CN101495497B - 二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应，合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸。根据该方法，可以使用非保护的嘧啶核苷5’-磷酸类作为原料，可以以50％以上的合成收率获得目标物二(嘧啶核苷5’-)多磷酸，因此作为二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的大量合成方法是适合的方法。
Description
技术领域
本发明涉及二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的高效率的制备方法。
背景技术
下述式(I)表示的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸中，例如由于P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸(Up4U)或其盐具有促进排痰的作用，因此是作为祛痰药或肺炎治疗药有待于开发的化合物，P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)或其盐是P2Y2和/或P2Y4嘌呤受体的选择性激动剂，因此是作为慢性支气管炎、副鼻腔炎等的治疗药有待于开发的化合物。
式中，R1和R2表示氢原子或羟基，B1和B2表示嘧啶碱基，R1和R2以及B1和B2各自可以相同也可以不同，n表示1～4的整数。
作为上述二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成方法，例如当为Up4U时，以尿苷5’-单磷酸(UMP)作为起始原料，使用氯磷酸二苯酯(DPC)等活化剂和焦磷酸(PPi)等磷酸化剂来合成，但目标化合物的合成收率极低、为约10％，根本无法成为实际应用的方法(专利文献1)。
因此，作为改善这些方法的尝试，正在研究经由核苷5’-环状三磷酸的方法。具体而言，有人报道了使尿苷5’-环状三磷酸与UMP反应制备Up4U的方法(非专利文献1)、使腺苷5’-环状三磷酸与腺苷5’-单磷酸 反应制备P1，P4-二(腺苷5’-)四磷酸的方法(非专利文献2)。
专利文献1：WO99/5155
非专利文献1：Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，11(2001)，157-160
非专利文献2：Organic Letters，第8卷，No.10，2075-2077(2006)
发明内容
发明所要解决的课题
有报道称，使尿苷5’-环状三磷酸与UMP反应制备Up4U的方法可以以32％的收率合成Up4U(非专利文献1)。但是，在该反应条件下要求高达40℃的反应温度，在该加热条件下生成大量的除目标物以外的副产物，因此存在着非常难以纯化的问题。特别是在加热下进行如dCp4U等非对称型的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成时，同时还副生结构与目标物酷似的对照型Up4U，在各种纯化条件下几乎都不能分离。由此可知：在核苷5’-环状三磷酸与核苷5’-单磷酸的反应中，在不会使副产物增加的室温左右的温度下实施反应至关重要。但是，在室温左右实施该反应时，如后述实施例中详述的那样，无法重现该收率，所得Up4U的合成收率极低，为10％以下。
另一方面，在报道了使腺苷5’-环状三磷酸与腺苷5’-单磷酸反应得到P1，P4-二(腺苷5’-)四磷酸的方法的文献中，暗示了该方法可适用于各种二(核苷5’-)多磷酸的主旨，但是用于合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸时的具体数据则完全没有显示。另外，该方法使用保护了羟基和氨基的核苷酸作为原料化合物，因此在合成目标化合物之后必需将该保护基进行脱保护，结果，使操作变得复杂，同时也成为收率下降的原因之一。另外，反应中使用的试剂类必须大大过剩地使用，在成本上也不利。更重要的是，在我们进行的将该方法应用于合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的追加试验中，如后述所示，存在着目标化合物的合成收率低、绝对不能满足要求的问题。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述问题反复进行了深入研究，结果发现：通过使嘧啶核苷5’-环状三磷酸和嘧啶核苷酸在特定的金属盐、特别是镁盐的存在下反应，即使在室温下，与公知的方法相比也可以显著提高目标物二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成收率，从而完成了本发明。因此本发明内容如下。
〔1〕二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法，其特征在于：使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应。
〔2〕上述〔1〕所述的制备方法，其中二(嘧啶核苷5’-)多磷酸为下述式(I)表示的化合物：
式中，R1和R2表示氢原子或羟基，B1和B2表示嘧啶碱基，R1和R2以及B1和B2各自可以相同也可以不同，n表示1～4的整数。
〔3〕上述〔1〕所述的制备方法，其中缩合剂为碳化二亚胺类。
〔4〕上述〔1〕所述的制备方法，其中金属盐为镁盐。
〔5〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法在15～30℃的温度条件下反应。
〔6〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和尿苷5’-单磷酸(UMP)来制备P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸(Up4U)。
〔7〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和尿苷5’-二磷酸(UDP)来制备P1，P5-二(尿苷5’-)五磷酸(Up5U)。
〔8〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和2’-脱氧胞苷5’-单磷酸(dCMP)来制备P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)。
〔9〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(dCTP)和尿苷5’-单磷酸(UMP)来制备P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)。
发明效果
本发明的合成方法，其最大优点在于：将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸之后，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应时，在选自镁、锰和铁的金属盐、特别是镁盐的存在下进行反应。
即，根据以往的方法，在嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸的反应中，采用完全不存在金属盐(非专利文献1)或在锌盐的存在下进行反应的方法(非专利文献2)。
但是，在本发明人等的研究中明确：在经由核苷5’-环状三磷酸的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成中，在不存在金属盐的非专利文献1的方法中，二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成收率极低，且反应温度还较高、达到40℃，生成大量的目标物以外的副产物，因此还存在纯化极其困难的问题。
另外，在锌盐的存在下反应的非专利文献2的方法虽然是适于合成P1，P4-二(腺苷5’-)四磷酸的方法，但在本发明人等的研究中可知：该方法不适于合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸，其合成收率未必高。
在这样的状况下，在非专利文献2中，本发明人等首次发现：被指出不比锌盐有效的镁盐，完全意外地在二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的合成中极其有效。即，根据本发明的方法，以非保护的核苷酸类作为起始原料，利用不需进行保护、脱保护步骤的简便操作方法，可以以远远高于现有方法的合成收率(50.5～94.3％)合成目标化合物，并且由于 反应温度为室温左右和温和的反应条件，因此具有副产物也少、纯化容易的优点，是适合于工业上大量合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的方法。
实施发明的最佳方式
如上所述，本发明方法如下：使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰及铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应，合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸。
作为用于将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸的缩合剂，可以使用：二环己基碳化二亚胺(DCC)、水溶性碳化二亚胺(WSC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)等碳化二亚胺类；羰基二咪唑(CDI)、氯磷酸二苯酯(DPC)等磷酰卤化物；甲苯磺酰氯等磺酰卤化物等公知的缩合剂，特别优选碳化二亚胺类。
反应根据所使用的缩合剂而不同，例如可以通过在二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、甲酰胺(FA)、吡啶、二噁烷、二甲基亚砜等的单独或混合溶剂中，相对于1摩尔的嘧啶核苷5’-三磷酸(NTP)使用1～5摩尔的缩合剂，在0℃～50℃、优选15～30℃下反应1～10小时左右来实施。
更具体而言，使用DIPC作为缩合剂时，可以通过在DMF中，相对于1摩尔的NTP使用1～5摩尔、优选1.2～1.4摩尔的DIPC，在0℃～50℃、优选20～30℃下反应3～5小时左右来实施。
如此操作而得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸，不用分离、接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下与嘧啶核苷酸反应，合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸。
作为反应中共存的金属盐，只要是选自镁、锰和铁的金属盐即可，没有特别限定。具体可以例示：氟化镁、氯化镁、溴化镁、碘化镁、氯化锰、氯化铁等金属卤化物；镁、锰、铁的硫酸、硝酸、磷酸、高 氯酸、四氟硼酸盐等金属无机酸盐；镁、锰、铁的三氟甲磺酸、甲磺酸、甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、硬脂酸、枸橼酸盐等金属有机酸盐等。
上述金属盐中，从合成收率及容易操作的角度考虑，优选镁盐，特别优选氯化镁。需要说明的是，所使用的金属盐可以是无水物也可以是水合物。
反应可以如下实施：相对于1摩尔的嘧啶核苷5’-环状三磷酸，添加1～5摩尔、优选1.0～1.3摩尔的嘧啶核苷酸和1～5摩尔、优选1.0～1.3摩尔的金属盐，在0～100℃、优选15～30℃下反应1～24小时左右。
反应后，对于合成目标物的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸，可以适当组合通常的核苷酸的分离纯化中所使用的方法(例如，重结晶法、离子交换柱层析法、吸附柱层析法、活性炭柱层析法等)进行分离纯化，根据需要还可以制成盐的形式。
例如，作为离子交换柱层析法中使用的离子交换树脂，可以使用碱性阴离子交换树脂(例如アンバ一ライトIRA402〔ロ一ム&ハ一ス社制〕、ダイアイオンPA-312、ダイアイオンSA-11A〔三菱化学社制〕)、弱碱性阴离子交换树脂(例如，アンバ一ライトIRA67〔ロ一ム&ハ一ス社制〕、ダイアイオンWA-30〔三菱化学社制〕)、强酸性阳离子交换树脂(例如，ダイアイオンPK-216〔三菱化学社制〕)或弱酸性阳离子交换树脂(例如，ダイアイオンWK-30〔三菱化学社制〕)等。
作为活性炭，可以使用成形为破碎状或粒状的色谱用活性炭，例如可以使用和光纯药工业社、二村化学工业社制等的市售品。
另外，重结晶法可如下进行：向得到的已纯化的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸或其盐中加入亲水性有机溶剂，使晶体析出。使用的亲水性有机溶剂可以例示：甲醇、乙醇等碳原子数为6以下的醇类；丙酮等酮类；二噁烷等醚类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺等酰胺类等，特别是可以列举醇类、优选乙醇。
上述本发明方法可适用于二(嘧啶核苷5’-)多磷酸、具体例如有上 述式(I)表示的二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备，并不限于特定化合物的制备。例如可适用于：(1)使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和尿苷5’-单磷酸(UMP)的P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸(Up4U)的合成；(2)使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和尿苷5’-二磷酸(UDP)的P1，P5-二(尿苷5’-)五磷酸(Up5U)的合成；(3)使用尿苷5’-三磷酸(UTP)和2’-脱氧胞苷5’-单磷酸(dCMP)的P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)的合成；(4)使用2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(dCTP)和尿苷5’-单磷酸(UMP)的P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)的合成等。
实施例
以下，给出实施例来具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1：金属盐对P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸(Up4U)的合成收率的效果
(1)尿苷5’-环状三磷酸(cUTP)二甲基甲酰胺溶液的制备
将5.00g(9.10mmol)尿苷5’-三磷酸(UTP)三钠溶解于去离子水中，制成50mL溶液，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、27cc)，与洗涤液合并，用8.7mL(37mmol)三丁胺进行中和。减压下浓缩该溶液，之后将残余物用20mL二噁烷共沸4次。将残余物溶解于50mL二甲基甲酰胺中，制成0.15M的UTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液。向该溶液中加入1535μL(10.0mmol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时，制成0.15M的cUTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液。
(2)尿苷5’-单磷酸(UMP)三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液的制备
向4.4mL(9.0mmol)2.05M的UMP水溶液中加入4.4mL(19mmol)三丁胺进行浓缩。残余物用20mL二噁烷共沸6次，之后溶解于50mL二甲基甲酰胺中，制成0.18M的UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液。
(3)研究金属盐在cUTP与UMP的反应中的效果
向上述(1)的500μL(75.0μmol)0.15M的cUTP三丁胺盐二甲基甲 酰胺溶液中加入上述(2)的500μL(90.0μmol)0.18M的UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液和表1所示的各种金属盐的200μL(90.0μmol)0.45M的二甲基甲酰胺溶液，在室温(25℃)下反应1小时。用HPLC(262nm)分析反应液，求出目标物Up4U的合成收率。其结果见表1。
[表1]
OTf：三氟甲磺酸
由表1的结果可知：在由cUTP和UMP合成Up4U的反应中，在金属盐未共存的情况下合成收率为3.8％(非专利文献1的方法：项目号8)；在锌盐共存的情况下合成收率为19.1～24.7％(非专利文献2的方法：项目号6～7)，相对于此，在选自铁、锰和镁的金属盐共存的情况下，合成收率显著提高，达到60％以上；特别是在镁盐共存的情况下，可以达到80％以上的合成收率(项目号1～5)。
实施例2：Up4U-钠盐的合成
(1)UTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液
将1.00g(1.82mmol)UTP三钠盐溶解于13mL去离子水中，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、10cc)，与洗涤液合并，用1.75mL(7.35mmol)三丁胺进行中和。减压下浓缩该溶液，之后将残余物用10mL二噁烷共沸4次。将残余物溶解于10mL二甲基甲酰胺中，制成0.133 M的UTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液。
(2)UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液
向1.06mL(2.18mmol)2.05M的UMP水溶液中加入1.06mL(4.46mmol)三丁胺进行浓缩。残余物用10mL二噁烷共沸4次，之后溶解于10mL二甲基甲酰胺中，制成0.184M的UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液。
(3)Up4U的合成
向上述(1)的UTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液中加入364μL(2.37mmol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时。向其中加入上述(2)的0.184M的UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液和将207.5mg(2.179mmol)无水氯化镁溶解于4.9mL二甲基甲酰胺中的溶液，在室温下搅拌255分钟。所得溶液用HPLC(262nm)进行分析，结果可知：由UTP以84.2％的合成收率生成了目标物Up4U。
(4)Up4U的纯化、分离
向上述(3)的反应溶液中加入6.5mL去离子水，减压下浓缩。向残余物中加入25mL去离子水，滤去生成的沉淀，之后合并滤液、洗液，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、20cc)。合并通过液、洗液，用三乙胺调节至pH7.5。使该溶液吸附在阴离子交换柱(IRA67-氯化物离子型、40cc)上，用0.15N的盐酸、去离子水依次清洗，之后将目标物用0.3-0.4M的碳酸氢铵水溶液进行洗脱。减压下浓缩含有目标物的馏分，之后将残余物用去离子水进行共沸，冷冻干燥。将所得残余物溶解于去离子水中，之后使之通过强阳离子交换柱(pK216-钠型、40cc)，合并洗脱液、洗涤液，减压下浓缩。将残余物溶解于去离子水中，之后加入乙醇进行冷却。过滤收集析出的晶体，得到1.08g(1.23mmol、67.7％)Up4U-钠盐。
实施例3：P1，P5-二(尿苷5’-)五磷酸(Up5U)的合成
加入500μL(75.0μmol)0.15M的cUTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶 液、584μL(90.0μmol)0.154M的尿苷5’-二磷酸(UDP)三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液、200μL(90.0μmol)0.45M的无水氯化镁二甲基甲酰胺溶液，在室温下搅拌72小时。所得溶液用HPLC(262nm)进行分析，结果可知：由UTP以50.5％的合成收率生成目标物Up5U。
实施例4：以2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(dCTP)作为起始原料的P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)的合成
向166μL(16.7μmol)0.144M的dCTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液中加入3.4μL(22.1μmol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时。加入0.18M的UMP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液、0.45M的无水氯化镁或氯化锌二甲基甲酰胺溶液，使达到表2所示的当量数，在室温下搅拌1小时。所得反应液用HPLC(272nm)进行分析，求出目标物dCp4U的合成收率。其结果见表2。
[表2]
由表2可知：通过在1.2～2.4当量的氯化镁存在下，使1.2～2.4当量的UMP与1当量的dCTP反应1小时，由dCTP以66.0～77.2％的高合成收率生成dCp4U。另一方面，在氯化锌的存在下，仅以10％以下的低收率合成了目标化合物，即使增加氯化锌的当量数，收率提高也不明显。
实施例5：以尿苷5’-三磷酸(UTP)作为起始原料的P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸(dCp4U)的合成
将0.15M的cUTP三丁胺盐二甲基甲酰胺溶液、0.15M的2’-脱氧胞苷5’-单磷酸(dCMP)三丁胺盐甲酰胺溶液、0.45M的氯化镁六水合物二甲基甲酰胺溶液按照表3所示的量比进行混合，用二甲基甲酰胺进行调整，使总量达到1mL。在室温下搅拌1小时，之后将所得溶液用HPLC(272nm)进行分析，求出目标物dCp4U的合成收率。
[表3]
| 项目号 | 0.15M的 cUTP (当量数) | 0.15M的 dCMP (当量数) | 0.45M的 MgCl2 6H2O (当量数) | dCp4U 合成收率(％)* |
| 1 | 200μL (1) | 200μL (1) | 67μL (1) | 51.7％ |
| 2 | 200μL (1) | 240μL (1.2) | 67μL (1) | 54.7％ |
| 3 | 300μL (1.5) | 200μL (1) | 100μL (1.5) | 65.9％ |
| 4 | 400μL (2) | 200μL (1) | 133μL (2) | 94.3％ |
| 5 | 500μL (2.5) | 200μL (1) | 167μL (2.5) | 91.3％ |
| 6 | 200μL (1) | 200μL (1) | - | 14.0％ |
*：根据dCMP计算的dCp4U的合成收率
由表3可知：通过使dCMP和cUTP在氯化镁存在下反应1小时，由dCMP定量地生成dCp4U。另外，还确认到：在氯化镁未共存时，收率显著下降。
Claims (9)
1.二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法，其特征在于：在二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲酰胺、吡啶、二烷、二甲基亚砜的单独或混合溶剂中，使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应。
2.权利要求1所述的制备方法，其中二(嘧啶核苷5’-)多磷酸为下述式(I)表示的化合物：
式中，R1和R2表示氢原子或羟基；B1和B2表示嘧啶碱基，R1和R2以及B1和B2各自可以相同也可以不同；n表示1～4的整数，但n不为1。
3.权利要求1所述的制备方法，其中缩合剂为碳化二亚胺类。
4.权利要求1所述的制备方法，其中金属盐为镁盐。
5.权利要求1所述的制备方法，该方法是在15～30℃的温度条件下反应。
6.权利要求1所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸和尿苷5’-单磷酸来制备P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸。
7.权利要求1所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸和尿苷5’-二磷酸来制备P1，P5-二(尿苷5’-)五磷酸。
8.权利要求1所述的制备方法，该方法是使用尿苷5’-三磷酸和2’-脱氧胞苷5’-单磷酸来制备P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸。
9.权利要求1所述的制备方法，该方法是使用2’-脱氧胞苷5’-三磷酸和尿苷5’-单磷酸来制备P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸。
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