CN103889428A

CN103889428A - 乙型肝炎病毒抗原分泌的新型抑制剂

Info

Publication number: CN103889428A
Application number: CN201180047912.9A
Authority: CN
Inventors: 晓东·徐; 安德里亚·库口纳提; 蒂莫西·M·布洛克; 桐·肖
Original assignee: INST HEPATITIS AND VIRUS RES
Current assignee: INST HEPATITIS AND VIRUS RES
Priority date: 2010-10-04
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2014-06-25
Also published as: US20130303552A1; US9533990B2; US8921381B2; EP2624837A2; US20150087659A1; WO2012047856A3; EP2624837A4; WO2012047856A2

Abstract

本发明涉及一种药物组合物，包括三唑并嘧啶，主要用于治疗患者体内的肝炎病毒。

Description

乙型肝炎病毒抗原分泌的新型抑制剂

交叉引用相关申请

本申请要求2010年10月4日递交的美国临时申请号为61/389,321的申请的优先权，该申请的内容通过参考被引用到本申请中。

联邦政府资助的研究声明

根据国家过敏症和传染病研究所所授予的1R43AI077123-01A1号文件相关合理条款，美国政府拥有支付许可和在一定条件下要求专利权人转让许可的权利。

发明领域

本发明涉及用于治疗患者体内肝炎病毒的组合物和方法。

背景技术

乙型肝炎是世界上最流行的传染病之一。虽然几乎所有个体的感染似乎为急性传染症状，然而大约有30%的病例为慢性传染病。据目前估计，全世界有350-400百万人患有慢性乙型肝炎，每年多数由于肝癌、肝硬化和其他的病发症的进展导致500,000-1,000,000人死亡。尽管提供了有效的疫苗，免疫疗法，干扰素和抗病毒药物，乙肝仍然是一个主要的全球性的健康问题。

致病因子是乙型肝炎病毒（HBV），一种小DNA病毒，其属于嗜肝病毒科原型成员。HBV为异常复制模式的包膜病毒，其以构建宿主细胞细胞核基因组的共价闭合环状DNA （ cccDNA ）复制为中心。游离型构建于初感染的部分双链环状DNA（松弛环状DNA，或cDNA）基因组的转化，其功能为作为所有HBV mRNA的模板。与大多数其他的病毒DNA的机制不同，HBV cccDNA 通过1.1基因组长度单位的RNA复制（前基因组，或者pgRNA）的反转录进行复制，所述RNA复制最初转录于cccDNA模板，并且由产生子代rcDNA的病毒编码聚合酶起作用。HBV DNA的合成与其壳病毒的装配相关联，并且几乎所有壳内基因组的复制更加有效地与用于病毒装配和分泌的包膜蛋白相结合，其基因组的少数分流到细胞核中转化为cccDNA，因此增加了游离体的含量。

作为由HBV编码的唯一的酶，已被FDA批准的具有四个类核苷酸聚合酶抑制子的聚合酶，已经作为抗病毒药物研究和其他的研究的有效靶标。已在临床上鉴定诊断，聚合酶初始序列的突变赋予其与已经鉴定临床诊断的拉米夫定（lamivudine）和阿德福韦酯（adefovir）抗衡，并且优于延续三年的拉米夫定治疗，其有一血清滴度反弹，有医治70%患者的经验。虽然能够与替比夫定（telbivudine）、阿德福韦酯和拉米夫定抗衡，使其很少发生，然而，已记载，α-干扰素仍是另外一个最大的慢性乙型肝炎疗法，但是由于长期反应效果差和较弱的副作用而被禁止。因此，应用改进技术的治疗来满足医学需要，用于HBV诊疗研究的不同方法是必然的。

除作为病毒的关键结构成分，HBV包膜是疾病过程的主要因素。在慢性感染个体中，血清的HBV表面抗原（HBsAg）含量高达400 μg/ml，由嗜染性细胞产生的分泌型非感染亚病毒粒子远远大于感染型（Dane）粒子。HBsAg包含乙型肝炎病毒感染中的主抗原决定簇，并且由小、中、大表面抗原构成（分别为S，M，L）。这些蛋白由作为三个分离的糖基化多肽的单一的开放读码框通过利用可替换的转录起始位点（用于L和M/S mRNAs）和启动子（用于L，M和S)获得。

虽然病毒聚合酶和HBsAg执行完全不同的功能，但是它们都是病毒完成其生命周期和有感染性的必需蛋白。这就是说，缺少HBsAg的HBV蛋白是完全缺陷型的，不能感染或引起感染。HBsAg用于保护病毒的核壳，启动感染周期，并且能够调节由感染细胞产生的新生病毒的形态发生和分泌。

慢性感染HBV的患者通常能够用可检测量的病毒壳体（HBc）的特异性循环抗体来鉴定，如果是HBsAg抗体通常为很少的任意可检测量。有证据表明慢性携带者确实产生HBsAg抗体，但是这些抗体与循环的HBsAg复合，其可在毫克/毫升量的慢性携带者的循环中产生。

减少HBsAg循环量的数量可使任意HBsAg抗体的产生增加，并且该抗体能够排除感染。然而，即使是不含HBsAg的核壳体能够表达或分泌到循环中，可能导致细胞死亡，但是会需要高含量的HBc抗体快速与其复合，并且导致HBc被清除。

慢性鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的研究已经表明，感染型肝细胞培养物中产生的亚病毒粒子具有反式激活病毒基因组复制的功能。除此之外， HBV生物学长久以来的宗旨是抑制病毒特异性免疫应答的表面抗原循环功能。在慢性旱獭类肝炎病毒（WHV）感染中，通过克拉夫定诊疗减少抗原将会产生免疫正效应，表明循环抗原可能确实抑制免疫效应。此外，病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的缺乏慢性WHV和HBV感染的重要标志，可能是由于通过感染性肝细胞中L和M的细胞内表达抑制MHCI产生。目前存在的FDA-批准的诊疗方法不能明显地影响血清内的HBsAg水平。

发明内容

本发明涉及一种药物组合物，选自化学式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V和VI及其混合物中一种或多种有效量的化合物：

其中

R₁ – R₁₂是独立的苯基或杂环，其中每一苯基或杂环可被利用至少一个选自以下群组的取代基独立地任意取代：(C_1-7 )烷基、(C_2- _ό)烯基、(C_2- _ό)炔基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7) 芳胺基、(C_3-12) 环烷基、(C_1-7) 酰基、芳基、卤素、OR_a、三氟甲氧基、三氟甲基、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b、P(=O)(OR_a)(R_a)和杂环，其特征在于：(C_1-7 )烷基或(C_3-12) 环烷基被任意利用1-5芳基、杂环、ORa、卤素、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b或P(=O)(OR_a)(R_a)各自独立随意取代；

X₁ – X₁₂是独立的键或饱和或不饱和亚烃基；

R_a 和 R_b 分别代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7) 烷酰基、(C_2-7) 烷酰氧基、或芳基、或R_a 和 R_b和与其连接的氮原子一起形成杂环；

m 为 0、1或 2；

n为0、1、2、3或 4；

或选自以下群组的所述化合物的衍生物：N-氧化衍生物、前药衍生物、保护衍生物、异构体、和所述化合物异构体的混合物；或所述化合物或所述衍生物的药用可接受盐或溶剂化物。

（b）一种药物学上可接受的载体。

另外提供化学式VII的化合物：

其中：

X₁、X₂、R₁、R₂、R₇均如上所描述。

R₁₃代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7) 烷酰基、(C_2-7) 烷酰氧基、或芳基；

用于治疗患者的肝炎病毒的方法，按患者需要量，给患者施用有效量的化学式I- III的化合物。在一个实施例中，所述方法包括给患者施用化学式I- III的有效量的化合物，所述化合物减少所述患者的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的血清浓度水平。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗患者体内肝炎病毒的组合物和方法。

对本发明的整体描述如上所使用的下述术语，除非有特别指定，都应按下面的意思理解：

“患者”指包括人类在内的哺乳动物。

“有效量”指有效治疗肝炎病毒并能产生预期治疗效果的本发明化合物的量。

“治疗”或“治疗处理”或“处理”指减缓、消除、抑制、改善、改变，或者阻止疾病或病灶，例如通过施用本发明的化合物。

“烷基”指可为大约含1至10个碳原子的支链或直链的脂肪族烃类基团。优选的烷基是含有约1至3个碳原子的低“链烷基”；更优选的是甲基。支链指一个或多个与线性烷基主链相连的诸如甲基、乙基或丙基的低烷基基团。所述烷基基团可被烷氧基、卤素、羧基、羟基或R_eR_fN-（其中R_e和R_f是独立的氢或烷基，或者R_e和R_f与跟它们连接的氮原子一起形成氮杂环）随意取代；更优选可被氟取代。烷基的例子包括甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟甲基、乙基，n-丙基，异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。

“环烷基”指含有大约3到7个碳原子的非芳香单环系。优选的单环烷基包括环戊基、环己基和环庚基；更为优选为环己基、环戊基。

“芳基”指含有大约6到10个碳原子的芳香碳环基。芳香基的例子包括苯基、萘基，或者由一个或多个相同或不同的芳基取代基取代的苯基或萘基，所述“芳基取代基”包括氢、羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或者Y₁Y₂NCO-，其中Y₁和Y₂为独立的氢或烷基。

“杂环”是具有由1、2、3或4个杂原子构成的4-（4）、5-（5）、6-（6）或7-（7）元饱和或不饱含杂环，所述杂原子选自氧、硫基、亚硫酰基、磺酰基和氮组成的群组，所述环可随意融合苯环。杂环包括“杂芳基”，其由大约5到10元芳香单环基或双环基烃环系构成，其单环系中大约有一到三个原子，双环系中大约有一到四个原子，该原子是除了碳原子的元素，例如是氮、氧或硫。该“杂芳基”也可以被一个或多个上面提到的“芳香基取代基”取代。典型的杂芳基基团包括取代的吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、异恶唑基、异噻唑基、恶唑基、噻唑基、吡唑基、呋吖基(furazanyl)、吡咯基、咪唑并〔2，1 -b〕噻唑基、苯并呋吖基(benzofurzanyl)、吲哚基、氮杂吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹啉基、咪唑基和异氨基喹啉。

“酰基”指H-CO- 或在先前提到的烷基基团的烷基-CO-基团。优选的酰基为低链烷基。典型的酰基基团包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、2-甲基丙酰基、丁酰基和己酰基。

“烷氧基”指先前在烷基基团提到的烷基-O基团。优选的烷氧基为含有大约1到3个碳原子的低链烷氧基；更为优选的是甲氧基。该烷氧基可被一个或多个烷氧基、羧基、烷氧羰基、芳香羰基或R₆R_fN-（其中R₆和R_f在前面已经定义）随意取代。典型的烷氧基团包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、异丙氧基、n-丁氧基、己氧基，2-（吗啉-4基）乙氧基和2-（乙氧基）乙氧基。

“芳氧基”指前面所说的在芳基基团中提到的芳基-O基团。

“酰氧基”指先前在酰基基团中提到的酰基-O基团。

“羧基”指COOH-（羧酸）基团。

“R_eR_fN-”指取代和未取代的氨基，所述R_e和R_f在前面已经描述。典型的基团包括氨基（NH₂-），甲氨基、乙基甲氨基、二甲氨基和二乙氨基。

“R_eR_fNCO-”指取代和未取代的氨甲酰基基团，所述R_e和R_f在前面已经描述。典型的基团为氨甲酰基（NH2CO-）和二甲基氨基甲酰基（Me₂NCO-）。

“酰基R_eN-”指酰氨基团，所述R_e和酰基如本文的定义。

“卤素”指氟、氯、溴或碘。优选的是氟、氯或溴，更优选的是氟或氯。

“前药”指适合患者施用而无毒性、刺激性、过敏性反应等并能够达到预期使用效果的化学式Ⅰ的化合物形式。前药在体内转化产生如上所述化学式的母化合物，例如在血液中被分解。如由T. Higuchi 和 V. Stella研究， A.C.S讨论协会，第14卷上发表的，作为新型给药系统的前药中，及由Edward B. Roche等，在1987年由美国药物联盟发明的生物可逆性药物设计中，述及的清晰讨论，都参考引用在该文中。

“溶剂化物”指本发明的化合物与一个或多个溶剂分子物理缔合。该物理缔合涉及不同程度的离子和共价键，包括氢键。在具体实例中的溶剂化物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子嵌入晶体的晶格中时。“溶剂化物”包括液相和可分离的溶剂化物。典型的溶剂化物包括乙醇溶剂化物、甲醇溶剂化物能。“水化物”是溶剂分子是水的溶剂化物。

“环结构取代物”指分子中环链接的任何原子和原子基团。

本发明涉及一种药物组合物，选自化学式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI及其混合物中一种或多种有效量的化合物：

其中

X₁ – X₁₂是独立的键或饱和或不饱和亚烃基；

m 为 0、1或 2；

n为0、1、2、3或 4；

（b）一种药物学上可接受的载体。

另外提供的化学式VII的化合物：

其中：

X₁、X₂、R₁、R₂、R₇均如上所描述。

在下面的表1中，实施例包括的化合物或其药学上可接受的盐形式非本文中限制性定义的实施例。

表1

本说明书中提及到的本发明中化合物的命名，该化合物具有以下通式：

该化合物的命名为顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。

本发明的目的，通过外旋式描述化合物，例如：

任意具有两个对映体的化合物均具有该式：

或下式：

所有的非对映体异构体，或它们的混合物，或在三分之一的手性中心的情况下存在。

本说明书中提及到本发明中化合物的命名，该化合物具有以下通式：

该化合物的命名为7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。

本发明的目的，通过外旋式描述化合物，例如：

任意具有两个对映体的化合物均具有该式：

或下式：

在本文中所提供的所有的实施例中，合适的任意取代基的实施例不意图限制所要求保护的本发明的范围内。本发明的化合物中可以包括本文中所提供的任何取代基，或取代基的组合。

现有领域的技术人员应当理解，本发明的化合物具有在可选择的主动和外消旋的形式下能够存在或分离的手性中心。有些化合物可具有形式多态性。可以理解的是，本发明包括所有外消旋、光学活性、多态性、互变异构、或立体异构形式，或它们的混合物，本发明的化合物具有此处描述的重要特性，如何准备可选择的活性形式（例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，由起始材料的光学活性合成，手性合成，或者使用手性固定相进行色谱分离）对现有技术来说是熟知的。

本发明的化合物可通过文献中熟知的已知化合物和易合成的中间物的处理过程获得。

药物组合物包含化学式I- III的化合物，例如能够治疗患者体内的肝炎病毒。肝炎病毒的实例包含诸如乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒的嗜肝病毒科家族。

在一实施例中，药物组合物进一步包括一抗病毒化合物。在另外一个实施例中，抗病毒化合物选自于核苷抗病毒化合物、核苷酸病毒化合物和它们的混合物。

还提供了一种通过按需要给患者施用有效量的化学式I- III的化合物，用于治疗患者的肝炎病毒的方法。另外一个治疗患者的肝炎病毒的方法，包括给患者施用有效量的化学式I的化合物，所述化合物减少所述患者的乙型肝炎表面抗原的血清浓度水平。

实际上，包含化学式I- III的化合物的组合物可以任何适当的形式被摄入，例如吸入、局部施用、肠胃外、直肠给药或口服。更为特殊的摄入途径包括静脉、肌肉、皮下、眼内、结肠内、滑膜腔内、腹腔内，经上皮包括透过皮下、眼、舌下、口腔、真皮、眼球，通过吸入剂和气雾剂鼻腔吸入。

化学式I- III的化合物的组合物以最适当的摄入途径摄入。本发明还涉及包含化学式I- III的化合物的摄入组合物，其适于作为患者药物。该组合物可通过使用一个或多个可接受的药物佐剂或辅料的常用方法合成。该佐剂包括，尤其是稀释剂、无菌水合介质和各种无毒有机溶剂。该组合物可以为口服给药形式或者注射剂方式或悬液形式。

赋形剂和赋形剂中的化学式I- III的化合物的选择，通常根据产品的可溶性和化学特性、具体施用模式和药物实践中遵守的规定决定。当使用水合悬液时，它们可包含乳化剂或有利悬浮的试剂。也可使用诸如蔗糖、乙醇的稀释剂，诸如聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或者它们的混合物的多元醇。除此之外，化学式I- III的化合物可加入缓释制剂和配方中。

对于肠胃外摄入，本发明化合物的乳液、悬液或溶液使用诸如麻油、花生油或橄榄油的蔬菜油，或者使用诸如水和丙二醇的水合有机溶液，诸如油酸乙酯的可注射有机酯，还有药用可接受盐的无菌水溶液。可注射形式必须是容易注射的液体范畴，并且能够维持正常流动，例如使用诸如卵磷脂的被覆，表面活性剂使其在扩散时能够维持需要的颗粒大小。通过使用延长吸收成份达到可注射组分的延长吸收，例如，单硬脂酸铝和明胶。本发明的产品的盐溶液尤其适用于肌肉注射和皮下注射。化学式I- III的化合物溶液作为一自由基或药用可接受盐，可在水中与诸如羟基纤维素的表面活性剂适当混合制备。也可以在甘油、液态聚丙二醇和它们的混合物以及油脂中分散制备。所述水合溶液，也包括纯蒸馏水中的盐溶液，可用于静脉注射，在一定的条件下，调整其适当的PH值，配置缓冲溶液，使用适当量的葡萄糖或氯化钠保持等渗，通过加热、紫外、微孔过滤灭菌，和/或加入不同的抗病毒和抗真菌成份，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

无菌注射液的制备为，过滤灭菌后，加入需要量的化学式I- III的化合物于含有如上列举的不同组分的合适溶剂中。通常，加入不同的灭菌活性成份于包含基本分散介质和所需的上面列举其他成分的灭菌器皿中溶解制备。当制备无菌注射液的无菌粉末时，优选的制备方法为，使用真空干燥和冷冻干燥技术，其产生加有来自于先前灭菌的溶液中添加的必要成份的活性成份的粉末。

局部给药可使用包含化学式I- III的化合物的凝胶（以水或酒精为介质）、乳膏或软膏。化学式为I- III的化合物也可以加入凝胶或基质中治疗斑块，其会通过通透屏障控制化合物的释放。

对于吸入摄入法，化学式I- III的化合物可使用雾化器或悬浮液或雾化溶剂，将其溶解或悬浮于合适的载体中，或者可使用干粉吸入剂，将其吸收或吸入适当的固相载体中。

可以改变本发明组合物的化学式为I- III的化合物的使用百分比，构成一定的比例以使得到适当的剂量是必须的。很显然，在大致相同的时间可摄入几个单位剂量形式。施用剂量由医生或合格的医疗专业人员确定，取决于理想治疗效果，摄入途径和治疗时间，以及患者的症状。成人中，剂量通常为，每天通过吸入摄入0.001到大约50，更为优选的是0.001到大约5 mg/kg体重，每天通过口服摄入0.01到大约100，更为优选的是0.1到70，尤为优选的是0.5到10 mg/kg体重，每天通过静脉注射摄入大约0.001到10，更为优选的为0.01到10 mg/kg体重。在每个具体病例中，根据治疗患者的特定因素情况来决定剂量，例如年龄，体重、健康情况或其他因素，其能够影响本发明的化合物的效应。

为了获得理想的治疗效果，本发明的化学式I- III的化合物可能经常在必要时摄入。一些患者可能对稍高或稍低的剂量很快产生反应，需要确定小的多的足够维持的剂量。对于另外一些患者，根据每个患者的生理需要，可能必须在每天施用1-4倍剂量的情况下长时间诊治。通常化学式为I- III的化合物每天可以1-4倍的剂量施用。当然，对于另外一些患者，可能必须每天施用的剂量不超过一或二倍。

方法过程：

本发明中的化合物通过本领域的技术人员采用市售的原始材料、文献中已知的化合物或很容易制备的中间体，并按照与本文所概述的标准程序和合成方法来制备。标准的合成方法和程序编制有机分子的官能团的转换和操作，可以很容易地获得相关的科学文献或在该领域的标准教科书。可以理解为本发明中给出了典型或优选的工艺条件（即反应温度，时间，反应物的摩尔比，溶剂，压力，等等），也可以使用其它的工艺条件，除非另有说明。最佳反应条件可以随特定的反应物或所用溶剂来定，但这类条件可以由本领域的技术人员在本领域中常规的最佳程序来确定。本领域的技术人员在本领域中根据有机合成的性质和提出的合成步骤的顺序来合成本发明中描述的化合物，这将被人们所认识。

本文中所描述的过程可以根据本领域中公知的方法进行监测。例如形成的产物通过分光装置进行检测，例如核磁共振光谱（例如1H或13C）、红外光谱法、分光光度法（例如，UV-可见光）、质谱、色谱法、高压液相色谱法（HPLC）、气相色谱（GC）、凝胶渗透色谱（GPC）或薄层色谱法（TLC）。

该化合物的制备涉及不同的化学基团的保护和脱保护。在本领域中，本领域的技术人员可以很容易的确定保护和脱保护的必要性和选择适当的保护基团。保护基团的化学性质被发现，例如Greene等人在有机合成中发现的保护基团，2d.Ed（Wiley＆Sons出版，1991），其全部公开的内容均作为本文的参考内容。

本文中所描述的反应过程是在合适的溶剂中进行的反应，是属于本领域的技术人员公知的有机合成。合适的溶剂通常是在非反应性的反应物、中间体或产品的温度下进行的该反应，即，可以从溶剂的冷冻温度在溶剂的沸点温度的范围你的温度。一个给定的反应可以在一种溶剂或一个以上的溶剂的混合物中进行。根据对特定的反应步骤中，可以为特定的反应步骤选择合适的溶剂。

这些教义的化合物可以通过有机领域公知的方法来制备，这些教义中化合物的制备通过使用以下方式来制备，可以是市售获得的试剂或在文献中描述的的标准方法。

下面提供的实施例提供了具有代表性的用于制备本发明中化合物的方法，通过制备本发明中的化合物，本技术领域的技术人员将了解到如何替换已知的适当的试剂、原始原料和纯化方法来制备本发明中的化合物。

在INOVA VARIAN (¹³C NMR 的75兆赫；¹⁹F NMR的282兆赫)光谱仪上记录¹H NMR谱在500兆赫或300兆赫时的频率。化学位移值被提到以ppm为单位，以TMS（四甲基硅烷）为内标。峰值模式通过下面的方式来表示：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；Q，四重峰；m，多重峰和dd，双重双峰。通过赫兹（HZ）报告偶合常数（J），使用一个国家不更正的显微熔点设备测定熔点。在费安捷伦LC-MS光谱仪（ES-API，正）上测定并得到质谱。以乙酸乙酯（EtOAc）和己烷的混合物作洗脱剂，在硅胶100-200目之间，进行硅胶柱色谱法。用HPLC测定所有的化合物具有的纯度至少为95%以上。HPLC分析上运行的Agilent 1100高效液相色谱仪，配备为PHENOMENEX C12柱。洗脱系统为：A（乙腈，0.05％TFA）和C（H ₂ O，0.05％TFA），流速为1毫升/分钟；方法A：60％A，40％C，λ为219毫微米；方法B：70％A，30％C，λ为254纳米；方法C：80％，20％C，λ为254纳米。分钟数表示保留时间（IR）。

具体实例

下面的实例中，提供了用于制备式（I-VII）的代表性的化合物的方法。通过制备本发明中的化合物，本技术领域的技术人员将了解到如何替换已知的适当的试剂、原始原料和纯化方法来制备本发明中的化合物。

实施例1：合成7 -（2-氯-6-氟苯基）-5 -（4-氯苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。在DMF（5ml）中加入1 -（2-氯-6-氟-苯基）-3-（4-氯-苯基）-丙烯酮的溶液（5毫摩尔）和3-氨基-1,2,4 - 三唑（7.5毫摩尔）的混合物，回流2小时。将反应混合物冷却至室温，用水（50毫升）稀释，并充分搅拌。将所得到的混合物过滤并用水洗涤，得到粗产物，通过从EtOAc中重结晶或通过硅胶柱色谱法（乙酸乙酯/己烷，30:70）将其进一步纯化，得到白色固体产物。产率78%，熔点：213-215℃，Rf值为0.43（乙酸乙酯/己烷，50:50），MS：MH+=361，1H NMR（300 MHz时，DMSO-d6）：δ10.16（s，1H，NH），7.66-7.61（m，3H，CHAR），7.49-7.21（m，5H，CHAR），6.81-6.80（m，1H ，CH = C），5.19（s，1H，CH）。 HPLC：99.5％（方法B，tR=5.75分钟）。

根据上述实施例1中描述的方法，使用相应的试剂制备实施例2-16中非限制性的化合物。

实施例2：5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氯苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：91％，熔点235°C， Rf值=0.44（乙酸乙酯/己烷，50:50）， MS：MH +=377，¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.20（s，1H，NH），7.65-7.35（m，8H，CH_ar），7.06（d，J=3.6 Hz，1H，CH =C），5.10（dd，J =3.3，1.5 Hz，1H，CH），HPLC：99.9％（方法B，TR=6.64分钟）。

实施例3：5 -（4-氯苯基）-7-（2,6-二氟苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：83％，熔点：223-224°C。 Rf值=0.40（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH +=345。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.13（s，1H，NH），7.66-7 .61（m，3H，CH_ar），7.49-7.41（m，3H，CH_ar），7.13-7 .07（m，2H，CH_ar），6.63（d，J=3.6 Hz，1H，CH= C），5.26-5.25（m，1H，CH）；19F NMR（282 MHz，DMSO-d6）：δ-118.26，13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）：δ160.6（dd，JC-F =247.9，7.7 Hz，C），150.5（C），150.4（C），135.9（C），134.3（C），133.5（ CH），131.4（t，JC-F=10.7 Hz，C），129.2（CH），128.4（CH），117.2（t，JC-F=15.2 Hz，C，J），112.8（d，JC-F=24.9 Hz，CH），95.1（CH），50.8（CH）。 HPLC：98.8％（方法B，tR=4.96分钟）。

实施例4：7 -（2-氯-4-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：83％。熔点250-251°C。 Rf值=0.17（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 361。¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.18（d，J= 1.5 Hz，1H，NH），7.69（s，1H，CH_ar），7.64-7.61（m，2H，CH_ar）,7.49-7 .46（ m，3H，CH_ar）,7.25-7 .22（m，2H，CH_ar），6.57（d，J =3.6 Hz，1H，CH= C），5.17（dd，J =3.6，1.5 Hz，1H，CH）。 HPLC：98.4％（方法B，TR= 6.39分钟）。

实施例5：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2-氯苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：77％。熔点：192-193°C。 Rf值=0.40（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 361。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.12（s，1H，NH），7.63（s，1H，CH_ar），7.54-7.25（m，7H，CH_ar），6.57（d，J = 1.5Hz，1H，CH= C），4.74（s，1H，CH）。 HPLC：98.0％（方法B，TR = 4.94分钟）。

实施例6：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3-氯苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：88％。熔点：246-248°C。 Rf值=0.36（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 361。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.15（s，1H，NH），7.66-7.17（m，8H，CH_ar），6.78（d，J= 2.1Hz，1H，CH= C），5.26（s，1H，CH），HPLC：97.5％（方法B，tR =5.85分钟）。

实施例7：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：57％。熔点:：203-204℃， Rf值=0.34（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH +=345。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.13（s，1H，NH），7.68-7 .63（m，3H，CH_ar），7.45-7.21（m，5H，CH_ar），6.80-6.79（m，1H，CH = C），5.12（s，1H，CH）。 HPLC：96.4％（方法B，TR= 4.62分钟）。

实施例8：5 -（4-溴苯基）-7-（2-氯-6-氟苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：73％。熔点242-243°C。 Rf值=0.28（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 407。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.16（s，1H，NH），7.65-7.38（m，8H，CH_ar），6.80（d，J= 1.8 Hz，1H，CH= C），5.19（s，1H，CH）。 HPLC：99.6％（方法B，TR= 6.57分钟）。

实施例9：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-乙基苯基）-4,7-二氢-[1，2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：76％。熔点：220-221°C。 Rf值=0.40（乙酸乙酯/己烷，50:50）MS：MH += 355。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.15（d，J= 0.9Hz，1H，NH），7.64（s，1H，CH_ar），7.53-7.23（m，7H，CH_ar），6.80-6.79（m，1H，CH = C），5.81（s，1H，CH），2.63（q，J = 1.8Hz，2H，CH 2），1.18（t，J=7.5Hz，3H，CH3）。 HPLC：99.1％（方法B，TR =6.15分钟）。

实施例10：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：76％。熔点：217-218°C。 Rf值=0.22（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 357。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.02（s，1H，NH），7.64-6.94（m，8H，CH_ar），6.79-6.78（m，1H，CH = C），5.03（s，1H ，CH），3.78（s，3H，OCH3）。 HPLC：99.1％（方法B，tR = 4.32分钟）。

实施例11：5-（[1,1'-联苯] -4-基）-7-（2 -氯-6-氟苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：81％。熔点：267℃。 Rf值=0.17（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 403。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.17（d，J= 1.2Hz，1H，NH），7.72-7 .66（m，7H，CH_ar）,7.50-7 .38（m，6H，CH_ar），6.83（m，1H，CH= C），5.22（s，1H，CH）。 HPLC：99.1％（方法B，TR= 7.85分钟）。

实施例12：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（萘-2-基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：92％。熔点237℃。 Rf值=0.34（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH+= 377。 ^IH NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.25（IH，s，NH），8.22（s，IH，CH_ar），7.97-7.92（m，3H，CH_ar），7.75-7.40（m，7H，CH_ar），6.87（d，J = 1.8Hz，IH，CH= C），5.33（s，IH，CH）。 HPLC：98.9％（方法B，TR= 6.45分钟）。

实施例13：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二氯苯基）-4,7-二氢-[1，2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：57％。熔点246-247°C。 Rf值=0.30（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 395。 ^IH NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.20（IH，s，NH），7.90（d，J= 1.8Hz，IH，CH_ar），7.69-7.19（m，6H，CH_ar），6.82-6.80（m，IH，CH= C），5.36（s，IH，CH）。 HPLC：97.1％（方法B，TR =7.61分钟）。

实施例14：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氯苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：52％。熔点209-211°C。 Rf值=0.46（乙酸乙酯/己烷，50:50）MS：MH+= 395。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.14（s，IH，NH），7.72-7.24（m，7H，CH_ar），6.80（d，J =1.8Hz，IH，CH = C），4.79（s，IH，CH）。 HPLC：95.0％（方法B，TR = 6.80分钟）。

实施例15：7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氟苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。收益率：66％。熔点：186-188℃ ，Rf值=0.46（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 363。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.15（1H，NH），7.64-7.11（m，7H，CH_ar），6.81-6.80（m，1H，CH = C），4.91（s，1H ，CH）。 HPLC：96.3％（方法B，TR =4.65分钟）。

实施例16：7 -（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二甲基苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：70％。熔点217-218°C。 Rf值=0.40（乙酸乙酯/己烷，50:50）。 MS：MH += 355。 ¹H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ10.00（s，1H，NH），7.64（s，1H，CH_ar），7.42-7.14（m，6H，CH_ar），6.79-6.78（m，1H，CH = C），5.07（s，1H，CH）。 HPLC：99.6％（方法B，TR= 6.37分钟）。

实施例17：合成7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。国家统计局的标准（299mg,1.68mmmol）是异丙醇（5ml）溶液中含有7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,7-二氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶（3a）（101毫克，0.28毫摩尔）。将反应混合物回流36小时，然后冷却至室温，用饱和NaHCO₃溶液（20mL），并用乙酸乙酯（15毫升×3）萃取。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发。给定的残余物通过硅胶柱色谱法（乙酸乙酯 /己烷30:70）纯化，得到42毫克白色固体状的4a，产率42％，熔点为238-239°C。 Rf值=0.33（乙酸乙酯/己烷，30:70）。 MS：MH += 359。 ¹H NMR（500 MHz，CDCl₃）：δ8.48（s，1H，CH_ar），8.15（d，J =7.5 Hz，2H，CH_ar），7.57-7.39（m，5H，CH_ar），7.20-7.19（m ，1H，CH_ar）。 HPLC：97.9％（方法C，TR =5.47分钟）。

实施例18：合成顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a〕嘧啶。将硼氢化钠（10毫摩尔）加入到含有7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[升,5-a]嘧啶（1毫摩尔）的甲醇（5毫升）悬浮液。将反应混合物回流30分钟，然后冷却至室温，用水（50毫升）稀释，并充分搅拌。将所得混合物过滤并用水洗涤，得到粗产物，将其进一步通过乙酸乙酯和己烷的混合物重结晶纯化，得到提供产品的白色固体。收益率：89％。熔点227-228°C。 Rf =0.16（乙酸乙酯 /己烷33.3:66.7）。 MS：MH += 363。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.54-7.15（m，8H，CH_ar），5.98-5.94（m，1H，CH），4.82-4.78（m，1H，CH），2.47-2.13（m，2H，CH 2）。 HPLC：99.8％（方法A，TR =3.67分钟）。

根据上述实施例18中描述的方法，使用相应的试剂制备实施例19-39中非限制性的化合物。

实施例19：顺式-5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：88％。熔点246-247°C。 Rf =0.19（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 379。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.55-7.35（m，8H，CH_ar），6.17（dd，J = 11.0，6.5Hz，1H，CH），4.81（d，J = 10.0Hz，1H， CH）,2.42-2 .30（m，2H，CH2）。 HPLC：98.2％（方法A，TR =4.10分钟）。

实施例20：顺式-5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氟苯基）-4,5,6,7-四氢[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶（升）。收益率：84％。熔点245-246°C。 Rf =0.19（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 347。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.52-7.11（m，8H，CH_ar），5.80（dd，J = 11.0，4.5Hz，IH，CH），4.79（d，J =11.0Hz，IH， CH），2.46-2.18（m，2H，CH 2）。 HPLC：98.9％（方法A，TR =3.35分钟）。

实施例21：顺式-7-（2-氯-4-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7- 四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶。产率：94％。熔点224-225°C。 Rf值=0.14（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 363。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.58-7.17（m，8H，CH_ar），5.73（d，J =3.5Hz，IH，CH），4.78（d，J= 10.5Hz，IH，CH），2.44-2.18（m，2H，CH2）。HPLC：96.8％（方法A，TR =4.12分钟）。

实施例22：顺式-7-（2-氯苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7- 四氢[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：68％。熔点：202-204℃。 Rf =0.14（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH +=345。¹H NMR（500MHz，DMSO-d6）：δ7.56-7.27（m，CH_ar，9H），7.08（s,1H，NH），5.75（s，IH，CH），4.78（d，J= 10.5Hz，IH，CH），2.46-2.16（s，2H，CH2）。HPLC：98.8％（方法A，TR= 3.63分钟）。

实施例23：顺式-5-（4-氯苯基）-7-（4-异丙基苯基）-4,5,6,7-四氢[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶（升）。产率：75％。熔点194-195℃。 Rf =0.09（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 353。^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ,7.47-7 .44（m，3H，CH_ar）,7.41-7 .38（m，2H，CH_ar），7.18（d，J =8.0Hz，2H，CH_ar），7.11（d，J=8.0Hz，2H，CH_ar），5.34（日，J = 10.5，5.0赫兹，IH，CH），4.70（日，J =11.5，2.5赫兹，IH，CH）,2.90-2 .82（m，IH，CH），2.42-2.07（m，2H，CH2），1.18（d，J=7.0 ，2H，CH_ar）HPLC：99.8％（方法A，TR = 4.99分钟）。

实施例24：顺式-5-（4-氯苯基）-7-苯基-4,5,6,7-四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶。产率：77％。熔点：210-212℃。Rf =0.09（乙酸乙酯/己烷，75:25）。MS：MH += 311。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ:7.48-7 .46（m，3H，CH_ar），7.42-7 .39（m，2H，CH_ar），7.35-7.26（m，3H，CH_ar），7.22-7 .20（m，2H，CH_ar），5.40-5.37（m，IH，CH），4.71（dd，J = 11.0，2.5Hz，IH，CH），2.45-2.06（m，2H，CH2）。 HPLC：99.8％（方法A，TR =3.11分钟）。

实施例25：顺式-7- （2-氯-6-氟苯基）-5-（2-氯苯基）-4,5,6,7-四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：90％。熔点：271-272°C。 Rf =0.17（乙酸乙酯 /己烷33.3:66.7）。 MS：MH += 363。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.70-7.15（m，8H，CH_ar），6.05-6.00（m，IH，CH），5.16-5.13（m，IH，CH），2.47-2.08（m，2H，CH2）。 HPLC：99.4％（方法A，TR =3.64分钟）。

实施例26：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3-氯苯基）-4,5,6,7- 四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a〕嘧啶，产率：80％。熔点262-263°C。 Rf =0.13（乙酸乙酯 /己烷33.3:66.7）。 MS：MH += 363。 ¹H NMR（500兆赫，DMSO-6）：δ7.56-7.17（米，8H，CHAR），5.94（IH，CH），4.81（，IH，CH），2.48-2.15（2H，CH 2米）。 HPLC：99.7％（MethodA的，TR =3.16分）。

实施例27：顺式-7 - （2 - 氯-6 - 氟苯基）-5 - （4 – 氟苯基）-4,5,6,7 - 四氢 - [1，2,4]三唑并[1,5-a〕嘧啶，产率：68％。熔点240-241°C。 Rf值=0.22（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 347。 1 H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.52-7.15（m，8H，CH_ar），5.98-5.93（m，IH，CH），4.82-4.78（m，IH，CH），2.48-2.14（m，2H，CH2）。 HPLC：98.4％（方法A，TR =3.86分钟）。

实施例28：顺式-5-（4–溴苯基）-7-（2-氯-6-氟苯基）-4,5,6,7- 四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a〕嘧啶，产率：64％。熔点246-247°C。 Rf =0.22（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 409。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.58-7.15（m，8H，CH_ar），5.97-5.95（m，IH，CH），4.80-4.77（m，IH，CH），2.43-2.15（m，2H，CH2）。 HPLC：99.5％（方法A，TR= 4.09分钟）。

实施例29：顺式-7- （2- 氯-6-氟苯基）-5-（4–乙基苯基）-4,5,6,7-四氢- [1,2,4]三唑并[1,5-a〕嘧啶，产率：90％。熔点230-231°C。 Rf =0.28（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 357。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.44-7.15（m，8H，CH_ar），5.97-5.93（m，IH，CH），4.75-4.72（m，IH，CH），2.60（q，J =7.5Hz，2H，CH2），2.47-2.15（m，2H，CH2），1.17（t，J=7.5Hz，3H，CH3）(方法A，TR = 3.67分钟）。

实施例30：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：86％。熔点221-222°C。 Rf =0.20（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 359。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.41-6.93（m，CH_ar，8H），5.96-5.92（m，IH，CH），4.72（s，J=10.5 Hz，IH，CH），3.75（ s，3H，OCH 3），2.46-2.14（m，2H，CH 2）。 HPLC：99.4(方法A，TR = 3.03分）。

实施例31：顺式-5-(1,1-联苯]-4-基) -7-（2-氯-6-氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，收益率：84％。熔点213-215°C。 Rf =0.20（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 405。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.69-7.16（m，13H，CH_ar），6.01-5.97（m，IH，CH），4.85-4.82（m，IH，CH），2.47-2.21（m，2H，CH2）。 HPLC：99.0％（方法A，TR= 4.92分钟）。

实施例32：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（萘-2-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，收益率：72％。熔点224-225°C。 Rf =0.31（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 379。，^IH NMR（500 MHz，DMSC/ 6）：δ8.01-7.16（m，11H，CH_ar），6.05-6.00(m，IH，CH)，4.98-4.95（m，IH，CH），2.61-2.27（m，2H，CH2，与DMSO的重叠峰）。 HPLC：99.6％（方法A，TR= 4.02分钟）。

实施例33：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：77％。熔点252-254°C。 Rf=0.21（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH +=397。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-6）：δ7.72-7.15（m，7H，CH_ar），5.97-5.92（m，IH，CH），4.84-4.80（m，IH，CH），2.47-2.14（m，2H，CH2）。 HPLC：99.7％（方法A，TR= 4.56分钟）。

实施例34：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：88％。熔点267-269°C。 Rf =0.22（乙酸乙酯/己烷33.3:66.7）。 MS：MH +=397。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.70-7.15（m，7H，CH_ar），6.05-6.00（m，IH，CH），5.14-5.11（m，IH，CH），2.49-2.09（m，2H，CH2）。 HPLC：98.7％（方法A，TR =4.96分钟）。

实施例35：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：92％。熔点225℃。 Rf =0.28（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 365。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.65-7.12（m，7H，CH_ar），6.04-5.99(m，IH，CH），5.05（d，J =10.5 Hz，IH，CH），2.43 2.23（m，2H，CH2）。 HPLC：99.1％（方法A，TR= 3.37分钟）。

实施例36：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二甲基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：88％。熔点223℃。 Rf=0.25（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 357。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.41-7.12（m，7H，CH_ar），5.97-5.92(m，IH，CH），4.69（d，J =10.5 Hz，IH，CH），2.46 2.14（m，2H，CH2，两个CH3的重叠峰），2.23（s，3H，CH 3，CH 2的重叠峰），2.20（s，3H，CH 3，CH 2的重叠峰）。 HPLC：99.7％（方法A，TR= 3.95分钟）。

实施例37：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-苯基-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，收益率：82％。熔点270-271°C。 Rf= 0.26（乙酸乙酯/己烷，75:25）。 MS：MH += 329。 IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.50-7.15（m，9H，CH_ar），5.99-5.94（m，IH，CH），4.80-4.76（m，IH，CH），2.48-2.16（m，2H，CH2）。 HPLC：99.5％（方法A，TR =3.05分钟）。

实施例38：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（吡啶-2-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：65％。熔点232°C。 Rf=0.08（乙酸乙酯 /己烷90：10）。 MS：MH+=330。¹H NMR（500 MHz，DMSO-6）：δ,8.56-8 .54（m，IH，CH_ar）,7.87-7 .83（m，IH，CH_ar），7.60-7.13（m，6H，CH_ar） 6.05-5.99（s，IH，CH），4.88-4.85（m，IH，CH），2.60-2.23（m，2H，CH 2，与DMSO的重叠峰）HPLC：99.7％（方法A，TR =2.24分钟）。

实施例39：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（6-甲氧基吡啶-3-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶，产率：64％。熔点230-221°C。 Rf=0.14（乙酸乙酯/己烷，90:10）。 MS：MH += 360。 ^IH NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ8.22（d，J= 2.0Hz，IH，CH_ar）,7.79-7 .77（m，IH，CH_ar），7.48-7.16（m，4H，CH_ar），6.86 6.82（IH，CH_ar），5.98-5.93（m，IH，CH），4.79-4.75(m，IH，CH），3.85（s，3H，OCH3），2.47-2.20（m，2H，CH2）。HPLC：95.0％（方法A，TR= 2.61分钟）。

实施例40：顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶的手性拆分：将7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5a]嘧啶在配备为CHIRALPAK®AD-RH柱的沃特斯2695高效液相色谱仪进行手性拆分。洗脱系统为：30%A（水），70%B（乙醇）；流速=0.5毫升/分钟，λ= 219纳米；两个对映体，40a的（R，S）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯-苯基）-4,5,6,7 -四氢- [1,2,4]三唑并[升,5-a]嘧啶和40b的（S，R）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯 -苯基）-4,5,6,7 - 四氢 - [1,2,4]三唑并[升,5-a]嘧啶从洗脱的峰中被孤立除去，分别为43.5分钟和57.8分钟。40a的（R，S）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯-苯基）-4,5,6,7 -四氢-[1,2,4]三唑并[升,5-a〕嘧啶：Rf =0.16（乙酸乙酯 /己烷33.3:66.7）。MS：MH += 363。 ¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.54-7.15（m，8H，CH_ar），5.98-5.94（m，1H，CH），4.82-4.78（m，1H，CH），2.47-2.13（m，2H，CH 2）。 HPLC：99.8％（方法A，TR= 3.67分钟），CHIRALPAK®AD-RH列的RF= 43.5分钟。40b的（S，R）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯-苯基）-4,5,6,7-四氢- [1，2,4]三唑并[升,5-a〕嘧啶：Rf =0.16（EtOAc /己烷33.3:66.7）。 MS：MH += 363。¹H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.54-7.15（m，8H，CH_ar），5.98-5.94（m，1H，CH），4.82-4.78（m，1H，CH），2.47-2.13（m，2H，CH2）。HPLC：99.8％（方法A，TR= 3.67分钟），CHIRALPAK®AD-RH列的RF= 57.8分钟。

方法

在评价和化合物原则上，利用下面的方法降低乙型肝炎表面抗原的血清浓度水平。

耐药的HBV变异株的产生和测试：质粒pTREHBV，编码HBV基因组的AYW血清型(郭, H.; 江, D.; 周, T.; Cuconati, A.; Block, T. M.; 郭, J. T., 2007年)被用作背景的野生型构造。标准的分子生物学程序，采用GeneTailor位点定向诱变系统（Invitrogen公司，卡尔斯巴德CA）被用来生成单或双点突变，会引起下列氨基酸变化的开放阅读框的聚合酶：M552V，M552I，N584T，A529V，L528M/M552V，L528M/M552V/T532G/S550I（西格，C，梅森，W，S，2000年Yotsuyanagi，H.;小池，K.，2007）。生产两倍和四倍的突变体，核苷酸被替换通过顺序产生单基因突变，确认序列，并引入额外的突变到中间结构，通过集成DNA测序技术（Coralville IA），证实了结构。SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17的引物序列被用于基因诱变。

根据指示，将HepG2细胞接种75平方厘米烧瓶中，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen），从突变体和野生型HBV的构造中瞬时表达乙肝表面抗原，完成质粒转染，24小时转染后，细胞经过胰蛋白酶消化，并接种到密度为5×105细胞/孔的96-细胞孔板上。24小时后，在0.5％DMSO的培养基中，每个细胞孔中的介质被试验化合物代替的浓度范围为0.016-50.0x106M。对照细胞孔中仅含有DMSO，每个化合物的浓度一式两份进行测试，通过ELISA检测HBsAg水平（多尔蒂，AM过，H. G.韦斯特比，刘禹，E. Simsek过，J.;梅塔，A.;诺顿，PG，B.;座，T.; Cuconati2007年，A.），并计算EC50值。对于每个突变的HBV基因组，至少进行5次甚至高达10次的化合物测试，直到能达到允许标准偏差的计算。

在聚苯乙烯96孔板的各孔中，将结合缓冲液（0.17％碳酸钠，0.29％的NaHCO 3，pH9.6）稀释至0.9毫克/毫升，通过培养25μl/孔的商业单克隆抗-HBs（克隆M701077，菲茨杰拉德产业的，协和MA）采集乙肝表面抗原ELISA。在4℃孵育培养，然后用150μl/孔的PBS/0.5％吐温20（PBST）洗涤两次，振摇。在37℃下，采集孔通过150μlPBST/2.0％BSA被阻断，然后如上所述，洗涤两次。如下文所述，第二次洗涤后，细胞板上细胞培养上清液中的化合物被转移和处理。

此外的化合物，在温度37℃下和含有5.0％CO₂的大气环境下，在细胞皿中培养六天。孵育后，如上文所述的，细胞皿中150μl的介质被转移到阻塞ELISA采集板中，并在4℃的温度下温育4天。除去培养基，洗涤平板，并在PBST/2.0％BSA溶液中加入25μl/孔的检测抗体（过氧化物酶标记的抗表面抗原鼠单克隆抗体Auzyme ELISA检测试剂盒，Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL）并稀释至浓度为0.625纳克/毫升。在37℃下孵育1小时。用150μl/孔的PBST洗涤两次，振荡，并加入50微升/孔的BM蓝的POD基片（POD，罗氏，印第安纳波利斯，IN），将细胞板在室温下放置20分钟，并使用SLT分光光度计在650 nm处的参考波长490nm下比色，（Tecan公司美国北卡罗来纳州研究三角园）根据颜色变化判定吸光度，并画出最佳的XLfit4.0拟合曲线（IDBS；布里奇沃特，新泽西州），根据结果进行分析。在细胞中培养DMSO，并对多个阴性对照品计算抑制程度，此外，每块板均含有多个含有1.0mM DTT作为参考抑制剂的反应孔。只有曲线R2值在0.5以上被认为是产生有效的EC50值。

根据本发明的代表性化合物的结果列于表2和表3所示。

表2：选定的化合物的例子，从通式I，II，III，IV，V和VI的例子选定化合物和野生型HBV中含有生物活性的化合物。

* EC₅₀：50％有效浓度，通过乙肝表面抗原ELISA检测试验测量在HepG2（HepG2.2.15细胞）中野生型HBV结构稳定转染。

表3：从通式I，II，III，IV，V和VI中选定化合物和效力为生物活性的抗HBV。

* EC₅₀：50％）的有效浓度，通过乙肝表面抗原ELISA检测试验测量在HepG2细胞中的HBsAg瞬时转染与抗HBV构造。

序列表

<110> 肝炎与病毒研究所

<120> 乙型肝炎病毒抗原分泌的新型抑制剂

<130> IHVR15PCT

<150> US 61/389,321

<151> 2010-10-04

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 1

gcctcagccc gtttctcctg gttcagttta ctag 34

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 2

caggagaaac gggctgaggc ccactcccat 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 3

ccaattttct tttgtctttg ggtgtacatt taacccctaa caaaac 46

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 4

acccaaagac aaaagaaaat tggtaacagc ggt 33

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 5

gttgctgtac caaaccttcg g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 6

gttcttgtgg caatgaccc 19

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 7

gtctttgggt atacatttaa cccctaacaa aac 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 8

taaatgtata cccaaagaca aaagaaaatt g 31

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 9

gggcctcagc ccgtttctca tggctcagtt tac 33

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 10

gagaaacggg ctgaggccca ctcccatagg 30

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 11

cactgtttgg ctttcagtta tgtggatgat gtggt 35

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 12

ataactgaaa gccaaacagt gggggaaagc c 31

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 13

cactgtttgg ctttcagtta tatcgatgat gtggt 35

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 14

cgtttctcat ggctcagttt ggtagtgcca tttc 34

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 15

aaactgagcc atgagaaacg ggctgaggcc 30

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 16

cccccactgt ttggctttca tttatgtgga tg 32

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 17

gaaagccaaa cagtggggga aagccctacg 30

Claims

1.一种药物组合物，包含：

（a）选自化学式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI、或它们的特定对映体的有效量的一种或多种化合物：

其中：

R₁ – R₁₂是独立的苯基或杂环，其中每一苯基或杂环可被利用至少一个选自以下群组的取代基独立地任意取代：(C_1-7 )烷基、(C_2- _ό)烯基、(C_2- _ό)炔基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7) 芳胺基、(C_3-12) 环烷基、(C_1-7) 酰基、芳基、卤素、OR_a、三氟甲氧基、三氟甲基、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b、P(=O)(OR_a)(R_a)和杂环，其中，(C_1-7 )烷基或(C_3-12) 环烷基被任意利用1-5芳基、杂环、ORa、卤素、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b或P(=O)(OR_a)(R_a)各自独立随意取代；

X₁ – X₁₂是独立的键或饱和或不饱和亚烃基；

R_a 和 R_b 分别独立地代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7) 烷酰基、(C_2-7) 烷酰氧基、或芳基、或R_a 和 R_b和与其连接的氮原子一起形成杂环；

m 为 0、1或 2；

n为0、1、2、3或 4；

或选自化学式VII的化合物和它的对映体组成群组中的有效量的一种或多种化合物：

其中：

X₁、X₂、R₁、R₂、R₇均如上所述，

R₁₃代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7) 烷酰基、(C_2-7) 烷酰氧基或芳基；

或化学式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、VI、VII的化合物或它们的特定对映体的衍生物，选自以下群组：N-氧化衍生物、前药衍生物、保护衍生物、同分异构体、以及所述化合物异构体的混合物；或所述化合物或所述衍生物的药用可接受盐或溶剂化物；及

（b）一种药物学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，包括：

（a）选自以下群组的有效量的一种或多种化合物：

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氯苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氟苯基）-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-4-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2-氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3-氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

5-（4-溴苯基）-7-（2-氯-6-氟苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-乙基苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

5-(1，1’-联苯]-4-基) -7-（2-氯-6-氟苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（萘-2-基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氯苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氟苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二甲基苯基）-4-7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-（4-氯苯基）-7-（2,6-二氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-4-氟苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯苯基）-5-（4-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-（4-氯苯基）-7-（4-异丙基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-（4-氯苯基）-7-苯基-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3-氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-（4-溴苯基）-7-（2-氯-6-氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-乙基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（4-甲氧基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-5-(1，1’-联苯]-4-基) -7-（2-氯-6-氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（萘-2-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氯苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（2,4-二氟苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（3,4-二甲基苯基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-苯基-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（吡啶-2-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

顺式-7-（2-氯-6-氟苯基）-5-（6-甲氧基吡啶-3-基）-4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

（R，S）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯-苯基）4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

（S，R）-7-（2-氯-6-氟-苯基）-5-（4-氯-苯基）4,5,6,7-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

或它们的特定对映体；

或药物学上可接受的形式。

3.根据权利要求1所述的组合物，还包含抗病毒化合物。

4.根据权利要求2所述的组合物，还包含抗病毒化合物。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述抗病毒化合物选自以下组成的群组：核苷抗病毒化合物、核苷酸化合物及其混合物。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述抗病毒化合物选自以下组成的群组：核苷抗病毒化合物、核苷酸化合物及其混合物。

7.一种治疗患者体内的肝炎病毒的方法，包括按所需给患者施用有效量的权利要求1所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述肝炎病毒选自嗜肝病毒科家族的病毒和丁型肝炎病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒。

10.一种治疗患者的肝炎病毒的方法，包括给患者施用有效量的化学式I- III的化合物，所述化合物减少所述患者的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的血清浓度水平。