该原液制备进一步的稀释液。 
顺铂、多西紫杉醇、紫杉醇、多柔比星、长春新碱和伊马替尼得自商业来源，并根据要求保存于4℃或-20℃。它们分别是：紫杉醇(安泰素注射液(Faulding)；硫酸长春新碱(Sigma)；盐酸多柔比星(Sigma)；多西紫杉醇(Sigma)：顺铂(Sigma)和甲磺酸伊马替尼(NovartisGlivec)。 
根据需要的原液浓度(针对每个测定)在适当的稀释剂(DMSO、无菌水或盐水)中制备化疗药剂。使用仅有DMSO的溶液作为阴性对照。 
(ii)细胞 
人癌细胞类型为：A549(肺)；CI80-13S(卵巢)；HT29(结肠)；MCF7(乳腺)；PC3(前列腺)；DU145(前列腺，激素非依赖性)；LNCap(激素依赖性)；K562(白血病)。小鼠癌细胞类型为：B16(黑素瘤)。 
在施用药物前一天将细胞一式三份或一式四份接种至96孔板中，使其在药物存在下生长6天，然后使用染料测定来确定相对于未处理对照孔的细胞生长。 
(iii)细胞培养 
以3～4,000个/微孔将细胞一式三份或一式四份接种至微孔中的90μl RPMI培养基/10％胎牛血清/青霉素、链霉素混合物中，用10μl药物(以10倍所需浓度在稀释板中制备)进行处理，并使其生长至对 照接近汇合(6天)。 
SRB：用PBS洗涤平板，用甲醇变性酒精(methylated spirits)固定，用自来水洗涤并用50μL/孔的SRB溶液(磺酰罗丹明，0.4％，在1％乙酸中)染色，接着用自来水和1％乙酸洗涤，溶于Tris中并在ELISA读数仪中读出564 nm的吸光度。 
MTS：每孔细胞中加入10μl MTS溶液，使之在37℃孵育1～4小时至显出深褐色。接着在每孔细胞中加入10μl 10％SDS以分散细胞。接着将测定板以2000rpm离心15分钟，并在Elisa读数仪中读出490nm的吸光度。 
使用ELISA平板读数仪软件——SOFTmax PRO3.1.2采集数据，接着输入至EXCEL中。在减去空白值(无细胞的孔)后，将重复实验的平均值和SD计算为对照的百分比。将对照的百分比与药剂的剂量作图并测得IC50(半数最高抑制浓度)值作图。 
或者，将细胞接种至2mL孔中，在生长24小时后用0.1、0.5和1.0μM的甾体皂苷进行处理。在与药物一起孵育24、48和72小时后收获细胞。在每个时间点对细胞进行计数，离心(5分钟，1500rpm，室温)沉淀，重悬于1mL PBS中并轻柔涡旋。加入2mL冰冷的甲醇并对细胞进行涡旋。一经收集了来自所有时间点的细胞，随即将每个样品以12000rpm离心4～5分钟，重悬于400μl PBS中并加入100μl 5×碘化丙锭(PI)染料(见下文)。将样品涡旋，通过尼龙滤器进行过滤，然后在488nm处进行流式细胞术分析。将细胞亚群的相对DNA含量表示为直方图，每个样品一般分析20,000个细胞。 
实施例2
测定甾体皂苷和抗癌剂的IC50值 
使用以下癌细胞系： 
A549-肺 
HT29-结肠 
MCF7-乳腺 
PC3-前列腺(激素非依赖性) 
DU145-前列腺(激素非依赖性) 
LNCap-前列腺(激素依赖性) 
K562-人红白血病。 
测定了以下甾体皂苷在用作单药剂时对癌细胞系的抑制： 
薯蓣皂苷：薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc 
三角叶薯蓣皂苷：薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc 
前皂苷配基A：薯蓣皂苷配基Rha2，Glc。 
测定了以下化疗药物和分子靶向药剂在用作单药剂时对癌细胞的抑制： 
化疗药剂： 
顺铂 
多西紫杉醇 
紫杉醇 
多柔比星 
长春新碱 
分子靶向药剂： 
伊马替尼。 
将甾体皂苷和上述抗癌剂溶于DMSO中，并用培养基将其稀释成每项应用所需的溶液。使用仅DMSO溶液作为阴性对照。 
将肿瘤细胞以2～5,000个/微孔一式二份接种到含有RPMI培养 基/10％胎牛血清的96孔板中。使细胞生长至5-6天后直至对照接近汇合。接着用PBS洗涤平板，用乙醇固定并以50μL/孔的SRB溶液(磺酰罗丹明，0.4％，在1％乙酸中)染色，其后用1％乙酸洗涤并溶于Tris中。使用ELISA读数仪在564nm处读出吸光度。 
使用Finney(Finney DJ(1971).Probit Analysis.第三版.Cambridge University Press)的概率计算法，由抑制百分比和浓度数据来确定IC50或抑制细胞生长50％所需的浓度。 
对于12×8 ELISA平板中的八种细胞使用表4所述的以下浓度： 
表4 
Figure G2007800327115D00291
从抑制数据中估计得到表5中的以下IC50值： 
表5 
Figure G2007800327115D00292
实施例3
测定甾体皂苷与顺铂、多西紫杉醇、多柔比星和长春新碱的混合物中化疗药剂的IC50值和剂量降低 
使用实施例1的细胞接种和ELISA平板法来测定对两种癌细胞系的抑制。使用LNCap及MCF7细胞系来测定甾体皂苷薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷和前皂苷配基A以及它们与顺铂、多西紫杉醇、多柔比星和长春新碱的混合物的IC50值。 
所述双组分混合物通过混合每种组分IC50值的50％来制成，其中甾体皂苷和化疗药剂的IC50值在表6中给出： 
表6 
测定中使用的IC50值(μM) 
  LNCap MCF7
薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷前皂苷配基A顺铂多西紫杉醇多柔比星长春新碱 1120.80.000030.0040.0005 1120.80.000030.0150.0005
如表7所示制成混合物： 
表7 
Figure G2007800327115D00301
这样，在4号ELISA细胞中(放大因数＝1)，浓度为每一种类IC50值的50％：薯蓣皂苷为1μM的50％，顺铂为0.8μM的50％。 
表8提供了对设置ELISA细胞浓度的进一步说明，其中在4号ELISA细胞中(放大因数＝1)，浓度为每一种类IC50值的50％：针对 MCF7，前皂苷配基A为2μM的50％，多柔比星为0.015μM的50％。 
表8 
Figure G2007800327115D00311
使用来自每一混合物的抑制数据来确定IC50的IC50值，其中所使用的浓度为放大因数值。为了确定双组分混合物中每一组分的实际IC50贡献，用IC50的IC50值乘以所述各组分的IC50。这接着可用于确定化疗药剂的IC50贡献由于混合物中存在甾体皂苷而发生的降低(即剂量降低)。一种测定剂量降低的较简单方法是使用以下的简单公式： 
Figure G2007800327115D00312
以下表9中测定了本实施例甾体皂苷的IC50值的IC50： 
表9 
  LNCapIC50的IC50 MCF7IC50的IC50
薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷前皂苷配基A 0.560.420.89 1.10.671.1
表10中给出了化疗药剂及其与甾体皂苷的混合物的IC50的IC50值，以及每种化疗药剂在与甾体皂苷混合时所测定的剂量降低： 
表10 
顺铂混合物 
Figure G2007800327115D00321
在甾体皂苷与顺铂的混合物中没有有效或一致的顺铂剂量降低。 
多西紫杉醇混合物 
  LNCapIC50的IC50 多西紫杉醇剂量降低 MCF7IC50的IC50 多西紫杉醇剂量降低
多西紫杉醇多西紫杉醇+薯蓣皂苷多西紫杉醇+三角叶薯蓣皂苷多西紫杉醇+前皂苷配基A 3.71.30.972.0  82％87％73％ 83.21.72.0  80％89％88％
在甾体皂苷与多西紫杉醇的混合物中可观察到一致的多西紫杉醇剂量降低。 
多柔比星混合物 
Figure G2007800327115D00322
在甾体皂苷与多柔比星的混合物中观察到了多柔比星剂量降低，其中薯蓣皂苷和三角叶薯蓣皂苷提供了比前皂苷配基A更高的剂量降低。 
长春新碱混合物 
Figure G2007800327115D00331
在薯蓣皂苷及三角叶薯蓣皂苷与长春新碱的混合物中观察到一致的长春新碱剂量降低，而前皂苷配基A则事实上显示了长春新碱剂量的零降低。 
实施例4
测定甾体皂苷与紫杉醇的混合物中紫杉醇的IC50值和剂量降低。 
使用实施例1的细胞接种和ELISA平板法来测定对两种癌细胞系的抑制。使用A549和MCF7细胞系来测定甾体皂苷薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷及前皂苷配基A以及它们与紫杉醇的混合物的IC50值。 
所述双组分混合物以实施例2同样的方式通过混合每种组分IC50值的50％来制成，其中甾体皂苷和紫杉醇的IC50值在表11中给出： 
表11 
测定中使用的IC50值(μM) 
  A549 MCF7
薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷前皂苷配基A紫杉醇 1120.003 1120.001
使用实施例2所述的计算方法，对本实施例的甾体皂苷测定了表12中的以下IC50的IC50值： 
表12 
  A549IC50的IC50 MCF7IC50的IC50
薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷前皂苷配基A 1.90.700.99 1.91.21.0
表13中给出了紫杉醇及其与甾体皂苷的混合物的IC50的IC50值，以及在与甾体皂苷混合时测得的紫杉醇剂量降低： 
表13 
紫杉醇混合物 
  LNCapIC50的IC50 紫杉醇剂量降低 MCF7IC50的IC50 紫杉醇剂量降低
紫杉醇紫杉醇+薯蓣皂苷紫杉醇+三角叶薯蓣皂苷紫杉醇+前皂苷配基A 1.72.21.0 2.3  35％71％ 32％ 1.51.91.5 2.3  37％50％ 23％
在甾体皂苷与多柔比星的混合物中观察到紫杉醇剂量降低，其中三角叶薯蓣皂苷提供了比薯蓣皂苷和前皂苷配基A更高的剂量降低。 
实施例5
测定甾体皂苷与顺铂、多西紫杉醇、多柔比星及长春新碱的混合物中化疗  药剂的IC50值以及剂量降低 
使用实施例1的细胞接种和ELISA平板法来测定对四种癌细胞系的抑制。使用PC3、DU145、A549和HT29细胞系来测定甾体皂苷薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷及前皂苷配基A以及它们与顺铂、多西紫杉醇、多柔比星和长春新碱的混合物的IC50值。 
所述双组分混合物以实施例2中同样的方式通过混合每种组分IC50值的50％来制成，其中甾体皂苷和化疗药剂的IC50值在表14中给出： 
表14 
Figure G2007800327115D00351
使用实施例2所述的计算方法，对本实施例的甾体皂苷测定了表15中的以下IC50的IC50值： 
表15 
Figure G2007800327115D00352
表16至19中给出了化疗药剂及其与甾体皂苷的混合物的IC50的IC50值，以及在与甾体皂苷混合时测得的每种化疗药剂的剂量降低： 
表16 
Figure G2007800327115D00362
使用顺铂时，在所有情形中均提供了剂量降低，只有顺铂+薯蓣皂苷对DU145和HT29为极低降低至零降低，以及顺铂+前皂苷配基A对HT29为极低降低。 
表17 
使用多西紫杉醇时，每种甾体皂苷混合物对四种细胞系中的每一种均提供了剂量降低，如表17所示。 
表18 
Figure G2007800327115D00371
Figure G2007800327115D00372
使用多柔比星时，每种甾体皂苷混合物对四种细胞系中的每一种均提供了剂量降低，如表18所示。 
表19 
Figure G2007800327115D00381
Figure G2007800327115D00382
使用长春新碱时，每种甾体皂苷混合物对四种细胞系中的每一种均提供了剂量降低，如表19所示。 
实施例6
测定甾体皂苷与伊马替尼的混合物中伊马替尼的IC50值和剂量降低。 
使用实施例1的细胞接种和ELISA平板法来测定对K562细胞系的抑制。使用K562细胞系来测定甾体皂苷薯蓣皂苷、三角叶薯蓣皂苷及前皂苷配基A以及它们与伊马替尼的混合物的IC50值。 
所述双组分混合物以与实施例2同样的方式通过混合每种组分IC50值的50％来制成，其中甾体皂苷和伊马替尼的IC50值在表20中给出： 
表20 
Figure G2007800327115D00391
使用实施例2所述的计算方法，对本实施例的甾体皂苷测定了以下IC50的IC50值，并示于表21中： 
表21 
  K562IC50的IC50
薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷前皂苷配基A 1.20.691.2
表22中给出了伊马替尼及其与甾体皂苷的混合物的IC50的IC50值，以及在与甾体皂苷混合时测得的伊马替尼剂量降低： 
表22 
伊马替尼混合物 
使用伊马替尼时，每种甾体皂苷混合物对K562细胞系均提供剂量降低。 
实施例7
测定与甾体皂苷共施用时化疗药物抗癌活性的体内增强程度 
5-氟尿嘧啶(5FU)是结肠癌治疗中使用的主要化疗药物，它通常与其他化疗药剂一起施用。本研究将5-氟尿嘧啶和三角叶薯蓣皂苷的共施用与5-氟尿嘧啶及三角叶薯蓣皂苷的单独施用进行了比较。 
将72只雌性Balb/c裸鼠植入微芯片，称重并基于体重随机分派到8个组中，每组9只。 
下表中给出了治疗方案，将它们均配制到NMP∶PEG300∶水(1∶9∶10，体积/体积)中并每日施用，5-氟尿嘧啶为静脉注射，其他为腹膜内注射(NMP＝N-甲基吡咯烷酮)： 
表23 
处理     剂量     给药
5-氟尿嘧啶 5-氟尿嘧啶+三角叶薯蓣皂苷 5-氟尿嘧啶+三角叶薯蓣皂苷5-氟尿嘧啶+三角叶薯蓣皂苷 三角叶薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷三角叶薯蓣皂苷     37.5mg/kg     37.5/1.65mg/kg     37.5/3.3mg/kg    37.5/6.6mg/kg     1.65mg/kg    3.3mg/kg    6.6mg/kg     每周腹膜内注射    每周静脉注射/每日    腹膜内注射    每周静脉注射/每日    腹膜内注射    每周静脉注射/每日    腹膜内注射    每日腹膜内注射    每日腹膜内注射    每日腹膜内注射
将HT29人前列腺癌细胞培养在RPMI1640细胞培养基中，其中补充了10％FBS和青霉素/链霉素(50IU/mL终浓度)。通过胰蛋白酶消化来收获细胞，用HBSS洗涤两次并计数。然后将细胞重悬于HBSS中并调整至含有2×107个细胞/mL的终体积。对于接种来说，将针在右肩下方透过皮肤插入皮下空间中，在其中释放100μL细胞(2×106)。 
当肿瘤体积达到平均200mm3时开始进行处理(第0天)。每周测量肿瘤体积三次，并根据下式确定： 
V(mm3)＝长度×直径2×π/6。 
处理连续进行17天。每种给药方案的平均肿瘤体积在表24中给出，并图示于图1中： 
表24 
 处理/天 0  2  4  7  9  11  14  16  18
 5-氟尿嘧啶(5FU) (37.5mg/kg) (1×每周) 236  280  307  330  432  511  681  676  824
 5FU/三角叶薯蓣皂苷 (37.5/1.65mg/kg) (1×每周/每日) 216  207  249  294  255  339  386  441  523
 5FU/三角叶薯蓣皂苷 (37.5/3.3mg/kg) (1×每周/每日) 235  212  229  278  264  315  381  451  598
 5FU/三角叶薯蓣皂苷 (37.5/6.6mg/kg) (1×每周/每日) 236  206  244  281  292  339  440  532  543
 三角叶薯蓣皂苷 (1.65mg/kg)(每日) 236  260  299  294  350  462  594  644  776
 三角叶薯蓣皂苷 (3.3mg/kg)(每日) 236  242  271  331  413  489  558  742  842
 三角叶薯蓣皂苷 (6.6mg/kg)(每日) 235  233  265  310  399  490   588  671  692
三角叶薯蓣皂苷与5-氟尿嘧啶联合处理时的肿瘤体积小于任何单独处理(即仅有5-氟尿嘧啶或仅有三种三角叶薯蓣皂苷处理中的任一种)的肿瘤体积。 
最后，应当理解，对本文所述发明的方法及组合物的多种修改和改变对于本领域技术人员来说是很明显的，而不偏离本发明的范围和构思。尽管结合一些具体实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求保护的发明不应受到这些具体实施方案的过度限制。事实上，对实施本发明之所述模式进行的多种修改对于本领域技术人员来说是很明显的，并且旨在包括在本发明的范围之中。 

Claims (6)

1.甾体皂苷和抗癌剂在制备用于预防和/或治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述甾体皂苷选自三角叶薯蓣皂苷、表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc的薯蓣皂苷和前皂苷配基A，所述抗癌剂是选自以下一种或多种的药剂：顺铂、紫杉醇、多西紫杉醇、硫酸长春新碱、多柔比星和5-氟尿嘧啶，并且所述受试者患有或易感于选自以下的癌症：乳腺癌、结肠癌、白血病、肺癌和前列腺癌。
2.权利要求1的用途，其中所述三角叶薯蓣皂苷表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc，所述前皂苷配基A表示为薯蓣皂苷配基Rha2，Glc。
3.组合产品，其包含：
甾体皂苷；和
抗癌剂；
其中所述甾体皂苷和所述抗癌剂以向受试者共施用的形式提供，或以向受试者分开施用的形式提供，其中所述甾体皂苷选自三角叶薯蓣皂苷、表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc的薯蓣皂苷和前皂苷配基A，并且所述抗癌剂是选自以下一种或多种的药剂：顺铂、紫杉醇、多西紫杉醇、硫酸长春新碱、多柔比星和5-氟尿嘧啶。
4.权利要求3的组合产品，其中所述三角叶薯蓣皂苷表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc，所述前皂苷配基A表示为薯蓣皂苷配基Rha2，Glc。
5.抗癌组合物，所述组合物包含抗癌剂和甾体皂苷，其中所述甾体皂苷选自三角叶薯蓣皂苷、表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Rha4]，Glc的薯蓣皂苷和前皂苷配基A，并且所述抗癌剂是选自以下一种或多种的药剂：顺铂、紫杉醇、多西紫杉醇、硫酸长春新碱、多柔比星和5-氟尿嘧啶。
6.权利要求5的抗癌组合物，其中所述三角叶薯蓣皂苷表示为薯蓣皂苷配基Rha2，[Glc4]，Glc，所述前皂苷配基A表示为薯蓣皂苷配基Rha2，Glc。
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