CN100544727C

CN100544727C - 治疗乙型肝炎的药物组合物

Info

Publication number: CN100544727C
Application number: CNB2005100108271A
Authority: CN
Inventors: 陈纪军; 江志勇; 张奉学; 刘妮; 赵舫; 张雪梅; 周俊
Original assignee: Tropical Medicine Institute Guangzhou University Of Chinese Medicine; Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Tropical Medicine Institute Guangzhou University Of Chinese Medicine; Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2009-09-30
Anticipated expiration: 2025-05-27
Also published as: CN1775217A

Abstract

治疗乙型肝炎的药物组合物，其中含有式(I)化合物泽泻醇A(Alisol A)作为有效成分，并含有常规药用载体。上述药物化合物泽泻醇A(Alisol A)在制备抗乙型肝炎药物和抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

Description

治疗乙型肝炎的药物组合物

发明领域：

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种治疗乙型肝炎的药物组合物及其在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和在制备抗乙型肝炎药物中的应用。

背景技术：

人们通常所说的肝炎，就是病毒性肝炎。目前已发现由7种肝炎病毒引起的肝炎分别为甲型肝炎，乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎和TTV。这7种病毒性肝炎中，甲型、戊型肝炎是通过胃肠道传播，属自限性疾病，不会发展为慢性肝炎。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，只有依附于乙型肝炎病毒才能复制；庚型肝炎不引起大范围传播。乙型和丙型肝炎是严重危害人体健康的病毒性传染病。乙肝病毒属DNA嗜肝病毒科，丙肝病毒属RNA黄病毒科，其传播途径是通过血液、母婴和性接触等3种途径传染，并且易转成慢性肝炎，是肝硬化、肝癌的主要病因。乙型肝炎病毒的复制过程涉及5步：结合、侵入，转录，翻译，基因复制和包装。首先颗粒通过受体附着于肝细胞，侵入胞浆后脱去外膜，形成核心颗粒。核心颗粒移至肝细胞核， HBV DNA右核心颗粒脱壳而出，在细胞核内形成cccDNA.cccDNA是乙型肝炎病毒复制的膜板，是感染长期持续的关键物质。cccDNA有2种功能，其一是合成病毒颗粒的各种构件，如HBsAg(面抗原，构成外膜)，HBcAg(核心抗原，构成内膜)，HBeAg(e抗原，分泌到血液中)；其二是合成下一代HBV DNA.大部分新合成的HBVDNA用于新病毒颗粒的包装，部分则重新进入肝细胞核，成为cccDNA的另一个来源。部分新合成的HBVDNA首先与HBcAg组装成核心颗粒，进而与HBsAg组装成完整的HBV颗粒，向细胞外释放。HBsAg有时过剩而独自释放入血，形成小球型颗粒或管型颗粒。

目前对乙型和丙型病毒性肝炎的治疗尚缺乏专属性较强的治疗药物。国外对治疗病毒性肝炎新药的研制侧重于开发抗肝炎病毒药，在抗肝炎病毒化疗药物的研究中取得一些进展。80年代曾进行试验的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韦、齐多夫定因疗效不佳，毒性反应大，在国外已不再用于治疗乙肝。近几年开发了多种核苷类药物，对HBV有明显的抑制作用。拉米夫定(lamivudine)，泛昔洛韦(famciclovir)，洛布卡韦(lobucavir)，阿地福韦(adefovir dipivoxiil)，FTC(二脱氧氟硫代胞嘧啶)，FMAU(氟甲阿糖尿嘧啶)，FDDC(氟二脱氧胞嘧啶)，BMS 200475(环氧羟碳脱氧鸟苷)这些药物具有下列共同点：均为核苷类的衍生物，分别为胞嘧啶，尿嘧啶，鸟嘧啶或嘌呤化合物。在体外或体内实验中，对HIV、HBV或HCV等病毒有抑制作用。其作用机制为进入细胞内成为三磷酸化合物，通过底物的竞争，对病毒的聚合酶或反转录酶抑制，最终抑制病毒DNA的合成、病毒的增殖。经过长期的治疗后，病毒可能出现变异和耐受性。需长期用药，因短期应用仅有暂时效果。如与其他不同作用靶点的药物联合应用，可提高疗效，降低耐药性发生。其他治疗方法如利巴韦林和基因重组干扰α-2b(intron A)合用、干扰素复合物、干扰素复合物(pegasys、2001年)治疗慢性丙型肝炎。另外为控制乙型肝炎的蔓延，医学界还研究出有效的乙型肝炎疫苗，对公众进行免疫注射。如治疗慢性乙型肝炎采用的药物是α一干扰素(IFN)，其作用主要是免疫调节。但干扰素治疗慢性乙型肝炎有其制约因素：其一，它从未获得真正成功，除非病人在治疗前已出现对HBV的实质性免疫反应。其二，在干扰素诱导的HBeAg血清转换之前，肝炎活动的突然、一过性加重(表现为ALT升高)可导致肝硬化病人发生肝功能衰竭、偶尔出现死亡。研发出抗肝炎、抗肝硬化的新一代药物在市场上会有很强的竞争力。抗肝炎药物在国内外有非常大的市场，但现在的抗肝炎药物普遍存在耐药性的问题。成功地开发出能解决抗肝炎药物的耐药性，临床有效率高，且毒副作用较低的药物，应有非常好的市场前景。

迄今，现有技术中没有含有式(I)化合物泽泻醇A(Alisol A)作为有效成分在治疗艾滋病方面的报道，也没有该化合物在制备乙型肝炎药物和乙型肝炎抑制剂药物中的应用报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供用于治疗乙型肝炎药物组合物，其中含有治疗乙型肝炎有效量的式(I)化合物泽泻醇A(Alisol A)及药用载体和/或赋形剂，提供该药物组合物在制备抗乙型肝炎药物中和抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

治疗乙型肝炎的药物组合物，其中含有式(I)化合物泽泻醇A(Alisol A)作为有效成分，并含有常规药用载体。

本发明同时提供了上述药物组合物在制备抗乙型肝炎药物中和抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物泽泻醇A(AlisolA)，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体。

所述的药用载体是一种或多种选固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。

具体实施方式：

下面的实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：泽泻醇A的提取分离与结构鉴定

泽泻醇A(Alisol A)的提取分离：

采集泽泻块根，其学名经鉴定为Alisma orientalis(Sam.)Juzep.，.室温阴干，粉碎。取20千克干粉，用90％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，减压回收得乙醇得浸膏。该浸膏悬浮于水中，用氯仿、正丁醇分别萃取，回收溶剂得氯仿部分(450克)和正丁醇部分(130克)。氯仿部分用甲醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干，研粉，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(100∶0-90∶10)梯度洗脱，TLC F254硅胶薄板指导分离并检测各流份，相同流份合并，第14-18流份合并，甲醇重结晶2次，得白色小针晶化合物泽泻醇A(Alisol A)23克(得率0.115％)。经TLC硅胶F254薄板检测与对照品泽泻醇A(Alisol A)，Rf值相同。

泽泻醇A(Alisol A)的结构数据：

熔点用四川大学科仪厂的显微熔点测定仪XRC-1型测定；红外光谱(IR)用Bio-Rad FTS-135型分光光度计测定，KBr压片。质谱(MS)用Auto SPEC3000型质谱仪测定，采用EI-MS技术。核磁共振谱(¹H NMR和¹³C NMR)用BrukerWH-400超导核磁共振仪测定，TMS作内标，CDCl₃作溶剂。青海洋化工厂出品的200-300目硅胶作为柱层析材料；薄层层析用青海化工厂出品的硅胶板指导分离。展开剂：A：氯仿-甲醇(95∶5，/v)；B：石油醚-乙酸乙酯-(7∶3)；C，甲醇-水(8∶2)。显色剂：A、5％H₂SO₄-EtOH。

结构：如化学式

所示

分子式：C₃₀H₅₀O₅

分子量：490

性状：无色柱状晶体(甲醇

[α]₀25：+99°(c 0.586，吡啶).

IRv_maxKBrcm^-1：3391(OH)，

1733，1717，1652，1608，1575，1506，1500，1361，1248，1183。

EI-MS m/z::472[M]⁺。

¹H NMR(C₅D₅N)：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.02(3H，d，J＝6.9Hz，H-21)，0.99，1.05，1.05，1.07，1.12，1.24，1.30(each 3H，s)，1.76(1H，d，J＝10.8Hz，H-9)，2.79(1H，m，H₁-12)，3.00(1H，br.s，H-24)，3.78(1H，dd，J＝9.4，2.4Hz，H-23)，3.88(1H，ddd，J＝10.7，10.7，6.0Hz，H-11)。

¹³C NMR(CDCl₃)δ：30.9(C-1)，33.6(C-2)，221.0(C-3)，46.9(C-4)，48.4(C-5)，20.1(C-6)，34.2(C-7)，40.3(C-8)，49.4(C-9)，36.8(C-10)，69.6(C-11)，34.2(C-12)，137.6(C-13)，56.9(C-14)，30.4(C-15)，29.0(C-16)，135.2(C-17)，22.9(C-18)，25.5(C-19)，28.1(C-20)，20.1(C-21)，40.0(C-22)，69.4(C-23)，77.7(C-24)，74.1(C-25)，27.2(C-26)，26.2(C-27)，29.5(C-28)，19.9(C-29)，24.0(C-30).

实施例2：

泽泻醇A(Alisol A)对2.2.15细胞的毒性和对分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用试验。

1材料和方法

1.1药物：泽泻醇A(Alisol A)为来自中药泽泻(Alisma plantago-aquqticavar.orienta)中的为单体化合物。

1.2 2.2.15细胞引自北京302医院；用DMEM液培养，培养液添加10％胎牛血清，0.03％L-谷氨酰胺，100mg/LG418，10⁵IU/L青酶素，100mg/L链霉素，5％NaCO₃调PH至6.8。

1.3仪器：酶标仪ELX800(德国)

1.4药物应用用胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，每孔按3×10⁴·0.1ml^-1分种于96孔板，24h后换用含药培养液，每种药物设八个药物浓度，每个浓度设两孔，并设不加药物的对照；11d后收集上清，备作HBsAg和HBeAg测定。同时测定药物细胞毒性。

1.5细胞毒性检测根据Mosmann建立的MTT法检测药物细胞毒性^[1]。具体方法是：向吸去上清的细胞孔中加入0.4g/L MTT的无血清培养液0.1ml/孔，37℃培养4h，去上清，用二甲基亚砜溶解，测490nm波长下的吸光下的吸光度A值。破坏百分率η_distroy＝(A_细胞组-A_实验组)/(A_细胞组-A_空白组)×100，50％毒性浓度(CC50)为实验孔存活细胞为对照孔50％时的药物浓度。

1.6HBsAg、HBeAg的检测：采用华美生物工程公司生产的酶联检测试剂盒检测。药物对抗原的抑制百分率η_inhibitory＝(A_细胞组-A_实验组)/(A_细胞组-A_空白组)×100，50％抑制浓度(IC50)为HBsAg或HBeAg以抑制率为50％时的药物浓度。选择指数(SI)为评价药物临床应用前景的参数，TI＝CC50/IC50。

2.结果：药物对HBsAg、HBeAg分泌及细胞存活的影响。本实验选择HBsAg、HBeAg作为泽泻醇A(Alisol A)效果的研究指标，通过MTT法检测细胞毒性(表1)，并相应计算出治疗指数来评价药物临床应用前景，其中SI＞2为有效低毒，1＜SI＜2为低效有毒，TI＜1为毒性作用。表1、表2和表3给出了具体结果。

表1泽泻醇A(Alisol A)对2.2.15细胞的毒性作用

表2.泽泻醇A(Alisol A)对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用

表3.泽泻醇A(alimasol A对HBsAg和HBeAg的抑制效果

结果表明：泽泻醇A(Alisol A)对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg具有抑制作用。

3.结论：

实验结果显示泽泻醇A(Alisol A)在对2.2.15细胞的半数毒性作用下，在体外对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。

实施例3：

泽泻醇A(Alisol A)对鸭乙肝病毒(DHBV)感染的抑制作用

实验目的：研究泽泻醇A对鸭乙肝病毒(DHBV)感染的抑制作用。

实验材料：

一、药物：

1.泽泻醇A(Alisol A)为来自中药泽泻(Alisma plantago-aquqtica var.orienta)中的为单体化合物。在植物中的含量为0.1％。

2.阿昔洛韦(ACV)：由丽珠集团湖北科益药业有限公司生产，批号0112005。

二、动物：雄性一日龄龙岩麻鸭，购自石井潮阳村孵化场，实验时体重约120克/只，常规饲养。饲养环境：本校动物饲养室，温度24℃～26℃，相对湿度60～80％，定时通风换气，每日约12小时光照。饲料：宝鼎501小鸭饲料，由穗屏企业有限公司饲料厂生产，本产品符合饲料卫生标准。40kg/包。

三、主要试剂及仪器：

1.NC膜：购自Amersham公司。

2.DHBV质粒：由广州中医药大学热带病研究所病毒室技术人员提取。

3.缺口翻译药盒：购自promega公司。α-³²p-dCTP，购自北京亚辉公司。

4.Sephadex G-50：购自Pharmacia公司。

5.96孔杂交点样器：美国Bio-rad公司产品。

6.盖革氏计数器：美国S.E.International公司产品。

四、阳性药选择：

选择对DHBV抑制作用较强的阿昔洛韦(ACV)作为阳性对照药。

五、药物剂量配制：

泽泻醇A(Alisol A)高剂量：取120mg+0.4ml DMSO+3.8ml水(30mg/ml)；泽泻醇A(Alisol A)低剂量；取80mg+0.5ml DMSO+8.2水(9.2mg/ml)，每天现配；阿昔洛韦(ACV)：200mg/kg。

六、结果处理：用单因素方差分析进行统计学处理。

七、实验方法与结果：

(一)、抗鸭乙肝病毒作用在体内实验：

一日龄龙岩麻鸭购回后，于第6天经胫静脉取血，分离血清后，用斑点杂交的方法检测DHBV，选出先天感染的鸭子实验。泽泻醇A(alimasol A)大剂量组和小剂量组给药剂量均为1ml/只/天；另设病毒对照(DHBV)，以水代替药物；阳性药用阿昔洛韦(ACV)200mg/kg/天。以上药物均口服给药，10天一疗程。在第17天即用药前(T₀)、用药第5天(T₅)、第10天(T₁₀)及停药后第3天(P₃)，自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃冻存待检。

(二)、DHBV-DNA检测方法：

取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的变化，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用³²P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪上测定OD值(滤光片波长为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度。

(三)、实验结果：

表4泽泻醇A(Alisol A)在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用(x±s)

注：泽泻醇A(Alisol A)组给药不同时间与给药前(T₀)比较： ^*P＜0.05

泽泻醇A(Alisol A)组与对照组相同时间比较：_△△P＜0.01 _△P＜0.05

(四)、结论：

实验表明，泽泻醇A(Alisol A)二个剂量组10天疗程，在高剂量(300mg/kg/天)组对鸭乙型肝炎病毒有明显的抑制作用。

实施例4：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例5：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例6：

将所分离得到的泽泻醇A(Alisol A)与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例7：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例8：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，按常规口服液制法制成口服液。

实施例9：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例10：

按实施例1的方法先制得泽泻醇A(Alisol A)，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

Claims

1、治疗乙型肝炎的药物组合物，其中含有式(I)化合物泽泻醇A(Alisol A)作为有效成分，并含有常规药用载体，

2、权利要求1所述药物化合物泽泻醇A(Alisol A)在制备抗乙型肝炎药物中的应用。