CN101443330B - 杂环非核苷类化合物及其制备方法、药物组合物和作为抗病毒抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类抗病毒抑制剂，具体而言，公开了一类由如下结构式表示的杂环非核苷类化合物及其制备方法，以及包含该类化合物的药物组合物，该类化合物可用作抗病毒抑制剂，用作治疗乙型肝炎、流感、疱疹、艾滋病等疾病的药物。

Description

杂环非核苷类化合物及其制备方法、药物组合物和作为抗病毒抑制剂的用途
技术领域
本发明涉及一类抗病毒抑制剂，具体而言，涉及一类杂环非核苷类化合物及其制备方法，以及包含该类化合物的药物组合物，该类化合物可用作抗病毒抑制剂，用作治疗乙型肝炎、流感、疱疹、艾滋病等疾病的药物。
背景技术
人类致病病毒是一种核酸颗粒，结构极为简单，多数缺乏酶系统，只能依赖宿主细胞复制其核酸和蛋白质，然后装配成病毒颗粒而增殖。病毒感染引起多种疾病，严重危害人类的健康和生命。据不完全统计，约60％流行性传染病是由病毒感染引起的。迄今，全世界已发现的病毒超过3000种，而且新的病毒还在不断被发现。2002年8月在巴黎召开的世界病毒学大会上，由国际病毒分类委员会提出的第7份报告收录了3600多种病毒，其中使人类致病的病毒有1200多种，分为29个科，7个亚科，53个属。当前，发病率高、危害大的病毒主要有流感病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒等。
对病毒性疾病的治疗至今仍缺乏专属性强的药物，临床上常用的药物主要有如下几类：抑制病毒复制的抗病毒药；增强机体免疫功能的免疫调节剂；针对临床症状的止咳、镇痛、解热和消炎等治疗药；防止继发感染的抗感染药；预防病毒感染的疫苗及阻断病毒传播的消毒药等。
国外对治疗病毒性疾病新药的研制侧重于开发抗病毒药。目前，抗流感病毒药物有金刚烷胺类药物、流感病毒神经氨酸酶抑制剂、流感病毒受体阻断剂和抗流感病毒反义寡核苷酸等，临床应用的主要为金刚烷胺类药物和神经氨酸酶抑制剂。肝炎病毒感染是当今国际公认的治疗学难题，在肝炎病毒中的乙型(HBV)、丙型(HCV)和丁型(HDV)在急性感染后有80％以上会转为慢性，其中，20％若持续感染有可能发展成肝硬化，其中的1％～5％转为肝癌，国际卫生组织已把肝炎列为世界第九死因。我国是病毒性肝炎的高发区，乙型肝炎病毒携带者有1.2亿人，估计每年因病毒性肝炎导致直接经济损失300亿～500亿人民币。因此，探索与开发抗病毒药物是国内外医药学家工作的重点。80年代曾进行试验的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韦、齐多夫定因疗效不佳，毒性反应大，在国外已不再用于治疗乙肝。近几年各大型企业利用已建立的肝癌细胞株、肝炎病毒转染细胞株或转基因细胞株和转基因小鼠肝炎动物模型遴选抗乙型和丙型肝炎病毒药，开发了多种核苷类药物，对HBV有明显的抑制作用。如拉米夫定(lamivudine)、泛昔洛韦(famciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)、阿地福韦(adefovir dipivoxiil)、FTC(二脱氧氟硫代胞嘧啶)、FMAU(氟甲阿糖尿嘧啶)、FDDC(氟二脱氧胞嘧啶)、BMS 200475(环氧羟碳脱氧鸟苷)。1998～2002年国外学者先后对30多个品种进行临床前实验研究。近期进入II～III期临床试验的药物有21个，在这些试验药物中，用于抗乙肝病毒的试验药物多数来自抗HIV逆转酶抑制剂和抗疱疹病毒DNA聚合酶抑制剂，其中，恩替卡韦(enticavir)已经在2005年上市。而用于抗丙肝病毒的试验药物多数来自广谱抗病毒药或RNA病毒抑制剂以及具有抗病毒活性的免疫调节剂。
目前已批准的抗病毒药物中，绝大多数是核苷类化合物，在临床运用过程中发现它们主要存在以下缺点：1)细胞毒性；2)长期用药产生的抗药性病毒变异株的出现，需要结构不相关的不同药物来对抗，因此发展非核苷类抗病毒药物成为一个引人注意的方向。
发明内容
本发明的目的在于设计与合成一类新型的杂环非核苷类化合物作为抗病毒抑制剂，从而为寻找抗病毒药物研究的先导化合物或抗病毒药物开辟途径。
本发明的另一目的在于提供制备本发明杂环非核苷类化合物的方法。
本发明的还一目的在于提供一种含有本发明杂环非核苷类化合物作为活性成分的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供本发明杂环非核苷类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
本发明提供的杂环非核苷类化合物，其具有如下结构式所示的结构：
Figure GWB00000002670200021
其中，X1为NR4、O或S；
R1为吡啶基、取代的吡啶基、苯基、取代的苯基、五元杂环基、取代的五元杂环基或稠杂环基，其中所述的五元杂环基为含有选自N、O和S中一个或两个杂原子的五元杂环基，所述的稠杂环基为喹啉基或吲哚基；
R2和R3各自独立地选自如下基团中的一种：H；卤素原子；硝基；C1-C25烷基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基、酰氧基或C1-C4烷氧基羰基取代的C1-C25烷基；羟基；氨基；C1-C25烷基氨基；C3-C25环烷基氨基；C3-C9环烷基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的C3-C9环烷基；芳基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的芳基；苄基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的苄基；C2-C25烯基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基、酰氧基或C1-C4烷氧基羰基取代的C2-C25烯基；C3-C25环烯基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的C3-C25环烯基；
Figure GWB00000002670200031
Figure GWB00000002670200032
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、芳基、苄基、取代苄基、C1-C6羟烷基、取代或非取代的杂环亚甲基，其中苄基上的取代基可以是卤素、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷胺基、腈基、羧基或C1-C10烷氧羰基；以及脲基或亚脲基；
R4为H、芳基、取代的芳基、苄基、C1-C13烷基、取代的C1-C13烷基、C2-C6的烯基或C3-C6的环烷基，其中所述芳基或C1-C13烷基上的取代基可以为卤素原子、烷氧基、氨基、烷基氨基或羟基。
在本发明的一种优选实施方案中：所述的X1为NR4,R4为氢原子或C1-C4烷基；
所述的R1优选为吡啶基、取代的吡啶基、噻唑基、取代的噻唑基、喹啉基或吲哚基，其中所述取代的吡啶基和取代的噻唑基的取代基为选自羟基、卤素原子、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苄基和C1-C4烷氧羰基氨基中的一个或两个；且R1进一步优选为2-吡啶基、2-噻唑基、2-喹啉基或2-吲哚基；
所述的R2优选为C1-C8直链或支链的烷基或C3-C8环烷基，更优选C1-C6直链或支链的烷基或C3-C6环烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基，最优选异丁基或环己基；
所述的R3为
Figure GWB00000002670200033
或
Figure GWB00000002670200034
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、芳基、苄基、卤代苄基、C1-C10烷基取代的苄基、C1-C10烷氧基取代的苄基、C1-C10烷胺基取代的苄基、腈基取代的苄基、羧基取代的苄基、C1-C10烷氧羰基取代的苄基、取代或非取代的杂环亚甲基；更优选R3为
Figure GWB00000002670200035
其中R′为C1-C6直链或支链的烷基，并优选C1-C4直链或支链的烷基，最优选乙基；
在这种实施方案中，本发明有代表性的具体化合物为如下化合物之一：
Figure GWB00000002670200036
Figure GWB00000002670200041
在本发明另一优选的实施方案中：
所述的X1为O；
所述的R1优选为吡啶基、取代的吡啶基、喹啉基或吲哚基，其中所述取代的吡啶基为选自羟基、卤素原子、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苄基和C1-C4烷氧羰基氨基中的一个或两个取代基所取代的吡啶基；且R1进一步优选为2-吡啶基、2-喹啉基或2-吲哚基；
所述的R2优选为C1-C8直链或支链的烷基或C3-C8环烷基，更优选C1-C6直链或支链的烷基或C3-C6环烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基，最优选异丁基；
所述的R3为
Figure GWB00000002670200042
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、芳基、苄基、卤代苄基、C1-C10烷基取代的苄基、C1-C10烷氧基取代的苄基、C1-C10烷胺基取代的苄基、腈基取代的苄基、羧基取代的苄基、C1-C10烷氧羰基取代的苄基、取代或非取代的杂环亚甲基；更优选R3为其中R′为C1-C6直链或支链的烷基，并优选C1-C4直链或支链的烷基，最优选乙基；
在这种实施方案中，本发明有代表性的具体化合物为如下化合物之一：
Figure GWB00000002670200044
在本发明又一优选的实施方案中：
所述的X1为S；
所述的R1优选为吡啶基、取代的吡啶基、苯基、取代的苯基、噻唑基、取代的噻唑基、喹啉基或吲哚基；其中所述取代的吡啶基、取代的苯基和取代的噻唑基为吡啶基、苯基和噻唑基各自被选自羟基、卤素原子、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基、苄基和C1-C4烷氧羰基氨基中的一个或两个取代基所取代；且R1进一步优选为：吡啶基，羟基取代的吡啶基，苯基，被选自羟基、卤素原子、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基和C1-C4烷氧羰基氨基中的一个或两个取代基所取代的苯基，2-噻唑基，被卤素原子、苯基或C1-C4烷基取代的2-噻唑基，2-喹啉基，或2-吲哚基；
最优选，所述的杂环非核苷类化合物具有如下结构式I所示的结构：
Figure GWB00000002670200051
其中R5和R6各自独立地为氢原子、卤素原子、C1-C4直链或支链的烷基或苯基；
所述的R2优选为C1-C8直链或支链的烷基、C3-C8环烷基或苄基，更优选C1-C6直链或支链的烷基、C3-C6环烷基或苄基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基，最优选异丁基、正丁基或苄基；
所述的R3选自如下基团之一：氢原子；C1-C6羟烷基；C1-C4烷氧基羰基取代的C1-C4烷基；C1-C4烷氧基羰基取代的C2-C4烯基；
Figure GWB00000002670200052
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、芳基、苄基、卤代苄基、C1-C10烷基取代的苄基、C1-C10烷氧基取代的苄基、C1-C10烷胺基取代的苄基、腈基取代的苄基、羧基取代的苄基、C1-C10烷氧羰基取代的苄基、取代或非取代的杂环亚甲基。
更进一步地优选，所述的R3选自如下基团之一：氢原子；C1-C4羟烷基；乙氧基羰基亚乙基；乙氧基羰基乙烯基；其中R′为C1-C4直链或支链的烷基；
Figure GWB00000002670200054
其中R′为氢原子或C1-C4直链或支链的烷基；
Figure GWB00000002670200055
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C4直链或支链的烷基、苯基、苄基、氟代苄基或4-[2-(2-噻唑基)-5-异丁基-噻唑基]亚甲基；
在这种实施方案中，本发明有代表性的具体化合物为如下化合物之一：
Figure GWB00000002670200056
本发明的杂环非核苷类化合物可以通过如下方法制得：
对于X1为NR4，其中R4为H的本发明的化合物(化合物4i)，可以根据以下化学反应式制备：
Figure GWB00000002670200071
其中：
R1为吡啶基、取代的吡啶基、苯基、取代的苯基、五元杂环基、取代的五元杂环基、喹啉基或吲哚基，其中所述的五元杂环基为含有选自N、O和S中一个或两个杂原子的五元杂环基；
R2选自如下基团中的一种：C1-C25烷基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基、酰氧基或C1-C4烷氧基羰基取代的C1-C25烷基；C3-C9环烷基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的C3-C9环烷基；芳基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的芳基；苄基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、C2-C25烯基、C3-C25环烯基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的苄基；C2-C25烯基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基、酰氧基或C1-C4烷氧基羰基取代的C2-C25烯基；C3-C25环烯基；被卤素原子、C1-C25烷基、C3-C25环烷基、C1-C25烷氧基、C3-C25环烷氧基、硝基、氨基、C1-C25烷基氨基、C3-C25环烷基氨基、C1-C25烷酰胺基、羟基或酰氧基取代的C3-C25环烯基；
R3为H、C1-C25烷基或
Figure GWB00000002670200072
其中R′为C1-C25烷基等；
其中，化合物1可以市购得到，例如从国药集团化学试剂有限公司、Aldrich公司等可以购买得到。化合物2可以参考文献J.Org.Chem.1973；38；3571合成得到。
在N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N，N-二甲基吡啶(DMAP)和分子筛存在，在溶剂DMA、DMF、乙腈、二氯甲烷或四氢呋喃中，在吡啶、N-甲基吗啡啉、三乙胺或二乙丙基乙基胺等碱性条件下，化合物1和化合物2反应生成中间体化合物3。
化合物3在醋酸铵和醋酸钠的混合物中加热至120～140℃下反应，关环生成化合物4i。
对于X1为S的本发明的化合物(化合物4ii)，可以根据以下化学反应式制备：
Figure GWB00000002670200081
其中，Lawesson’s试剂是2，4-双(对甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二硫化物，为市售产品。上述制得的化合物3在四氢呋喃溶剂中，加入Lawesson’s试剂，加热回流反应生成化合物4ii。
对于X1为O的本发明的化合物(化合物4iii)，可以根据以下化学反应式制备：
Figure GWB00000002670200082
上述制得的化合物3在三氯氧磷溶液中加热至100～130℃反应生成化合物4iii。
其中R3为CO2Et的化合物4可以根据以下化学反应式反应，制备得到化合物5：
Figure GWB00000002670200083
化合物4可以是4i、4ii或者4iii。
化合物4水解得到化合物5，可以在氢氧化锂化合物、氢氧化钠等碱性条件下或者是在盐酸，硫酸等酸性条件下反应，反应条件可以是室温或者加热至100℃。
式5的化合物可以根据以下化学反应式制备得到化合物6：
Figure GWB00000002670200084
其中R′和R″各自独立地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、芳基、苄基、取代苄基、C1-C6羟烷基、取代或非取代的杂环亚甲基，其中苄基上的取代基可以是卤素、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷胺基、腈基、羧基或C1-C10烷氧羰基；X为O或者NH。
化合物5在草酰氯或者氯化亚砜等条件下生成酰氯，酰氯和不同的醇、不同的取代胺或者氨水等反应生成化合物6。反应溶剂可以是二氯甲烷、乙酸乙脂、水或其混合物，反应在碱性条件下进行，碱性试剂可以是碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠或者是碳酸氢钠等无机碱，或者是吡啶、N-甲基吗啡啉、氯甲酸异丁酸酯、三乙胺、二乙丙基乙基胺等有机碱。
或者化合物4可以根据以下化学反应式制备化合物7：
Figure GWB00000002670200091
其中，化合物4在无水四氢呋喃或者无水乙醚等有机溶剂中，加入铝锂氢，反应温度为-20℃～25℃，反应生成化合物7。
或者化合物7可以根据以下化学反应式制备化合物8：
Figure GWB00000002670200092
其中，IBX为2-碘酰基苯甲酸，购置于Aldrich公司。格氏试剂是为C1-C25烷基或C3-C8环烷基格氏试剂，即R为C1-C25烷基或C3-C8环烷基。化合物7氧化生成中间体化合物8，化合物8在无水乙醚或者无水四氢呋喃做溶剂中，加入格氏试剂反应生成化合物9。化合物8也可以替换为化合物4进行反应。
或者化合物9可以根据以下化学反应式制备化合物10：
Figure GWB00000002670200093
化合物9氧化生成化合物10。氧化条件可以是在丙酮溶液中用活性MnO2氧化，或者是在甲苯和DMSO混合溶液中用IBX氧化等等。
或者可以根据以下化学反应式制备化合物19：
Figure GWB00000002670200094
其中，R1、R2、R3的定义同上，X为卤素。化合物13的合成方法可参考文献(J.Chem.Soc.Perkin I.1982，159-164；Heterocyclic.Chem.1991，28，1003)。化合物12在无水四氢呋喃或者无水乙醚等有机溶剂中，加入丁基锂，反应时间为0.5小时～2小时，反应完后加入无水氯化锌生成锌试剂。或者，化合物12在无水四氢呋喃或者无水乙醚等有机溶剂中，加入活化锌粉，加热回流反应生成锌试剂。加入化合物13，在钯催化剂下(可以是四三苯基磷钯，或者是醋酸钯和三苯基磷的混合物)，苯或者甲苯等做溶剂，反应8～24小时得到化合物19。
或者可以根据以下化学反应式制备化合物14和化合物15：
其中，R为C1-C25烷基、苯基或其中R′为C1-C25烷基等。化合物20可以市购得到，例如从国药集团化学试剂有限公司、Aldrich公司等可以购买得到。化合物8和化合物20在无水四氢呋喃溶液中加入NaH反应生成化合物14，化合物14加氢得到化合物15。
或者可以根据以下化学反应式制备化合物16：
其中，化合物17即化合物4中R1为2-噻唑基；R2、R3的定义同上；R为C1-C25烷基或C3-C8环烷基。化合物17在二氯甲烷的溶液中加入液溴反应24小时生成化合物18，化合物18在DMA或者DMF做溶剂，加入锌试剂及催化剂镍，室温反应生成化合物16。
或者可以根据以下化学反应式制备化合物19：
其中，R1、R2、R3定义同上。硼试剂可以市购得到，例如从国药集团化学试剂有限公司、Aldrich公司等可以购买得到。化合物13的合成方法参考文献(J.Chem.Soc.Perkin I.1982，159-164；Heterocyclic.Chem.1991，28，1003)。硼试剂和化合物13在甲醇或者乙醇溶剂中加入钯催化剂及水和碳酸钾或者碳酸钠为碱，反应12小时得到化合物19。
或者可以根据以下化学反应式制备化合物21：
Figure GWB00000002670200105
其中，R4为芳基、取代的芳基、苄基、C1-C13烷基、取代的C1-C13烷基、C2-C6的烯基或C3-C6的环烷基，其中所述芳基或C1-C13烷基上的取代基可以为卤素原子、烷氧基、氨基、烷基氨基或羟基；X为卤素原子。
化合物4i在室温下，在无水四氢呋喃溶液中加入NaH，反应1小时后加入卤代物反应12小时得到化合物21。
通常用TLC来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后一般用冰水淬灭，用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等萃取，依次用5％盐酸、水、饱和食盐水洗涤，干燥，低温减压除去溶剂，经柱层析得最终产物，得到的产物用核磁共振、质谱等方法来证明。
本发明提供一种抗病毒的药物组合物，该组合物包含本发明上述杂环非核苷类化合物中的一种或多种作为活性成分，并可进一步包含药学上常规的辅剂，例如赋形剂、崩解剂、抗氧化剂、甜味剂、包衣剂等。
有益效果
本发明设计与合成了一类新型的杂环非核苷类抗病毒抑制剂，能有效抑制流感病毒复制以及乙肝病毒DNA复制、乙肝病毒s抗原和e抗原的合成，可用于制成治疗病毒性疾病的药物，且克服现有核苷类药物存在的细胞毒性，长期用药产生的抗药性病毒变异株的出现，需要结构不相关的不同药物来对抗等缺陷。本发明化合物结构相对简单，易于制备。
附图说明
图1为在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服(灌胃)给药后，治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。
制备实施例
下述制备实施例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx 300M仪器测定，NMR定标：δH/C 7.26/77.0ppm(CDCl3)；试剂主要由上海化学试剂公司提供，产品纯化主要用柱色谱法，硅胶(200-300目)，柱色谱法所用的硅胶型号为粗空(ZLX-II)，由青岛海洋化工厂分厂生产。
制备实施例1：
Figure GWB00000002670200111
将化合物1.1(3.3mmol)、化合物2.1(3mmol)、N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(3.3mmol)、N，N-二甲基吡啶(DMAP)(0.3mmol)和分子筛混合，冰浴(0℃)条件下冷却，随后依次加入DMF(5mL)、吡啶(4.5mmol)，TLC来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后用水(25mL)稀释，EtOAc(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂、柱层析石油醚/乙酸乙脂(体积比5∶1)分离得到化合物3.1。之后，将化合物3.1(0.6mmol)与醋酸铵(NH4OAc)(15mmol)、醋酸钠(NaOAc)(30mmol)混合，加热至130℃，TLC来跟踪测定反应的完成程度，随后冷却至室温，用水(50mL)稀释，乙酸乙酯(50mL)萃取、浓缩除尽溶剂、以石油醚/乙酸乙脂(体积比1∶1)柱层析分离得到化合物4i.1。
采用与制备实施例1相同的方法，但采用下表所列不同的取代羧酸(化合物1)替代吡啶-2-羧酸，不同的化合物2替代化合物2.1，合成以下化合物：
Figure GWB00000002670200121
制备实施例2：
Figure GWB00000002670200122
将化合物3.1(0.6mmol)与Lawesson’s试剂(0.9mmol)混合，之后加入THF(5mL)，加热回流，TLC来跟踪测定反应的完成程度，随后冷却至室温，浓缩反应液除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比3∶1)柱层析分离得到化合物4ii.1。
采用与制备实施例1相同的方法，但采用下表所列不同的取代羧酸(化合物1)替代吡啶-2-羧酸，不同的化合物2替代化合物2.1，可以合成不同的化合物3；然后，采用与制备实施例2相同的方法，合成以下目标化合物：
用同样方法合成以下化合物：
Figure GWB00000002670200141
Figure GWB00000002670200151
Figure GWB00000002670200161
Figure GWB00000002670200171
制备实施例3：
Figure GWB00000002670200172
将化合物3.1(0.6mmol)与POCl3(3mL)混合，加热至80℃，TLC来跟踪测定反应的完成程度，之后将反应液倒至0℃的饱和的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液(50mL)，除去POCl3，之后用乙酸乙酯(50mL)萃取，浓缩除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物4iii.1。
采用与制备实施例1相同的方法，但采用下表所列不同的取代羧酸(化合物1)替代吡啶-2-羧酸，可以合成不同的化合物3；然后，采用与制备实施例3相同的方法，合成以下目标化合物：
制备实施例4：
Figure GWB00000002670200182
将化合物4.1(0.5mmol)与氢氧化锂(LiOH)(2mmol)混合，加入MeOH(4mL)和水(1mL)的混合溶剂，室温反应，TLC跟踪，反应完毕，浓缩溶剂，用1mol/L的盐酸酸化(10mL)，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂得到化合物5.1。
用同样方法可以合成以下化合物
Figure GWB00000002670200183
制备实施例5：
Figure GWB00000002670200191
将化合物5.1(0.5mmol)溶于二氯甲烷(25mL)中，加入草酰氯(0.6mmol)，室温搅拌过夜，旋干后，加入乙酸乙脂和水(10mL∶10mL)，加入碳酸氢钠(1.0mmol)，加入对氟苄胺(0.6mmol)，室温搅拌数小时后，加入水(10mL)，乙酸乙脂(25mL)萃取2遍，有机相用1N盐酸(20mL)洗2遍，饱和食盐水洗1遍，MgSO4干燥，浓缩有机相。混合物以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)经色谱柱纯化，得产物6.1。
采用与制备实施例5相同的方法，用下表所列不同的取代胺或者醇替代对氟苄胺，合成以下化合物：
Figure GWB00000002670200192
Figure GWB00000002670200201
制备实施例6：
将化合物4.1(0.5mmol)溶于无水THF(25mL)中，加入铝锂氢(LiAlH4)(0.6mmol)，冰浴下反应，TLC跟踪，反应完毕，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂、以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物7.1。
Figure GWB00000002670200203
制备实施例7：
Figure GWB00000002670200204
将化合物7.1(1mmol)与IBX(1.25mmol)混合，加入甲苯和DMSO(2mL∶1mL)的混合溶剂，50℃反应，TLC跟踪，反应完毕，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂得到化合物8.1。化合物8.1溶于无水乙醚(10mL)中，滴加入甲基格氏试剂(1.2mmol)，室温反应，TLC跟踪，反应完毕，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂、以石油醚/乙酸乙脂(体积比2∶1)柱层析分离得到化合物9.1。
采用与制备实施例7相同的方法，但采用乙基格氏试剂替代甲基格氏试剂，合成以下化合物C282-2：
Figure GWB00000002670200211
制备实施例8：
Figure GWB00000002670200212
将化合物9.1(0.5mmol)与IBX(0.6mmol)混合，加入甲苯和DMSO(2mL∶1mL)的混合溶剂，50℃反应，TLC跟踪，反应完毕，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂得到化合物10.1。用同样方法可以由化合物C282-2合成以下化合物C280-4：
Figure GWB00000002670200213
制备实施例9：
Figure GWB00000002670200214
将化合物12.1(1.0mmol)溶于无水THF中，-78℃下缓慢滴加nBuLi(1.05mmol)，反应半小时后加入无水氯化锌(1.1mmol)，室温搅拌半小时后，加入化合物13.1(1.0mmol)及催化剂(0.05mmol)，加入苯溶剂(10mL)，80℃反应12小时，TLC跟踪，反应完毕，浓缩除尽溶剂，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物11.1。
Figure GWB00000002670200221
制备实施例10：
Figure GWB00000002670200222
将化合物20.1(1.05mmol)溶于无水THF(10mL)中，0℃下加入NaH(1.05mmol)，反应半小时后加入化合物8.1(1.0mmol)，0℃下搅拌反应12小时，TLC跟踪，反应完毕，浓缩除尽溶剂，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物14.1。将化合物14.1溶于MeOH(10mL)中，加入10％的Pd/C，加氢反应，室温反应过夜，抽虑得化合物15.1。
制备实施例11：
Figure GWB00000002670200224
将化合物17.1(1.0mmol)溶于DCM(10mL)中，加入液溴(1.2mmol)，室温反应12小时，TLC跟踪，反应完毕，浓缩除尽溶剂，乙酸乙酯(25mL)萃取、以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物18.1。将碘甲烷(1.2mmol)和活化锌粉(1.3mmol)在DMA中反应得到锌试剂(1.2mmol)，加入化合物18.1，加入催化剂(10％)，室温反应3小时后用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂得到粗产品，以石油醚/乙酸乙脂(体积比4∶1)柱层析分离得到化合物16.1。
Figure GWB00000002670200231
制备实施例12：
将对甲氧基苯硼试剂(1.0mmol)溶于乙醇(10mL)中，加入水(2mL)，加入碳酸钾(3.0mmol)，加入化合物21.1(1.0mmol)及催化剂(0.05mmol)，80℃反应12小时，TLC跟踪，反应完毕，浓缩除尽溶剂，用水(25mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比5∶1)柱层析分离得到化合物19.1。
Figure GWB00000002670200233
制备实施例13：
Figure GWB00000002670200234
将对化合物4i.1(1.0mmol)溶于无水四氢呋喃(10mL)中，加入NaH(1.2mmol)，室温反应1小时后，加入碘甲烷(3.0mmol)，室温反应12小时，TLC跟踪，反应完毕，浓缩除尽溶剂，用5％盐酸酸化，水(20mL)稀释，乙酸乙酯(25mL)萃取、浓缩除尽溶剂，以石油醚/乙酸乙脂(体积比5∶1)柱层析分离得到化合物21.1。
Figure GWB00000002670200241
试验实施例
试验实施例1：抗乙型肝炎病毒(HBV)活性测试试验
1、试验目的：
样品化合物抗乙型肝炎病毒(HBV)活性筛选。试验包括：在病毒-细胞水平的试验中，检测样品化合物的细胞毒性、对乙型肝炎病毒表面和核心抗原的分泌，以及病毒核酸(DNA)的复制水平的影响作用。
2、试验原理：
乙型肝炎病毒(HBV)转基因人肝癌细胞HepG2.2.15细胞株，在培养时能分泌乙肝病毒颗粒(含抗原和DNA)于培养上清中。
在抗病毒药物的干预下，检测细胞分泌到培养上清中的HBsAg、HBeAg以及病毒DNA含量，参照未加药对照组的含量，可以观测样品药物的抗病毒活性作用；同时检测样品药物的细胞毒性作用。运用MTT法检测样品药物导致50％细胞毒性死亡的数值浓度为(CC50)；用ELISA方法检测样品药物达到抑制HBsAg、HBeAg分泌，以及运用荧光定量PCR法检测样品药物抑制病毒DNA复制量的50％时的浓度数值为(IC50)。
3、实验样品：
临时配成实验所需样品药物浓度(1mM)，每个样品药物做7个稀释浓度的试验，并设拉米夫定等抗病毒药物作为试验的阳性对照药，检测每次试验反应的正常与否。
4、实验方法：
a)实验方法及培养上清收集
将HepG2.2.15细胞接种于96孔板中，次日加入样品药物，经定期更换培养液及同浓度的样品药物，于第八天收集培养上清待测。向96孔板中的细胞加MTT，4小时后加MTT溶解液反应过夜，次日在酶标仪上测OD570。根据OD值计算出样品药物对HepG2.2.15细胞的毒性作用，影响细胞生长的状况，导致半数细胞死亡量所需的浓度(CC50)。
b)培养上清中HBsAg和HBeAg含量的检测(ELISA法)：
运用HBsAg和HBeAg检测用试剂盒(购自华美生物工程公司)进行检测。向包被好的条形板中加入样品，并加入等量的酶标结合物，37℃反应1小时后洗板，重复5次。加入显色液A和B，15分钟后终止反应，测定OD450/630，并根据OD值计算出样品对HBV抗原的半数抑制率(IC50)。
c)荧光定量PCR法检测培养上清HBV-DNA含量：
取适量的培养上清加入到等体积的病毒提取液中，混匀后煮沸，然后于室温10000rpm离心5分钟，取适量的上清用于PCR扩增，同时设置HBV-DNA标准样品5个，做标准曲线。并根据检测所得的病毒DNA复制值，计算出每个样品药物各浓度时对HBV-DNA复制的抑制率，然后再进行样品药物半数抑制率计算获得其(IC50)，对不能进行IC50值计算的样品，给与ICx表示并给出相应的浓度数值。
试验用PCR引物为：
P1：5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3’
P2：5’ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3’.
试验用PCR探针为：
5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3’
5、实验结果：
Figure GWB00000002670200251
Figure GWB00000002670200261
注：CC50为样品药物对HepG2.2.15细胞的生长的影响，半数50％致死浓度。
IC50为样品对抗原或DNA拷贝的抑制达半数50％时的浓度。
SI为样品生物活性选择系数。SI值＞2为有效，且越大越好。
NA为无明显生物活性或无法进行计算。NT为没有测试。NC为没有结果。
从测试结果可以看出该类化合物大部分在细胞水平上都具有很好的抑制HBV DNA复制的活性。其中有19个化合物的IC50值小于1μM，其中8个化合物的IC50值小于0.1μM。
试验实施例2：抗乙型肝炎病毒(HBV)动物水平的活性测试试验
1、药物
临时配成实验所需样品药物浓度(100mg/mL)，用0.3％羧甲基纤维素钠配制 批号：00701010
阳性药物拉米夫定  葛籣素威康制药公司产品，用生理盐水配制。批号：005110011
2、病毒：
鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存
3、动物：
1日龄北京鸭，购自北京前进种鸭动物饲养场。
4、试剂：
α-32P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司。缺口翻译药盒购自普洛麦格公司(Promega Co.)；Sephadex G-50，Ficoll PVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS为西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产品；硝酸纤维素膜0.45nm Amersham公司产品。
5、实验方法：
a).鸭乙型肝炎病毒感染：
1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分离血清，-70℃保存待检。
b).药物治疗试验：
DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行药物治疗试验，每组6只，给药组(W28D，W28F，W28M，C37)分别设1个剂量组-50mg/kg，1天2次，给药10天(Bid×10)，口服(灌胃)给药。设病毒对照组(DHBV)以生理盐水代替药物。阳性药用拉米夫定，口服(灌胃)给药50mg/kg，1天2次，10天。在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
c).检测方法：
取上述待检鸭血清，同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针(购自普洛麦格公司Promega Co.)作鸭血清斑点杂交，放射自显影，膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
6、药效计算：
a)计算每组鸭不同时间血清DHBV-DNA OD值的平均值(X±SD)，并将每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，采用配对t检验，计算t1、P1值。分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。
b).计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作图，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态。
c)将给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。
7、实验结果
图1为在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服(灌胃)给药后，治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较：
4个药物的50mg/kg组，口服(灌胃)给药1天2次，共10天，未见鸭一般状况及进食有任何变化。
阳性对照药拉米夫定50mg/kg在配对分析和成组分析，均显示抑制DHBV-DNA的效果，说明实验成立。停药后三天，DHBV-DNA反跳达原水平。
在本实验条件下，W28F 50mg/kg在T5和T10及配对分析和成组分析均显示抑制DHBV-DNA的效果，并有统计意义；P3DHBV-DNA虽有反跳，但未达原水平。W28M50mg/kg组，虽T10和P3配对分析，显示有统计意义的抑制DHBV-DNA效果，但成组分析，未能显示有统计意义的效果。W28D 50mg/kg T10在配对分析和成组分析均显示抑制DHBV-DNA的效果，并有统计意义。C3750mg/kg在各个时间点的配对分析和成组分析未能显示抑制DHBV-DNA的效果。

Claims (5)

1.一类由如下结构式I表示的杂环非核苷类化合物：
Figure FSB00000872416800011
其中，R5和R6各自独立地为氢原子、卤素原子、C1-C4直链或支链的烷基或苯基；
所述的R2为C1-C8直链或支链的烷基、C3-C8环烷基或苄基；
所述的R3选自如下基团之一：氢原子；C1-C6羟烷基；C1-C4烷氧基羰基取代的C1-C4
烷基；C1-C4烷氧基羰基取代的C2-C4烯基；
Figure FSB00000872416800012
其中，R′和R″各自独立
地为氢原子、C1-C25烷基、卤代C1-C10烷基、苯基、苄基、卤代苄基、C1-C10烷基取代的苄基、C1-C10烷氧基取代的苄基、C1-C10烷胺基取代的苄基、腈基取代的苄基、羧基取代的苄基、C1-C10烷氧羰基取代的苄基、4-[2-(2-噻唑基)-5-异丁基-噻唑基]亚甲基。
2.根据权利要求1所述的杂环非核苷类化合物，其特征是，所述的杂环非核苷类化合物为如下化合物之一：
3.一种抗病毒的药物组合物，该组合物包含权利要求1或2所述的杂环非核苷类化合物中的一种或多种作为活性成分，并包含药学上常规的辅剂。
4.权利要求1或2所述的杂环非核苷类化合物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征是，所述的病毒性疾病为乙型肝炎、流感、疱疹或艾滋病。
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