CN101437844A

CN101437844A - 编码玉蜀黍除草剂抗性基因的多核苷酸和使用方法

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Publication number: CN101437844A
Application number: CNA2007800165661A
Authority: CN
Inventors: T·丹; A·D·小圭达; C·B·哈策尔; B·李; M·E·威廉斯
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2027-03-09
Also published as: CA2644130A1; CA2644130C; US20080050823A1; WO2007103567A2; US7705200B2; US20080050818A1; US20080050822A1; US7838263B2; US20090217415A1; CN103146828B; CN101437844B; TW200808961A; MX2008011586A; US20080096218A1; US20080052796A1; US20080050824A1; US20080052798A1; US20080052797A1; WO2007103567A3; US20070214515A1

Abstract

本发明涉及编码可以赋予针对至少一种除草剂的抗性的基因的多核苷酸序列。它进一步涉及携带包含所述多核苷酸序列的嵌合基因的植物和植物种子，所述多核苷酸序列增强或赋予针对至少一种除草剂的抗性，以及制备所述植物和种子的方法。本发明进一步提供了可以用作分子标记的序列，其依次可以用于鉴定玉米系中起因于新杂交的目的区域，并且通过避免敏感系快速且有效地选择最佳系用于育种策略。

Description

编码玉蜀黍除草剂抗性基因的多核苷酸和使用方法

发明领域

本发明涉及用于产生或增强植物中的除草剂抗性的组合物和方法。此外，本发明涉及已用本发明的组合物遗传转化的植物。

发明背景

在农作物的商业生产中，希望容易且快速地从农作物植物的田地中清除不需要的植物(即，“杂草”)。理想的处理将是可应用于整块田地但仅清除不需要的植物同时使农作物植物不受伤害的处理。一种这样的处理系统涉及对除草剂耐受的农作物植物的使用。当除草剂喷洒在除草剂耐受农作物植物的田地上时，农作物植物继续茁壮成长而非除草剂耐受杂草被杀死或严重损害。

针对特定除草剂的农作物耐受性可以通过将基因工程改造到农作物内来赋予，所述基因编码合适的除草剂代谢酶。在一些情况下，这些酶和编码其的核酸起源于植物。在其他情况下，它们衍生自其他生物，例如微生物。参见例如，Padgette等人(1996)“New weed controlopportunities：Development of soybeans with a Round UP Ready^TM gene”和Vasil(1996)“Phosphinothricin-resistant crops，”2个参考文献都在Herbicide-Resistant Crops，编辑Duke(CRC Press，Boca Raton，Florida)第54-84页和第85-91页。事实上，转基因植物已进行工程改造以表达来自多种生物的多种除草剂耐受基因，包括编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白质的基因(Shiota等人(1994)Plant Physiol.106：17)，以及其他植物P450基因(参见，例如，Didierjean，L.等人(2002)Plant Physiol.130：179-189；Morant，M.S.等人(2003)Opinion in Biotechnology14：151-162)。赋予针对除草剂耐受性的其他基因包括：乙酰羟酸合酶(“AHAS”)，其已发现对表达其的植物赋予针对多个ALS除草剂类型的抗性，并且已引入多种植物内(参见，例如，Hattori等人(1995)Mol.Gen.Genet.246：419)；谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶(Aono等人(1995)Plant Cell Physiol.36：1687)；和关于各种磷酸转移酶的基因(Datta等人(1992)Plant Mol.Biol.20：619)。

尽管除草剂耐受农作物植物目前是商购可得的，但农作物生产的每个方面中的改善是持续需要的。不幸的是，目前商购可得的除草剂和农作物都具有可以限制其在商业农作物生产中的有用性的特定特征。特别地，个别除草剂具有针对常见杂草物种的不同和不完全的活性谱。

除草剂的乙酰乳酸合酶或ALS(也称为AHAS)家族通过抑制氨基酸的支链的产生来控制杂草，所述氨基酸是植物生长和发育所必需的。特别地，它们与植物ALS酶结合。在这个家族中常用的除草剂尤其包括烟嘧黄隆、玉嘧黄隆和绿黄隆。这个种类中的除草剂可以是相当农作物特异的。本发明的实施方案涉及针对除草剂的ALS抑制类别的成员抗性的植物，所述ALS抑制类别包含除草剂的5个亚类，包括但不限于除草剂的磺酰脲(SU)家族和除草剂的咪唑啉酮家族。

除草剂的色素合成抑制类别靶向允许植物合成色素的酶，所述色素例如类胡萝卜素色素或叶绿素色素。色素的丧失导致叶绿素的光破坏和植物组织的增白，这是许多除草剂常称为“漂白”除草剂的原因。漂白除草剂的亚类的例子是HPPD抑制类别，这抑制4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)(Lee等人(1997)Weed Sci.45：601-609)。这个家族的除草剂包括但不限于尤其是硝草酮(mesotrione)、tembotrione、苯吡唑草酮(topramezone)和磺草酮。由于除草剂的代谢，玉米对硝草酮一般是耐受的(Mitchell等人(2001)Pest Mgt.Sci.57：120-128)。相同的解毒系统可以给予针对硝草酮和一些SU除草剂的耐受性(Green&Williams(2004)Proceedings Weed Science Society of America 44：13)。本发明的实施方案涉及针对除草剂的色素合成抑制类别的成员抗性的植物。

除草剂的原卟啉原氧化酶(PPO)抑制类别干扰叶绿素的合成，从而导致产生高度活性的化合物(自由基)的化合物。这些活性化合物破坏细胞膜，这导致与这些产物的芽后(post-emergence)应用相关的烧叶。这个家族中的除草剂包括但不限于尤其是三氟羧草醚、氟黄胺草醚、乳氟禾草灵、磺胺草唑、氟酮唑草、酰亚胺苯氧乙酸和氟噁嗪酮。本发明的实施方案涉及针对除草剂的PPO抑制类别的成员抗性的植物。

光系统II(PSII)抑制除草剂具有涉及与光系统II的电子传递链中的组分相互作用的作用方式。光合作用要求电子从光系统II传递到光系统I。这个电子传递链中的关键步骤是在类囊体膜中由D₁蛋白质还原质体醌(PQ)。PSII抑制剂除草剂与D₁蛋白质结合，从而抑制PQ结合且中断电子传递过程。这导致植物不能固定二氧化碳且不能产生植物存活所需的碳水化合物。电子传递中的阻断还引起氧化应激和引起快速细胞损伤的自由基的产生。PSII抑制除草剂由几个除草剂家族代表，包括均三氮苯、三嗪酮(triazinone)(不对称的三嗪)、取代的尿素、尿嘧啶、哒嗪酮、氨基甲酸苯酯、腈、苯并噻二唑、苯基哒嗪和酰胺。本发明的实施方案涉及针对除草剂的PSII抑制类别的成员抗性的植物。

合成生长素除草剂是广泛使用的除草剂类别，其模拟由植物生产的天然生长素激素。生长素调节许多植物过程，包括细胞生长和分化。生长素在植物中一般以低浓度呈现。合成生长素除草剂模拟天然生长素且在细胞中引起相对高的浓度，这导致快速的生长应答。用这些除草剂处理的易感植物显示出可以称为‘生长素超剂量’的症状，并且由于增加速度的无规且不受控制的生长而最终死亡。本发明的实施方案涉及针对除草剂的合成生长素类别的成员抗性的植物。

本发明的一些实施方案基于负责玉蜀黍中重要的除草剂抗性机制的基因的精细作图、克隆和表征。

已知从20世纪90年代早期开始，玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays)L.)中针对磺酰脲除草剂亚型(烟嘧黄隆[Dupont Accent

除草剂]、玉嘧黄隆、氟嘧黄隆和噻黄隆)的天然耐受性受单基因(由Kang(1993)Journalof Heredity 84(3)：216-217命名为nsf)的控制，具有显性的抗性和隐性的敏感性(Harms等人(1990)Theor.Appl.Genet.80：353-358；Kang(1993)同上；Green & Uhlrich(1993)Weed Sci.41：508-516；Green& Uhlrich(1994)Pestic.Sci.40：187-191)。还已知耐受的玉蜀黍植物通过羟基化作用来代谢烟嘧黄隆，具有细胞色素P450的特征(Fonne-Pfister等人(1990)Pesticide Biochem.Physiol.37：165-173；Brown & Cotterman(1994)Chem.Plant Prot.10：47-81)。已提出负责决定对一些磺酰脲除草剂的耐受性的相同玉米基因还负责对苯达松(Barrett等人(1997)Role of cytochrome P-450 in herbicide metabolismand selectivity and multiple herbicide metabolizing cytochrome P-450activities in maize.In K.K.Hatzios，编辑Regulation of EnzymaticSystems Detoxifying Xenobiotics in Plants.Dordrecht：KluwerAcademic.第35-50页；Green(1998)Weed Technology12：474-477)和HPPD抑制剂除草剂例如硝草酮(Green & Williams(2004)同上；Williams等人(2005)HortScience 40(6)：1801-1805)的耐受性。玉蜀黍物理图谱和整合标记的发展中的近期进展(Bortiri等人(2006)Curr Opin Plant Biol.9(2)：164-71)已允许用于鉴定Nsf1基因座的定位克隆法。

本发明的实施方案的Nsf1抗性基因编码与细胞色素P450家族相关的新基因。尽管多种细胞色素P450基因已得到描述，但它们在其对不同病原体的应答和确切作用方面广泛不同。本公开内容中描述的新细胞色素P450基因已证实提供针对众多除草剂改善的耐受性或抗性，所述除草剂包括烟嘧黄隆、玉嘧黄隆、氟嘧黄隆、噻黄隆和硝草酮。

发明概述

本发明涉及包括分离的多核苷酸的实施方案，所述分离的多核苷酸包含编码能够赋予针对至少一种除草剂的抗性的多肽的核苷酸序列，其中当基于Needleman-Wunsch比对算法与SEQ ID NO：1比较时，所述多肽具有至少85、90或95％同一性的氨基酸序列，或所述核苷酸序列的互补体，其中所述互补体和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。实施方案的多核苷酸赋予针对其的抗性的除草剂包括除草剂的ALS抑制类别；色素合成抑制类别；PPO抑制类别；PS II抑制类别；和合成生长素类别的成员。实施方案的多核苷酸可以赋予针对来自相同类别、或来自不同类别的一种或多种除草剂的抗性，包括来自所有5个类别的代表性成员。

本发明的另外的实施方案包括包含实施方案的多核苷酸的载体，和包含与至少一种调节序列可操作地连接的实施方案的多核苷酸的重组DNA构建体。还包含的是各自包含本发明的实施方案的重组DNA构建体的植物细胞、以及植物和种子。还包括的是包含编码负责目的性状的多肽的另外多核苷酸的植物，所述多肽例如具有草甘膦N-乙酰转移酶活性的多肽、杀虫Bt多肽、和其他目的多肽。包含这些多核苷酸的植物包括单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于玉蜀黍、小麦、大麦、燕麦、柳枝稷、高粱、稻、大豆、低芥酸菜子、马铃薯、棉花和向日葵。

由本发明具体体现的方法包括1)用于转化细胞的方法，其包括用本发明的实施方案的多核苷酸转化细胞，2)用于生产植物的方法，其包括用本发明的实施方案的重组DNA构建体转化植物细胞，并且由所述转化的植物细胞再生植物，和3)赋予或增强针对至少一种除草剂的抗性的方法，其包括用本发明的实施方案的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对至少一种除草剂的抗性，例如除草剂的ALS抑制类别；色素合成抑制类别；PPO抑制类别；PS II抑制类别；和合成生长素类别的成员。

此外，本发明的实施方案是Nsf1序列的变体等位基因，其中特定的单个氨基酸改变(参见实施例2)使得该基因不起作用，从而导致对于大多数玉米对其抗性的至少一种ALS或HPPD抑制剂除草剂的敏感性。因此，由本发明具体体现的另外方法是使用Nsf1基因的变体作为育种策略中的标记的方法，以避免掺入敏感的等位基因。

本发明还包含了改变植物细胞中能够赋予针对至少一种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：(a)用本发明的实施方案的重组DNA构建体转化植物细胞，和(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对至少一种除草剂的抗性。可以赋予针对其的抗性的除草剂包括例如除草剂的ALS抑制类别；色素合成抑制类别；PPO抑制类别；PS II抑制类别；和合成生长素类别的成员。

实施方案的多核苷酸可以赋予或增强针对其的抗性的除草剂包括但不限于选自除草剂的ALS抑制类别的除草剂，例如烟嘧黄隆、玉嘧黄隆、氟嘧黄隆、咪草烟、绿黄隆、氯嘧黄隆、醚苯黄隆、氟唑啶草、和灭草喹。此外，此种除草剂可以选自除草剂的色素合成抑制类别，例如异噁氟草、苯吡唑草酮、磺草酮(sulcatrione)和tembotrione。此种除草剂还可以选自自除草剂的PPO抑制类别，例如三氟羧草醚、flumioxan和磺胺草唑。任选地，此种除草剂可以选自除草剂的PS II抑制类别，例如敌草隆、利谷隆、苯达松和绿麦隆。此种除草剂还可以选自除草剂的合成生长素类别，例如麦草畏。

实施方案的方法包括测定植物中实施方案的多核苷酸或Nsf1基因座的存在的方法，其包含下述的至少一种：(a)从植物中分离核酸分子，且通过尝试扩增与多核苷酸同源的序列测定Nsf1基因是否存在；或(b)从植物中分离核酸分子，且进行DNA杂交，或(c)从植物中分离蛋白质，且使用针对NSF1蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或(d)从植物中分离蛋白质，且使用针对NSF1蛋白质的抗体进行ELISA测定，由此测定植物中权利要求1的多核苷酸的存在。

实施方案还包含的是具有针对至少一种除草剂增强的耐受性的植物，其包含在重组DNA构建体中的Nsf1基因。此种植物进一步包含第二种除草剂抗性基因，其提供针对选自除草剂类别的除草剂的一定水平的耐受性，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

从而使得Nsf1基因的存在对植物赋予的针对相同除草剂的耐受性水平高于由包含第二种除草剂抗性基因但不包含Nsf1基因的植物显示的耐受性水平。

实施方案还包含的是包含Nsf1基因的大豆植物，其中此种大豆植物还显示出大豆胞囊线虫抗性。此种植物已通过转化或植物育种技术产生，并且可以已由种质进行育种，所述种质例如选自下述的那些：Peking、PI88788、PI89772、PI90763、PI209332、PI404189A、PI437654、PI438489B、PI467312、PI468916、Hartwig、J87-233、和衍生自所列出的来源中的任何一种的后代。

附图简述

图1(a-e)是使其与其他已知细胞色素P450多肽(SEQ ID NOs：3-13)比较的实施方案的多肽序列(SEQ ID NO：2)的多重序列比对。图1d还指出了细胞色素P450家族的最常见的保守结构域(SEQ IDNO：14)的位置。比对中的相同残基以大写字母指出。

图2(a-b)是几种敏感和抗性玉米系的多肽序列的多重序列比对，显示细胞色素P450家族的最常见的保守结构域(SEQ ID NO：14)以及序列中的变异。

发明详述

本发明的实施方案提供了涉及诱导植物中的除草剂抗性的组合物和方法。组合物是赋予或增强针对一个或多个除草剂类别的一个或多个成员的抗性的新核苷酸和氨基酸序列，包括ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、和合成生长素除草剂类别，其成员包括但不限于烟嘧黄隆、玉嘧黄隆、氟嘧黄隆和硝草酮。特别地，某些实施方案提供了具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的多肽、及其变体和片段。进一步提供了分离的核酸分子、及其变体和片段，其包含编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

编码SEQ ID NO：2的多肽的天然核苷酸序列的一个例子在SEQID NO：1中阐述。本文还公开了植物、植物细胞、种子和微生物，其包含编码实施方案的多肽的核苷酸序列。

实施方案的全长多肽(SEQ ID NO：2)与细胞色素P450家族的已知多肽共享不同程度的同源性。特别地，实施方案的新多肽与从下述分离的细胞色素P450蛋白质共享同源性：稻(Oryza sativa)：登记号XP_469850(SEQ ID NO：3)，ABC69856(SEQ ID NO：4)；XP_469849(SEQ ID NO：11)和XP_469851(SEQ ID NO：12)；和XP_469852(SEQ ID NO：13)和瑞士黑麦草(Lolium rigidum)：登记号AAK38080(SEQ ID NO：5)；AAK38079(SEQ ID NO：6)；AAK38081(SEQ IDNO：7)；BAD27508(SEQ ID NO：8)；BAD27507(SEQ ID NO：9)和BAD27506(SEQ ID NO：10)。图1提供了SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列与稻和瑞士黑麦草细胞色素P450蛋白质(SEQ ID NOs：3-13)的比对。

使用GAP程序进行的氨基酸比对指出SEQ ID NO：2与稻和瑞士黑麦草细胞色素P450蛋白质共享表1中所示的序列相似性。

表1：NSF1肽与其他细胞色素P450肽的比较

其他细胞色素P450蛋白质	百分比同一性	百分比相似性
其他细胞色素P450蛋白质	百分比同一性	百分比相似性	XP_469850(SEQ ID NO：3)	67％	76％
ABC69856(SEQ ID NO：4)	67％	76％	XP_469850(SEQ ID NO：3)	67％	76％
ABC69856(SEQ ID NO：4)	67％	76％	AAK38080(SEQ ID NO：5)	68％	76％
AAK38079(SEQ ID NO：6)	67％	77％	AAK38080(SEQ ID NO：5)	68％	76％
AAK38079(SEQ ID NO：6)	67％	77％	AAK38081(SEQ ID NO：7)	67％	76％
BAD27508(SEQ ID NO：8)	67％	76％	AAK38081(SEQ ID NO：7)	67％	76％
BAD27508(SEQ ID NO：8)	67％	76％	其他细胞色素P450蛋白质	百分比同一性	百分比相似性
BAD27507(SEQ ID NO：9)	67％	76％	其他细胞色素P450蛋白质	百分比同一性	百分比相似性
BAD27507(SEQ ID NO：9)	67％	76％	BAD27506(SEQ ID NO：10)	67％	76％
XP_469849(SEQ ID NO：11)	66％	75％	BAD27506(SEQ ID NO：10)	67％	76％
XP_469849(SEQ ID NO：11)	66％	75％	XP_469851(SEQ ID NO：12)	61％	71％
XP_469852(SEQ ID NO：13)	60％	72％	XP_469851(SEQ ID NO：12)	61％	71％

植物中的细胞色素P450基因家族催化植物生物活性分子的生物合成或分解代谢中非常不同且通常复杂的区域特异性和/或立体特异性反应。(Morant等人(2003)Curr.Opin.Biotech.14(2)：151-162)。P450s是通过使用来自NADPH的电子催化分子氧的活化的血红素蛋白。在单独的鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)基因组中，存在估计超过300种细胞色素P450(Werck-Reichhart等人(2000)Trends in Plant Science 5(3)：116-123)。共有的结构特征存在于植物细胞色素P450中并且照那样地帮助对其进行鉴定。这些特征包括一般在近C端发现的F-X-X-G-X-R-X-C-X-G(SEQ ID NO：14)基序(参见图1d)。上游约150个残基，一般发现的另一个保守基序在A/G-G-X-D/E-T-T/S(SEQ IDNO：15)基序后并且对应于负责氧结合和激活的肽的区域。

实施方案的核酸和多肽在用于赋予或增强对植物的除草剂抗性的方法中有用。因此，本文公开的组合物和方法用于保护植物不受由除草剂引起的损害。“除草剂抗性”意指植物或植物细胞具有比非抗性的植物或细胞耐受更高浓度的除草剂，或比非抗性的细胞或植物对某种浓度的除草剂耐受更长时间的能力。即，除草剂被阻止引起植物损伤，或由除草剂引起的损害降到最低或减弱，例如叶黄化和相关的产量损失的减少。本领域技术人员将理解本文公开的组合物和方法可以与本领域可用于增加或增强植物除草剂抗性的其他组合物和方法一起使用。术语“增强”指改善、增加、扩增、增大、升高、提高等。

在具体方面，实施方案包括用于赋予或增强植物中的除草剂抗性的方法，其包括将至少一种DNA构建体引入植物内，其中所述DNA构建体包含与驱动在植物中表达的启动子可操作地连接的编码实施方案的除草剂抗性多肽的核苷酸序列。植物表达所述多肽，从而对植物赋予或增强除草剂抗性，或改善植物的固有水平的抗性。在具体实施方案中，基因赋予或增强针对ALS抑制、色素合成抑制、PPO抑制、PS II抑制、或合成生长素除草剂类别的至少一种除草剂的抗性，其成员包括但不限于除草剂烟嘧黄隆、玉嘧黄隆、氟嘧黄隆、噻黄隆、苯达松和硝草酮。

实施方案的多肽的表达可以靶向特定植物组织，但一般在除草剂抗性的情况下，持续表达遍及植物的细胞是所需的。因此，尽管许多启动子可以用于本发明的实施方案中，但一般使用组成型启动子。组成型启动子是指导遍及植物的各个部分并持续贯穿植物发育的基因表达的启动子。

如本文所使用的，“核酸”包括提及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有说明，包含具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。实施方案的多肽可以由本文公开的核酸，或通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，实施方案的截短的蛋白质可以通过在合适的宿主细胞中表达实施方案的重组核酸，或可替代地通过先体外后体内程序例如蛋白酶消化和纯化的组合来产生。

如本文所使用的，术语“编码”或“编码的”当在特定核酸的背景下使用时，意指核酸包含指导核苷酸序列翻译成特定蛋白质的必需信息。蛋白质由其编码的信息由密码子的使用指定。编码蛋白质的核酸可以包含在核酸的翻译区域内的非翻译序列(例如内含子)，或可以缺乏此种间插的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。

本发明的实施方案包含分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质，或其生物学活性部分，相当大程度上或基本上不含如在其天然存在的环境中发现的，通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含天然位于多核苷酸由其衍生的生物的基因组DNA中多核苷酸的侧面的序列(最佳地蛋白质编码序列)(即，位于多核苷酸的5′和3′末端处的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约1kb、约0.5kb或约0.1kb的核苷酸序列，其天然位于多核苷酸由其衍生的细胞的基因组DNA中多核苷酸的侧面。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(按干重计)污染蛋白质的蛋白质制剂。当实施方案的蛋白质或其生物学活性部分重组产生时，最佳地培养基代表小于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(按干重计)的化学前体或非目的蛋白质的化学药品。

实施方案还包含了所公开的核苷酸序列以及由其编码的蛋白质的片段和变体。“片段”意指核苷酸序列的部分或氨基酸序列的部分和因此由其编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，且因此具有赋予或增强针对ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、或合成生长素除草剂类别的至少一种除草剂的抗性的能力。可替代地，用作杂交探针的核苷酸序列的片段不必需编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可以为至少约15个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、和最高达编码实施方案的多肽的全长核苷酸序列。

编码实施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列的片段将编码至少约15个、约25个、约30个、约40个、或约50个邻接氨基酸、或最高达实施方案的全长多肽中存在的氨基酸总数目(例如，关于SEQ IDNO：2的521个氨基酸)。用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列的片段一般无需编码蛋白质的生物活性部分。

如本文所使用的，提及特定多核苷酸的“全长序列”意指具有天然序列的完整核酸序列。“天然序列”意指内源序列，即在生物的基因组中发现的非工程改造序列。

因此，实施方案的核苷酸序列的片段可以编码多肽的生物活性部分，或它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。除草剂抗性多肽的生物活性部分可以通过下述进行制备：分离实施方案的核苷酸序列之一的部分，表达蛋白质的编码部分且评估蛋白质的编码部分赋予或增强植物中的除草剂抗性的能力。其为实施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约15个、约20个、约50个、约75个、约100个或约150个核苷酸、或最高达本文公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目(例如，关于SEQ ID NO：1的1563个核苷酸)。

“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点上的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点上的一个或多个核苷酸的置换。如本文所使用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域技术人员将认识到实施方案的核酸的变体将这样构建，从而使得可读框被保留。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性，编码实施方案的多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体例如这些可以使用众所周知的分子生物学技术进行鉴定，如，例如使用如下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，例如通过使用定点诱变产生但仍编码实施方案的蛋白质的那些。一般地，如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数测定的，实施方案的特定多核苷酸的变体将与那种特定多核苷酸具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性。

实施方案的特定多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体还可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参考多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性进行评估。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：2的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的分离的多核苷酸。任何2个多肽之间的百分比序列同一性可以使用本文其他地方描述的序列比对程序和参数进行计算。当实施方案的任何给定多核苷酸对通过比较由它们编码的2个多肽共享的百分比序列同一性进行评估时，2个编码多肽之间的百分比序列同一性为至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性。

“变体”蛋白质意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点上的一个或多个氨基酸的缺失或添加，和/或在天然蛋白质的一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的置换而衍生自天然蛋白质的蛋白质。由实施方案包含的变体蛋白质是生物活性的，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即如本文所描述的赋予或增强植物除草剂抗性的能力。此种变体可以例如起因于遗传多态性或人为处理。如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数测定的，实施方案的天然蛋白质的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性。实施方案的蛋白质的生物活性变体将与那种蛋白质相差少至约1-15个氨基酸残基，少至约1-10个，例如约6-10个，少至约5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

实施方案的蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于此种操作的方法是本领域一般已知的。例如，除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列变体和片段可以通过DNA中的突变进行制备。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质生物活性的合适氨基酸置换的指导可以在引入本文作为参考的Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型中找到。保守置换例如用具有相似性质的另一个氨基酸交换一个氨基酸可以是最佳的。

因此，实施方案的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变形式。同样地，实施方案的蛋白质包含天然存在的蛋白质以及其变体和修饰形式。此种变体将继续具有赋予或增强植物针对ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、或合成生长素除草剂类别的至少一种除草剂的抗性的所需能力。显而易见的是，将在编码变体的DNA中制备的突变必须不使序列超出读框，且最佳地将不制备可以产生二级mRNA结构的互补区。参见，EP专利号0075444。

本文包含的蛋白质序列的缺失、插入和置换不预期产生蛋白质的特征中的根本改变。然而，当难以在这样做之前预测置换、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员将理解作用将通过筛选已用变体蛋白质转化的转基因植物进行评估，以确定对植物的除草剂抗性特征的作用。

变体多核苷酸和蛋白质还包含衍生自诱变或诱重组程序的序列和蛋白质，包括但不限于诸如DNA改组的程序。本领域技术人员可以预见将改变蛋白质对其应答的除草剂范围的修饰。使用此种程序，可以处理一个或多个不同的蛋白质编码序列以制备具有所需性质的新蛋白质。以这种方式，重组多核苷酸的文库由包含序列区域的相关序列多核苷酸的群体产生，所述序列区域具有相当大序列同一性，且可以在体外或体内进行同源重组。例如，使用这种方法，编码目的结构域的序列基序可以在实施方案的蛋白质基因和其他已知蛋白质基因之间进行改组，以获得编码具有改善的目的性质的蛋白质的新基因，例如增加的赋予或增强植物除草剂抗性的能力。关于此种DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，US 2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

实施方案的多核苷酸可以用于分离来自其他生物，特别是其他植物的相应序列。以这种方式，诸如PCR、杂交等的方法可以用于基于其与本文所述序列的序列同源性来鉴定此种序列。实施方案包含了基于其与本文所述完整序列或与其变体和片段的序列同一性而分离的序列。此种序列包括其为所公开序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意指衍生自共同的祖先基因且由于物种形成在不同物种中发现的基因。在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物，当它们的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列共享至少约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或更多序列同一性时。直向同源物的功能在物种中通常是高度保守的。因此，实施方案包含了分离的多核苷酸，其编码赋予或增强植物除草剂抗性的蛋白质，且在严格条件下与本文公开的序列、或与其变体或片段杂交。

在PCR方法中，寡核苷酸引物可以设计用于在PCR反应中使用，以由从任何目的生物中提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域一般已知的且在下述参考文献中公开：Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。也参见Innis等人，编辑(1990)PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，编辑(1999)PCR Methods Manual(AcademicPress，New York)。PCR的已知方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，所有或部分已知多核苷酸用作与来自所选择的生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中存在的其他相应多核苷酸选择性杂交的探针。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测的基团例如³²P或任何其他可检测标记进行标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过基于实施方案的多核苷酸使合成寡核苷酸标记进行制备。用于制备用于杂交以及用于构建cDNA和基因组文库的探针的方法是本领域一般已知的，且公开于Sambrook等人(1989)同上中。

例如，本文公开的完整多核苷酸，或其一个或多个部分，可以用作能够与相应的多核苷酸和信使RNAs特异性杂交的探针。为了达到在多种条件下的特异性杂交，此种探针包括独特的且最佳地长度至少约10个核苷酸、长度至少约15个核苷酸、或长度至少约20个核苷酸的序列。此种探针可以用于通过PCR由所选择的生物扩增相应的多核苷酸。这种技术可以用于从所需生物中分离另外的编码序列，或作为诊断测定以测定编码序列在生物中的存在。杂交技术包括铺平板DNA文库的杂交筛选(噬斑或菌落；参见，例如Sambrook等人(1989)同上。

此种序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意指在其下探针将与其靶序列杂交至比与其他序列可检测地更大程度(例如，超过背景至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖的且在不同环境下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，严格条件可以进行调整以允许序列中的一些错配，从而使得检测较低程度的相似性(异源探测)。一般地，探针长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。

一般地，严格条件将是这样的，其中盐浓度在pH7.0-8.3下小于约1.5M Na离子，一般约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)，以及温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)为至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可以用添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。示例性低严格条件包括在37℃下用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，和在50-55℃下在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格条件包括在37℃下在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，和在55-60℃下在0.5X-1X SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和在60-65℃下在0.1X SSC中最终洗涤至少30分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％-约1％SDS。杂交持续时间一般小于约24小时，通常约4-约12小时。洗涤时间的持续时间将是至少足以达到平衡的时间长度。

特异性一般是杂交后洗涤的函数，临界因子是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，热解链温度(T_m)可以由Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式进行估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸百分比，％form是杂交溶液中的甲酰胺百分比，且L是碱基对中的杂交物的长度。T_m是在其下50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。T_m对于每1％的错配降低约1℃；因此T_m、杂交和/或洗涤条件可以进行调整，以与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≧90％同一性的序列，那么T_m可以降低10℃。一般地，在限定的离子强度和pH下，严格条件选择为比关于特定序列及其互补体的T_m低约5℃。然而，高度严格条件可以利用在比T_m低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比T_m低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比T_m低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用等式、杂交和洗涤组合物以及所需T_m，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液中的严格性的变化是固有描述的。如果所需错配程度导致小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，那么最佳地是增加SSC浓度，从而使得可以使用较高的温度。关于核酸杂交的广泛指导在Tij ssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，编辑(1995)Current Protocolsin Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中找到。参见Sambrook等人(1989)同上。

各种程序可以用于检查特定DNA、RNA或蛋白质序列的存在或不存在。这些包括例如，DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹和ELISA分析。诸如这样的技术是本领域技术人员众所周知的，并且存在提供详细规程的许多参考文献。此种参考文献包括Sambrook等人(1989)同上和Crowther，J.R.(2001)，The ELISA Guidebook，Humana Press，Totowa，NJ，USA。

下述术语用于描述2个或更多多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”，和(d)“序列同一性百分比”。

(a)如本文所使用的，“参考序列”是用作用于序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的亚群或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。

(b)如本文所使用的，“比较窗”提及多核苷酸序列的邻接和指定区段，其中就2个多核苷酸的最佳比对与参考序列(其不包含添加或缺失)比较，比较窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。一般地，比较窗长度为至少约20个邻接核苷酸，且任选地可以为约30个、约40个、约50个、约100个或更长。本领域技术人员理解为了避免由于多核苷酸序列中包含缺口而与参考序列的高相似性，一般引入缺口罚分且从匹配数目中扣除。

用于比对比较的序列的方法是本领域众所周知的。因此，任何2个序列之间的百分比序列同一性的测定可以使用数学算法来完成。此种数学算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mo l.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索局部比对法；如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中修饰的，Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法。

这些数学算法的计算机实现可以用于比较序列以测定序列同一性。此种实现包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics，Mountain View，California获得)中的CLUSTAL；ALIGN程序(版本2.0)以及GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10(可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用缺省参数来进行。CLUSTAL程序由下述充分描述：Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120权剩余表(weight residue table)、缺口长度罚分12、和缺口罚分4可以与ALIGN程序一起使用。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码实施方案的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与实施方案的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST2.0中)可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述使用。可替代地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用于进行检测分子间的疏远关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序的缺省参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对还可以通过检查人工进行。

除非另有说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10使用下述参数获得的值：关于核苷酸序列的％同一性和％相似性使用缺口权重50和长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的％同一性和％相似性使用缺口权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等价程序。“等价程序”意指任何序列比较程序，当与由GAP版本10产生的相应比对比较时，对于正被讨论的任何2个序列，其产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对，和相同的百分比序列同一性。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找到使匹配数目达到最大和使缺口数目降到最低的2个完整序列的比对。GAP考虑了所有可能的比对和缺口位置，且产生具有最大数目的匹配碱基和最少缺口的比对。它允许提供以匹配碱基为单位的缺口产生罚分和缺口延长罚分。GAP必须得益于它插入的每个缺口的匹配的缺口产生罚分数。如果选择大于0的缺口延长罚分，那么对于每个插入的缺口GAP必须另外得益于缺口长度乘以缺口延长罚分。在GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中关于蛋白质序列的缺省缺口产生罚分值和缺口延长罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列，缺省缺口产生罚分是50，而缺省缺口延长罚分是3。缺口产生和缺口延长罚分可以表示为选自0-200的整数。因此，例如，缺口产生和缺口延长罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出最佳比对家族的一个成员。这个家族可能存在许多成员，并且没有其他成员具有更佳的质量。GAP显示用于比对的4个品质因数：质量、比、同一性和相似性。质量是达到最大的度量以便比对序列。比是质量除以较短片段中的碱基数目。百分比同一性是实际上匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。在缺口对面的符号被忽略。当关于一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，评分为相似性。在GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)如本文所使用的，当经过指定比较窗就最大对应性比对时，在2个多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”提及2个序列中相同的残基。当序列同一性的百分比就蛋白质而言使用时，认识到并不相同的残基位置通常差别为保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守置换方面不同时，百分比序列同一性可以向上调整以校正置换的保守性质。差别为此种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。一般这涉及将保守置换评分为部分而不是完全匹配，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当相同氨基酸被给予1的得分和非保守置换被给予0的得分时，保守置换被给予0-1的得分。保守置换的评分例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实现的进行计算。

(d)如本文所使用的，“序列同一性百分比”意指通过经过比较窗比较2个最佳比对的序列测定的值，其中就2个序列的最佳比对与参考序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分比通过下述进行计算：测定在其上相同的核酸碱基或氨基酸残基存在于2个序列中的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数目，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

术语“多核苷酸”的使用并不意欲使实施方案限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。实施方案的多核苷酸还包含所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式等。

本发明的分离的多核苷酸可以掺入能够引入宿主细胞内且在宿主细胞内复制的重组DNA构建体内。“载体”可以是此种构建体，其包括复制系统以及使多肽编码序列能够在给定宿主细胞中转录和翻译的序列。适合于植物细胞的稳定转染或转基因植物的建立的许多载体已在下述参考文献中得到描述，例如，Pouwels等人，Cloning Vectors：ALaboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach和Weissbach，Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；和Flevin等人，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990。一般地，植物表达载体包括例如在5′和3′调节序列的转录控制下的一种或多种克隆的植物基因和显性选择标记。此种植物表达载体还可以包含启动子调节区(例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性表达的调节区)，转录起始开始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，用于靶向的表达的信号肽序列，转录终止位点，和/或多腺苷酸化信号。

术语“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”、“重组DNA构建体”、“DNA构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换使用且是核酸片段。重组构建体包含核酸片段的人工组合，包括但不限于在自然界中未发现在一起的调节和编码序列。例如，重组DNA构建体可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源且以与自然界中发现的那种不同的方式排列的调节序列和编码序列。此种构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，那么如本领域技术人员众所周知的，载体的选择依赖于将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分知道必须存在于载体上的遗传成分，以便成功地转化、选择和繁殖包含本发明的任何一种分离的核酸片段的宿主细胞。获得显示多核苷酸或Nsf1基因座的所需表达水平和模式的系的筛选可以通过扩增、DNA的DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、蛋白质表达的免疫印迹分析、表型分析等来完成。

术语“重组DNA构建体”指由得自不同来源的核酸片段装配的DNA构建体。核酸片段的类型和起源可以是非常不同的。

在一些实施方案中，进一步提供了包含与实施方案的异源核苷酸序列可操作地连接的启动子的DNA构建体。实施方案的DNA构建体在本文公开的产生转化的植物、植物细胞、和微生物以及实践用于诱导ALS和HPPD抑制剂除草剂抗性的方法中有用。DNA构建体将包括与实施方案的多核苷酸可操作地连接的5′和3′调节序列。“可操作地连接”意指2个或更多元件之间的功能连接。“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、其内或下游(3′非编码序列)，并且可以影响相关的编码序列的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、和多腺苷酸化识别序列。例如，目的多核苷酸和调节序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能连接。可操作地连接的元件可以是邻接的或非邻接的。当用于指2个蛋白质编码区的连接时，可操作地连接意指编码区在相同读框中。编码序列可以另外包含用于使蛋白质靶向叶绿体、液泡、内质网或细胞外部的序列。盒可以另外包含待共转化到生物内的至少一种另外基因。可替代地，另外的一种或多种基因可以在多个DNA构建体上提供。此种DNA构建体与用于插入多核苷酸的多个限制位点和/或重组位点一起提供，所述多核苷酸编码在调节区的转录调节下的除草剂抗性多肽。DNA构建体可以另外包含选择标记基因。

DNA构建体将以转录的5′-3′方向包括转录起始区(即，启动子)、翻译起始区、实施方案的多核苷酸、翻译终止区和任选地、在宿主生物中起作用的转录终止区。调节区(即，启动子、转录调节区、和翻译终止区)和/或实施方案的多核苷酸可以对于宿主细胞或对于彼此是天然的/类似的。可替代地，调节区和/或实施方案的多核苷酸可以对于宿主细胞或对于彼此是异源的。如本文所使用的，“异源的”就序列而言是源于外来物种的序列，或如果源于相同物种，通过有意的人为干预在组合物和/或基因组基因座中由其天然形式进行相当大修饰。例如，与异源多核苷酸可操作地连接的启动子来自与多核苷酸由其衍生的物种不同的物种，或如果来自相同/类似物种，那么之一或两者由其原始形式和/或基因组基因座进行相当大修饰，或启动子不是用于可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

任选包括的终止区可以对于转录起始区是天然的，可以对于可操作地连接的目的多核苷酸是天然的，可以对于植物宿主是天然的，或可以衍生自对于启动子、目的多核苷酸、宿主或其任何组合的另一个来源(即，外来或异源的)。方便的终止区可从根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。在具体实施方案中，使用马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见，例如，整体引入本文作为参考的Keil等人(1986)Nucl.Acids Res.14：5641-5650；和An等人(1989)Plant Cell 1：115-122。

许多启动子可以在实施方案的实践中使用，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。启动子可以基于所需结果进行选择。广泛范围的植物启动子在引入本文作为参考的Potenza等人(2004)In Vitro Cell DevBiol-Plant 40：1-22的近期综述中得到讨论。例如，核酸可以与组成型、组织优选的、病原体诱导型或其他启动子组合用于在植物中表达。此种组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及公开于WO 99/43838和美国专利号6,072,050中的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell2：163-171)；泛蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如，美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。

另外的序列修饰已知增强细胞宿主中的基因表达。这些包括编码伪多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复、和可能对基因表达有害的其他此种充分表征的序列的消除。序列的G-C含量可以调整至对于给定细胞宿主平均的水平，如通过参考宿主细胞中表达的已知基因计算的。可能时，序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。

DNA构建体可以另外包含5′前导序列。此种前导序列可以用于增强翻译。翻译前导区是本领域已知的且包括：小核糖核酸病毒前导区，例如EMCV前导区(脑心肌炎5′非编码序列)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导区，例如TEV前导区(烟草蚀斑病毒)(Gallie等人(1995)Gene 165(2)：233-238)，MDMV前导区(玉米矮花叶病毒)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导区(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导区(TMV)(Gallie等人(1989)in Molecular Biology of RNA，编辑Cech(Liss，New York)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导区(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。还参见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可以利用已知增强翻译的其他方法，例如内含子等。

在DNA构建体制备中，各种DNA片段可以进行处理，以便提供正确方向的，以及适当时在正确的读框中的DNA序列。为此，衔接头或接头可以用于连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、多余DNA的去除、限制位点的去除等。为了这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重置换，例如转换和颠换。

DNA构建体还可以包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予针对除草剂化合物的抗性的基因，所述除草剂化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮、和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。另外的选择标记包括表型标记例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白质例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等人(2004)Plant Cell 16：215-28)，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol129：913-42)、和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte等人(2004)J.CellScience 117：943-54)。关于另外的选择标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu等人(1987)Cell 48：555-566；Brown等人(1987)Cell 49：603-612；Figge等人(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature 334：721-724。此种公开内容引入本文作为参考。

选择标记基因的上述列表不意欲是限制性的。任何选择标记基因可以用于实施方案中。

实施方案的基因可以作为转基因进行表达，以制备对ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、或合成生长素除草剂类别的至少一种除草剂抗性的植物。使用本公开内容中其他地方描述的不同启动子，这将允许其在不同环境下以调节的形式表达。人们还可以插入完整基因，天然启动子和编码序列作为转基因。最后，使用实施方案的基因作为转基因将允许与其他性状快速组合，例如昆虫或真菌抗性。

在某些实施方案中，实施方案的核酸序列可以与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，所述目的多核苷酸序列可以是转基因或非转基因的，以制备具有所需表型的植物。例如，实施方案的多核苷酸可以与实施方案的任何其他多核苷酸堆叠、或与其他基因堆叠。产生的组合还可以包括任何一种目的多核苷酸的多个拷贝。实施方案的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因组合堆叠，以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于对于动物饲料所需的性状例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡氨基酸(例如hordothionins(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如，经修饰的贮存蛋白(于2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429)，所述专利的公开内容引入本文作为参考。实施方案的多核苷酸还可以与对于昆虫、疾病或除草剂抗性所需的性状堆叠(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白质(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；串珠镰孢菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和抗病性基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变(Lee等人，(1988)EMBO J.7(5)：1241-1248)，对谷氨酰胺合酶抑制剂例如膦丝菌素或草铵膦(basta)的抗性(例如，bar基因；De Block等人(1987)EMBOJ.6：2513-2518)；赋予对HPPD抑制除草剂例如硝草酮或异噁氟草的耐受性的HPPD基因(Matringe等人(2005)Pest Management Science61：269-276；Dufourmantel等人，(2007)Plant Biotech.J.5：118-133；还参见WO1997049816)，关于针对PPO抑制除草剂的耐受性的基因(Li和Nicholl(2005)Pest Management Science 61：277-285)；合成生长素抗性基因(美国专利申请2005/014737和Herman等人，(2005)J.Biol.Chem.280：24759-24767)，和草甘膦抗性(epsps基因，gat基因例如美国专利申请公开US2004/0082770、以及WO02/36782和WO03/092360中公开的那些))；和对于加工或加工产物所需的性状例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；经修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；变性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶、和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)的表达)，所述文献的公开内容引入本文作为参考。人们还可以使实施方案的多核苷酸与提供农学性状的多核苷酸组合，所述农学性状例如雄性不育(例如，参见美国专利号5,583,210)、茎强度、开花时间、产量改善、或转化技术性状例如细胞周期调节或基因靶向(例如WO99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)，所述专利的公开内容引入本文作为参考。

这些堆叠的组合可以通过任何方法进行制备，所述方法包括且不限于通过任何常规或

方法或遗传转化杂交育种植物。如果性状通过遗传转化植物进行堆叠，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间且以任何顺序进行组合。例如，包含一种或多种所需性状的转基因植物可以用作靶以通过随后转化引入进一步的性状。性状可以在共转化规程中与由转化盒的任何组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入2个序列，那么2个序列可以包含在分开的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒上(顺式)。序列的表达可以由相同启动子或由不同启动子来驱动。在某些情况下，可能希望引入将抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或超表达盒的任何组合进行组合，以产生在植物中的所需性状组合。应进一步认识到多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在所需基因组位置上进行堆叠。参见，例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、和WO99/25853，所述所有专利引入本文作为参考。

进一步的实施方案包括可由下述方法获得的植物：使作为第一种亲本植株的包含Nsf1基因的植物与作为第二种亲本植株的缺乏Nsf1基因的不同植物杂交，从而获得包含第一种亲本的Nsf1基因的后代；和任选进一步包括一个或多个进一步的育种步骤，以获得包含第一种亲本的Nsf1基因的一个或多个更多代的后代。此种具体体现的植物可以包括近交和杂种植物。此种植物的种子，包括对于Nsf1基因是纯合和杂合的那些种子，和获得起因于那些种子加工的植物产物的方法在本发明中得到体现。在食物或饲料或玉米产物，例如面粉、粗粉和油的生产中使用此种种子也是本发明的实施方案。

“祖先系”或“祖先”是用作基因来源，例如用于开发优良系的亲本系。“后代”是祖先系的后裔，并且可以通过许多代育种与其祖先分开。“优良系”或“优良变种”是已起因于用于优良的农学性能的多个育种和选择循环的农学上优良的系或变种。类似地，“优良种质”是一般衍生自和/或能够产生具有优良的农学性能的植物的农学上优良的种质，例如现有的或新开发的玉米或大豆优良系。

本发明中还具体体现的是分子标记的使用，以使用育种技术将基因或转基因移入优良系内。分子标记可以用于多种植物育种应用中(例如参见Staub等人(1996)Hortscience 31：729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter.1：3-8)。主要关心的区域之一是使用标记辅助选择(MAS)来增加回交和渐渗基因的效率。显示与影响所需表型性状的基因座连锁的分子标记提供了用于选择植物群体中的性状的有用工具。当表型难以测定时，例如，许多抗病性性状，或在植物发育的晚期发生时，例如种子特征，这是特别真实的。因为DNA标记测定是较不费力的，并且占据比田间表型分型更少的物理空间，所以可以测定大得多的群体，从而增加发现由供体系移至受体系的具有靶片段的重组体的机会。连锁靠得越近，标记就越有用，因为重组不太可能在标记和引起性状的基因间发生，所述重组可以导致假阳性。具有侧接标记减少假阳性选择将发生的机会，因为将需要双重组事件。理想情况是在基因其自身中具有标记，从而使得重组不可能在标记和基因间发生。此种标记被称为‘完美标记’。

任选地，实施方案的核酸可以靶向叶绿体用于表达。以这种方式，当核酸未直接插入叶绿体内时，表达盒将另外包含编码转送肽的核酸以使目的基因产物导向叶绿体。此种转送肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

叶绿体靶向序列是本领域已知的，并且包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science233：478-481。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12：601-606。该方法依赖于包含选择标记的DNA的基因枪递送和通过同源重组使DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过具有沉默质体的转基因的反式激活，经由核编码和质体指导的RNA聚合酶的组织优选的表达来完成。此种系统已在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中得到报道。

待靶向叶绿体的核酸可以就在叶绿体中的表达进行最优化，以解决植物核和这种细胞器之间的密码子选择中的差异。以这种方式，目的核酸可以使用叶绿体优选的密码子进行合成。参见，例如引入本文作为参考的美国专利号5,380,831。

实施方案的方法可以包括且不限于，将多肽或多核苷酸引入植物内。“引入”意指将多核苷酸呈递给植物。在一些实施方案中，多核苷酸将以这样的方式呈递，从而使得序列接近植物的细胞的内部，包括其可能插入植物的基因组内。实施方案的方法不依赖用于将序列引入植物内的具体方法，仅依赖多核苷酸接近植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸引入植物内的方法是本领域已知的，包括且不限于稳定转化法、瞬时转化法、和病毒介导的方法。

“转化”指核酸片段转移到宿主生物的基因组内，从而导致遗传上稳定的遗传。包含被转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。“宿主细胞”指重组DNA构建体的转化在其中发生的细胞，且可以包括酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。植物转化法的例子包括尤其是土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(De Blaere等人，1987，Meth.Enzymol.143：277)和粒子加速的或“基因枪”转化技术(Klein等人，1987，Nature(London)327：70-73；美国专利号4,945,050)。

“稳定转化”意指引入植物内的核苷酸构建体整合到植物的基因组内，并且能够由其后代遗传。“瞬时转化”或“瞬时表达”意指引入植物内且未整合到植物的基因组内的多核苷酸，或引入植物内的多肽。

转化规程以及用于将多肽或多核苷酸序列引入植物内的规程可以依靶向用于转化的植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变。将多肽和多核苷酸引入植物细胞内的合适的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606、土壤杆菌属介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接的基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)、和冲击粒子加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)in Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lec1转化(WO 00/28058)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Scienceand Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechno logy 8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷物)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)in The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，编辑Chapman等人(Longman，NewYork)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(经由根癌土壤杆菌的玉蜀黍)；所述所有参考文献引入本文作为参考。

用于在植物基因组的特定位置上靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在所需基因组位置上的插入使用位点特异性重组系统来达到。参见，例如，WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855和WO99/25853，所述所有专利引入本文作为参考。简言之，实施方案的多核苷酸可以包含在侧面为非相同重组位点的转移盒中。将转移盒引入在其基因组内已稳定掺入靶位点的植物内，所述靶位点侧面为对应于转移盒的位点的2个非相同重组位点。提供了合适的重组酶并且将转移盒整合在靶位点上。目的多核苷酸由此整合在植物基因组中的特定染色体位置上。

已转化的细胞可以依据常规方法培养成植物。参见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可以生长、并用相同转化的品系或不同品系授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得到的后代。可以生长2代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定维持且遗传，并且随后收获种子以确保已达到所需表型特征的表达。以这种方式，实施方案提供了具有稳定整合入其基因组内的实施方案的核苷酸构建体，例如，实施方案的DNA构建体的转化种子(也称为“转基因种子”)。

如本文所使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、玉蜀黍植物可以由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、和在植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、谷穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等。谷粒意指由商业栽培者为了除培养或再生物种的目的外生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在实施方案的范围内，前提是这些部分包含引入的多核苷酸。

本发明的实施方案可以用于赋予或增强植物，特别是大豆(大豆(Glycine max))中的除草剂抗性。其他植物物种在实践本发明的实施方案中也可以是重要的，包括且不限于其他双子叶和单子叶农作物植物。实施方案的玉蜀黍基因通常在大多数商业玉米系中发现，其中大多数对至少一种，和通常几种，合成生长素、ALS-、PS II-和色素合成抑制剂除草剂是天然耐受的，所述除草剂例如玉嘧黄隆、烟嘧黄隆和硝草酮。

因此想象存在于大多数玉米系中针对某些除草剂的相同耐受性可以经由转基因方式通过使用内源玉蜀黍Nsf1基因及其变体延伸至其他农作物植物。具有对于所选择的SU除草剂的耐受性或敏感性的玉蜀黍系的列表是可广泛获得的，例如由下述提供的那些：USDA，ARS，National Genetic Resources Program.Germplasm Resources InformationNetwork-(GRIN).[在线数据库]National Germplasm ResourcesLaboratory，Beltsville，Maryland.[在2006年3月6日检索]：由因特网检索：<URL：http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/dno_eval_acc.pl？89201+153002+21>；和可从Buckler Laboratory网址获得的“玉蜀黍种质系”列表[在2006年3月6日检索]：由因特网检索：<URL：http://www.maizegenetics.net/index.php？page＝germplasm/lines.html>，以及参考文章例如Kang(1993)J.Heredity.84(3)：216-217中。

适当时，多核苷酸可以就在转化的生物中增加的表达进行最优化。例如，多核苷酸可以使用植物优选的密码子进行合成用于改善的表达。关于宿主优选的密码子选择的讨论参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。用于合成植物优选基因的方法是本领域可用的。参见，例如引入本文作为参考的美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。

本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣植物的例子包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zeamays))、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))，稻(稻(Oryza sativa))，黑麦(黑麦(Secale cereale))，高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor)、蜀黍(Sorghum vulgare))，粟(例如，御谷(御谷(Pennisetum glaucum))，稷(稷(Panicum miliaceum))，谷子(谷子(Setaria italica))，穇子(穇子(Eleusine coracana))，向日葵(向日葵(Helianthus annuus))，红花(红花(Carthamus tinctorius))，小麦(普通小麦(Triticum aestivum))，大豆(大豆)，烟草(烟草(Nicotianatabacum))，马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))，花生(落花生(Arachis hypogaea))，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(甘薯(Ipomoea batatus))，木薯(木薯(Manihot esculenta))，咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))，椰子(椰子(Cocos nucifera))，菠萝(菠萝(Ananas comosus))，柑橘类植物树(柑桔属物种(Citrus spp.))，可可树(可可树(Theobroma cacao))，茶(茶(Camellia sinensis))，香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))，鳄梨(鳄梨(Persea americana))，无花果(无花果(Ficus casica))，番石榴(番石榴(Psidium guajava))，芒果(芒果(Mangifera indica))，油橄榄(油橄榄(Olea europaea))，番木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(腰果(Anacardium occidentale))，澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia))，扁桃(扁桃(Prunus amygdalus))，甜菜(甜菜(Beta vulgaris))，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦(燕麦属物种(Avena spp.))，大麦，棕榈，椰子，蓖麻子，橄榄，豆类(例如瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、绿豆、利马豆、蚕豆)，豌豆(例如，豇豆、紫花豌豆、小扁豆、鹰嘴豆等)，蔬菜，观赏植物和针叶树。

对于本发明重要的其他植物包括具有用作生物燃料农作物潜能的那些，包括但不限于大网茅草例如柳枝稷(柳枝稷(Panicum virgatum))，象草(象草(Pennisetum purpureum))，石茅高梁(石茅高粱(Sorghumhalepense))，芒属物种(Miscanthus spp.)，以及杂交杨树和杂交柳树。

蔬菜包括番茄(番茄(Lycopersicon esculentum))，莴苣(例如，莴苣(Lactuca sativa))，青豆(菜豆(Phaseo lusvulgaris))，利马豆(利马豆(Phaseolus limensis))，豌豆(山黧豆属物种(Lathyrus spp.))，和香瓜属(Cucumis)的成员例如黄瓜(黄瓜(C.sativus))、罗马甜瓜(罗马甜瓜(C.cantalupensis))、甜瓜(甜瓜(C.melo))。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、八仙花(八仙花(Macrophylla hydrangea))、芙蓉(朱槿(Hibiscus rosasanensis))、玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属物种(Narcissus spp.))、矮牵牛(碧冬茄(Petuniahybrida))、康乃馨(麝香石竹(Dianthus caryophyllus))、一品红(一品红(Euphorbia pulcherrima))、和菊花。

实施方案不仅提供了用于在转基因应用中使用的基因，还提供了允许抗性基因用作玉米育种策略中的标记的序列和方法。例如，实施方案的基因，或包含其的基因座可以在预期用于育种的农作物系中进行鉴定。当通常存在天然耐受性时，育种者一般希望避免使用对除草剂敏感的农作物系。因此，Nsf1基因序列的鉴定将帮助育种者鉴定和避免产生除草剂敏感系。

基于核酸的标记可以使用许多不同的技术进行开发和应用。此种技术包括且不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、单序列重复(SSR)、随机扩增多态DNA(RAPD)、分裂扩增多态序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，1993，Trends in Genetics 9：275-280)、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，1995，Nucleic Acids Res.23：4407-4414)、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，1999，Gene 234：177-186)、序列表征扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，1993，Theor.Appl.Genet.85：985-993)、标志序列位点(STS)(Onozaki等人，2004，Euphytica138：255-262)、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，1989，Proc NatlAcad Sci USA86：2766-2770)、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，1999，Theor.Appl.Genet.98：780-792)、反转录转座子间扩增多态性(IRAP)、反转录转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人(1999)Theor.Appl.Genet.98：704-711)等。

如本文所使用的，“基因座”应指携带基因，或可能携带2种或更多基因的染色体的遗传限定区域，所述基因如此紧密连锁从而使得它们在遗传上表现为负责表型的单个基因座。“基因”应指那个基因座内的特定基因，包括其相关的调节序列。因此，Nsf1基因座指在遗传上定义为赋予针对ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、和合成生长素除草剂类别的至少一种除草剂的抗性的染色体区域。本发明的一个实施方案是Nsf1基因的分离和证实它是负责由基因座的存在赋予的表型的基因。遗传上定义的基因座其性质在尺寸方面不如可以分子描述的基因那样精确定义。

单位、前缀和符号可以以其SI公认形式表示。除非另有说明，分别地，核酸以5′至3′方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。数字范围包括限定范围的数字。氨基酸在本文中可以以其通常已知的3字母符号或由IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可以由其通常公认的单字母编码提及。上文限定的术语就整体而言通过参考说明书更充分地限定。

实施例

本发明的实施方案在下述实施例中进一步限定，其中除非另有说明，所有份和百分比都按重量计，且度是摄氏的。应当理解这些实施例在指出本发明的实施方案的同时，仅为了举例说明而给出。根据上文讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的实施方案的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以制备各种改变和修饰以使其适应各种使用和条件。因此，除了本文显示和描述的那些外，本发明实施方案的各种修饰由于前述说明书对于本领域技术人员将是显而易见的。此种修饰还意欲包含在附加权利要求的范围内。本文所述的每个参考文献的公开内容整体引入作为参考。

实施例1

通过定位克隆鉴定Nsf1基因

BC1群体(预期50％Nsf1/nsf1，50％nsf1/nsf1)使用敏感的近交W703A作为回归亲本，和B73或Q66作为抗性系来开发。植物在约V3阶段时用2.3mM烟嘧黄隆、0.5％v/v Kinetic表面活性剂溶液进行喷雾。抗性和敏感性亲本也与对照一样进行生长和喷雾。为了避免错误分类可能由于除除草剂应用外的原因死亡的植物，仅取样和分析抗性后代。总共96个抗性植物用于初始作图。这足以将Nsf1置于标记umc1766和umc2036之间，并且因此在基于玉蜀黍B73的物理图谱的重叠群202上((在2006年3月6日检索)从因特网检索<URL：http://www.gramene.org/Zea_mays/cytoview？contig＝ctg202&x＝44&y＝9>)。

在基于玉蜀黍Mo17的重叠群的BAC末端序列的基础上，侧接CAPS(分裂扩增多态序列)标记在重叠群202的BACs上进行鉴定。

对于这个间隔的精细作图，在下一个步骤中使用总共388个抗性植物。基于这个间隔中的BACs的亚克隆片段的测序，在重叠BACs上发现2个侧接CAPs标记。这2种标记都具有2/388个重组体。

这2个BACs进行测序和分析。在侧面为2个有专利权的标记P1和P2的2个BACs的163kb区域内，存在几个推定基因。对于第3轮作图，使用总共2584个抗性植物，并且开发标记以分离一些基因。一个标记显示11/2584(0.4％)个重组体，从而帮助消除负责抗性的某些基因。2个其他标记各自具有2(0.08％)个重组体，从而消除另一个基因。最后，2个基因间的标记具有单个重组体(0.04％)，从而消除那2个基因之一。因此确定哪个基因是目的基因。测定基因Nsf1与本领域已知的一些细胞色素P450基因具有同源性。

实施例2

Nsf1基因的分析

在B73衍生的BAC中的基因18(Nsf1)序列的分析显示521个氨基酸的可读框，并且包含在所有细胞色素P450s中发现的保守的血红素结合基序FXXGXXXCXG(SEQ ID NO：14)(图1d和2b)。

为了确定Nsf1等位基因在玉蜀黍系中是否是一致的，测试对烟嘧黄隆具有未知敏感性水平的3个玉米系，以测定它们的反应且随后评估它们的序列。植物在约V3阶段时用2.3mM烟嘧黄隆、0.5％v/vKinetic表面活性剂溶液进行喷雾。已知抗性和敏感系也与对照一样进行生长和喷雾。3个系的测试结果显示系Q66和Black Mexican Sweet(BMS)是抗性的，且系A188是敏感的。

在2个其他抗性系Q66和BMS中也具有这个ORF，尽管Q66与B73和BMS相差3个氨基酸(图2a和2b)。这3个变体氨基酸在图2a和2b中在Q66序列串中用粗体和矩形进行标记以显示其位置。敏感系GA209的分析显示相对于抗性系的392bp插入，其导致移码和仅338个氨基酸的可读框(图2b)。众多北美敏感系的调查显示许多敏感系包含这个相同的未知DNA插入。

来自F2敏感系的序列分析显示在B73(SEQ ID NO：2)和F2(SEQID NO：22)之间仅存在一个核苷酸差异，这使氨基酸263从精氨酸变成苏氨酸(图2b)。这个单一变化因此消除了抗性表型，并且具有此种变化的变体序列预期不保留生物活性。这个变化在开发SNP中是有用的，以帮助玉米育种者避免易感等位基因。

Nsf1与近期已报道控制那种植物中的磺酰脲敏感性的稻细胞色素P450(登记号：ABC69856，SEQ ID NO：4)67％相同。

来自B73的基因组序列显示具有预期的GT左边界和AG右边界的单个内含子。内含子的位置显示于序列表的SEQ ID NO：16中。

这种基因的克隆具有许多潜在应用。它可以用作选择标记用于在敏感可转化系例如A188中转化(Ishida等人，(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)。设计为抑制Nsf1基因功能的转基因将充当显性失活选择标记。Nsf1还可以用于在其他植物例如大豆中产生转基因抗性，所述其他植物对磺酰脲的这个亚类敏感。

实施例3：

关于玉蜀黍植物对烟嘧黄隆的敏感性的测试

测试对烟嘧黄隆具有未知敏感性水平的3个玉米系以测定其反应。植物在约V3阶段时用2.3mM烟嘧黄隆、0.5％v/v Kinetic表面活性剂溶液进行喷雾。已知抗性和敏感系也与对照一样进行生长和喷雾。3个系的测试结果显示系Q66和BMS是抗性的，且系A188是敏感的。

实施例4：转基因大豆植物的制备

下述母液和培养基用于大豆植物的转化和再生：

母液

硫酸盐100X原液：37.0g MgSO₄.7H₂O，1.69g MnSO₄.H₂O，0.86gZnSO₄.7H₂O，0.0025g CuSO₄.5H₂O.

卤化物100X原液：30.0g CaCl₂.2H₂O，0.083g KI，0.0025gCoCl₂.6H₂O，

P、B、Mo 100X原液：18.5g KH₂PO₄，0.62g H₃BO₃，0.025gNa₂MoO₄.2H₂O

Fe EDTA 100X原液：3.724g Na₂EDTA，2.784g FeSO₄.7H₂O.

2，4-D原液：10mg/mL。

维生素 B5 1000X 原液：10.0g 肌醇，0.10g 烟酸，0.10g 吡哆醇HCl，1g 硫胺素。

培养基(每升)

SB196：10mL各种上述母液，1mL B5维生素原液，0.463g(NH₄)₂SO₄，2.83g KNO₃，1mL2，4-D原液，1g天冬酰胺，10g蔗糖，pH5.7。

SB103：1pk。Murashige & Skoog盐混合物，1mL B5维生素原液，750mg MgCl₂六水合物，60g麦芽糖，2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)，pH5.7。

SB166：补加有5g/L活性炭的SB103。

SB71-4：Gamborg’s B5盐(Gibco-BRL目录号21153-028)，1mL B5维生素原液，30g蔗糖，5g TC琼脂，pH5.7。

将大豆胚发生悬浮培养于28℃维持在旋转振荡器(150rpm)上在35mL液体培养基(SB196)中，使用提供16小时日/8小时夜循环的荧光灯。培养物通过将约35mg组织接种到35mL新鲜液体培养基内每2周进行传代培养。

大豆胚发生悬浮培养使用DuPont Biolistic PDS1000/He仪器通过基因枪轰击进行转化(参见Klein等人(1987)Nature 327：70-73)。

用于表达Nsf1的重组DNA质粒在与选择标记基因分开的重组DNA质粒上。将2种重组DNA质粒如下共沉淀到金颗粒上。将悬浮液中的DNAs加入50μL20-60mg/mL0.6μm金颗粒悬浮液中，且随后与50μLCaCl₂(2.5M)和20μL亚精胺(0.1M)组合。将混合物脉冲涡旋5次，在微量离心机中旋转10秒，且取出上清液。DNA包被的颗粒随后用150μL100％乙醇洗涤1次，脉冲涡旋并在微量离心机中再次旋转，且重悬浮于85μL无水乙醇中。随后将5μL DNA包被的金颗粒装载到每个巨载体盘上。

将约150-250mg 2周的悬浮培养物置于60mm x 15mm空的培养板中，并且残留液体使用移液管从组织中取出。组织放置距离阻滞筛约3.5英寸并且每个组织板轰击1次。破膜压设为650psi并且室抽空为-28英寸Hg。轰击18个板，并且在轰击后，来自每个板的组织分成2个瓶，放回到液体培养基内，并且如上所述进行培养。

轰击后7天，将液体培养基更换成补加有50mg/mL潮霉素的新鲜SB196培养基。选择培养基每周或每2周进行更新。轰击后7周，观察到由未转化的、坏死胚发生簇中生长出绿色的、转化的组织。分离的绿色组织被取出且接种到个别瓶内以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。因此，每个新系作为独立的转化事件进行处理。这些悬浮液随后通过传代培养作为在未成熟的发育阶段中簇生的胚悬浮液进行维持，或通过个别体细胞胚的成熟和发芽再生成完整植物。

将转化的胚发生簇从液体培养物中取出并且置于不包含激素或抗生素的固体琼脂培养基(SB166)上1周。胚于26℃使用混合的荧光和白炽灯以16小时日：8小时夜的时间表进行培养。1周后，随后将培养物转移至SB103培养基且维持在相同生长条件下另外3周。在由液体培养转移至固体培养基前，来自所选择的系的组织通过PCR就嵌合基因的存在进行测定。体细胞胚在4周后变得适合于发芽，并且随后从成熟培养基中取出且在空的培养皿中干燥1-5天。然后将干燥的胚种植在SB71-4培养基中，且允许在上文所述的相同光和发芽条件下发芽。将发芽的胚转移至无菌土壤且生长至成熟。

实施例5

T0和T1转基因植物分析

T0测试

制备包含Nsf1基因的2种不同构建体，以检查当转化到大豆内时基因的除草剂功效。Nsf1构建体与35S：HYG插入片段一起进行共轰击，以允许使用潮霉素的事件选择。

在V2-V6生长阶段时，总共127个T0植物用35g/ha玉嘧黄隆进行喷雾。所有玉嘧黄隆处理与0.2％w/w非离子型表面活性剂一起在287L/ha的喷雾体积中应用。除了T0植物外，包括3种不同的对照的重复-2种阳性和1种阴性。个别植物在处理后10天时就除草剂应答进行评估，并且指定1-9的目测应答得分(1＝死亡植物至9＝未观察到作用)。基于对起始玉嘧黄隆喷雾的高耐受性得分，5个T0事件用另外35g/ha玉嘧黄隆进行喷雾。植物在第二次应用后10天时就目测耐受性使用1-9的得分进行评定。

在T0代中，在用35g/ha玉嘧黄隆处理后10天时，与对照比较51个事件中的4个具有改善的耐受性。在35g/ha玉嘧黄隆的另外应用后，51个T0事件中的3个具有改善的耐受性水平。这51个事件中的2个进展至T1代用于更广泛的除草剂测试。

T1测试

来自T0代的2个事件进展至T1代用于Nsf1基因的另外除草剂功效测试。2种对照的重复以及T1植物生长在温室实验中，且在V3生长阶段时用以2种速率之一(200g/ha或50g/ha)的硝草酮、烟嘧黄隆(70g/ha)或玉嘧黄隆(35g/ha)进行喷雾。所有除草剂处理与1％w/w经修饰的种子油佐剂一起以374L/ha的喷雾体积进行应用。如在T0测试中使用的一样，植物在应用后8天时使用1-9的得分就除草剂应答进行评定。

扩展的除草剂功效测试在第二次T1植物实验中发展用于由T0代进展的相同的2个事件。在V3生长阶段时，植物用不同的除草剂处理进行喷雾，所述除草剂当以检查的速率应用于商品大豆时，一般将引起相当大的农作物损伤。所有除草剂处理以287L/ha的喷雾体积进行应用。异噁氟草(140g/ha)、苯吡唑草酮(140g/ha)、和磺草酮(140g/ha)与1％w/w经修饰的种子油佐剂一起应用。敌草隆处理(560g/ha)与1％w/w石油农作物油佐剂一起应用。三氟羧草醚(4480g/ha)、磺胺草唑(140g/ha)、氟噁嗪酮(140g/ha)、和麦草畏(280g/ha)与0.25％w/w非离子型表面活性剂一起应用。玉嘧黄隆(35g/ha)处理与0.5％w/w碱性掺合佐剂一起应用。在处理后8和15天时，植物使用0-100的等级(0＝无损伤至100＝死亡植物)就农作物损伤进行目测评定。因为T1事件被隔离，仅选择具有最佳总体得分的植物，其对应于预期将具有转基因的75％。

在三氟羧草醚、麦草畏、敌草隆、氟噁嗪酮、异噁氟草、硝草酮、玉嘧黄隆、磺草酮、磺胺草唑、和苯吡唑草酮处理应用后8DAT和15DAT时，与对照比较，2个事件之一具有明显更佳的耐受性。在三氟羧草醚、麦草畏、异噁氟草、硝草酮、玉嘧黄隆、磺草酮、磺胺草唑、和苯吡唑草酮处理应用后15DAT时，与对照比较，第二个事件具有明显更佳的耐受性。尽管在测试事件中的Nsf1基因的确切表达水平未测定，但当与对照植物直接比较时，包含玉蜀黍Nsf1基因的转基因大豆植物显示出针对一系列不同除草剂更佳的耐受性。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Company

<120>编码玉蜀黍除草剂抗性基因的多核苷酸和使用方法

<130>2068-PCT

<150>60/780,946

<151>2006-03-09

<150>60/888,634

<151>2007-02-07

<160>26

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1563

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1563)

<400>1

<210>2

<211>521

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>2

<210>3

<211>732

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.XP_469850

<400>3

<210>4

<211>513

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Access ion No.：ABC69856

<400>4

<210>5

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Access ion No.：AAK38080

<400>5

<210>6

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Access ion No.：AAK38079

<400>6

<210>7

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>AAK38081

<400>7

<210>8

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Access ion No.：BAD27508

<400>8

<210>9

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.：BAD27507

<400>9

<210>10

<211>517

<212>PRT

<213>瑞士黑麦草(Lolium rigidum)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.：BAD27506

<400>10

<210>11

<211>512

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.：XP_469849

<400>11

<210>12

<211>527

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.：XP_469851

<400>12

<210>13

<211>518

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Accession No.：XP_469852

<400>13

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>所有细胞色素P450序列共有的基序

<221>VARIANT

<222>2，3，5，6，7，9

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>14

<210>15

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>所有细胞色素P450序列共有的基序

<221>VARIANT

<222>(1)...(1)

<223>Xaa＝Ala或Gly

<221>VARIANT

<222>(3)...(3)

<223>Xaa＝任意氨基酸

<221>VARIANT

<222>(4)...(4)

<223>Xaa＝Asp或Glu

<221>VARIANT

<222>(6)...(6)

<223>Xaa＝Thr或Ser

<400>15

<210>16

<211>1859

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>玉蜀黍B73的Nsf1基因的基因组序列

<221>内含子

<222>(946)...(1238)

<223>内含子

<400>16

<210>17

<211>1566

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>Q66玉蜀黍系的Nsf1的ORF

<221>CDS

<222>(1)...(1566)

<400>17

<210>18

<211>521

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>Q66玉蜀黍系的Nsf1肽

<400>18

<210>19

<211>1566

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>Black Mexican Sweet(BMS)玉蜀黍系的Nsf1的ORF

<221>CDS

<222>(1)...(1566)

<400>19

<210>20

<211>521

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>BMS玉蜀黍系Nsf1肽

<400>20

<210>21

<211>1566

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>F2玉蜀黍系的Nsf1的ORF

<221>CDS

<222>(1)...(1566)

<400>21

<210>22

<211>521

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>F2玉蜀黍系Nsf1肽

<400>22

<210>23

<211>1952

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>GA209玉蜀黍系的Nsf1的ORF

<221>CDS

<222>(1)...(1017)

<400>23

<210>24

<211>338

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>GA209玉蜀黍系Nsf1肽

<400>24

<210>25

<211>1932

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>W703A玉蜀黍系的Nsf1的ORF

<221>CDS

<222>(1)...(843)

<400>25

<210>26

<211>280

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(0)...(0)

<223>W703A玉蜀黍系Nsf1肽

<221>VARIANT

<222>208，218

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>26

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其包含：

(a)编码能够赋予针对至少一种除草剂的抗性的多肽的核苷酸序列，其中所述除草剂是选自下述的除草剂类别的成员：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别

其中当基于Needleman-Wunsch比对算法与SEQ ID NO：1比较时，所述多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列，或

(b)所述核苷酸序列的互补体，其中所述互补体和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽能够赋予针对至少2种除草剂的抗性，其中每种除草剂是选自下述的不同除草剂类别的成员：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别。

3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽能够赋予针对至少3种除草剂的抗性，其中每种除草剂是选自下述的不同除草剂类别的成员：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别。

4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽能够赋予针对至少4种除草剂的抗性，其中每种除草剂是选自下述的不同除草剂类别的成员：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别。

5.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽能够赋予针对至少5种除草剂的抗性，其中每种除草剂是选自下述的不同除草剂类别的成员：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别。

6.权利要求1的多核苷酸，其中基于Needleman-Wunsch比对算法，所述多肽的所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

7.权利要求1的多核苷酸，其中基于Needleman-Wunsch比对算法，所述多肽的所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％的同一性。

8.权利要求1的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ IDNO：1。

9.一种载体，其包含权利要求1的多核苷酸。

10.一种重组DNA构建体，其包含与至少一种调节序列可操作地连接的权利要求1的多核苷酸。

11.一种用于转化细胞的方法，其包括用权利要求1的多核苷酸转化细胞。

12.一种植物细胞，其包含权利要求10的重组DNA构建体。

13.一种用于生产植物的方法，其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞，并且由所述转化的植物细胞再生植物。

14.一种植物，其包含权利要求10的重组DNA构建体。

15.一种种子，其包含权利要求10的重组DNA构建体。

16.权利要求14的植物，其中所述植物是单子叶植物。

17.权利要求16的植物，其中所述双子叶植物选自玉蜀黍、小麦、大麦、燕麦、柳枝稷、高粱和稻。

18.权利要求14的植物，其中所述植物是双子叶植物。

19.权利要求18的植物，其中所述双子叶植物选自大豆、低芥酸菜子、马铃薯、棉花和向日葵。

20.权利要求14的植物，其中所述植物进一步包含第二种除草剂抗性基因。

21.权利要求14的植物，其中所述植物进一步包含编码具有草甘膦N-乙酰转移酶活性的多肽的基因。

22.权利要求21的植物，其中所述植物进一步包含编码赋予针对ALS抑制剂的耐受性的多肽的第二种除草剂抗性基因。

23.权利要求14的植物，其中所述植物进一步包含编码杀虫剂多肽的基因。

24.一种具有针对至少一种除草剂增强的耐受性的植物，其包含权利要求10的重组DNA构建体，其中所述植物进一步包含第二种除草剂抗性基因，其提供针对选自除草剂类别的除草剂的一定水平的耐受性，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其中权利要求10的重组构建体对所述植物赋予的针对所述除草剂的耐受性水平高于由包含所述第二种除草剂抗性基因但不包含权利要求10的重组构建体的植物显示的耐受性水平。

25.一种赋予或增强针对至少一种除草剂的抗性的方法，其中所述除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对所述至少一种除草剂的抗性。

26.一种赋予或增强针对至少2种除草剂的抗性的方法，其中每种除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对所述至少2种除草剂的抗性。

27.一种赋予或增强针对至少3种除草剂的抗性的方法，其中每种除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对所述至少3种除草剂的抗性。

28.一种赋予或增强针对至少4种除草剂的抗性的方法，其中每种除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对所述至少4种除草剂的抗性。

29.一种赋予或增强针对至少5种除草剂的抗性的方法，其中每种除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(a)ALS抑制类别；

(b)色素合成抑制类别；

(c)PPO抑制类别；

(d)PS II抑制类别；和

(e)合成生长素类别；

其包括用权利要求10的重组DNA构建体转化植物，由此赋予或增强针对所述至少5种除草剂的抗性。

30.一种改变植物细胞中能够赋予针对至少一种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：

(a)用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞；和

(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对所述至少一种除草剂的抗性；

其中所述至少一种除草剂选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别。

31.一种改变植物细胞中能够赋予针对至少2种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：

(a)用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞；和

(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对所述至少2种除草剂的抗性；

其中所述至少2种除草剂各自选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别。

32.一种改变植物细胞中能够赋予针对至少3种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：

(a)用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞；和

(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对所述至少3种除草剂的抗性；

其中所述至少3种除草剂各自选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别。

33.一种改变植物细胞中能够赋予针对至少4种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：

(a)用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞；和

(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对所述至少4种除草剂的抗性；

其中所述至少4种除草剂各自选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别。

34.一种改变植物细胞中能够赋予针对至少5种除草剂的抗性的蛋白质表达水平的方法，其包括：

(a)用权利要求10的重组DNA构建体转化植物细胞；和

(b)使所述转化的植物细胞在适合于表达所述重组DNA构建体的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致所述转化的宿主中产生改变水平的蛋白质，所述蛋白质能够赋予针对所述至少5种除草剂的抗性；

其中所述至少5种除草剂各自选自除草剂类别，所述除草剂类别选自：

(i)ALS抑制类别；

(ii)色素合成抑制类别；

(iii)PPO抑制类别；

(iv)PS II抑制类别；和

(v)合成生长素类别。

35.权利要求25-34中任一项的方法，其中所述除草剂选自除草剂的ALS抑制类别且选自下述：

(a)烟嘧黄隆；

(b)玉嘧黄隆；

(c)氟嘧黄隆；

(d)咪草烟；

(e)绿黄隆；

(f)氯嘧黄隆；

(g)醚苯黄隆；

(h)氟唑啶草；和

(i)灭草喹。

36.权利要求25-34中任一项的方法，其中所述除草剂选自除草剂的色素合成抑制类别且选自下述：

(a)异噁氟草；

(b)苯吡唑草酮；

(c)磺草酮；和

(d)tembotrione。

37.权利要求25-34中任一项的方法，其中所述除草剂选自除草剂的PPO抑制类别且选自下述：

(a)三氟羧草醚；

(b)flumioxan；和

(c)磺胺草唑。

38.权利要求25-34中任一项的方法，其中所述除草剂选自除草剂的PS II抑制类别且选自下述：

(a)敌草隆；

(b)利谷隆；

(c)苯达松；和

(d)绿麦隆。

39.权利要求25-34中任一项的方法，其中所述除草剂是麦草畏。

40.一种测定植物中权利要求1的多核苷酸的存在的方法，其包含下述的至少一种：

(a)从所述植物中分离核酸分子，且通过尝试扩增与权利要求1的多核苷酸同源的序列测定Nsf1基因是否存在，或

(b)从所述植物中分离核酸分子，且进行DNA或RNA杂交，或

(c)从所述植物中分离蛋白质，且使用针对NSF1蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(d)从所述植物中分离蛋白质，且使用针对NSF1蛋白质的抗体进行ELISA测定，由此测定所述植物中权利要求1的多核苷酸的存在。

41.一种测定植物中Nsf1基因座的存在的方法，其包含下述的至少一种：

(b)从所述植物中分离核酸分子，且进行DNA或RNA杂交，或

(d)从所述植物中分离蛋白质，且使用针对NSF1蛋白质的抗体进行ELISA测定，由此测定所述植物中Nsf1基因座的存在。

42.一种包含权利要求1的多核苷酸的大豆植物，其中所述大豆植物还显示出大豆胞囊线虫抗性，其中所述多核苷酸已通过转化或植物育种技术整合入，且其中所述大豆植物已由选自下述的种质进行育种：

(a)Peking；

(b)PI88788；

(c)PI89772；

(d)PI90763；

(e)PI209332；

(f)PI404189A；

(g)PI437654；

(h)PI438489B；

(i)PI467312；

(j)PI468916；

(k)Hartwig；

(l)J87-233；和

(m)衍生自来源(a)-(1)的后代。