BRPI0708711A2 - polinucleotìdeo isolado, vetor, contrução de dna recombinante, método para transformar uma célula , método para produzir uma planta, método para conferir ou aprimorar a resistência a pelo menos um, dois, três, quatro, cinco herbicida(s), método para alterar o nìvel de expressão de uma proteìna capaz de conferir resistência a pelo menos um, dois, três, quatro, cinco herbicida(s) em uma célula de planta, método para determinar a presença do locus nsf1 em uma planta, e método pra obter uma planta de soja - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, VETOR, CONSTRUçãO DE DNA RECOMBINANTE, METODO PARA TRANSFORMAR UMA CéLULA, MéTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA, METODO PARA CONFERIR OU APRIMORAR A RESISTENCIA A PELO MENOS UM, DOIS, TRES, QUATRO, CINCO HERBICIDA (5), METODO PARA ALTERAR O NìVEL DE EXPRESSAO DE UMA PROTEìNA CAPAZ DE CONFERIR RESISTéNCIA A PELO MENOS UM, DOIS, TRES, QUATRO, CINCO HERBICIDA(S) EM UMA CéLULA DE PLANTA, METODO PARA DETERMINAR A PRESENçA DO LOCUS NSF1 EM UMA PLANTA, E METODO PARA OBTER UMA PLANTA DE SOJA. Esta invenção refere-se à seqüências de polinucleotídeos codificantes de um gene que podem conferir resistência a pelo menos um herbicida. Esta ainda se refere a plantas e sementes de plantas portadoras de genes quiméricos que compreendem as referidas sequências de polinucleotideos, que ampliam ou conferem resistência a pelo menos um herbicida, e métodos para produzir tais plantas e sementes. A invenção ainda apresenta seqüências que podem ser usadas como marcadores moleculares, que por sua vez podem ser usados para identificar a região de interesse em linhagens de milho resultantes de novoscruzamentos e para, de forma rápida e eficiente, identificar as melhores linhagens para estratégias de melhoramento, evitando linhagens sensíveis.

Description

POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO OM GENE DE RESISTÊNCIA ÀHERBICIDA DE MILHO E MÉTODOS PARA USO

Campo da Invenção

Essa invenção está relacionada com composições e métodosúteis na criação ou melhora na resistência à herbicida emplantas. Adicionalmente, a invenção está relacionada complantas que tenham sido transformadas geneticamente com ascomposições da invenção.

Fundamentos da Invenção

Na produção comercial de cultivares, é desejáveleliminar facilmente e rapidamente plantas indesejáveis (i.e.,"ervas daninhas") de um campo de plantas cultivadas. Umtratamento ideal poderia ser um que possa ser aplicado em umcampo inteiro mas que pudesse eliminar apenas as plantasindesejáveis enquanto deixaria as plantas cultivadas ilesas.Tal sistema de tratamento envolve o uso de plantas cultivadasque sejam tolerantes a um herbicida. Quando o herbicida épulverizado em u«i- campo -de plantas cultivadas tolerantes aherbicida, as plantas cultivadas continuam a prosperarenquanto as ervas daninhas não tolerantes a herbicida sãomortas ou severamente prejudicadas.

A tolerância de cultivares a herbicidas específicos podeer conferida através da engenharia de genes dentro dascultivares que codificam apropriadas enzimas metabolizandoherbicidas. Em alguns casos essas enzimas, e os ácidosnucléicos que codificam as mesmas, são originadas de umaplanta. Em outros casos, elas são derivadas de outrosorganismos, tais como micróbios. Ver, pex., Padgette et al.(1996) "New weed control opportunities: Development ofsoybeans with a Round UP Ready™ gene" and Vasil (1996)"Phosphinothricin-resistant crops," both in Herbicide-Resistant Crops, ed. Duke (CRC Press, Boca Raton, Florida)pp.54-84 e pp. 85-91. Além disso, plantas transgênicas temsido engenheiradas para expressar uma variedade de genes detolerância a herbicida de uma variedade de organismos,incluindo um gene codificando uma proteína quimérica docitocromo P4507A1 de rato e NADPH-citocromo P450oxidoredutase de levedura (Shiota et al. (1994) PlantPhysiol. 106: 17), entre outros genes P450 de plantas (ver,por exemplo, Didierjean, L. et al. (2002) Plant Physiol. 130:179-189; Morant, M.S. et al. (2003) Opinion in Biotechnology14:151-162). Outros genes que conferem tolerância aherbicidas incluem: acetohidroxi-ácido sintase ("AHAS"), quetem sido encontrado para conferir resistência a múltiplostipos de herbicidas ALS em plantas expressando os mesmos etem sido introduzido dentro de uma variedade de plantas (ver,pex., Hattori et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 246: 419);glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono et al.(1995) Plant Cell Physiol. 36: 1687); e genes para váriasfosfotransferases (Datta et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:619) .

Enquanto plantas cultivadas tolerantes a herbicidas sãopresentemente disponíveis comercialmente, melhoramentos emcada aspecto da produção de cultivares estão continuamentesendo demandados. Herbicidas e cultivares que estãopresentemente disponíveis comercialmente infelizmente possuemcaracterísticas particulares que podem limitar sua utilidadena produção de cultivares comerciais. Particularmente,herbicidas individuais têm diferentes e incompletos espectrosde atividade contra espécies de ervas daninhas comuns.

A família de herbicidas acetolactato sintase, ou ALS(também conhecido como AHAS) controla as ervas daninhasatravés da inibição da produção de cadeias ramificadas deaminoácidos que são essenciais para o crescimento edesenvolvimento da planta. Especificamente, eles se ligam àenzima ALS da planta. Herbicidas comumente usados nessafamília incluem nicosulfuron, rimsulfuron, e chlorsulfuron,entre outros. Herbicidas nesta categoria podem ser bastanteespecíficos para cada cultivar. Concretizações da invençãoestão relacionadas com plantas que são resistentes a membrosda classe de herbicidas ALS-inibidores, que engloba 5- sub-classes de herbicidas incluindo, mas não estando limitado a,família de herbicidas sulfonilurea (SU) e a família deherbicidas da imidazolinona.

A classe de herbicidas inibindo a síntese de pigmentotem como alvo as enzimas que permitem que as plantassintetizem pigmentos, tais como pigmentos carotenóides oupigmentos de clorofila. Perda de pigmentos resulta na foto-destruição da clorofila e clareamento dos tecidos vegetais,por essa razão que esses herbicidas são freqüentementechamados de herbicidas "branqueadores". Um exemplo de umasub-classe de herbicidas branqueadores é a classe HPPD-inibidora, que inibe a enzima 4-hidroxifenilpiruvatodioxigenase (HPPD) (Lee et al. (1997) Weed Sei. 45:601-609).Herbicidas nesta família incluem, mas não estão limitados a,mesotrione, tembotrione, topramezone e sulcotrione, entreoutros. Milho é geralmente tolerante a mesotrione devido aometabolismo do herbicida (Mitchell et al. (2001) Pest Mgt.Sei. 57:120-128). O mesmo sistema de detoxificação pode dartolerância a ambos herbicidas mesotrione e alguns SU (Green &Williams (2004) Proceedings Weed Science Society of America44:13). Concretizações da invenção estão relacionadas aplantas que são resistentes a membros da classe de herbicidasinibidoras da síntese de pigmentos.

A classe de herbicidas inibindo protoporfirinogêniooxidase (PPO) interfere na síntese de clorofila, resultandoem compostos que produzem compostos- altamente ativos(radicais livres). Esses compostos reativos desorganizammembranas celulares que resultam na queima das folhasassociada com aplicações pós-emergência desses produtos.Herbicidas nesta família incluem, mas não estão limitados a,acifluorfen, fomesafen, lactofen, sulfentrazone,carfentrazone, "f lumiclorac e flumioxazin, entre outros.Concretizações da invenção estão relacionadas com plantas quesejam resistentes a membros da classe de herbicidas PPO-inibidores.

Herbicidas inibidores do fotosistema II (PSII) tem ummodo de ação que envolve interação com componentes na cadeiade transferência de elétrons do fotossistema II. Fotosinteserequer a transferência de elétrons do fotosistema II para ofotosistema I. Um passo chave na cadeia de transferência deelétrons é a redução da plastoquinona (PQ) através daproteína D1 na membrana tilacóide. Herbicidas PSII-inibidoresse ligam à proteína D1, então inibindo a ligação PQ einterrompendo o processo de transferência de elétrons. Issoresulta em plantas não sendo capazes de fixar dióxido decarbono e produz os carboidratos necessários para a plantasobreviver. 0 bloqueio na transferência de elétrons tambémcausa um estresse oxidativo e a geração dos radicais quecausam rápido dano celular. Herbicidas PSII-inibidores sãorepresentados por diversas famílias de herbicidas, incluindoas triazinas simétricas, triazinonas (trizinas assimétricas),uréias substituídas, uracilas, piridazinonas, fenilcarbamato, nitrilas, benzotiadiazoles, fenil piridazinas, eamidas ácidas. Concretizações da invenção relatam plantas quesão resistentes a membros da classe de herbicidas PS II-inibidores.

Herbicidas auxinas sintéticas são uma classe amplamenteusadas de herbicidas que imitam- os hormônios auxinas naturaisproduzidos pelas plantas. Auxinas regulam muitos processosvegetais, incluindo crescimento celular e diferenciação.Auxinas estão geralmente presentes em baixas concentrações naplanta. Herbicidas auxinas sintéticas imitam auxinas naturaise causam relativamente altas concentrações nas células queresultam em uma resposta de rápido crescimento. Plantassuscetíveis tratadas com esses herbicidas exibem sintomas quepodem ser chamados 'overdose de auxilia' , e eventualmentemorrem como um resultado do aumento das taxas dedesorganização e crescimento descontrolado. Concretizações dainvenção estão relacionadas com plantas que são resistentes amembros da classe de herbicidas auxina sintéticos.

Algumas concretizações desta invenção são baseadas em umbom mapeamento, clonagem e caracterização do gene responsávelpor um importante mecanismo de resistência a herbicida emmilho.

É conhecido desde o início de 1990 que a tolerâncianatural em milho (Zea mays L.) para um subgrupo de herbicidassulfoniluréia (nicosulfuron [herbicida Dupont Accent®],rimsulfuron, primisulfuron, e thifensulfuron) -é controladapor um simples gene (denominado nsf por Kang (1993) Journalof Heredity 84(3): 216-217), com resistência dominante esensibilidade recessiva (Harms et al. (1990) Theor. Appl.Genet. 80:353-358; Kang (1993) supra; Green & Uhlrich (1993)Weed Sci. 41:508-516; Green & Uhlrich (1994) Pestic. Sci.40:187-191). Também é conhecido que plantas tolerantes demilho metabolizam nicosulfuron através de hidroxilação, comas características de um citocromo P450 (Fonne-Pfister et al.(1990) Pesticide Biochem. Physiol. 37:165-173; Brown &Cotterman (1994) Cheia. Plant Prot. 10:47-81). Tem sidosugerido que o mesmo gene de milho responsável por determinartolerância a alguns herbicidas sulfoniluréia é tambémresponsável pela tolerância ao bentazon (Barrett et al.(1997) Role of cytochrome P-450 in herbicide metabolism andselectivity and multiple herbicide metabolizing cytochrome P-450 activities in maize. In Κ. K. Hatzios, ed. Regulation ofEnzymatic Systems Detoxifying Xenobiotics in Plants.Dordrecht: Kluwer Aeademic. pp. 35-50; Green (1998) WeedTechnology 12:474-477) e herbicidas inibidores de HPPD taiscomo mesotrione (Green & Williams (2004) supra; Williams etal. (2005) HortScience 40(6) :1801-1805) . Recentes avanços nodesenvolvimento do mapa físico de milho e marcadoresintegrados (Bortiri et al. (2006) Curr Opin Plant Biol.9(2):164-71) tem permitido uma clonagem posicionai aproximadapara ser usada para identificação do locus Nsfl.

0 gene de resistência Nsfl das concretizações dapresente·, invenção codifica um novo gene relacionado aocitocromo da família P450. Enquanto múltiplos genes docitocromo P450 têm sido descritos, eles diferem amplamente emsua resposta para diferentes patógenos e ação exata. 0 novogene do citocromo P450 descrito nesta divulgação tem sidodemonstrado para prover melhora na tolerância ou resistênciaa numerosos herbicidas, incluindo nicosulfuron, rimsulfuron,primisulfuron, thifensulfuron e mesotrione.Sumário da Invenção

A presente invenção está direcionada a concretizaçõesincluindo um polinucleotideo isolado compreendendo umaseqüência de nucleotideos codificando um polipeptídeo capazde conferir resistência a pelo menos um herbicida, onde opolipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido de pelo menos85, 90 ou 95% de identidade, quando comparado com a SEQ IDN0:1 baseado no algoritmo de alinhamento Needleman-Wunsch, ouum complemento da seqüência de nucleotídeo, onde ocomplemento e a seqüência de nucleotídeo consistem do mesmonúmero de nucleotideos e são 100% complementares. Osherbicidas para os quais o polinucleotideo das concretizaçõesconfere resistência incluem membros da classe ALS-inibidores;a classe inibidora da síntese de pigmentos; a classe PPO-inibidora; a classe PS II-inibidora; e a classe de herbicidasauxina sintética. 0 polinucleotideo das concretizações podemmelhorar resistência a um ou mais herbicidas da mesma classe,ou de diferentes classes, incluindo membros representativosde todas as 5 classes.

Concretizações adicionais da presente invenção incluemum vetor compreendendo o polinucleotideo das concretizações eum constructo de DNA recombinante compreendendo opolinucleotideo das concretizações, operacionalmente ligado apelo menos uma seqüência regulatória. Uma célula vegetal, bemcomo uma planta e uma semente compreendendo- cada um oconstructo de DNA recombinante de uma concretização dapresente invenção são também englobados. Também são incluídosplantas compreendendo polinucleotideos adicionais codificandopolipeptideos responsáveis por tratos de interesse, tais comopolipeptideos tendo atividade glifosato N-acetiltransferase,polipeptideos inseticidas Bt, e outros polipeptideos deinteresse. Plantas compreendendo esses polinucleotideosincluem monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo, mas nãoestando limitado a, milho, trigo, cevada, aveia, switchgrass,sorgo, arroz, soja, canola, batata, algodão e girassol.

Os métodos encorporados pela presente invenção incluem1) um método para transformar uma célula, compreendendotransformar uma célula com o polinucleotideo de umaconcretização da presente invenção, 2) um método paraproduzir uma planta compreendendo transformar uma célulavegetal com o constructo de DNA recombinante de umaconcretização da presente invenção e regenerar uma planta dacélula vegetal transformada, e 3) métodos de conferir oumelhorar a resistência a pelo menos um herbicida,compreendendo transformar uma planta com o constructo de DNArecombinante de uma concretização da presente invenção, dessemodo conferindo ou reforçando resistência a pelo menos umherbicida, tal como um membro da classe ALS-inibidora; aclasse inibidora da síntese de pigmento; a classe PPO-inibidora; a classe PS II-inibidora; e a classe de herbicidasde auxina sintética.

Em adição, uma concretização da invenção é um alelovariante da seqüência Nsfl na qual uma simples mudançaespecifica no aminoácido (ver Exemplo 2) torna um geneinoperante, resultando em sensibilidade a pelo menos umherbicida ALS ou HPPD inibidor para o qual a maioria dosmilhos são resistentes. Assim sendo, um método adicionalincorporado pela presente invenção é um método de usar avariante do gene Nsfl como um marcador em estratégias dereprodução para evitar a incorporação de um alelo sensível.

Métodos de alterar o nível de expressão de uma proteínacapaz de conferir -resistência a pelo menos um herbicida emuma célula vegetal compreendendo (a) transformar uma célulavegetal com o constructo de DNA recombinante de umaconcretização da presente invenção e (b) crescer a célulavegetal transformada sob condições que sejam adequadas paraexpressão do constructo de DNA recombinante onde a expressãodo constructo de DNA recombinante resulta em produção deníveis alterados de uma proteína capaz de conferir• resistência a pelo menos um herbicida no hospedeirotransformado são também incorporados pela presente invenção.Os herbicidas para os quais a resistência pode ser conferidaincluem, por exemplo, membros da classe ALS-inibidores;classe de inibidores da síntese de pigmentos; a classe PPO-inibidores; a classe PS II-inibidores; e a classe deherbicidas auxina sintética.

Herbicidas para os quais um polinucleotídeo dasconcretizações pode conferir ou melhorar resistência incluem,mas não estão limitados a, herbicidas selecionados da classede herbicidas ALS-inibidores tais como nicosulfuron,rimsulfuron, primisulfuron, imazethapyr, chlorsulfuron,chlorimuron ethyl, triasulfuron, flumetsulam e imazaquin.Adicionalmente, tais herbicidas podem ser selecionados daclasse de herbicidas inibidora da síntese de pigmentos, taiscomo isoxaflutole, topramezone, sulcatrione e tembotrione.Tais herbicidas podem ser também selecionados da classe deherbicidas PPO-inibidores, tais como acifluorfen, flumioxan esulfentrazone. Opcionalmente, tais herbicidas podem serselecionados da classe de herbicidas PS II-inibidores, taiscomo diuron, linuron, bentazon e chlorotoluron. Taisherbicidas podem também ser selecionados da classe deherbicidas auxina sintética, tais como dicamba.

Métodos da concretização incluem um método de determinara presença do polinucleotídeo das concretizações ou o locusNsfl em uma planta, compreendendo pelo menos um desses: (a)isolar moléculas de ácido nucléico da planta e determinar seum gene Nsfl é apresentado pela tentativa de amplificarseqüências homólogas ao poliiiucleotídeo; ou (b) isolarmoléculas de ácido nucléico da planta e desempenhar umahibridização Southern, ou (c) isolar proteínas da planta edesempenhar um western blot usando anticorpos da proteínaNSFl, ou (d) isolar proteínas da planta e desempenhar umensaio ELISA usando anticorpos para a proteína NSF1, e assimdeterminar a pfesença do polinucleotídeo da reivindicação 1na planta.Também são englobados pelas concretizações as plantascom tolerância melhorada a pelo menos um herbicida,compreendendo o gene Nsfl em um constructo de DNArecombinante. Tais plantas compreendem ainda um segundo genede resistência a herbicida provendo um certo nivel detolerância para um herbicida selecionado de uma classe deherbicidas selecionada do grupo consistindo de:

(a) classe ALS-inibidora;

(b) classe inibidora da síntese de pigmento;

(c) classe PPO-inibidora;

(d) classe PS II-inibidora; e

(e) classe auxina sintética;

tanto que a presença do gene Nsfl confere sobre a planta umalto nível de tolerância para o mesmo herbicida do que onível de tolerância exibido por uma planta compreendendo osegundo gene de resistência à herbicida mas não compreendendoo gene Nsfl.

Também são englobadas pelas concretizações plantas desoja compreendendo o gene Nsflr onde tais plantas de sojatambém exibem resistência aos cistos de nemátodas de soja.Tais plantas podem ter sido criadas através de transformaçãoou técnicas de melhoramento genético de planta, e podem tersido melhorados do germoplasma tais como aquelas selecionadasdo grupo consistindo de, Peking, PI88788, PI89772, PI90763,PI209332, PI404189A, PI437654, PI438489B, PI467312, PI468916,Hartwig, J87-233, e progênies derivadas de qualquer uma dasfontes listadas.

Breve Descrição das Figuras

Figura l(a-e) é um alinhamento múltiplo de seqüências daseqüência do polipeptideo das concretizações (SEQ ID NO: 2)coraparando-o com outros polipeptídeos do Citocromo P450conhecidos (SEQ ID NOs: 3-13). Figura Id também indica aposição da maioria dos domínios comumente conservados dafamília do citocromo P450 (SEQ ID NO: 14). Resíduos idênticosno alinhamento são indicados em letras maiúsculas.

Figura 2(a-b) é um alinhamento múltiplo de seqüênciasdas seqüências de polipeptídeos de diversas linhagens demilho sensíveis e resistentes mostrando domínios comumenteconservados da família do citocromo P450 (SEQ ID NO: 14) bemcomo variações entre as seqüências.

Descrição Detalhada da Invenção

Concretizações da presente invenção provêrp.. composições emétodos direcionados a induzir resistência a herbicidas emplantas. As composições são novas seqüências de nucleotídeose aminoácidos que conferem ou melhoram resistência a um oumais membros de uma ou mais classes de herbicidas, incluindoas classes de herbicida ALS-inibidor, PPO-inibidor, inibidorda síntese de pigmènto, PS ΓΙ-inibidor e auxina sintética,aqueles membros incluem, mas não estão limitados a,nicosulfuron, rimsulfuron, primisulfuron, e mesotrione.Especificamente, certas concretizações provêm polipeptideostendo a seqüência de aminoácido descrita na SEQ ID NO: 2, evariantes e fragmentos dos mesmos. Moléculas isoladas deácido nucléico, e variantes e fragmentos dos mesmos,compreendendo seqüências de nucleotideo que codificam aseqüência de aminoácido apresentadas em SEQ ID NO: 2 sãoainda providos.

Um exemplo da seqüência de nucleotideo nativa quecodifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 está descrita em SEQID NO: 1. Plantas, células vegetais, sementes, emicroorganismos compreendendo uma seqüência de nucleotideoque codifica um polipeptídeo das concretizações são tambémdivulgados aqui.

O comprimento total do polipeptídeo das concretizações(SEQ ID NO: 2) apresentam diferentes graus de homologia compolipeptideos conhecidos da família do citocromo P450. Emparticular, o novo polipeptídeo das concretizações mostramhomologia com proteínas do citocromo P450 isoladas de Oryzasativa: Números de acesso XP_469850 (SEQ ID NO: 3), ABC69856(SEQ ID NO: 4); XP_469849 (SEQ ID NO: 11) e XP_469851 (SEQ IDNO: 12); e XP_469852 (SEQ ID NO: 13) e Lolium rigidum:Números de acesso AAK38080 (SEQ ID NO: 5); AAK38079 (SEQ IDNO: 6); AAK38081 (SEQ ID NO: 7); BAD27508 (SEQ ID NO: 8);BAD27 507 (SEQ ID NO: 9) e BAD27506 (SEQ ID NO: 10) . Figura 1provê um alinhamento de seqüências de aminoácidos descritasna SEQ ID NO: 2 com proteínas do citocromo P450 de O. sativae L. rigidum (SEQ ID NOs: 3-13).

Alinhamentos de aminoácidos realizados usando o programaGAP indicam que a SEQ ID NO: 2 apresenta similaridades deseqüência mostradas na Tabela 1 com proteínas do citocromoP450 de O. sativa e L. rigidum.

Tabela 1: Comparação do peptideo NSFl com outros peptideos doCitocromo P450

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A família de genes do citocromo P450 em plantascatalisam regiões específicas extremamente diversas efreqüentemente complexas e/ou reações estereoespecíficas nabiosíntese ou catabolismo de moléculas bioativas de plantas.(Morant et al. (2003) Curr. Opin. Biotech. 14(2): 151-162).P450s são proteínas heme que catalisam a ativação do oxigêniomolecular através do uso de elétrons do NADPH. No genoma deArabidopsis thaliana sozinho, existe uma estimativa de maisde 300 citocromos P450 (Werck-Reichhart et al. (2000) Trendsin Plant Science 5(3): 116-123). Características estruturaiscomuns ocorrem nos citocromos P450 de plantas e ajudamidentificá-las como tal. Essas características incluem omotivo F-X-X-G-X-R-X-C-X-G (SEQ ID NO: 14) geralmenteencontrado próximo à extremidade C-terminal (ver Figura ld).Cerca de 150 resíduos acima, outro motivo conservadogeralmente encontrado segue o motivo A/G-G-X-D/E-T-T/S (SEQID NO: 15) e corresponde à região do peptídeo responsávelpela ativação e ligação ao oxigênio.

Os ácidos nucléicos e polipetídeos das concretizaçõesencontram uso em métodos para conferir ou melhorarresistência ao herbicida para uma planta. Assim sendo, ascomposições e métodos divulgados aqui são úteis na proteçãode plantas de danos causados por herbicidas. "Resistência aherbicida" significa que uma planta ou uma célula vegetal tema habilidade de tolerar uma alta concentração de um herbicidaquando comparada com plantas ou células que não sejamresistentes, ou tolerar uma certa concentração de umherbicida por um longo período de tempo quandó comparada comcélulas ou plantas que não sejam resistentes. Isto é,herbicidas são prevenidos de causar injúrias nas plantas, ouas injúrias causadas por herbicidas são minimizadas oudiminuídas, tais como, por exemplo, a redução doamarelecimento das folhas e a perda de produção associada. Umespecialista na área apreciará que as composições e métodosdivulgados aqui podem ser usados com outras composições emétodos disponíveis no estado da técnica para aumentar oumelhorar a resistência à herbicida das plantas. 0 termo"melhorar" refere-se a reforçar, aumentar, amplificar,multiplicar, elevar, e semelhantes.

Em aspectos particulares, as concretizações incluemmétodos para conferir ou melhorar a resistência a herbicidasem uma planta compreendendo introdução dentro de uma plantade pelo menos um constructo de DNA, onde o constructo de DNAcompreende uma seqüência de nucleotídeo codificando umpolipeptídeo das concretizações resistente a herbicidaoperacionalmente ligado a um promotor que dirige a expressãoem plantas. A planta expressa o polipeptídeo, assimconferindo ou melhorando a resistência a herbicidas sobre aplanta, ou melhorando .o nível de resistência inerente dasplantas. Em concretizações particulares, o gene confere oumelhora a resistência a pelo menos um herbicida das classesde herbicida ALS-inibidora, inibidora da síntese de pigmento,PPO-inibidora, PS II-inibidora ou auxina sintética, cujosmembros incluem, mas não estão limitados a, herbicidasnicosulfuron, rimsulfuron, primisulfuron, thifensulfuron;bentazon, e mesotrione.A expressão de um polipeptideo das concretizações podeser alvo de específicos tecidos vegetais, mas geralmente nocaso de resistência a herbicidas, a expressão continua édesejada através das células vegetais. Entretanto, enquantomuitos promotores podem ser usados nas concretizações dainvenção, geralmente promotores constitutivos são utilizados.Um promotor constitutivo é um promotor que dirige a expressãode um gene através de várias partes de uma planta econtinuamente através do desenvolvimento da planta.

Como usado aqui, "ácido nucléico" refere-se a iampolímero deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo em qualqueruma das formas de cadeia simples ou cadeia dupla, e a menosque limitado em outro lugar, engloba análogos conhecidos(pex., ácidos nucléicos peptídicos) tendo a naturezaessencial dos nucleotídeos naturais onde eles hibridizam comácidos nucléicos de cadeia simples de maneira similar aosnucleotídeos ocorrendo naturalmente.

Os termos- "polipeptideo," "peptídeo," e "proteína" sãousados substituivelmente aqui para se referir a um polímerode resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímerosde aminoácidos onde um ou mais resíduos de aminoácidos é umanálogo químico artificial de um aminoácido correspondenteocorrendo naturalmente, bem como aos polímeros de aminoácidosocorrendo naturalmente. Polipeptídeos das concretizaçõespodem ser produzidos de cada um dos ácidos nucléicosdivulgados aqui, ou através do uso de técnicas de biologiamolecular padrões. Por exemplo, uma proteína truncada dasconcretizações pode ser produzida através da expressão de umácido nucléico recombinante das concretizações em uma célulahospedeira apropriada, ou alternativamente através de umacombinação de procedimentos ex vivo, tais como digestão deprotease e purificação.

Como usado aqui, os termos "codificando" ou "codificado"quando usados no contexto de um ácido nucléico especificadosignifica que o ácido nucléico compreende a informaçãorequisitada para dirigir a tradução da seqüência denucleotídeo dentro da proteína especificada. A informaçãopela qual uma proteína é codificada é especificada pelo usode códons. Um ácido nucléico codificando uma proteína podecompreender seqüências não traduzidas (pex., introns) dentrode regiões traduzidas do ácido nucléico ou pode perder taisseqüências não traduzidas intervenientes (pex., como nocDNA).

As concretizações da i-nvenção -englobam composições depolinucleotídeos isolados ou substancialmente purificados oucomposições de proteínas. Um polinucleotídeo ou proteína"isolado" ou "purificado", ou porção biologicamente ativa dosmesmos, é substancialmente ou essencialmente livre decomponentes que normalmente acompanham ou interagem com opolinucleotídeo ou proteína como achados ocorrendonaturalmente em seu ambiente. Então, um polinucleotídeo ouproteína isolado ou purificado é substancialmente livre deoutros materiais celulares, ou meio de cultura quandoproduzido através de técnicas recombinantes, ousubstancialmente livre de precursores químicos ou outrosquímicos quando quimicamente sintetizado. Otimamente, umpolinucleotídeo "isolado" é livre de seqüências (otimamenteseqüências codificando proteínas) que flanqueiam naturalmenteo polinucleotídeo (i.e., seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico doorganismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo,em várias concretizações, o polinucleotídeo isolado podeconter menos do que cerca de 5 kb, cerca de 4 kb, cerca de 3kb, cerca de 2 kb, cerca de 1 kb, cerca de 0.5 kb, ou cercade 0.1 kb de seqüência de nucleotídeo que naturalmenteflanqueia o polinucleotídeo no DNA genômico da célula de ondeo polinucleotídeo é derivado. Uma proteína que ésubstancialmente livre de material celular inclui preparaçõesda proteína tendo menos do que cerca de 30%, cerca de 20%,cerca de 10%, cerca de 5%, ou cerca de 1% (através do pesoseco) da proteína contaminante. Quando a proteína dasconcretizações, ou uma porçãer-biologicamente ativa da mesma,é recombinantemente produzida, meios de culturas ótimosrepresentam menos do que cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de10%, cerca de 5%, ou cerca de 1% (através do peso seco) dosprecursores químicos ou químicos não protéicos de interesse.

Fragmentos e variantes das seqüências de nucleotídeodivulgadas e proteínas codificadas através dos mesmos sãotambém englobados pelas concretizações. O termo "fragmento"significa uma porção da seqüência de nucleotideo ou umaporção da seqüência de aminoácido e conseqüentemente umaproteína codificada através dos mesmos. Fragmentos de umaseqüência de nucleotideo podem codificar fragmentos deproteína que retenham a atividade biológica da proteínanativa e conseqüentemente tenham a habilidade de conferir oumelhorar a resistência a pelo menos um herbicida das classesde herbicida ALS-inibidor, PPO-inibidor, inibidor da síntesede pigmento, PS II-inibidor ou auxina sintética.Alternativamente, fragmentos de uma seqüência de nucleotideoque sejam úteis como sondas de hibridização nãonecessariamente codificam fragmentos de proteínas retendo aatividade biológica. Então, fragmentos de uma seqüência denucleotideo podem alcançar de cerca de pelo menos 15nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100nucleotídeos, até o comprimento total da seqüência denucleotideo codificando os polipeptídeos das concretizações.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotideo quecodifica uma porção biologicamente ativa der "um polipeptídeodas concretizações codificará pelo menos cerca de 15, cercade 25, cerca de 30, cerca de 40, ou cerca de 50 aminoácidoscontínuos, ou até o número total de aminoácidos presentes nocomprimento total do polipeptídeo das concretizações (porexemplo, 521 aminoácidos para SEQ ID NO: 2) . Fragmentos deuma seqüência de nucleotideo que sejam úteis como sondas dehibridização ou iniciadores de PCR geralmente não precisamcodificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína.Como usado aqui, "comprimento total de seqüência" emreferência a um polinucleotideo especificado significa ter aseqüência de ácido nucléico inteira de uma seqüência nativa.0 termo "seqüência nativa" significa uma seqüência endógena,i.e., uma seqüência não engenheirada encontrada em um genomade um organismo.

Então, um fragmento de uma seqüência de nucleotideo dasconcretizações pode codificar uma porção biologicamente ativade um polipeptideo, ou ele pode ser um fragmento que pode serusado como sonda de hibridização ou iniciador de PCR usandométodos divulgados abaixo. Uma porção biologicamente ativa deum polipeptideo resistente a um herbicida pode ser preparadaatravés do isolamento de uma porção de uma das seqüências denucleotideos das concretizações, expressando a porçãocodificada da proteína e estimando a habilidade da porçãocodificada da proteína de conferir ou melhorar a resistênciaa herbicida em uma planta. Moléculas de ácido nucléico quesão fragmentos de uma seqüência de nucleotideo dasconcretizações compreendem pelo menos cerca ^ie 15, cerca de20, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, ou cerca de 150nucleotideos, ou até o número de nucleotideos presentes em umcomprimento total da seqüência de nucleotideo divulgada aqui(por exemplo, 1563 nucleotideos para SEQ ID NO: 1) .

O termo "variantes" significa seqüênciassubstancialmente similares. Para polinucleotídeos, umavariante compreende uma deleção e/ou adição de um ou maisnucleotideos em um ou mais sítios internos dentro dopolinucleotideo nativo e/ou uma substituição de um ou maisnucleotideos em um ou mais sítios no polinucleotideo nativo.Como usado aqui, um polinucleotideo ou polipeptídeo "nativo"compreende uma seqüência de nucleotídeo ou seqüência deaminoácido ocorrendo naturalmente, respectivamente. Umespecialista na área reconhecerá que variantes dos ácidosnucléicos das concretizações serão construídas de tal modoque a fase aberta de leitura é mantida. Parapolinucleotídeos, variantes conservativas incluem aquelasseqüências que, por causa da degeneração do código genético,codificam a seqüência de aminoácido de um dos polipeptídeosdas concretizações. Variantes alélicas ocorrendo naturalmentede tal modo como essas podem ser identificadas com o uso detécnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, porexemplo, com reação de polimerase em cadeia (PCR) e técnicasde hibridização como delineadas abaixo. Polinucleotídeosvariantes também incluem polinucleotideo derivadosinteticamente, tal como aqueles gerados, por exemplo,através do uso da mutagênese sítio-dirigida mas que ain»Vacodificará uma proteína das concretizações. Geralmente,variantes de um polinucleotideo particular das concretizaçõesterão pelo menos cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%,cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cercade 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%,cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% oumais identidade de seqüência para um polinucleotideoparticular como determinado pelos programas e parâmetros dealinhamento de seqüência descritos em algum lugar aqui.

Variantes de um polinucleotideo particular dasconcretizações (i.e., o polinucleotideo de referência) podemtambém ser avaliadas pela comparação da porcentagem deidentidade de seqüência entre o polipeptideo codificado porum polinucleotideo variante e o polipeptideo codificado pelopolinucleotideo de referência. Então, por exemplo,polinucleotideos isolados que codificam um polipeptideo comuma dada porcentagem de identidade de seqüência para opolipeptideo da SEQ ID NO: 2 são divulgados. A porcentagem deidentidade de seqüência entre quaisquer dois polipeptídeospode ser calculada usando programas e parâmetros dealinhamento de seqüências descritos em algum lugar aqui. Ondequalquer dado par de polinucleotideos das concretizações éavaliado através de comparação da porcentagem de identidadede seqüência compartilhada pelos dois polipeptídeos que elescodificam, a porcentagem de identidade de seqüência entre os2(K dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 4 0%·~-cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cercade 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%,cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cercade 98%, cerca de 99% ou mais de identidade de seqüência.

Proteína "variante" significa uma proteína derivada deuma proteína nativa através de deleção ou adição de um oumais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteínanativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em pelomenos um ou mais sítios na proteína nativa. Proteínasvariantes englobadas pelas concretizações são biologicamenteativas, isto é, elas continuam a possuir a atividadebiológica desejada da proteína nativa, isto é, a habilidadepara conferir ou melhorar a resistência a herbicidas emplantas como descrito aqui. Tais variantes podem resultar de,por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulação humana.Variantes biologicamente ativas de uma proteína nativa dasconcretizações terão pelo menos cerca de 40%, cerca de 45%,cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cercade 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%,cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cercade 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácido para as proteínas nativas como determinado pelosprogramas e parâmetros de alinhamento de seqüência descritosem algum lugar aqui. Uma variante biologicamente ativa de umaproteína da-s · concretizações pode diferir daquela proteínaatravés de tão pouco quanto cerca de 1-15 resíduos deaminoácidos, tão pouco quanto cerca de 1-10, tanto como cercade 6-10, tão pouco quanto cerca de 5, tão pouco quanto 4, 3,2, ou ainda 1 resíduo de aminoácido.

As proteínas das concretizações podem ser alteradas "devárias maneiras incluindo substituições de aminoácidos,deleções, truncações, e inserções. Métodos para taismanipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica.Por exemplo, variantes de seqüências de aminoácidos efragmentos das proteínas de resistência a herbicidas podemser preparados através de mutações no DNA. Métodos paramutagênese e alterações no polinucleotídeo são bem conhecidosno estado da técnica. Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methodsin Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walkerand Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York) e as referênciascitadas aqui. Orientação para substituições apropriadas deaminoácidos que não afetem a atividade biológica da proteínade interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed.Res. Found., Washington, D.C.), aqui incorporado porreferência. Substituições conservativas, tais como a troca deum aminoácido com outro tendo propriedades similares, podeser ótimo.

Então, os genes - e polinucleotídeos das concretizaçõesincluem ambas as seqüências ocorrendo naturalmente bem comoas formas mutantes. Igualmente, as proteínas dasconcretizações englobam ambas as proteínas ocorrendonaturalmente bem como as variações e formas modificadas dasmesmas. Tais variantes continuarão a possuir a habilidadedesejada para conferir ou melhorar a resistência da plantapara pelo menos um herbicida das classes de herbicidas ALS-inibidora, PPO-inibidora, inibidora da síntese de pigmento,PS II-inibidora ou auxina sintética. Obviamente, as mutaçõesque serão feitas no DNA codificando a variante não devemcolocar a seqüência fora da fase de leitura e otimamente nãocriarão regiões complementares que possam produzir estruturassecundárias de mRNA. Ver, Patente européia No. 0075444.

As deleções, inserções, e substituições das seqüênciasde proteínas englobadas aqui não esperam produzir mudançasradicais nas características da proteína. No entanto, quandoé difícil predizer o efeito exato da substituição, deleção,ou inserção no progresso de fazê-lo, um especialista na áreaapreciará que o efeito será avaliado através de triagem dasplantas transgênicas que tenham sido transformadas com aproteína variante para averiguar o efeito na resistência a herbicida característico da planta.

Polinucleotídeos e proteínas variantes também englobamseqüências e proteínas derivadas de mutagênese ou deprocedimentos recombinogênicos, incluindo e não limitado aprocedimentos tais como-- embaralhamento de DNA. Umespecialista na área pode prever modificações que poderiamalterar o alcance de herbicidas para os quais a proteínaresponde. Com tal procedimento, uma ou mais seqüênciascodificando proteínas diferentes pode ser manipulada paracriar uma nova proteína possuindo as propriedades desejadas.Desta maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantessão geradas de uma população de seqüências relacionadas depolinucleotídeos compreendendo regiões de seqüências quetenham identidade de seqüência substancial e possam serhomologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo,usando essa abordagem, motivos de seqüências codificando umdomínio de interesse podem ser embaralhados entre o gene daproteína das concretizações e outros genes de proteínasconhecidas para obter um novo gene codificando para umaproteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal comoaumento na habilidade para conferir ou melhorar a resistênciaa herbicida em planta. Estratégias para tal embaralhamento deDNA são conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, US2002/0058249; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri etal. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et ai. (1997) J.Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e patentes americanas Nos. 5,605,793 e 5,837,458.

Os polinucleotídeos das concretizações podem ser usadospara isolar seqüências correspondentes de outros organismos,particularmente outras plantas. Desta maneira, métodos taiscomo PCR, hibridização, e semelhantes podem ser usados paraidentificar tais seqüências baseados na sua homologia deseqüência para as seqüências descritas aqui. Seqüênciasisoladas baseadas na sua identidade de seqüência para asseqüências inteiras descritas aqui ou variantes e fragmentosdas mesmas são englobadas pelas concretizações. Taisseqüências incluem seqüências que são ortólogas dasseqüências divulgadas. 0 termo "Ortólogas" significa genesderivados de um gene ancestral comum e que são encontrados emdiferentes espécies como resultado de especiação. Genesencontrados em diferentes espécies são considerados ortólogosquando suas seqüências de nucleotideos e/ou suas seqüênciasde proteínas codificadas compartilham pelo menos cerca de60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%,cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cercade 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de98%, cerca de 99%, ou maior identidade de seqüência. Funçõesde ortólogos são freqüentemente altamente conservadas entreas espécies. Então, polinucleotídeos isolados que codificampara uma proteína que confere ou melhora a resistência daplanta ao herbicida e que hibridiza sob condiçõesestringentes com as seqüências divulgadas aqui, ou paravariantes ou fragmentos das mesmas, são englobadas pelasconcretizações.

Em uma abordagem de PCR, oligonucleotídeos iniciadorespodem ser desenhados para uso em reações de PCR paraamplificar seqüências de DNA correspondentes de cDNA ou DNAgenômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodospara desenhar iniciadores de PCR e clonagem de PCR sãogeralmente conhecidos no estado da técnica e são divulgadosem Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCRStrategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand,eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).Métodos conhecidos de PCR incluem, e não estão limitados a,métodos usando iniciadores pareados, iniciadores aninhados,iniciadores simples específicos, iniciadores degenerados,iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos devetores, iniciadores parcialmente mal emparelhados, esemelhantes.

Em técnicas de hibridização, todo ou parte de umpolinucleotídeo conhecido é usado como uma sonda quehibridiza seletivamente a outros polinucleotídeoscorrespondentes presentes em uma população de fragmentos deDNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (i.e.,bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido.As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNAgenômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outrosoligonucleotídeos, e podem ser marcados com um grupodetectável tal como 32P, ou qualquer outro marcadordetectável. Então, por exemplo, sodas para -hibridização podemser feitas através de marcação de oligonucleotídeossintéticos baseada nos polinucleotídeos das concretizações.Métodos para preparação das sondas para hibridização e paraconstrução de bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmenteconhecidos no estado da técnica e são divulgados em Sambrooket al. (1989) supra.

Por exemplo, um polinucleotídeo inteiro divulgado aqui,ou um ou mais porções dos mesmos, pode ser usado como sondacapaz de hibridizar especificamente a polinucleotideos e RNAsmensageiros correspondentes. Para alcançar hibridizaçãoespecifica sob uma variedade de condições, tais sondasincluem seqüências que são únicas e são otimamente pelo menoscerca de 10 nucleotideos em comprimento, pelo menos cerca de15 nucleotideos em comprimento, ou pelo menos cerca de 20nucleotideos em comprimento. Tais sondas podem ser usadaspara amplificar polinucleotideos correspondentes de umorganismo escolhido através de PCR. Essa técnica pode serusada para isolar seqüências codificadoras adicionais de umorganismo desejado ou como um ensaio diagnóstico paradeterminar a presença de seqüências codificadoras em umorganismo. Técnicas de hibridização incluem triagem dehibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (qualquer umadas placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al.(1989) supra.

Hibridização de tais seqüências pode ser executada sobcondições estringentes. Os termos "condições estringentes" ou"condições de hibridização estringentes" significam condiçõessob as quais uma sonda hibridizará com sua seqüência alvopara um nivel detectável maior do que para outras seqüências(pex., pelo menos 2-vezes acima do "background"). Condiçõesestringentes são dependentes de seqüência e serão diferentesem diferentes circunstâncias. Através do controle daestringência da hibridização e/ou condições de lavagem,seqüências alvo que sejam 100% complementares à sonda podemser identificadas (marcação homóloga). Alternativamente,condições estrigentes podem ser ajustadas para permitir algummal emparelhamento nas seqüências tanto que níveis maisbaixos de similaridade sejam detectados (marcaçãoheteróloga). Geralmente, uma sonda é menos do que cerca de1000 nucleotideos em comprimento, preferencialmente menos doque 500 nucleotideos em comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas onde aconcentração de sais é menor do que cerca de 1.5 M Na ion,tipicamente cerca de 0.01 a 1.0 M de concentração de ion Na(ou outros sais) empH 7.0 a 8.3 e a temperatura é pelo menoscerca de 30 °C para sondas curtas (pex., 10 a 50nucleotideos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas(pex., maior do que 50 nucleotideos). Condições estringentespodem também ser alcançadas com a adição de agentesdesestabilizantes tais como a formamida. Condições de baixaestringência exemplares incluem hibridização com uma soluçãotampão de formamida de 30 a 35%, IM NaCl, 1% SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37 °C, e uma--lavagem em SSC IX a 2X (20XSSC = 3.0 M NaCl/0.3 M citrato de trisódio) de 50 a 55 °C.Condições de estringência moderada exemplares incluemhibridização em formamida 40 a 45%, 1.0 M NaCl, 1% SDS a37 °C, e uma lavagem em SSC 0. 5X a IX SSC de 55 a 60 °C.Condições de alta estringência exemplares incluemhibridização em formamida 50%, 1 M NaCl, 1% SDS a 37 °C, euma lavagem final em 0. IX SSC de 60 a 65 °C por pelo menos 30minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreendercerca de 0.1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização égeralmente menos do que cerca de 2 4 horas, usualmente cercade 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem serápelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar oequilíbrio.

Especificidade é tipicamente a função das lavagens póshibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e atemperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a temperatura de melting (Tm) pode ser aproximada da

equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284:Tm = 81.5 0C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) -

500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, %GC éa porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, %form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização,e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é atemperatura (sob força iônica e pH definidos) onde 50% de umaseqüência alvo complementar hibridiza com uma sondaemparelhada perfeitamente. Tm é reduzida em cerca de 1 0Cpara cada 1%.- de mal emparelhamento; então, Tm, hibridização,e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar

com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, seseqüências com identidade >90% são procuradas, a Tm pode serdiminuída 10 °C. Geralmente, condições estringentes sãoselecionadas para serem cerca de 5 0C menor do que a Tm paraseqüência específica e seu complemento em uma força iônica epH definidos. No entanto, condições estringentes severaspodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou4 °C menor do que a Tm; condições de estringência moderada

podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou10 °C menor do que a Tm; condições de baixa estringênciapodem utilizar uma hibridização e /ou lavagem a 11, 12, 13,-14, 15, ou 20 0C menor do que a Tm. Usando a equação,composições de hibridização e lavagem, e Tm desejados,aqueles especialistas na área entenderão que variações naestringência de hibridização e/ou soluções de lavagem sãoinerentemente descritos. Se o nivel desejado de mauemparelhamento resulta em uma Tm menor do que 45 °C (soluçãoaquosa) ou 32 °C (solução formamida), é preferível aumentar aconcentração de SSC para uma temperatura mais alta que possaser usada. Um guia extensivo para hibridização de ácidosnucléicos é encontrado em Tijssen (1993) LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probesf Part I, Chapter 2(Elsevier, New York); and Ausubel et ai., eds. (1995) CurrentProtocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishingand Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989)supra.

Vários procedimentos podem ser usados para checar apresença ou ausência de uma seqüência particular de DNA, RNA,ou uma proteína. Esses procedimentos incluem, por exemplo,análises de southern blots, northern blots, western blots, eELISA. Técnicas como essas são bem conhecidas para osespecialistas na área e existem muitas referências que provémprotocolos detalhados. Tais referências incluem Sambrook etal. (1989) supra, e Crowther7 J.R. (2001), The ELISAGuidebook, Humana Press, Totowa, NJ, USA.

Os seguintes termos são usados para descrever a relaçãode seqüências entre dois ou mais polinucleotideos oupolipeptideos: (a) "seqüência referência", (b) "janela decomparação", (c) "identidade de seqüência", e (d)"porcentagem de identidade de seqüência".

(a) Como usado aqui, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como base para comparaçãode seqüência. Uma seqüência referência pode ser umsubgrupo ou um todo de uma seqüência especificada;por exemplo, como um segmento de um cDNA ouseqüência gênica de comprimento total, ou cDNA ouseqüência gênica inteiro.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" fazreferência a um segmento continuo e especificado deuma seqüência de polinucleotideo, onde a seqüênciade polinucleotideo na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., espaços)comparados com a seqüência de referência (que nãocompreende adições ou deleções) para alinhamentoótimo dos dois polinucleotideos. Geralmente, ajanela de comparação é pelo menos cerca de 20nucleotideos contínuos em comprimento, eopcionalmente pode ser cerca de 30, cerca de 40,cerca de 50, cerca de 100, ou maior. Osespecialistas na área entendem que para evitar umaalta similaridade com a seqüência referência devidoa inclusão de espaços (gaps) na seqüência depolinucleotideo uma penalidade para espaços (gappenalty) é tipicamente introduzido e é subtraído donúmero de compartilhamento.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação sãobem conhecidos no estado da técnica. Então, a determinação daporcentagem de identidade de seqüência entre quaisquer duasseqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático.Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são osalgoritmos de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; oalgoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv.Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global deNeedleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o métodode busca para alinhamento local de Pearson e Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin eAltschul (1990) Proc.,, Natl. Acad. Sei. USA 872264, modificadocomo em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:5873-5877.

Implementações computacionais desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determinar identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, e não estão limitadas a: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponível da Intelligenetics, MountainView, Califórnia); ο programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA na GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package, Versão 10 (disponível da Aceelrys Inc.,9685 Seranton Road, San Diego, Califórnia, USA). Alinhamentosusando esses programas podem ser realizados usando osparâmetros pré-definidos. 0 programa CLUSTAL está bemdescrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988);Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988)( Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CASTOS8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. 0 programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers eMiller (1988) supra. Uma tabela de peso residual PAM120, umapenalidade para espaço de comprimento 12, e uma penalidadepara espaço de 4 podem ser usados com o programa ALIGN quandoestiver sendo comparadas seqüências de aminoácidos. Osprogramas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol.215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990)supra. Buscas de nucleotídeos no BLAST podem ser realizadascom o programa BLASTN, pontuação = 100, seqüência de bases =12, para obter seqüências de nucleotl-deo homólogas aseqüência de nucleotídeo codificando uma proteína dasconcretizações. Buscas de proteína no BLAST podem serrealizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, seqüênciade bases = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogasa uma proteína ou polipeptídeo das concretizações. Para obteralinhamentos espaçados pára propósitos de comparação, BLASTespaçados (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito emAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389.Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizadopara realizar uma busca iterada que detecte relaçõesdistantes entre as moléculas. Ver Altschul et al. (1997)supra. Quando utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, osparâmetros pré-definidos dos respectivos programas (pex.,BLASTN para seqüências de nucleotideos, BLASTX paraproteínas) podem ser usados. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.Alinhamento pode também ser realizado manualmente através deinspeção.

Salvo indicação em contrário, valores deidentidade/similaridade de seqüência providos aqui referem-sea valores obtidos usando o GAP Versão 10 usando os seguintesparâmetros: % de identidade e % de similaridade para umaseqüência de nucleotídeo usando espaçamento de peso de 50 eComprimento Peso de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp;% de identidade e % de similaridade para uma seqüência deamihoácido usando espaçamento de peso de 8 e Comprimento Pesode 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programaequivalente dos mesmos. 0 termo., "programa equivalente"significa qualquer programa de comparação de seqüência que,para quaisquer duas seqüências em questão, gera umalinhamento tendo resíduos idênticos de nucleotídeo ouaminoácidos compartilhados e uma porcentagem idêntica deidentidade de seqüência quando comparada com o alinhamentocorrespondente gerado pelo GAP Versão 10.

GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol.Biol. 48:443-453, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas que maximiza o número decompartilhamentos e minimiza o número de espaçamentos. GAPconsidera todos os alinhamentos possíveis e posições deespaço e gera o alinhamento com o maior número de basescompartilhadas e o menor número de espaçamentos. Ele permitea provisão de uma criação de penalidade para espaçamento euma extensão de penalidade para espaçamento nas unidades debases compartilhadas. GAP deve fazer um ganho do número decompartilhamento de criação de penalidade para espaçamentopara cada espaço que ele insere. Se uma extensão depenalidade para espaço maior do que zero é escolhido, GAPdeve, em adição, fazer um ganho para cada espaço inserido docomprimento do espaço vezes a extensão da penalidade paraespaço. Valores padrões da criação da penalidade para espaçoe a extensão da penalidade para espaço na Versão 10 do GCGWisconsin Genetics Software Package para seqüências deproteínas são 8 e 2, respectivamente. Para seqüências denucleotídeos o padrão da criação da penalidade para espaço é50 enquanto que o padrão para a extensão da penalidade paraespaço é 3. A criação do espaço e a extensão das penalidadespara espaço podem ser expressas como um inteiro selecionadodo grupo de inteiros consistindo de 0 a 200. Então, porexemplo, a criação de espaço e a extensão da penalidade paraespaço podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maior.

GAP representa um membro da família dos melhoresalinhamentos. Podem existir muitos membros desta família, enenhum outro membro tem uma melhor qualidade. GAP exibequatro caracteres de mérito para alinhamentos: Qualidade,Razão, Identidade, e Similaridade. A qualidade é a métricamaximizada a fim de alinhar as seqüências. Razão é aqualidade dividida pelo número de bases em um segmento maiscurto. Porcentagem de identidade é a porcentagem dos símbolosque atualmente compartilham. Porcentagem de similaridade é aporcentagem dos símbolos que são similares. Símbolos queestão através dos espaços são ignorados. Uma similaridade épontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par desímbolos é maior ou igual a 0.50, limiar de similaridade. Amatriz de pontuação é usada na Versão 10 do GCG WisconsinGenetics Software Package is BLOSUM62 (ver Henikoff andHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915) .

(c) Como usado aqui, o termo "identidade de seqüência"ou "identidade" no contexto de duas seqüências depolinucleotídeos ou polipeptídeos faz referência a resíduosnas duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para amáxima correspondência sobre uma janela de comparaçãoespecificada. Quando a porcentagem de identidade de seqüênciaé usada em referência a proteínas é reconhecido que posiçõesresiduais que não são idênticas freqüentemente diferem,através de substituições de aminoácidos conservadas, onderesíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduosde aminoácidos com propriedades químicas similares (pex.,carga ou hidrofobicidade) e portanto não mudam aspropriedades funcionais da molécula. Quando seqüênciasdiferem nas substituições conservadas, a porcentagem deidentidade de seqüência pode ser ajustada para cima paracorrigir para a natureza conservada da substituição.Seqüências que diferem através de tais substituiçõesconservadas são ditas ter "similaridade de seqüência" ou"similaridade." Meios para fazer esse ajuste são bemconhecidos para os especialistas na área. Tipicamente issoenvolve pontuar uma substituição conservada como uma parcialao invés de um total mau emparelhamento, aumentando assim aporcentagem de identidade de seqüência. Então, por exemplo,onde a um aminoácido idêntico é dada uma pontuação de 1 e auma substituição não conservada é dada uma pontuação de zero,a uma substituição conservada é dada uma pontuação entre zeroe 1. A pontuação de substituições conservadas é calculada,pex.,como implementada no programa PC/GENE (Intelligenetics,Mountain View, Califórnia).

(d) Como usado aqui, o termo "porcentagem de identidadede seqüência-" significa o valor determinado através dacomparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre umajanela de comparação, onde a porção da seqüência depolinucleotideo na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (i.e., espaços) quando comparada com aseqüência de referência (que não compreende adições oudeleções) para um alinhamento ótimo das duas seqüências. Aporcentagem é calculada pela determinação do número deposições onde base de ácido nucléico idêntica ou resíduo deaminoácido ocorre em ambas as seqüências para produzir onúmero de posições compartilhadas, dividindo o número deposições compartilhadas pelo número total de posições najanela de comparação, e multiplicando o resultado por 100para produzir a porcentagem de identidade de seqüência.

O uso do termo "polinucleotídeo" não é destinado alimitar as concretizações para os polinucleotideoscompreendendo DNA. Os especialistas na área reconhecerão queos polinucleotideos podem compreender ribonucleotideos ecombinações de ribonucleotideos e deoxiribonucleotideos. Taisdeoxiribonucleotideos e ribonucleotideos incluem ambas asmoléculas ocorrendo naturalmente e análogos sintéticos. Ospolinucleotideos das concretizações também englobam todas asformas das seqüências incluindo, mas não estando limitado a,formas de cadeia simples, formas de cadeia dupla, esemelhantes.

Polinucleotideos isolados da presente invenção podem serincorporados dentro de constructos de DNA recombinantescapazes de introdução e replicação dentro de uma célulahospedeira. Um "vetor" pode ser um constructo que inclui umsistema de replicação e seqüências que sejam capazes detranscrição e tradução de uma seqüência codificandopolipeptideo em uma da célula hospedeira. Um número devetores adequados para transfecção estável de célulasvegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicastem sido descritos em, pex., Pouwels et al., Cloning Vectors:A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach andWeissbach, Methods for Plant Molecular Biologyl AcademicPress, 1989; e Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Aeademie Publishers, 1990. Tipicamente, vetores deexpressão em plantas incluem, por exemplo, um ou mais genesde plantas clonados sob o controle transcricional deseqüências regulatórias 5' e 3' e um marcador de seleçãodominante. Tais vetores de expressão em plantas também podemconter uma região regulatória de promotor (pex., uma regiãoregulatória controlando expressão induzivel ou constitutiva,regulada ambientalmente ou em de maneira desenvolvida, ouespecifica de células ou tecidos), um sitio de iniciação datranscrição, um sitio de ligação ao ribossomo, um sinal deprocessamento de RNA, uma seqüência de peptideo sinal paraexpressão direcionada, um sitio de terminação da transcrição,e/ou um sinal de poliadenilação.

Os termos "constructo recombinante", "cassete deexpressão", "constructo de expressão", "constructoquimérico", "constructo", "constructo -de DNA recombinante","constructo de DNA" e "fragmento de DNA recombinante" sãousados de forma substituível aqui e são fragmentos de ácidonucléico. Um constructo recombinante compreende umacombinação artificial de fragmentos de ácido nucléico,incluindo, mas não estando limitado a, seqüênciasregulatórias e codificadoras que não são encontradas juntasna natureza. Por exemplo, um constructo de DNA recombinantepode compreender seqüências regulatórias e seqüênciascodificadoras que sejam derivadas de diferentes origens, ouseqüências regulatórias e seqüências codificadoras derivadasda mesma origem e arranjadas de uma maneira diferente daquelaencontrada na natureza. Tais constructos podem ser usadossozinhos ou em conjunto com um vetor. Se um vetor é usadoentão a escolha do vetor é dependente do método que seráutilizado para transformar células hospedeiras como é bemconhecido para um especialista na área. Por exemplo, um vetorplasmidial pode ser usado. Um especialista qualificado estábem consciente dos elementos genéticos que devem estarpresentes no vetor a fim de transformar com sucesso,selecionar e propagar células hospedeiras compreendendoqualquer dos fragmentos de ácido nucléico isolados dainvenção. O rastreamento para obter linhagens exibindo onível e padrão de expressão desejada dos polinucleotídeos oudo locus Nsfl pode ser realizado através de amplificação,análises de Southern de DNA, análises de Northern daexpressão de mRNA, análises de immunoblotting da expressão deproteínas, análises fenotípicas, e semelhantes.

O termo "constructo de DNA recombinante" refere-se a umconstructo de DNA montado a partir de fragmentos de ácidosnucléicos obtidos de diferentes origens. Os tipos e origensdos fragmentos de ácido nucléicos podem ser muito diversos.

Em algumas concretizações, constructos de DNAcompreendendo um promotor operacionalmente ligado a umaseqüência de nucleotídeo heteróloga das concretizações sãoainda providos. Os constructos de DNA das concretizaçõesencontram uso na geração de plantas transformadas, célulasvegetais transformadas, e microorganismos transformados epara praticar os métodos para indução de resistência aosherbicidas ALS e HPPD inibidor divulgados aqui. 0 constructode DNA incluirá as seqüências regulatórias 5' e 3'operacionalmente ligadas a um polinucleotideo dasconcretizações. 0 termo "operacionalmente ligada" significauma ligação funcional entre dois ou mais elementos. 0 termo"seqüências regulatórias" refere-se a nucleotídeoslocalizados acima (seqüências não codificadoras 5'), dentro,ou abaixo (seqüências não codificadoras 3') de uma seqüênciacodificadora, e que pode influenciar a transcrição,processamento de RNA, estabilidade, ou tradução da seqüênciacodificadora associada. Seqüências regulatórias podemincluir, e não estão limitadas a, promotores, seqüênciaslider de tradução, introns, e seqüências de reconhecimento depoliadenilação. Por exemplo, uma ligação operável entre umpolinucleotideo de interesse e uma seqüência reguladora (umpromotor, por exemplo) é uma ligação funcional que permite-aexpressão do polinucleotideo de interesse. Elementosoperacionalmente ligados podem ser contínuos ou nãocontínuos. Quando usado para referir a ligação de duasregiões codificadoras de proteínas, operacionalmente ligadassignifica que as regiões codificadoras estão na mesma fase deleitura. A seqüência codificadora pode adicionalmente conteruma seqüência usada para direcionar a proteína aocloroplasto, vacúolo, retículo endoplasmático ou para fora dacélula. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos umgene adicional para ser co-transformado dentro do organismo.Alternativamente, o gene adicional pode ser provido emmúltiplos constructos de DNA. Tal constructo de DNA é providocom uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios derecombinação para inserção do polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo resistente a um herbicida para estar sobre aregulação transcricional das regiões regulatórias. 0constructo de DNA pode adicionalmente conter genes marcadoresde seleção.

O constructo de DNA incluirá na direção 5'-3' detranscrição, uma região de iniciação de transcrição (i.e., umpromotor), região de iniciação traducional, umpolinucleotídeo das concretizações, uma região de terminaçãotraducional e, opcionalmente, uma região de terminaçãotranscricional funcional no organismo hospedeiro. As regiõesregulatórias (i.e., promotores, regiões regulatóriastranscricionais, e regiões terminadoras traducionais) e/ou opolinucleotídeo das concretizações podem, .ser nativos/análogosà célula hospedeira ou umas còm as outras. Alternativamente,as regiões regulatórias e/ou o polinucleotídeo dasconcretizações podem ser heterólogos à célula hospedeira ouumas com as outras. Como usado aqui, o termo "heterólogo" emreferência a uma seqüência é uma seqüência que se origina deuma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, ésubstancialmente modificada de sua forma nativa na composiçãoe/ou locus genômico através de intervenção humanadeliberativa. Por exemplo, um promotor operacionalmenteligado a um polinucleotideo heterólogo é de uma espéciediferente da espécie da qual o polinucleotideo foi derivado,ou, se da mesma espécie ou análoga, uma ou ambas sãosubstancialmente modificadas de sua forma original e/ou locusgenômico, ou o promotor não é o promotor nativo dopolinucleotideo operacionalmente ligado.

A região de terminação incluída opcionalmente pode sernativa da região de iniciação transcricional, pode ser nativado polinucleotideo de interesse operacionalmente ligado, podeser nativa da planta hospedeira, ou pode ser derivada deoutra origem (i.e., estrangeira ou heteróloga) ao promotor,ao polinucleotideo de interesse, ao hospedeiro, ou qualquercombinação dos mesmos. Regiões de terminação convenientes sãodisponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como asregiões de terminação da octopina sintase e da nopalinasintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet.262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon etal. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) PlantCell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158;Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshiet al. (1987) Nucleic Aeids Res. 15:9627-9639. Emconcretizações particulares, o terminador do gene inibidor IIda protease da batata (PinII) é utilizado. Ver, por exemplo,Keil et al. (1986) Nucl. Aeids Res. 14:5641-5650; e An et al.(1989) Plant Cell 1:115-122, aqui incorporados por referênciana sua totalidade.Um número de promotores pode ser usado na prática dasconcretizações, incluindo o promotor nativo da seqüência dopolinucleotideo de interesse. Os promotores podem serselecionados baseado no resultado desejado. Uma ampla gama depromotores de planta é discutida em revisões recentes dePotenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22,aqui incorporada por referência. Por exemplo, os ácidosnucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos,tecido-especificos, induzidos por patógenos, ou outrospromotores para expressão em plantas. Tais promotoresconstitutivos incluem, por exemplo, a parte mais importantedo promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivosdivulgados nos documentos de patente WO 99/43838 eUS6, 072, 050; a parte mais importante do promotor CaMV 35S(Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz(McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 andChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU(Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS(Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS(patente americana No. 5,659,026), e semelhantes. Outrospromotores constitutivos incluem, por exemplo, Patentesamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597;5, 466, 785; 5, 399, 680; 5, 268, 463; 5,608,142; e 6,177,611.

Modificações de seqüências adicionais são conhecidaspara melhorar a expressão gênica em um hospedeiro celular.Essas modificações incluem eliminação de seqüênciascodificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais dositio de junção éxon-intron, repetições semelhantes atransposons, e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias para a expressão gênica. 0 conteúdo G-Cda seqüência pode ser ajustado a níveis médios para um dadohospedeiro celular, como calculado por referência a genesconhecidos expressos em células hospedeiras. Quando possível,a seqüência é modificada para evitar estruturas preditas degrampo de mRNA secundário.

Constructos de DNA podem adicionalmente conterseqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem agir paramelhorar a tradução. Líderes de tradução são conhecidas noestado da técnica e incluem: líderes de picornavirus, porexemplo, líder EMCV (região 5' não codificadora deEncephalomyocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 8 6:612 6-6130); líderes de potivirus, porexemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995)Gene 165 (2) : 23-3-238) , líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus),e a proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulinahumana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94);líderes não traduzidos do mRNA da proteína da capa do vírusdo mosaico da alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987)Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico de tabaco(TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNAf ed.Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírusestampado clorótico de milho (MCMV) (Lommel et al. (1991)Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987)Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos paramelhorar a tradução podem também ser utilizados, por exemplo,introns, e semelhantes.

Na preparação do constructo de DNA, os vários fragmentosde DNA podem ser manipulados, para colocar as seqüências deDNA na orientação correta e, como apropriado, na correta fasede leitura. Em direção ao fim, adaptadores ou ligadores podem ser empregados para aderirem aos fragmentos de DNA ou outrasmanipulações podem ser envolvidas para proverem convenientessítios de restrição, removerem DNA supérfluos, removeremsítios de restrição, ou semelhantes. Para este propósito,mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição,anelamento, re-substituições, pex., transições etransversões, podem ser envolvidas.

O constructo de DNA pode também compreender um gene demarcador de seleção para a seleção das células transformadas.Genes marcadores de seleção são utilizados para seleção dascélulas ou tecidos transformados. Genes marcadores incluemgenes codificando resistência a antibióticos, tais comoaqueles codificando a neomicina fosfotransferase II (NEO) e ahigromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes conferindoresistência a compostos de herbicidas, tais como glufosinatode amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Marcadores de seleçãoadicionais incluem marcadores fenotípicos tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes tais como proteínafluorescente verde (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng85:610-9 and Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28),proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J.Cell Science 117:943-54 and Kato et al. (2002) Plant Physiol129:913-42), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ daEvrogen, ver, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores de seleção adicionais, ver geralmente,Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511;Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff(1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) inThe Operonf pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566;Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483;Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reineset al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labowet al. (1990) Mol. Cell. Biol.--10:3343^3356; Zambretti et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski etal. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman(1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al.(1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595;Kleinschnidt 'et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin(1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva et al.(1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka etal. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais divulgações são aqui incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores de seleção não élimitante. Qualquer gene marcador de seleção pode ser usadonas concretizações.

O gene das concretizações pode ser expresso como umtransgene a fim de fazer plantas resistentes a pelo menos umherbicida das classes de herbicidas ALS-inibidor, PPO-inibidor, inibidor da síntese de pigmento, PS II-inibidor ouauxina sintética. Usando os diferentes promotores descritos em outros locais nesta divulgação, permitirá sua expressão emuma forma modulada em diferentes circunstâncias. Alguém podetambém inserir o gene inteiro, com ambos o promotor nativo ea região codificadora, como um transgene. Finalmente, usandoo gene das concretizações como um transgene permitirá rápidacombinação com outros-.tratos, tais como resistência a insetosou fungos.

Em certas concretizações as seqüências de ácido nucléicodas concretizações podem ser empilhadas com qualquercombinação de seqüências do polinucleotídeo de interesse, quepodem- ser transgênicas ou não transgênicas, a fim de criarplantas com o fenótipo desejado. Por exemplo, ospolinucleotídeos das concretizações podem ser empilhados comquaisquer outros polinucleotideos das concretizações, ou comoutros genes. As combinações geradas podem também incluirmúltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotideos deinteresse. Os polinucleotideos das concretizações podem serempilhados com qualquer outro gene ou combinação de genespara produzir plantas com uma variedade de tratos desejáveisincluindo e não limitado a tratos desejáveis para alimentaçãoanimal tais como genes envolvidos com alto teor de óleo(pex., Patente americana No. 6,232,529); amino ácidosbalanceados (pex. hordotioninas (Patentes americanas Nos.5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; e 5,703,409); alto teor delisina em cevada (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem.165:99-106; e WO 98/20122); e proteínas com alto teor demetionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279;Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; and Musumura et al.(1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestibilidade aumentada(pex., proteínas de armazenagem modificadas (pedido depatente americano No. 10/053,410, depositado em 7 de novembrode 2001); e tioredoxinas (pedido de patente americano No.10/005, 429, depositado em 3 de dezembro-.de 2001)), asdivulgações das quais são aqui incorporadas por referência.Os polinucleotideos das concretizações podem também serempilhados com tratos desejáveis para resistência a insetos,doenças ou herbicidas (pex., proteínas tóxicas de Bacillusthuringiensis (patentes americanas Nos. 5,366,892; 5,747,450;5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser et al (1986) Gene48:109); Iectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol.24:825); genes de detoxificação da fumonisina (patenteamericana No. 5,792,931); genes de avirulência e deresistência à doenças (Jones et al. (1994) Science 266:789;Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al.(1994) Cell 78:1089); mutantes acetolactato sintase (ALS) quelevam à resistência a herbicidas tais como as mutações S4e/ou Hra (Lee et al., (1988) EMBO J. 7 (5) : 1241-1248) ,resistência a inibidores da glutamina sintase tais comofosf inotricina ou basta (pex., gene bar; De Block et al.(1987) EMBO J. 6:2513-2518); genes HPPD que conferemtolerância a herbicidas inibidores „de HPPD tais comomesotriona ou isoxaflutole (Matringe et al. (2005) PestManagement Science 61:269-276; Dufourmantel et al., (2007)Plant Biotech. J. 5:118-133; ver também W01997049816) , genespara tolerância a herbicidas PPO inibidores ( Li and Nicholl(2005) Pest Management Science 61:277-285); genes deresistência a auxina sintética (pedido de patente americano2005/014737 e Herman et al., (2005) J. Biol. Chem. 280:24759-24767), e resistência ao glifosato (genes epsps, genesgat tais como aqueles divulgados na publicação do pedido depatente americano US2004/0082770, -,.também W002/36782 eW003/092360)); e tratos desejáveis para processamento ouprocesso de produto tais como alto teor de óleo (pex.,patente americana No. 6,232,529 ); óleos modificados (pex.,genes da desaturase de ácidos graxos (patente americana No.5,952,544; WO 94/11516)); amidos modificados (pex., ADPGpirofosforilases (AGPase), amido sintases (SS), enzimas deramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação deamido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (pex., patenteamericana No. 5.602,321; beta-quetotiolase,polihidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase(Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847)facilitam a expressão de polihidroxialkanoatos (PHAs)), asdivulgações das quais são aqui incorporadas por referência.Alguém pode combinar os polinucleotideos das concretizaçõescom polinucleotideos provendo tratos agronômicos tais comomacho esterilidade (pex., ver patente americana No.5.583,210), força do caule, tempo de florescimento,melhoramento de produção, ou tratos de tecnologia detransformação tais como regulação do ciclo celular oudirecionamento gênico (e.g. WO 99/61619; WO 00/17364; WO99/25821), as divulgações das quais são aqui incorporadas porreferência.

Essas combinações empilhadas podem ser criadas porqualquer método incluindo e não limitado a plantas dereprodução cruzada por qualquer metodologia convencional ouTopCross® , ou transformação genética. Se os tratos são "empilhados através de transformação genética das plantas, asseqüências de polinucleotideos de interesse podem sercombinadas a qualquer tempo e em qualquer ordem. Por exemplo,uma planta transgênica compreendendo um ou mais tratosdesejados pode ser usada como alvo para introduzir tratos adicionais por transformação subseqüente. Os tratos podem serintroduzidos simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotideos de interesse providospor qualquer combinação dos cassetes de transformação. Porexemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duasseqüências podem estar contidas em cassetes de transformaçãoseparados (trans) ou estar contidas no mesmo cassete detransformação (eis). Expressão das seqüências pode serdirigida pelo mesmo promotor ou por diferentes promotores. Emcertos casos, pode ser desejável introduzir um cassete detransformação que suprimirá a expressão do polinucleotideo deinteresse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação deoutros cassetes de expressão ou cassetes de superexpressãopara gerar a combinação de tratos desejada na planta. É aindareconhecido que seqüências do polinucleotideo podem serempilhadas em uma localização genômica desejada usando umsistema de recombinação sitio-especifico. Ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, e W099/25853,todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Concretizações adicionais incluem plantas obtidas pormétodos compreendendo: cruzamento de uma planta contendo ogene Nsfl como uma primeira planta parental, com uma plantadiferente que perdeu um gene Nsfl como uma segunda plantaparental, desse modo para obter progênie compreendendo o geneNsfl do primeiro parental; e opcionalmente compreendendoainda um ou mais passos de cruzamento para obter progênie deuma ou mais gerações compreendendo o gene Nsfl do primeiroparental. Tais plantas incorporadas podem incluir ambas asplantas puras e híbridas. Sementes de tais plantas, incluindoaquelas sementes que são homozigotas e heterozigotas para ogene Nsfl, e métodos de obter produtos de plantas resultantesdo processamento daquelas sementes são incorporadas nainvenção. Usando tais sementes na alimentação humana ouanimal ou na produção de um produto de milho, tais comofarinha, refeição e óleo é também uma concretização dainvenção.

Uma "linhagem ancestral ou "progenitora" é uma linhagemparental usada como fonte de genes, pex., para odesenvolvimento de linhagens elite. "Progênie" são osdescendentes da linhagem ancestral, e podem ser separados deseus ancestrais por muitas gerações de cruzamento. Uma"linhagem elite" ou "variedade elite" é uma linhagem ouvariedade superior agronomicamente que tem resultado demuitos ciclos de cruzamento e seleção para um desempenhoagronomicamente superior. Similarmente, "germoplasma elite" éum germoplasma agronomicamente superior, tipicamente derivadode e/ou capaz de dar origem a uma planta com desempenhoagronomicamente superior, tal como uma linhagem elite jáexistente ou recém-desenvolvida de milho ou soja.

Também incorporado na invenção está o uso de marcadoresmoleculares para mover o gene ou o transgene para dentro delinhagens elites usando técnicas de reprodução. Marcadoresmoleculares podem ser usados em uma variedade de aplicaçõespara melhoramento genético de plantas (pex ver Staub et al.

(1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) PlantMolecular Biology Repórter. 1: 3-8). Uma das principais áreasde interesse é aumentar a eficiência de retrocruzamento genesintrogredidos usando seleção assistida por marcador (MAS). Ummarcador molecular que demonstra ligação com um locusafetando um trato fenotipico desejado provê uma útilferramenta para a seleção dos tratos em uma população deplantas. Isso é particularmente verdade onde o fenótipo édifícil para ser analisado, pex. muitos tratos de resistênciaa doenças, ou, ocorre em um estágio atrasado nodesenvolvimento da planta, pex. características da semente.Como ensaios com marcadores de DNA são menos trabalhosos, eocupam menos espaço físico, do que a fenotipagem em campo, umnúmero muito maior de populações podem ser analisadas,aumentando as chances de achar um recombinante com o segmentoalvo da linhagem doadora movido para a linhagem receptora. 0estreitamento de ligação, mais útil ao marcador, comorecombinação é menos provável de ocorrer entre o marcador e ogene causando o trato, o qual pode resultar em falsospositivos. Tendo marcadores flanqueando seriam necessáriospara diminuir as chances que a seleção de falsos positivosocorrerá como um evento de recombinação dupla. A situaçãoideal é ter um marcador no próprio gene, tanto, que arecombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Talmarcador é chamado um 'marcador perfeito'.

Opcionalmente, os ácidos nucléicos das concretizaçõespodem ser direcionados para o cloroplasto para expressão.Desta forma, onde o ácido nucléico não é diretamente inseridodentro do cloroplasto, o cassete de expressão adicionalmenteconterá um ácido nucléico codificando um peptídeo de trânsitopara dirigir o produto gênico de interesse para oscloroplastos. Tais peptideos de trânsito são conhecidos noestado da técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol.Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) PlantPhysiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys.Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science233:478-481.

Seqüências direcionando para o cloroplasto sãoconhecidas no estado da técnica e incluem a subunidade menordo cloroplasto da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase(Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol.Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem.266(5) :3335-3342) ; 5-(enol piruvil) shiquimato-3-fosfatosintase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb.22(6):789-810); triptofano sintase (Zhao et al. (1995) J.Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence etal. (1997) J. Biol. Chem. 272(33) :20357-20363) ; corismatosintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); e a proteína de ligação da clorofila a/b coletora deluz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999) . Ver também Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol.Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968;Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.Métodos para transformação de cloroplastos sãoconhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Svab etal. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab andMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab andMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método está baseado emuma arma de liberação de partículas de DNA contendo ummarcador de seleção e direcionando o DNA para o genomaplastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente,transformação de plastídeo pode ser acompanhada pelatransativação de um transgene conduzido pelo plastídeosilenciado através da expressão específica de tecido de umaRNA polimerase codificada no núcleo e dirigida para oplastídeo. Tal sistema tem sido reportado em McBride et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.

Os ácidos nucléicos que são direcionados ao cloroplastopodem ser otimizados para expressão no cloroplasto calculandoas diferenças no uso de códons entre o núcleo e as organelasvegetais. Desta forma, os ácidos nucléicos de interesse podemser sintetizados, usando códons preferidos dos cloroplastos.Ver, por exemplo, patente americana No. 5,380,831, aquiincorporada por referência.

Os métodos das concretizações podem envolver, e nãoestão limitados a, introduzir um polipeptídeo oupolinucleotídeo em uma planta. O termo "introduzir" significaapresentar à planta o polinucleotídeo. Em algumasconcretizações, o polinucleotídeo será apresentado de talmaneira que a seqüência ganha acesso ao interior de umacélula vegetal, incluindo sua inserção potencial dentro dogenoma de uma planta. Os métodos das concretizações nãodependem de um método particular para introduzir umaseqüência dentro da planta, apenas que o polinucleotideoganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.Métodos para introduzir polinucleotideos dentro das plantassão conhecidos no estado da técnica incluindo, mas nãolimitado a, métodos de transformação estável, métodos detransformação transiente, e métodos mediados por virus.

O termo "transformação" refere-se a transferência de umfragmento de ácido nucléico para dentro do genoma de umorganismo hospedeiro, resultando em um herança estávelgeneticamente. Organismos hospedeiros contendo fragmentos deácido nucléicos transformados são referidos como organismos"transgênicos". 0 termo "célula hospedeira" refere-se àcélula onde a transformação do constructo de DNA recombinanteocorre e pode incluir uma célula de levedura, uma célula bacteriana, e uma célula vegetal. Exemplos de métodos detransformação de planta incluem transformação mediada porAgrobacterium (De Blaere etal., 1987, Meth. Enzymol.143:211) e tecnologia de transformação de aceleramento departícula ou "biobalistica" (Klein et al., 1987, Nature(London) 327:70-73; patente americana No. 4,945,050), entreoutros.

O termo "transformação estável" significa que oconstructo de nucleotídeo introduzido dentro da planta seintegra dentro do genoma da planta e é capaz de ser herdadopela progênie dos mesmos. 0 termo "transformação transiente"ou "expressão transiente" significa que um polinucleotideo éintroduzido dentro da planta e não integra dentro do genomada planta ou um polipeptideo é introduzido dentro da planta.

Protocolos de transformação bem como protocolos paraintroduzir seqüências de polipeptideos ou polinucleotideodentro das plantas podem, variar dependendo do tipo de plantaou célula vegetal, i.e., monocotiledôneas ou dicotiledôneas,direcionadas para transformação. Métodos disponíveis paraintrodução de polipeptideos e polinucleotideos dentro dascélulas vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986)Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformaçãomediada por Agrobacterium (patentes americanas Nos. 5,563,055e 5,981,840), transferência direta de gene (Paszkowski et al.(1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partículaatravés da bali stica _ .(ver, por_ exemplo, Sanford et al.,patentes americanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; e5,932,782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissuef andOrgan Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips(Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology6:923-926); e transformação Lecl (W0 00/28058). Também verWeissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanfordet al. (1987) Partieulate Science and Technology 5:27-37(onion); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674(soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja);Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740(arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology6:559-563 (milho); U.S. Patent Nos. 5,240,855; 5,322,783 and5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444(milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho);Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S. Patent No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae);De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation ofOvule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp.197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet.84:560-566 (transformação mediada por fibra); D1Halluin etal. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al.(1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford(1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz) ;Osjoda et al.(1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (transformação demilho via Agrobacterium tumefaciens) ; todas as quais são aquiincorporadas por referência.

Métodos são conhecidos no estado da técnica paradirecionar a inserção de um polinucleotideo em umalocalização especifica no genoma da planta. Em umaconcretização, a inserção do polinucleotideo em umalocalização desejada no genoma é alcançada usando um sistemade recombinação sitio-especifico. Ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, e W099/25853,todas as quais são aqui incorporadas por referência.Brevemente, o polinucleotideo das concretizações pode estarcontido no cassete de transferência flanqueado por doissítios de recombinação não idênticos. 0 cassete detransferência é introduzido dentro da planta tendoestavelmente incorporado dentro do seu genoma um sítio alvoque é flanqueado por dois sítios de recombinação nãoidênticos que correspondem aos sítios do cassete detransferência. Uma recombinase apropriada é provida e ocassete de transferência é integrado no sítio alvo. 0polinucleotideo de interesse é assim integrado em uma posiçãoespecífica do cromossomo no genoma da planta.

As células que têm sido transformadas podem sedesenvolver em plantas de acordo com métodos convencionais.Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports5:81-84. Essas plantas podem então se desenvolver, e aindaserem polinizadas com a mesma linhagem transformada oudiferentes linhagens, e a progênie resultante ter umaexpressão constitutiva da característica fenotípica desejadaidentificada. Duas ou mais gerações podem se desenvolver paraassegurar que a expressão das características fenotípicasdesejadas é estavelmente mantida e herdada e então assementes são colhidas para assegurar que a expressão dascaracterísticas desejadas tem sido alcançada. Desta maneira,as concretizações provêm sementes transformadas (tambémreferenciadas como "sementes transgênicas") tendo umconstructo de nucleotideo das concretizações, por exemplo, umconstructo de DNA das concretizações, estavelmenteincorporado em seu genoma.

Como usado aqui, o termo planta inclui células vegetais,protoplastos de plantas, culturas de tecido vegetal onde aplanta de milho pode ser regenerada, calos vegetais, gruposde plantas, e células vegetais que estejam intactas nasplantas ou partes das plantas tais como embriões, pólen,óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, grãos,espigas, casca, caule, raiz, ápice radicular, anteras, esemelhantes. O termo grão significa a semente maduraproduzida por agricultores comerciais para outro propósitoalém de crescer ou desenvolver a espécie. Progênie,variantes, e mutantes das plantas regeneradas são tambémincluídas dentro do escopo das concretizações, desde queessas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

As concretizações da invenção podem ser usadas paraconferir ou melhorar resistência à herbicida em plantas,especialmente soja (Glycine max). Outras espécies vegetaispodem também ser de interesse na prática das concretizaçõesda invenção, incluindo, e não estando limitado a, outrasplantas cultivadas de monocotiledôneas e -iJicotiledoneas. 0gene de milho das concretizações é comumente achado namaioria das linhagens comerciais de milho, maioria das quaissão naturalmente tolerantes a pelo menos um, e usualmentevários, herbicidas auxina sintético, ALS-inibidor, PS II-inibidor e inibidor da síntese de pigmento, tais comorimsulfuron, nicosulfuron e mesotrione.

É, portanto previsto que a mesma tolerância a certosherbicidas presentes na maioria das linhagens de milho podemser estendidas para outras plantas cultivadas através demeios transgênicos pelo uso do gene endógeno de milho Nsfl evariantes do mesmo. Listagens de linhagens de milho comtolerância ou sensibilidade a herbicidas SU selecionadosestão amplamente disponíveis, tais como aqueles providos pelaUSDA, ARS, National Genetic Resources Program. GermplasmResources Information Network - (GRIN). [banco de dadosonline] National Germplasm Resources Laboratory, Beltsville,Maryland. [recuperado em 6 de março de 2006]: Recuperado dainternet: <URL: http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/dno_eval_acc.pl?89201+153002+21>; e aslistagens das "linhagens de germoplasma de milho" disponíveisdo Buckler Laboratory website [recuperado em 6 de -março de2006] : Recuperado da internet: <URL:http: //www.maizegenetics . net/index.php?page=germplasm/lines .html>, e também em artigos de referência tais como Kang (1993)J. Heredity. 84(3): 216-217.

Onde apropriado, · osotimizados para aumentartransformados. Por exemplo,polinucleotídeos podem sera expressão em organismosos polinucleotídeos podem sersintetizados usando códons preferidos para as plantas paramelhorar a expressão. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri(1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão do uso decódons preferidos dos hospedeiros. Métodos estão disponíveisno estado da técnica para sintetizar genes preferidos deplantas. Ver, por exemplo, patentes americanas Nos.5,380,831, e 5,436,391, e Murray et al. (1989) Nucleic AcidsRes. 17:477-498, aqui incorporados por referência.

A presente invenção pode ser usada para transformação dequalquer espécie de planta, incluindo, mas não limitado a,monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas deinteresse incluem, mas não estão limitados a, milho (Zeamays), Brassica sp. (pex., B. napus, B. rapa, B. juncea) ,alfalfa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio(Secale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) ,milheto (pex., milheto pearl (Pennisetum glaucum), milhetoproso (Panicum miliaceum), milheto foxtail (Setaria italica),milheto finger (Eleusine coracana)), girassol (Helianthusannuus) , cár-tamo (Carthamus tinetorius) , trigo (Tritieumaestivum), soja (Glyeine max), tabaco (Nieotiana tabaeum),batata (Solanum tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea),algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batatadoce (Ipomoea batatus), cassava (Manihot eseulenta) , café(Coffea spp.), côco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananaseomosus), árvores de citrus (Citrus spp.), cacau (Theobromaeaeao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate(Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidiumguajava) , manga (Mangifera indica), azeite (Olea europaea),mamão (Carica papaya) , caju (Anacardium occidentale) ,macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunusamygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana-de-açucar(Saccharum spp.), aveia {Avena spp.), cevada, palmeira, côco,mamona, azeite, feijão (por exemplo guar, alfarroba, fenacho,soja, feijão de jardim, feijão mungo, feijão lima, feijão defava), ervilhas (tais como cowpeas, ervilhas de campo,lentilhas, grão de bico, etc.), vegetais, ornamentais, e coniferas.

Outras plantas de interesse da invenção incluem aquelasque têm potencial para uso como cultivares parabiocombustivel, incluindo, mas não limitado a, gramineas daspradarias tais como switchgrass (Panieum virgatum), gramineaelefante (Pennisetum purpureum), graminea Johnson (Sorghumhalepense), Miseanthus spp., bem como o álamo híbrido eárvores de salgueiro híbridas.

.,Vegetais incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum,alface (pex., Laetuea sativa), feijão verde (Phaseolusvulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis),ervilha (Lathyrusspp.), e membros do gênero Cucumis tais como pepino (C.sativus), melão cantalupo (C. eantalupensis), e melão musk(C. melo). Ornamentais incluem azaléia (Rhododendron spp.),hortência (Maerophylla hydrangea) , hibisco (Hibiseusrosasanensis), rosa (Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.),narciso (Nareissus spp.), petúnia (Petunia hybrida) , cravo(Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbiapulcherrima), e crisântemo.

As concretizações provêm não apenas um gene para uso emaplicações transgênicas, mas seqüências e métodos quepermitam ao gene de resistência ser usado como um marcador emestratégias de melhoramento genético de milho. Por exemplo, ogene das concretizações, ou o locus contendo o mesmo, podeser identificado em uma linhagem de cultivar destinada paraser usada para melhoramento -genético. Melhoradores poderiamgeralmente querer evitar o uso de linhagens de cultivares quesejam sensíveis à herbicidas onde existe usualmentetolerância natural. Assim sendo, a identificação da seqüênciado gene Nsfl ajudará melhoradores a identificar e evitarcriar linhagens sensíveis a herbicida.

Marcadores baseados em ácidos nucléicos podem serdesenvolvidos e aplicados usando muitas tecnologiasdiferentes. Tais tecnologias incluem, e não estão limitadasa, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), SimpleSequence Repeat (SSR), Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD), Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS)(Rafalski and Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280),Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Vos et al.,1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), Single NucleotidePolymorphxsm (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234:177-186),Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) (Paran andMichelmore, 1993, Theor. Appl. Genet. 85:985-993), SequenceTagged Site (STS) (Onozaki et al., 2004, Euphytica 138:255-262), Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) (Oritaet al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:2766-2770), Inter-Simple Sequenee Repeat (ISSR) (Blair et al., 1999, Theor.Appl. Genet. 98:780-792), Inter-Retrotransposon AmplifiedPolymorphism (IRAP), Retrotransposon-Microsatellite AmplifiedPolymorphism (REMAP) (Kalendar et al. (1999) Theor. Appl.Genet. 98:704-711) e semelhantes.

Como usado aquilo termo "locus" deve se referir a umaregião definida geneticamente de um cromossomo carregando umgene ou, possivelmente, dois ou mais genes tão proximamenteligados que geneticamente eles se comportam como um locussimples, responsável por um fenótipo. Um "gene" deve fazerreferência a um gene especifico dentro daquele locus,incluindo suas seqüências regulatórias associadas. Então, olocus Nsfl refere-se à região cromossomal geneticamentedefinida como conferindo resistência a pelo menos umherbicida das classes de herbicida ALS-inibidora, PPO-inibidora, inibidora da síntese de pigmento, PS II- inibidorae auxina sintética. Uma concretização da presente invenção éo isolamento do gene Nsfl e a demonstração que ele é um generesponsável pelo fenótipo conferido pela presença do locus.Loci geneticamente definidos são, pela sua natureza, não tãoprecisamente definidos em termos de dimensão como genes, osquais podem ser delineados molecularmente.

Unidades, prefixos, e símbolos podem ser denotados na suaforma aceita nos sistemas internacionais. A menos queindicado de outra forma, ácidos nucléicos são escritos daesquerda para direita na orientação 5' para 3'; seqüências deaminoácidos são escritas da esquerda para direita naorientação amino para carboxi, respectivamente. Extensãonumérica é inclusiva dos números definindo a extensão.Aminoácidos podem ser referenciados aqui através de seussímbolos de três letras comumente conhecidos ou através dossímbolos de uma letra recomendados pela Comissão deNomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleotídeos, igualmente,podem ser referenciados através de seu código de letrasimples comumente aceito. Os termos acima definidos são maiscompletamente definidos através de referência paraespecificação como um todo.

Exemplos

As concretizações da invenção são ainda definidas nosseguintes Exemplos, nos quais todas as partes e porcentagenssão em peso e graus são Celsius, a menos que sejaespecificado de outra forma. Deve ser entendido que essesExemplos, enquanto indicar concretizações da invenção, sãodados como forma de ilustração somente. A partir da discussãoacima e esses exemplos, um especialista na área pode apuraras características essenciais das concretizações destainvenção, e sem separar do espírito e escopo da mesma, podefazer várias mudanças e modificações para adaptá-la à váriosusos e condições. Então, várias modificações dasconcretizações da invenção em adição àquelas apresentadas edescritas aqui serão perceptíveis para aqueles especialistasna área da descrição precedente. Tais modificações são tambémdestinadas a cair dentro do escopo das reivindicaçõesanexadas. A revelação de cada referência descrita aqui éincorporada como referência na sua totalidade.

Exemplo 1

Identificação do gene Nsfl através de clonagem posicionai

Uma população BCl (esperada 50% Nsfl/nsfl, 50%nsfl/nsfl) foi desenvolvida usando a linhagem pura sensívelW703A como parental recorrente, e B73 ou Q66 como linhagemresistente. Plantas foram nebulizadas com uma solução 2.3 mMnicosulfuron, 0.5% v/v surfactante cinético no estágioaproximado V3. Ambos os parentais resistentes e sensíveisforam também desenvolvidos e pulverizados como controle. Afim de evitar classificar falsamente uma planta que possa termorrido devido a outras razões que não sejam a aplicação deherbicida, apenas as progênies resistentes foram amostradas eanalisadas. Um total de 96 plantas resistentes foram usadaspara o mapeamento inicial. Isso foi suficiente para colocarNsfl entre os marcadores umcl766 e iimc2036, e deste modo nocontig 202 do milho B73-baseado no mapa físico ((Recuperadoem 6 de março de 2006) Recuperado da internet <URL:http: //www.gramene . org/Zea_mays/cytoview?contig=ctg202&x=44&y= 9>) .

Baseado nas seqüências extremidade BAC de um milho Mol7-baseado no contig, flanqueando CAPS (seqüência polimórficaclivada e amplificada) marcadores foram identificados nosBACs do contig 202.

Para um fino mapeamento deste intervalo, um total de 388plantas resistentes foram usadas no próximo passo. Baseado noseqüenciamento dos fragmentos subclonados dos BACs nesteintervalo, dois marcadores flanqueando CAPs foram encontradosna sobreposição dos BACs. Ambos os marcadores tinham 2/388recombinantes.

Ambos os BACs foram seqüenciados e analisados. Dentro da,região 163 kb dos 2 BACs f lanqueados por dois marcadoresproprietários, Pl e P2, existiam diversos genes putativos.Para a terceira rodada de mapeamento, um total de 2584plantas resistentes foram usadas, e os marcadores foramdesenvolvidos para separar alguns dos genes. Um marcadormostrou 11/2584 (0.4%) recombinantes, ajudando a eliminarcertos genes como sendo responsáveis pela resistência. Cadaum dos dois outros marcadores tiveram 2 (0.08%)recombinantes, eliminando ainda outro gene. Finalmente, um marcador entre dois genes teve uma simples recombinação(0.04%), eliminando um daqueles dois genes. Desse modo foideterminado qual gene foi o gene de interesse. 0 gene, Nsfl,foi determinado ter homologia a alguns genes do citocromoP450 conhecidos no estado da técnica.

Exemplo 2

Análise do gene Nsfl

Análises da seqüência do gene 18 (Nsfl) no BAC derivadode B73 mostra uma fase aberta de leitura de 521 aminoácidos,e contém o motivo de ligação heme conservado FXXGXXXCXG (SEQID NO: 14) encontrado em todos os citocromos P450s (FigurasId e 2b).

A fim de determinar se o alelo Nsfl foi consistenteatravés das linhagens de milho, três linhagens de milho comníveis de sensibilidade desconhecidos para o nicosulfuronforam testadas para determinar sua reação e então suasseqüências foram avaliadas. Plantas foram nebulizadas comsolução de 2.3 mM de nicosulfuron, 0.5% v/v surfactantecinético no estágio aproximado V3. Ambas as linhagensconhecidas resistentes e sensíveis foram também desenvolvidase pulverizadas como controle. Resultados do teste dessas trêslinhagens mostraram que as linhagens Q66 e Black MexicanSweet (BMS) foram resistentes e a linhagem A188 foi sensível.

Essas duas outras linhagens resistentes, Q66 e BMS,também possuem esta ORF, embora Q66 seja diferente de ambasas linhagens B73 e BMS por 3 aminoácidos (Figura·.2a e 2b).Esses três aminoácidos variantes são marcados com negrito eretângulos nas Figuras 2a e 2b na seqüência Q66 arranjadapara mostrar suas posições. Análises de uma linhagemsensível, GA209, mostram um inserção de 392 bp relativa àslinhagens resistentes que resultam em um "frameshift" e umafase aberta de leitura de apenas 338 aminoácidos (Figura 2b).Uma sobrevivente de numerosas linhagens sensíveis norteamericanas mostraram que muitas das linhagens sensíveiscontém essa mesma inserção de DNA desconhecido.

Análises da seqüência da linhagem sensível F2 mostraramque existe apenas um nucleotídeo de diferença entre B73 (SEQID NO: 2) e F2 (SEQ ID NO: 22), que mudaram o aminoácido 263de arginina para treonina (Figura 2b). Esta simples mudançaportanto elimina o fenótipo de resistência e seqüênciasvariantes com tal mudança são esperadas não retenção daatividade biológica. Essa mudança é útil no desenvolvimentode um SNP para auxiliar melhoradores de milho em evitar alelosuscetível.

Nsfl é 67% idêntico ao citocromo de arroz P450 que temsido recentemente relatado para controlar sensibilidade asulfoniluréia nesta planta (Número de acesso: ABC69856, SEQ ID NO: 4).

Seqüência genômica de B73 apresenta um simples introncom a borda esquerda esperada GT e a borda direita esperada AG. A posi-ção do Intron é mostrada na listagem de seqüênciana SEQ ID NO: 16.

A clonagem deste gene tem um número de aplicaçõespotenciais. Ela poderia ser usada como um marcador de seleçãopara transformação em uma linhagem transformável sensível talcomo A188 (Ishida et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750) . Um transgene desenhado para suprimir a função do geneNsfl poderia funcionar como um marcador seletivo negativodominante. Nsfl poderia também ser usado para criarresistência transgênica em outras plantas, tais como soja,que são sensíveis a esta subclasse de sulfoniluréias.

Exemplo 3:

Teste de plantas de milho para sensibilidade ao nicosulfuron

Três linhagens de milho com níveis de sensibilidadedesconhecidos para o nicosulfuron foram testadas paradeterminar sua reação. Plantas foram nebulizadas com umasolução de 2.3 mM nicosulfuron, 0.5% v/v surfactante cinéticono estágio aproximado V3. Ambas as linhagens resistentes esensíveis foram também desenvolvidas e pulverizadas comocontroles. Resultados do teste das três linhagens mostraramque as linhagens Q66 e BMS foram resistentes e a linhagemA188 foi sensível.

Exemplo 4: Preparação das plantas de soja transgênicas

As seguintes soluções e meios estoques foram usados paratransformação e regeneração das plantas de soja:

Soluções estoque

Estoque Sulfato 100 X: 37.0 g MgSO4.7H20, 1.69 g MnSO4-H2O,0.86 g ZnSO4.7H20, 0.0025 g CuSO4.5H20.

Estoque Halogenetos 100 X: 30.0 g CaCl2.2H20, 0.083 g Kl,0.0025 g CoCl2.6H20,

Estoque Ρ, B, Mo 100X: 18.5 g KH2PO4, 0.62 g H3BO3, 0.025 gNa2MoO4.2H20Estoque Fe EDTA IOOX : 3.724 g ^EDTA, 2.784 g FeSO4.7^0.Estoque 2,4-D: 10 mg/mL.

Estoque Vitamina B5 1000X: 10.0 g myo-inositol, 0.10 g ácidonicotinico, 0.10 g piridoxina HCl, 1 g tiamina.

Meio (por litro)

SBl96: 10 mL de cada uma das soluções estoque acima, 1 mL B5estoque de vitamina, 0.463 g (NH4) 2 SO4, 2.83 g KNO3, 1 mLestoque de 2,4-D, 1 g asparagina, 10 g sacarose, pH 5.7.

SB103: 1 pk. Mistura de sais Murashige & Skoog, 1 mL B5 deestoque de vitamina, 750 mg MgCl2 hexahidrato, 60 g maltose,2 g gelrite, pH 5.7.

SBl66: SB103 suplementado comativado.

SB71-4: sais Gamborg's B5s028), 1 mL B5 de estoque deagar, pH 5.7.

Culturas em suspensãomantidas "ém 35 mL de meiorotativo (150 rpm) à 28 °Cum ciclo noturno de 16-ho5g por litro de carvão vegetal(Gibco-BRL catálogo No. 21153-vitamina, 30 g sacarose, 5 g TCembriogênicas de soja foramliquido (SB196) em um agitadorcom luzes fluorescentes provendocas dia/8-horas noite. Culturasforam subcultivadas a cada duas semanas através de inoculaçãode aproximadamente 35 mg de tecido dentro de 35 mL de meioliquido.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja foramtransformadas por bombardeamento de partículas (ver Kleinet al. (1987) Nature 327:70-73) usando um instrumentobiolístico da DuPont PDSIOOO/He.

O plasmídeo de DNA recombinante usado para expressar Nsflestava em um plasmídeo de DNA recombinante separado do genemarcador de seleção. Ambos os plasmídeos de DNA recombinantesforam co-precipitados em partículas de ouro como segue. OsDNAs em suspensão foram adicionados a 50 μία de uma suspensãode partículas de ouro a 20 - 60 mg/mL 0.6 μπι e entãocombinados com 50 μΙ, de CaCl2 (2.5 M) e 20 μία de espermidina

(0.1 Μ) . A mistura foi pulsada no agitador por 5 veses,centrifugada em uma microcentrífuga por 10 segundos, e osobrenadante removido. As partículas de DNA recobertas sãoentão lavadas uma vez com 150 μΐ. de etanol 100%, pulsadas emum agitador e centrifugadas em uma microcentrífuga novamente,e ressuspendidas em 85 μΙ, de etanol anidro. 5μΙ, daspartículas de ouro cobertas com DNA são então carregadas emcada disco macrocarregador.

Aproximadamente 150 a 250 mg da cultura de suspensão dedua-s semanas de idade foram colocadas em uma placa de petrivazia 60 mm χ 15 mm e o líquido residual foi removido dotecido usando uma pipeta. 0 tecido foi colocado a cerca de3.5 polegadas distante de uma tela de retenção e cada placade tecido foi bombardeada uma vez. A pressão de ruptura demembrana foi fixada em 4,48 MPa (650 psi) e a câmara foievacuada para 0,71 m (28 polegadas) de Hg. Dezoito placasforam bombardeadas, e, após o bombardeamento, o tecido decada placa foi dividido entre dois frascos, colocados devolta dentro do meio liquido, e cultivados como descrito acima.

Sete dias após o bombardeamento, o meio liquido foitrocado meio fresco SB196 suplementado com higromicina 50mg/mL. O meio seletivo foi renovado semanalmente ou a cadaduas semanas. Sete semanas após o bombardeamento, tecidoverde transformado foi observado crescer de gruposembriogênicos não transformados necróticos. Tecido verdeisolado foi removido e inoculado em frascos individuais paragerar novas culturas de suspensão embriogênicas transformadaspropagadas clonalmente. Então, cada nova linhagem foi tratadacomo um evento de transformação independente. Essassuspensões foram então mantidas como suspensões de embriõesagrupadas em um estágio de desenvolvimento imaturo através dosubcultivo ou foram regeneradas em plantas inteiras atravésda maturação ou germinação de embriões somáticos individuais.

Grupos embriogênicos transformados foram removidos dacultura liquida e colocados em meio ágar sólido (SB166)contendo nenhum hormônio ou antibióticos por uma semana.Embriões foram cultivados à 26 0C com luzes fluorescentes eincandescentes misturada em um calendário de 16-horas dia: 8-horas noite. Depois de uma semana, as culturas foram entãotransferidas para meio SB103 e mantidas nas mesmas condiçõesde crescimento por 3 semanas adicionais. Antes datransferência da cultura liquida para o meio sólido, tecidodas linhagens selecionadas foi analisado por PCR para apresença do gene quimérico. Embriões somáticos se tornaramadequados para germinação depois 4 semanas e foram entãoremovidos do meio de maturação e secos em discos de petrivazios por um a cinco dias. Os embriões secos foram entãoplantados em meio SB71-4 e permitidos germinar sob a mesmaluz e condições de germinação como descritas acima. Embriõesgerminados foram transferidos para um solo estéril ecrescidos até a maturidade.

Exemplo 5

Análises de plantas transgênicas TO e TlTeste TO

Dois constructos diferentes compreendendo o gene Nsflforam criados para examinar a eficácia herbicida do genequando transformado dentro de soja. Os constructos Nsfl foramco-bombardeados com um inserto 35S:HYG para permitir seleçãodo evento usando higromicina.

No estágio de crescimento V2 a V6, um total de 127plantas TO foram· pulverizadas com 35 g/ha de rimsulfuron.Todos os tratamentos com rimsulfuron foram aplicados com 0.2%w/w de surfactante não iônico em um volume de spray de 287L/ha. Em adição às plantas TO, replicações de três diferentescontroles foram incluídas - duas positivas e uma negativa.Plantas individuais foram avaliadas para resposta à herbicidanos dez dias depois do tratamento, e registrou uma pontuaçãode resposta visual de 1 a 9 (1 = planta morta 9 = nenhumefeito observado). Baseado em pontuações de alta tolerânciapara o spray inicial de rimsulfuron, cinco eventos TO forampulverizados com um adicional de rimsulfuron 35 g/ha. Plantasforam classificadas por tolerância visual usando umapontuação de 1 a 9 em 10 dias após a segunda aplicação.

Na geração TO7 4 de 51 eventos tem melhorado a.tolerância comparado com os controles nos dez dias após otratamento com rimsulfuron 35 g/ha. Três dos 51 eventos TO tiveram nível melhorado de tolerância após uma aplicaçãoadicional de rimsulfuron 35 g/ha. Dois desses 51 eventosforam avançados para geração Tl por mais testes herbicidas extensivos.

Teste T1

Dois eventos da geração TO foram avançados para ageração Tl para um teste de eficácia a herbicida adicional dogene Nsf1. Replicatas de dois controles, bem como plantas TI,foram desenvolvidas em experimentos da casa de vegetação epulverizadas com mesotriona em uma de duas taxas (200 g/ha ou50 g/ha), nicosulfuron (70 g/ha), ou rimoulfuron (35 g/ha) noestágio de crescimento V3. Todos os tratamentos herbicidasforam aplicados com adjuvante de óleo de semente modificado1% w/w em um volume de spray de 374 L/ha. Plantas foramclassificadas para resposta à herbicida nos oitos dias após aaplicação usando uma pontuação de 1 a 9 como usado no testeTO.

Um teste de eficácia à herbicida expandido foidesenvolvido em um segundo experimento de planta Tl para osmesmos dois eventos avançados da geração TO. No estágio decrescimento V3, plantas foram pulverizadas com diferentestratamentos de herbicidas que poderiam tipicamente causarsubstancial injúria na cultivar quando aplicados para produtode base de soja nas taxas examinadas. Todos os tratamentosherbicidas foram aplicados em um volume de spray de 287 L/ha.Isoxaflutole (140 g/ha), topramezone (140 g/ha), esulcotrione (140 g/ha) foram aplicados com 1% w/w de óleoadjuvante de semente modificado. Tratamentos de diuron (560g/ha) foram aplicados com óleo adjuvante de cultivar 1% w/wpetróleo. Acifluorfen (4480 g/ha), sulfentrazone (140 g/ha),flumioxazin (140 g/ha), e dicamba (280 g/ha) foram aplicadoscom surfactante não iônico 0.25% w/w. Tratamentos comrimsulfuron (35 g/ha) foram aplicados com adjuvante misturabásica 0.5% w/w. Em oito e 15 dias após o tratamento, plantasforam classificadas visualmente para injúria na cultivarusando uma escala de 0 a 100 (0 = nenhuma injúria a 100 =planta morta). Desde que os eventos Tl estivessem segregando,apenas as plantas com melhor pontuação em toda parte foramselecionadas, correspondendo a 75% que poderiam ser esperadaspara possuir o transgene.Um dos dois eventos tiveram de forma significativamelhor tolerância quando comparados com o controle no 8 DAT e15 DAT após aplicação dos tratamentos de acifluorfen,dicamba, diuron, flumioxazin, isoxaflutole, mesotrione,rimsulfuron, sulcotrione, sulfentrazone, e topramezone. 0segundo evento teve significativamente melhor tolerânciaquando comparado aos controles no 15 DAT após a aplicação dostratamentos de acifluorfen, dicamba, isoxaflutole,mesotrione, rimsulfuron, sulcotrione, sulfentrazone, etopramezone. Embora o exato nivel de expressão do gene Nsflnos eventos testados não tenha sido determinado, plantastransgênicas de soja compreendendo o gene Nsfl de milhoexibiram melhor tolerância à faixa de diferentes herbicidasdo que quando comparada diretamente com as plantas controle.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Depositante: E.I. du Pont de Nemours and Company

<120> Titulo da Invenção: Polinucleotideo codificando um gene de resistênciaa herbicida de milho e métodos para uso

<130> Referência do documento: 2068-PCT

<150> Número do Documento de Prioridade: 60/780,946

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 2006-03-09

<150> Número do Documento de Prioridade: 60/888,634

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 2007-02-07

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 26

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID NO: 1

<211> Comprimento: 1563

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1563)

<400> Seqüência: 1

atg gat aag gcc tac ate gcc gcc ctc tcc gcc gcc gcc ctc ttc ttg 48

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu

1 5 10 15

ctc cac tac ctc ctg ggc cgg cgg gcc ggc ggc gag ggc aag gcc aag 96

Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys

20 25 30

gcc aag ggc tcg cgg cgg cgg ctc ccg ccg age cct ccg gcg ate ccg 144

Ala Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro

35 40 45

ttc ctg ggc cac ctc cac ctc gtc aag gcc ccg ttc cac ggg gcg ctg 192

Phe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu

50 55 60

gcc cgc ctc gcg gcg cgc cac ggc ccg gtg ttc tcc atg cgc ctg ggg 240

Ala Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly

65 70 75 80

acc cgg cgc gcc gtg gtc gtg tcg tcg ccg gac tgc gcc agg gag tgc 288

Thr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys

85 90 95

ttc acg gag cac gac gtg aac ttc gcg aac cgg ccg ctg ttc ccg tcg 336

Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser

100 105 110atg cgg ctg gcg tcc ttc gac ggc gcc atg ctc tcc gtg tcc age tac 384Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr115 120 125

ggc ccg tac tgg cgc aac ctg cgc cgc gtc gcc gcc gtg cag ctc ctc 432Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu130 135 140

tcc gcg cac cgc gtc ggg tgc atg gcc ccc gcc ate gaa gcg cag gtg 480Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val145 150 155 160

cgc gcc atg gtg cgg agg atg gac cgc gcc gcc gcg gcc ggc ggc ggc 528Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly165 170 175

ggc gtc gcg cgc gtc cag ctc aag cgg cgg ctg ttc gag ctc tcc ctc 576Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu180 185 190

age gtg ctc atg gag acc ate gcg cac acc aag acg tcc cgc gcc gag 624Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu195 200 205

gcc gac gcc gac tcg gac atg tcg acc gag gcc cac gag ttc aag cag 672Ala Asp Ala Asp Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln210 215 220

ate gtc gac gag ctc gtg ccg tac ate ggc acg gcc aac cgc tgg gac 720Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp225 230 235 240

tac ctg ccg gtg ctg cgc tgg ttc gac gtg ttc ggc gtg agg aac aag 768Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys245 250 255

ate ctc gac gcc gtg ggc aga agg gac gcg ttc ctg ggg cgg ctc ate 816Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile260 265 270

gac ggg gag cgg cgg agg ctg gac gct ggc gac gag age gaa agt aag 864Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys275 280 285

age atg att gcg gtg ctg ctc act ctg cag aag tcc gag cca gag gtc 912Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val290 295 300

tac act gac act gtg ate act gct ctt tgc gcg aac cta ttc ggc gcc 960Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320

gga acg gag acc acg tcc acc acg acg gaa tgg gcc atg tca ctg ctg 1008Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu325 330 335

ctg aac cac cgg gag gcg ctc aag aag gcg cag gcc gag ate gac gcgLeu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala340 345 350gcg gtg ggc acc tcc cgc ctg gtg acc gcg gac gac gtg ccc cac ctc 1104

Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu355 360 365

acc tac ctg cag tgc ate gtc gac gag acg ctg cgc ctg cac ccg gcc 1152

Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala

370 375 380

gcg ccg ctg ctg ctg ccg cac gag tcc gcc gcg gac tgc acg gtc ggc 1200

Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly

385 390 395 400

ggc tac gac gtg ccg cgc ggc acg atg ctg ctg gtc aac gtg cac gcg 1248

Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Val His Ala405 410 415

gtc cac agg gac ccc gcg gtg tgg gag gac ccg gac agg ttc gtg ccg 1296

Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro420 425 430

gag cgg ttc gag ggc gcc ggc ggc aag gcc gàg ggg cgc ctg ctg atg 1344

Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met435 440 445

ccg ttc ggg atg ggg cgg cgc aag tgc ccc ggg gag acg ctc gcg ctg 1392

Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu

450 455 460 cgg acc gtc ggg ctg gtg ctc gcc acg ctg ctc cag tgc ttc gac tgg 1440

Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp

465 470 475 480

gac acg gtt gat gga gct cag gtt gac atg aag gct age ggc ggg ctg 1488

Asp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu485 490 495

acc atg ccc cgg gcc gtc ccg ttg gag gcc atg tgc agg ccg cgt aca 1536

Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr500 505 510

gct atg cgt ggt gtt ctt aag agg ctc 1563

Ala Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu515 520

<210> SEQ ID NO: 2<211> Comprimento: 521<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 2

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85

Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu

10 15

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Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro45

Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu60

Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly

75 80

Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys90 95Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser100 105 . 110

Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr115 120 125

Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu130 135 140

Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val145 150 155 160

Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly165 170 175

Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu180 185 190

Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu195 200 205

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Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp225 230 235 240

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Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile

260 265 270

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Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val290 295 300

Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320

Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu325 330 335

Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala340 345 350

Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu355 360 365

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370 375 380

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Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro420 425 430

Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met435 440 445

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<210> SEQ ID NO: 3<211> Comprimento: 732<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)<223> Outras Informações: No. de Acesso XP_469850

<400> Seqüência: 3

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Trp Lys Glu Ile Ser Ile His His Lys Lys Met Pro Ser Ser Thr Thr145 150 155 160

Thr Lys Thr Thr Thr Pro Ser Arg Asp Ala Trp Ile Val Ser Ala Arg165 170 175

Ser Asp Pro Phe His Leu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Pro Leu Gly Ile180 185 190

Lys Ala Asp Ala Leu Ser Gln Ile Ala Ala Val His Gln Ser His Arg195 200 205

Asn Thr Ser His Ile Arg Glu Leu Ser Leu Ala Met Asp Asn Ala Tyr

210 215 220

Ile Ile Ala Ile Leu Ser Val Ala Ile Leu Phe Leu Leu His Tyr Tyr225 230 235 240

Leu Leu Gly Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ala Arg Leu Pro Pro Gly Pro245 250 255

Pro Ala Val Pro Ile Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Lys Pro Met260 265 270

His Ala Thr Met Ser Arg Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Pro Val Phe Ser275 280 285

Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Gly Cys290 295 300

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Arg Phe Glu Ser Gln Leu Leu Val Ser Phe Asn Gly Ala Ala Leu Ala325 330 335

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420 425 430

Glu Phe Lys Gln Val Val Asp Glu Ile Ile Pro His Ile Gly Ala Ala

435 440 445

Asn Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly

450 455 460

Val Arg Arg Lys Ile Leu Ala Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu465 470 475 480

Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Arg Arg Leu Asp Asp Gly Asp Glu

485 490 495

Gly Glu Lys Lys Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr

500 505 510

Glu Pro Glu Val Tyr Thr Asp Asn Met Ile Thr Ala Leu Thr Ala Asn

515 520 525

Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Ser Glu Trp Ala

530 535 540

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Glu Ile Asp Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg Leu Ile Thr Ala Asp Asp

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Val Thr Arg Leu Gly Tyr Leu Gln Cys Ile Val Arg Glu Thr Leu Arg

580 585 590

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610 615 620

Asn Ala Tyr Ala Ile His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Glu Pro Glu625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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690 695 700

Gly Leu Thr Ile Pro Lys Val Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro705 710 715 720

Arg Asp Ala Met Gly Gly Val Leu Arg Glu Leu Val725 730

<210> SEQ ID NO: 4<211> Comprimento: 513<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0) ... (0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: ABC69856

<400> Seqüência: 4

Met Asp Asn Ala Tyr Ile Ile Ala Ile Leu Ser Val Ala Ile Leu Phe1 5 10 15 Leu Leu His Tyr Tyr Leu Leu Gly Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Pro Ala Val Pro Ile Leu Gly His Leu His Leu 35 40 45 Val Lys Lys Pro Met His Ala Thr Met Ser Arg Leu Ala Glu Arg Tyr 50 55 60 Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg Ala Val Val Val65 70 75 80Ser Ser Pro Gly Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu His Asp Val Thr 85 90 95 Phe Ala Asn Arg Pro Arg Phe Glu Ser Gln Leu Leu Val Ser Phe Asn 100 105 110 Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ala Ser Tyr Gly Ala His Trp Arg Asn Leu 115 120 125 Arg Arg Ile Val Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala His Arg Val Gly Leu 130 135 140 Met Ser Gly Leu Ile Ala Gly Glu Val Arg Ala Met Val Arg Arg Met145 150 155 160Tyr Arg Ala Ala Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ala Ala Arg Ile Gln Leu 165 170 175 Lys Arg Arg Leu Phe Glu Val Ser Leu Ser Val Leu Met Glu Thr Ile 180 185 190 Ala His Thr Lys Ala Thr Arg Pro Glu Thr Asp Pro Asp Thr Asp Met 195 200 205 Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Gln Val Val Asp Glu Ile Ile Pro 210 215 220 His Ile Gly Ala Ala Asn Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Trp225 230 235 240Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Arg Lys Ile Leu Ala Ala Val Ser Arg 245 250 255 Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Arg Arg Leu 260 265 270 Asp Asp Gly Asp Glu Gly Glu Lys Lys Ser Met Ile Ala Val Leu Leu 275 280 285 Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Glu Val Tyr Thr Asp Asn Met Ile Thr 290 295 300 Ala Leu Thr Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr305 310 315 320Thr Ser Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn His Pro Asp Thr Leu 325 330 335 Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg Leu 340 345 350 Ile Thr Ala Asp Asp Val Thr Arg Leu Gly Tyr Leu Gln Cys Ile Val 355 360 365 Arg Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro Met Leu Leu Pro His 370 375 380 Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr Asn Ile Pro Arg Gly385 390 395 400Ser Met Leu Leu Ile Asn Ala Tyr Ala Ile His Arg Asp Pro Ala Val 405 410 415 Trp Glu Glu Pro Glu Lys Phe Met Pro Glu Arg Phe Glu Asp Gly Gly 420 425 430 Cys Asp Gly Asn Leu Leu Met Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Arg Cys 435 440 445 Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Gly Thr 450 455 460 Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg Val Asp Gly Val Glu Val Asp465 470 475 480Met Thr Glu Gly Gly Gly Leu Thr Ile Pro Lys Val Val Pro Leu Glu 485 490 495 Ala Met Cys Arg Pro Arg Asp Ala Met Gly Gly Val Leu Arg Glu Leu 500 505 510 Val

<210> SEQ ID NO: 5<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: AAK38080<400> Seqüência: 5

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Cys Ala Phe Leu Phe Leu

1 5 10 15

Val His Tyr Val Leu Gly Lys Val Ser Asp Gly Arg Arg Gly Lys Lys

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Ala Val Val Val Ser Ser Ser Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu

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100 105 110

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115 120 125

Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Val Gln Leu Leu Ser Ala His

130 135 140

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Ala Arg Arg Leu Phe His Ala Thr Glu Ala Ser Pro Asp Gly Ala Ala

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu His

245 250 255

Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu

260 265 270

Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met

275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320

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325 330 335

His Pro Ala Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val

340 345 350

Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Val Pro Ser Leu Ala Tyr

355 360 365

Leu Gln Cys Ile Val Ser Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400Asn Val Pro Ala Asp Thr Met Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His

405 410 415

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435 440 445

Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly

450 455 460

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Gly Val Lys Val Asp Met Thr Glu Gly Gly Gly Phe Thr Ile Pro Lys

485 490 495

Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Ala Val Met Arg Asp

500 505 510

Val Leu Gln Asn Leu515

<210> SEQ ID NO: 6<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: AAK38079<400> Seqüência: 6

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Ser Ala Phe Leu Phe Leu

1 5 10 15

Val His Tyr Val Leu Gly Lys Val Ser Asp Gly Arg Arg Gly Lys Lys

20 25 30

Gly Ala Val Gln Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Val Pro Phe Leu Gly

35 40 45

His Leu His Leu Val Glu Lys Pro Ile His Ala Thr Met Cys Arg Leu

50 55 60

Ala Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg65 70 75 80

Ala Val Val Val Ser Ser Ser Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu

85 90 95

His Asp Val Thr Phe Ala Asn Arg Pro Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu

100 105 110

Val Ser Phe Asn Gly Thr Ala Leu Val Thr Ser Ser Tyr Gly Pro His

115 120 125

Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Val Gln Leu Leu Ser Ala His

130 135 140

Arg Val Thr Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met145 150 155 160

Ala Arg Arg Leu Phe His Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Gly Ala Ala

165 170 175

Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu

180 185 190

Met Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ser Glu Ala Asp Ala

195 200 205

Asp Thr Asp Met Ser Leu Glu Ala Gln Glu Phe Lys Glu Val Val Asp

210 215 220

Lys Leu Ile Pro His Leu Gly Ala Ala Asn Met Trp Asp Tyr Leu Pro225 230 235 240

Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Ser Lys Ile Leu His

245 250 255

Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asn Ala Glu260 265 270Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met

275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320

Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn

325 330 335

His Pro Ala Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val

340 345 350

Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Val Pro Ser Leu Ala Tyr

355 360 365

Leu Gln Cys Ile Val Ser Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400

Asn Val Pro Ala Asp Thr Met Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Ala Trp Glu Asp Pro Leu Glu Phe Lys Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Glu Asp Gly Lys Ala Glu Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met

435 440 445

Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly

450 455 460

Met Val Leu Ala Thr Leu Val Gln Cys Phe Asp Trp Glu Pro Val Asp465 470 475 480

Gly Val Lys Val Asp Met Thr Glu Gly Gly Gly Phe Thr Ile Pro Lys

485 490 495

Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Val Val Met Arg Asp

500 505 510

Val Leu Gln Asn Leu515

<210> SEQ ID NO: 7<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)<223> Outras Informações: AAK38081

<400> Seqüência: 7

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Cys Ala Phe Leu Phe Leu1 5 10 15 Val His Tyr Val 20 Leu Gly Lys Val Ser 25 Asp Gly Arg Arg Gly 30 Lys LysGly Ala Val 35 Gln Leu Pro Pro Ser 40 Pro Pro Ala Val Pro 45 Phe Leu GlyHis Leu 50 His Leu Val Asp Lys 55 Pro Ile His Ala Thr 60 Met Cys Arg LeuAla Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg65 70 75 80Ala Val Val Val Ser 85 Ser Ser Glu Cys Ala 90 Arg Glu Cys Phe Thr 95 GluHis Asp Val Thr 100 Phe Ala Asn Arg Pro 105 Lys Phe Pro Ser Gln 110 Leu LeuVal Ser Phe 115 Asn Gly Thr Ala Leu 120 Val Thr Ser Ser Tyr 125 Gly Pro HisTrp Arg 130 Asn Leu Arg Arg Val 135 Ala Thr Val Gln Leu 140 Leu Ser Ala HisArg Val Ala Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met145 150 155 160Ala Arg Arg Leu Phe His Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Gly Ala Ala 165 170 175 Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu 180 185 190 Met Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ser Glu Ala Asp Ala 195 200 205 Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Glu Val Val Asp 210 215 220 Lys Leu Ile Pro His Leu Gly Ala Ala Asn Met Trp Asp Tyr Leu Pro225 230 235 240Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu His 245 250 255 Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu 260 265 270 Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met 275 280 285 Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr 290 295 300 Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn 325 330 335 His Pro Ala Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val 340 345 350 Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Val Pro Ser Leu Ala Tyr 355 360 365 Leu Gln Cys Ile Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro 370 375 380 Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400Asn Val Pro Ala Asp Thr Met Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His 405 410 415 Arg Asp Pro Ala Ala Trp Glu His Pro Leu Val Phe Arg Pro Glu Arg 420 425 430 Phe Glu Asp Gly Lys Ala Glu Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met 435 440 445 Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly 450 455 460 Met Val Leu Ala Thr Leu Val Gln Cys Phe Asp Trp Glu Pro Val Asp465 470 475 480Gly Val Asn Val Asp Met Thr Glu Gly Gly Gly Phe Thr Ile Pro Lys 485 490 495 Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Ala Val Met Arg Asp 500 505 510 Val Leu Gln Ser Ile 515

<210> SEQ ID NO: 8<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum

<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: BAD27508<400> Seqüência: 8

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Cys Ala Phe Leu Phe Leu1 5 10 15Val His Tyr Val Leu Gly Lys Val Ser Asp Gly Arg Arg Gly Lys Lys

20 25 30

Gly Ala Val Gln Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Ile Gly

35 40 45

His Leu His Leu Val Glu Lys Pro Ile His Ala Thr Met Cys Arg Leu

50 55 60

Ala Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg65 70 75 80

Ala Val Val Val Pro Ser Ser Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu

85 90 95

His Asp Val Thr Phe Ala Asn Arg Pro Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu

100 105 110

Ala Ser Phe Asn Gly Thr Ala Leu Val Thr Ser Ser Tyr Gly Pro His

115 120 125

Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Val Gln Leu Leu Ser Ala His

130 135 140

Arg Val Ala Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met145 150 155 160

Ala Arg Arg Leu Phe His Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Gly Ala Ala

165 170 175

Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu

180 185 190

Met Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ser Glu Ala Asp Ala

195 200 205

Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Glu Val Val Asp

210 215 220

Lys Leu Ile Pro His Leu Gly Ala Ala Asn Met Trp Asp Tyr Leu Pro225 230 235 240

Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu His

245 250 255

Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu

260 265 270

Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met

275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320

Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn

325 330 335

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340 345 350

Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Val Pro Ser Leu Ala Tyr

355 360 365

Leu Gln Cys Ile Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400

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405 410 415

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485 490 495

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<210> SEQ ID NO: 9<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDE0<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: BAD27507<400> Seqüência: 9

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Val His Tyr Val Leu Gly Lys Val Ser His Gly Arg Arg Gly Lys Lys

20 25 30

Gly Ala Val Gln Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Ile Gly

35 40 45

His Leu His Leu Val Glu Lys Pro Ile His Ala Thr Met Cys Arg Leu

50 55 60

Ala Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg65 70 75 80

Ala Val Val Val Ser Ser Ser Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu

85 90 95

His Asp Val Thr Phe Ala Asn Arg Pro Ser Ser Arg Arg Lys Leu Leu

100 105 110

Ala Ser Phe Asn Gly Thr Ala Leu Val Thr Ser Ser Tyr Gly Pro His

115 120 125

Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Val Gln Leu Leu Ser Ala His

130 135 140

Arg Val Ala Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met145 150 155 160

Ala Arg Arg Leu Phe His Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Gly Ala Thr

165 170 175

Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu

180 185 190

Met Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ser Glu Ala Asp Ala

195 200 205

Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Glu Val Val Asp

210 215 220

Lys Leu Ile Pro His Leu Gly Ala Ala Asn Met Trp Asp Tyr Leu Pro225 230 235 240

Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu His

245 250 255

Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu

260 265 270

Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met

275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn

325 330 335

His Pro Ala Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val

340 345 350

Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Val Leu Ser Leu Ala Tyr

355 360 365

Leu Gln Cys Ile Val Ser Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400

Asn Val Pro Ala Asp Thr Met Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Ala Trp Glu His Pro Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Glu Asp Gly Lys Ala Glu Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met

435 440 445

Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly

450 455 460

Met Val Leu Ala Thr Leu Val Gln Cys Phe Asp Trp Glu Pro Val Asp465 470 475 480

Gly Val Lys Val Asp Met Thr Glu Gly Gly Gly Phe Thr Ile Pro Lys

485 490 495

Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Thr Val Met Arg Asp

500 505 510

Val Leu Gln Asn Leu515

<210> SEQ ID NO: 10<211> Comprimento: 517<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Lolium rigidum

<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDE0

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: BAD27506<400> Seqüência: 10

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Cys Ala Phe Leu Phe Leu1 5 10 15 Val His Tyr Val 20 Leu Gly Lys Val Ser 25 His Gly Arg Arg Gly 30 Lys LysGly Ala Val 35 Gln Leu Pro Pro Ser 40 Pro Pro Ala Ile Pro 45 Phe Ile GlyHis Leu 50 His Leu Val Glu Lys 55 Pro Ile His Ala Thr 60 Met Cys Arg LeuAla Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg65 70 75 80Ala Val Val Val Ser 85 Ser Ser Glu Cys Ala 90 Arg Glu Cys Phe Thr 95 GluHis Asp Val Thr 100 Phe Ala Asn Arg Pro 105 Lys Phe Pro Ser Gln 110 Leu LeuAla Ser Phe 115 Asn Gly Thr Ala Leu 120 Val Thr Pro Ser Tyr 125 Gly Pro HisTrp Arg 130 Asn Leu Arg Arg Val 135 Ala Thr Val Gln Leu 140 Leu Ser Ala HisArg Val Ala Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Ala Glu Val Arg Ala Met145 150 155 160Ala Arg Arg Leu Phe 165 His Ala Ala Glu Ala 170 Ser Pro Gly Gly Ala 175 AlaArg Val Gln Leu 180 Lys Arg Gly Pro Phe 185 Glu Leu Ser Leu Ser 190 Val LeuMet Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Ala Thr Arg Ser Glu Ala Asp Ala

195 200 205

Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Glu Val Val Asp

210 215 220

Lys Pro Ile Pro His Leu Gly Ala Ala Asn Met Trp Asp Tyr Leu Pro225 230 235 240

Val Met Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu His

245 250 255

Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu

260 265 270

Arg Arg Arg Leu Ala Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Lys Lys Ser Met

275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Lys Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320

Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Arg Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn

325 330 335

His Pro Ala Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val

340 345 350

Gly Thr Ser Arg Leu Val Ser Val Asp Asp Met Pro Ser Leu Ala Tyr

355 360 365

Leu Gln Cys Ile Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro

370 375 380

Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400

Asn Val Pro Ala Asp Thr Met Leu Ile Val Asn Ala Tyr Ala Ile His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Ala Trp Glu His Pro Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Glu Asp Gly Lys Ala Glu Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met

435 440 445

Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu Arg Thr Ile Gly

450 455 460

Met Val Leu Ala Thr Leu Val Gln Cys Phe Asp Trp Glu Pro Val Asp465 470 475 480

Gly Val Lys Val Asp Met Thr Glu Gly Gly Gly Phe Thr Ile Pro Lys

485 490 495

Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Ala Val Met Arg Asp

500 505 510

Val Leu Gln Asn Leu515

<210> SEQ ID NO: 11<211> Comprimento: 512<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa

<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: XP_469849<400> Seqüência: 11

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Val Phe Ser Ile Val Ile Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Val Asp Tyr Leu Arg Arg Leu Arg Gly Gly Gly Thr Ser Asn Gly

20 25 30

Lys Asn Lys Gly Met Arg Leu Pro Pro Gly Leu Pro Ala Val Pro Ile

35 40 45

Ile Gly His Leu His Leu Val Lys Lys Pro Met His Ala Thr Leu Ser50 55 60Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser65 70 75 80

Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Gly Cys Ala Arg Glu Cys Phe85 90 95

Thr Glu His Asp Val Ala Phe Ala Asn Arg Pro Arg Phe Glu Ser Gln100 105 110

Leu Leu Met Ser Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Met Ala Ser Tyr Gly115 120 125

Pro His Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser130 135 140

Ala Arg Arg Val Gly Leu Met Ser Gly Leu Ile Ala Gly Glu Val Arg145 150 155 160

Ala Met Val Arg Ser Leu Cys Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ala Pro Val165 170 175

Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu Met Glu180 185 190

Thr Ile Ala Gln Ser Lys Ala Thr Arg Pro Glu Thr Thr Asp Thr Asp195 200 205

Thr Asp Met Ser Met Glu Ala Gln Glu Tyr Lys Gln Val Val Glu Glu210 215 220

Ilé Leu Glu Arg Ile Gly Thr Gly Asn Leu Cys Asp Tyr Leu Pro Ala225 230 235 240

Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Arg Ile Leu Ala Ala245 250 255

Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu Arg Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Arg260 265 270

Trp Arg Met Asp Asp Gly Glu Lys Lys Ser Met Ile Ala Val Leu Leu275 280 285

Thr Leu Gln Lys Thr Gln Pro Glu Val Tyr Thr Asp Asn Met Ile Thr290 295 300

Ala Leu Cys Ser Asn Leu Leu Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr305 310 315 320

Thr Ile Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn His Pro Glu Thr Leu325 330 335

Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg Leu

340 345 350

Ile Thr Ala Asp Asp Val Pro Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val355 360 365

Arg Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro Met Leu Ile Pro His370 375 380

Glu Ser Ser Ala Asp Cys Glu Val Gly Gly Tyr Ser Val Pro Arg Gly385 390 395 400

Thr Met Leu Leu Val Asn Ala Tyr Ala Ile His Arg Asp Pro Ala Ala405 410 415

Trp Glu Glu Pro Glu Arg Phe Val Pro Glu Arg Phe Glu Gly Gly Gly420 425 430

Cys Asp Gly Asn Leu Ser Met Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Arg Cys435 440 445

Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu His Thr Val Gly Leu Val Leu Gly Thr450 455 460

Leu Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg Val Asp Gly Val Glu Val Asp465 470 475 480

Met Ala Glu Gly Gly Gly Leu Thr Met Pro Lys Val Val Pro Leu Glu485 490 495Ala Val Cys Arg Pro Arg Asp Ala Met Gly Gly Val Leu Arg Glu Leu500 505 510

<210> SEQ ID NO: 12<211> Comprimento: 527<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa

<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras ; Informações ;: No. de : Acesso: XE '_4 69851 <400> Seqüência: 12 Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Val Phe Ser Ile Ala Ile Leu Phe Leu1 5 10 15 Leu Val Asp Tyr Phe Arg Cys Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Ser Asn 20 25 30 Asn Gly Glu Asn Lys Gly Met Leu Gln Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala 35 40 45 Ile Pro Phe Phe Gly His Leu His Leu Ile Asp Lys Pro Leu His Ala 50 55 60 Ala Leu Ser Arg Leu Ala Glu Arg His Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg65 70 75 80Leu Gly Ser Arg Asn Ala Val Val Val Ser Ser Pro Glu Cys Ala Arg 85 90 95 Glu Cys Phe Thr Asp Asn Asp Val Cys Phe Ala Asn Arg Pro Gln Phe 100 105 110 Pro Ser Gln Met Pro Ala Thr Phe Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Phe Ala 115 120 125 Asn Tyr Gly Ala His Trp Arg Asn Leu Arg Arg Ile Ala Thr Val His 130 135 140 Leu Leu Ser Ala His Arg Val Arg Gly Met Ala Gly Val Val Ser Gly145 150 155 160Glu Ile Arg Pro Met Val Gln Arg Met Tyr Arg Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Gly Val Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu 180 185 190 Ser Leu Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Ala Gln Thr Lys Thr Thr Arg 195 200 205 Pro Glu Ala Asp Asp Ala Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu 210 215 220 Phe Lys Asn Val Leu Asp Glu Leu Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Asn225 230 235 240Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Val Phe Asp Val Leu Gly Val 245 250 255 Lys Arg Lys Ile Ala Thr Leu Ala Asn Arg Arg Asp Ala Phe Val Arg 260 265 270 Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Gln Arg Met Asp Asn Gly Val Asp Gly 275 280 285 Gly Asp Asp Gly Glu Lys Lys Ser Val Ile Ser Val Leu Leu Ser Leu 290 295 300 Gln Lys Thr Glu Pro Glu Val Tyr Lys Asp Ile Val Ile Val Asn Leu305 310 315 320Cys Ala Ala Leu Phe Ala Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ala Met Thr Ile 325 330 335 Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn His Pro Lys Ile Leu Lys Lys 340 345 350 Ala Lys Ala Glu Ile Asp Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg Leu Ile Asn 355 360 365 Gly Asp Asp Met Pro His Leu Ser Tyr Leu Gln Cys Ile Ile Asn Glu 370 375 380Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Val Ala Pro Leu Leu Ile Pro His Glu Ser385 390 395 400Ser Ala Asp Cys Lys Val Asn Gly Tyr His Ile Pro Ser Gly Thr Met 405 410 415 Leu Leu Val Asn Val Ile Ala Ile Gln Arg Asp Pro Met Val Trp Lys 420 425 430 Glu Pro Asn Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Glu Asn Gly Glu Ser Glu 435 440 445 Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly 450 455 460 Glu Thr Met Ala Leu Gln Thr Ile Gly Leu Val Leu Gly Ala Leu Ile465 470 475 480Gln Cys Phe Asp Trp Asp Arg Val Asp Gly Ala Glu Val Asp Met Thr 485 490 495 Gln Gly Ser Gly Leu Thr Asn Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met 500 505 510 Cys Lys Pro Arg Glu Ala Met Ser Asp Val Phe Arg Glu Leu Leu

515 520 525

<210> SEQ ID NO: 13<211> Comprimento: 518<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: No. de Acesso: XP_469852<400> Seqüência: 13

Met Val Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Phe Ser Ile Ala Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ile His Phe Leu Phe Arg Arg Arg Gly Arg Ser Asn Gly Met Pro Leu

20 25 30

Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Phe Gly His Leu His Leu Ile

35 40 45

Asp Lys Pro Phe His Ala Ala Leu Ser Arg Leu Ala Glu Arg His Gly

50 55 60

Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Asn Ala Val Val Val Ser65 70 75 80

Ser Pro Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Asp Asn Asp Val Cys Phe

85 90 95

Ala Asn Arg Pro Arg Phe Pro Ser Gln Met Leu Ala Thr Phe Asn Gly

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Ser Ala Asn Tyr Gly Pro His Trp Arg Asn Leu Arg

115 120 125

Arg Ile Ala Thr Val His Leu Leu Ser Ser His Arg Val Ser Gly Met

130 135 140

Ser Gly Ile Ile Ser Gly Gln Ala Arg His Met Val Arg Arg Met Tyr145 150 155 160

Arg Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ala Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Asn

165 170 175

Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Ala

180 185 190

Gln Ser Lys Thr Thr Arg Arg Glu Ala Pro Asp Ala Asp Thr Asp Met

195 200 205

Ser Met Glu Ala Gln Glu Leu Arg His Val Leu Asp Glu Leu Asn Pro

210 215 220

Leu Ile Gly Ala Ala Asn Leu Trp Asp Tyr Leu Pro Ala Leu Arg Trp225 230 235 240

Phe Asp Val Phe Gly Val Lys Arg Lys Ile Val Ala Ala Val Asn Arg245 250 255Arg Asn Ala Phe Met Arg Arg Leu Ile Asp Ala Glu Arg Gln Arg Met 260 265 270 Asp Asn Asn Asp Val Asp Gly Gly Asp Asp Gly Glu Lys Lys Ser Met 275 280 285 Ile Ser Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Gln Pro Glu Val Tyr Thr 290 295 300 Asp Thr Leu Ile Met Thr Leu Cys Ala Pro Leu Phe Gly Ala Gly Thr305 310 315 320Glu Thr Thr Ser Thr Thr Ile Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu Asn 325 330 335 His Pro Glu Ile Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Met Ser Val 340 345 350 Gly Asn Ser Arg Leu Ile Ser Val Val Asp Val His Arg Leu Gly Tyr 355 360 365 Leu Gln Cys Ile Ile Asn Glu Thr Leu Arg Met Tyr Pro Ala Ala Pro 370 375 380 Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Lys Val Gly Gly Tyr385 390 395 400His Ile Pro Ser Gly Ala Met Leu Leu Val Asn Val Ala Ala Ile Gln 405 410 415 Arg Asp Pro Val Ile Trp Lys Glu Pro Ser Glu Phe Lys Pro Glu Arg 420 425 430 Phe Glu Asn Gly Arg Phe Glu Gly Leu Phe Met Ile Pro Phe Gly Met 435 440 445 Gly Arg Arg Arg Cys Pro Gly Glu Met Leu Ala Leu Gln Thr Ile Gly 450 455 460 Leu Val Leu Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp Trp Gly Arg Val Asp465 470 475 480Asp Ala Met Val Asp Met Thr Gln Ser Asn Gly Leu Thr Ser Leu Lys 485 490 495 Val Ile Pro Leu Glu Ala Met Cys Lys Pro Arg Glu Ala Met Cys Asp 500 505 510 Val Leu Arg Lys Phe Met

515

<210> SEQ ID NO: 14<211> Comprimento: 10<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras Informações: Motivo comum a todas as seqüências de Citocromo

P450

<221> Nome/Chave: VARIANTE

<222> Localização: 2, 3, 5, 6, 7, 9

<223> Outras Informações: Xaa = qualquer aminoácido<400> Seqüência: 14

Phe Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly1 5 10

<210> SEQ ID NO: 15<211> Comprimento: 6<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras Informações: Motivo comum a todas as seqüências de Citocromo

P450<221> Nome/Chave: VARIANT

<222> Localização: (1)...(1)

<223> Outras Informações: Xaa = Ala ou Gly

<221> Nome/Chave: VARIANTE<222> Localização: (3)...(3)

<223> Outras Informações: Xaa = qualquer aminoácido

<221> Nome/Chave: VARIANTE

<222> Localização: (4)... (4)

<223> Outras Informações: Xaa = Asp ou Glu

<221> Nome/Chave: VARIANTE

<222> Localização: (6)...(6)

<223> Outras Informações: Xaa = Thr ou Ser

<400> Seqüência: 15Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa1 5

<210> SEQ ID NO: 16<211> Comprimento: 1859<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: seqüência genômica de milho para o gene Nsfl

<221> Nome/Chave: íntron

<222> Localização: ( 946) ... (1238)

<223> Outras Informações: íntron

<400> Seqüência: 16

atggataagg cctacatcgc cgccctctcc gccgccgccc tcttcttgct ccactacctc 60

ctgggccgcc gggccggcgg cgagggcaag gccaaggcca agggctcgcg gcggcggctc 120

ccgccgagcc ctccggcgat cccgttcctg ggccacctcc acctcgtcaa ggccccgttc 180

cacggggcgc tggcccgcct cgcggcgcgc cacggcccgg tgttctccat gcgcctgggg 240

acccggcgcg ccgtggtcgt gtcgtcgccg gactgcgcca gggagtgctt cacggagcac 300

gacgtgaact tcgcgaaccg gccgctgttc ccgtcgatgc ggctggcgtc cttcgacggc 360

gccatgctct ccgtgtccag ctacggcccg tactggcgca acctgcgccg cgtcgccgcc 420

gtgcagctcc tctccgcgca ccgcgtcggg tgcatggccc ccgccatcga agcgcaggtg 480

cgcgccatgg tgcggaggat ggaccgcgcc gccgcggccg gcggcggcgg cgtcgcgcgc 540

gtccagctca agcggcggct gttcgagctc tccctcagcg tgctcatgga gaccatcgcg 600

cacaccaaga cgtcccgcgc cgaggccgac gccgactcgg acatgtcgac cgaggcccac 660

gagttcaagc agatcgtcga cgagctcgtg ccgtacatcg gcacggccaa ccgctgggac 720

tacctgccgg tgctgcgctg gttcgacgtg ttcggcgtga ggaacaagat cctcgacgcc 780

gtgggcagaa gggacgcgtt cctggggcgg ctcatcgacg gggagcggcg gaggctggac 840

gctggcgacg agagcgaaag taagagcatg attgcggtgc tgctcactct gcagaagtcc 900

gagccagagg tctacactga cactgtgatc actgctcttt gcgcggtgag tgcttcttct 960

tctaccatac gtcactctct tatcctcaca aaatacaaaa aaagttgccc gttttctcag 1020

tttagtcgtc aacactccgg actctactat ccgccaaagt ataggattcg ctaaaaattt 1080

aggtgtcttt tttaatacta aaattagata ttgaatttgt tgtgctttat gttgacatag 1140

tctgtaattc tttttccccg aggataaaaa atgttagaca tggatctgga tatttgaacc 1200

atgagaaaga ctgactgcaa ttttgttctg tgataaagaa cctattcggc gccggaacgg 1260

agaccacgtc caccacgacg gaatgggcca tgtcactgct gctgaaccac cgggaggcgc 1320

tcaagaaggc gcaggccgag atcgacgcgg cggtgggcac ctcccgcctg gtgaccgcgg 1380

acgacgtgcc ccacctcacc tacctgcagt gcatcgtcga cgagacgctg cgcctgcacc 1440

cggccgcgcc gctgctgctg ccgcacgagt ccgccgcgga ctgcacggtc ggcggctacg 1500

acgtgccgcg cggcacgatg ctgctggtca acgtgcacgc ggtccacagg gaccccgcgg 1560tgtgggagga cccggacagg ttcgtgccgg agcggttcga gggcgccggc ggcaaggccg 1620aggggcgcct gctgatgccg ttcgggatgg ggcggcgcaa gtgccccggg gagacgctcg 1680

cgctgcggac cgtcgggctg gtgctcgcca cgctgctcca gtgcttcgac tgggacacgg 1740

ttgatggagc tcaggttgac atgaaggcta gcggcgggct gaccatgccc cgggccgtcc 1800

cgttggaggc catgtgcagg ccgcgtacag ctatgcgtgg tgttcttaag aggctctga 1859

<210> SEQ ID NO: 17<211> Comprimento: 1566<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: fase de leitura aberta (ORF) para Nsfl de linhagem

de milho Q66

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1566)

<400> Seqüência: 17

atg gat aag gcc tac ate gcc gcc ctc tcc gcc gcc gcc ctc ttc ttg 48

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu1 5 10 15

ctc cac tac ctc ctg ggc cgg cgg gcc ggc ggc gag ggc aag gcc aagLeu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys20 25 30

96

gcc aag ggc tcg cgg cgg cgg ctc ccg ccg age cct ccg gcg ate ccgAla Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro35 40 45

144

ttc ctg ggc cac ctc cac ctc gtc aag gcc ccg ttc cac ggg gcg ctgPhe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu50 55 60

192

gcc cgc ctc gcg gcg cgc cac ggc ccg gtg ttc tcc atg cgc ctg gggAla Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly65 70 75 80

240

acc cgg cgc gcc gtg gtc gtg tcg tcg ccg gac tgc gcc agg gag tgcThr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys85 90 95

288

ttc acg gag cac gac gtg aac ttc gcg aac cgg ccg ctg ttc ccg tcgPhe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser100 105 110

336

atg cgg ctg gcg tcc ttc gac ggc gcc atg ctc tcc gtg tcc age tacMet Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr115 120 125

384

ggc ccg tac tgg cgc aac ctg cgc cgc gtc gcc gcc gtg cag ctc ctcGly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu130 135 140

432

tcc gcg cac cgc gtc ggg tgc atg gcc ccc gcc ate gaa gcg cag gtgSer Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val145 150 155 160

480

cgc gcc atg gtg cgg agg atg gac cgc gcc gcc gcg gcc ggc ggc ggcArg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly165 170 175

528ggc gtc gcg cgc gtc cag ctc aag cgg cgg ctg ttc gag ctc tcc ctc 576

Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu180 185 190

age gtg ctc atg gag acc ate gcg cac acc aag acg tcc cgc gcc gag 624

Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu

195 200 205

gcc gac gcc aac tcg gac atg tcg acc gag gcc cac gag ttc aag cag 672

Ala Asp Ala Asn Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln210 215 220

ate gtc aac gag ctc gtg ccg tac ate ggc acg gcc aac cgc tgg gac 720

Ile Val Asn Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp225 230 235 240

tac ctg ccg gtg ctg cgc tgg ttc gac gtg ttc ggc gtg agg aac aag 768

Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys245 250 255

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<223> Outras Informações: peptídeo Nsfl de linhagem de milho Q66

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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435 440 445

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500 505 510

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<220> Características:

<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: fase de leitura aberta (ORF) para Nsfl de linhagem

de milho Doce Preto Mexicano (BMS)

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<400> Seqüência: 19

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180 185 190

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tac ctg ccg gtg ctg cgc tgg ttc gac gtg ttc ggc gtg agg aac aag 768

Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys245 250 255

ate ctc gac gcc gtg ggc aga agg gac gcg ttc ctg ggg cgg ctc ate 816

Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile260 265 270

gac ggg gag cgg cgg agg ctg gac gct ggc gac gag age gaa agt aag 864

Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys275 280 285

age atg att gcg gtg ctg ctc act ctg cag aag tcc gag cca gag gtc 912

Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val290 295 300

tac act gac act gtg ate act gct ctt tgc gcg aac cta ttc ggc gcc 960

Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320

gga acg gag acc acg tcc acc acg acg gaa tgg gcc atg tca ctg ctg 1008

Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu325 330 335

ctg aac cac cgg gag gcg ctc aag aag gcg cag gcc gag ate gac gcg 1056

Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala340 345 350

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Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu355 360 365

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<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: peptídeo Nsfl de linhagem de milho BMS

<400> Seqüência: 20

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu1 5 10 15 Leu His Tyr Leu 20 Leu Gly Arg Arg Ala 25 Gly Gly Glu Gly Lys 30 Ala LysAla Lys Gly 35 Ser Arg Arg Arg Leu 40 Pro Pro Ser Pro Pro 45 Ala Ile ProPhe Leu 50 Gly His Leu His Leu 55 Val Lys Ala Pro Phe 60 His Gly Ala LeuAla Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly65 70 75 80Thr Arg Arg Ala Val 85 Val Val Ser Ser Pro 90 Asp Cys Ala Arg Glu 95 CysPhe Thr Glu His 100 Asp Val Asn Phe Ala 105 Asn Arg Pro Leu Phe 110 Pro SerMet Arg Leu 115 Ala Ser Phe Asp Gly 120 Ala Met Leu Ser Val 125 Ser Ser TyrGly Pro 130 Tyr Trp Arg Asn Leu 135 Arg Arg Val Ala Ala 140 Val Gln Leu LeuSer Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val145 150 155 160Arg Ala Met Val Arg 165 Arg Met Asp Arg Ala 170 Ala Ala Ala Gly Gly 175 GlyGly Val Ala Arg 180 Val Gln Leu Lys Arg 185 Arg Leu Phe Glu Leu 190 Ser LeuSer Val Leu 195 Met Glu Thr Ile Ala 200 His Thr Lys Thr Ser 205 Arg Ala GluAla Asp 210 Ala Asp Ser Asp Met 215 Ser Thr Glu Ala His 220 Glu Phe Lys GlnIle Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp225 230 235 240

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245 250 255

Ile Leu Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile

260 265 270

Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys

275 280 285

Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val

290 295 300

Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320

Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu

325 330 335

Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala

340 345 350

Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu

355 360 365

Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala

370 375 380

Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu

450 455 460

Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp465 470 475 480

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485 490 495

Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr

500 505 510

Ala Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu515 520

<210> SEQ ID NO: 21<211> Comprimento: 1566<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: fase de leitura aberta (ORF) para Nsfl de linhagem

de milho F2

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1566)

<400> Seqüência: 21

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1 5 10 15

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Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr115 120 125

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Ile Leu Asp Ala Val Gly Thr Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile260 265 270

gac ggg gag cgg cgg agg ctg gac gct ggc gac gag age gaa agt aag 864

Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys275 280 285age atg att gcg gtg ctg ctc act ctg cag aag tcc gag cca gag gtc 912Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val290 295 300

tac act gac act gtg ate act gct ctt tgc gcg aac cta ttc ggc gccTyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320

gcg

ggc

gac acg gtt gat gga gct cag gtt gac atg aag gct age ggc ggg ctgAsp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu485 490 495

960

gga acg gag acc acg tcc acc acg acg gaa tgg gcc atg tca ctg ctg 1008

Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu325 330 335

ctg aac cac cgg gag gcg ctc aag aag gcg cag gcc gag ate gac gcg 1056

Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala340 345 350

gcg gtg ggc acc tcc cgc ctg gtg acc gcg gac gac gtg ccc cac ctc 1104

Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu

355 360 365

acc tac ctg cag tgc ate gtc gac gag acg ctg cgc ctg cac ccg gcc 1152

Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala

370 375 380

ccg ctg ctg ctg ccg cac gag tcc gcc gcg gac tgc acg gtc ggc 1200Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly385 390 395 400

tac gac gtg ccg cgc ggc acg atg ctg ctg gtc aac gtg cac gcg 1248Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Val His Ala405 410 415

gtc cac agg gac ccc gcg gtg tgg gag gac ccg gac agg ttc gtg ccg 1296

Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro420 425 430

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Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met435 440 445

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Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu

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acc atg ccc cgg gcc gtc ccg ttg gag gcc atg tgc agg ccg cgt aca 1536Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr500 505 510gct atg cgt ggt gtt ctt aag agg ctc tgaAla Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu *515 520

1566

<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 521 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Zea mays <220> Características: <221> Nome/Chave : PEPTÍDEO <222> Localização: (0).. • (0) <223> Outras Informações : peptídeo Nsfl de linhagem de milho F2<400> Seqüência: 22 Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu1 5 10 15 Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Lys Ala Lys 20 25 30 Ala Lys Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro 35 40 45 Phe Leu Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu50 55 60 Ala Arg Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly65 70 75 80Thr Arg Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys 85 90 95 Phe Thr Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser 100 105 110 Met Arg Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr 115 120 125 Gly Pro Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu130 135 140 Ser Ala His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val145 150 155 160Arg Ala Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Val Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu 180 185 190 Ser Val Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu 195 200 205 Ala Asp Ala Asp Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln210 215 220 Ile Val Asp Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Arg Trp Asp225 230 235 240Tyr Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys 245 250 255 Ile Leu Asp Ala Val Gly Thr Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile 260 265 270 Asp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys 275 280 285 Ser Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val290 295 300 Tyr Thr Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Cys Ala Asn Leu Phe Gly Ala305 310 315 320Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu 325 330 335 Leu Asn His Arg Glu Ala Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala

340 345 350Ala Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro His Leu355 360 365

Thr Tyr Leu Gln Cys Ile Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Ala370 375 380

Ala Pro Leu Leu Leu Pro His Glu Ser Ala Ala Asp Cys Thr Val Gly385 390 395 400

Gly Tyr Asp Val Pro Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Val His Ala405 410 415

Val His Arg Asp Pro Ala Val Trp Glu Asp Pro Asp Arg Phe Val Pro420 425 430

Glu Arg Phe Glu Gly Ala Gly Gly Lys Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met435 440 445

Pro Phe Gly Met Gly Arg Arg Lys Cys Pro Gly Glu Thr Leu Ala Leu450 455 460

Arg Thr Val Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu Gln Cys Phe Asp Trp465 470 475 480

Asp Thr Val Asp Gly Ala Gln Val Asp Met Lys Ala Ser Gly Gly Leu485 490 495

Thr Met Pro Arg Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Cys Arg Pro Arg Thr500 505 510

Ala Met Arg Gly Val Leu Lys Arg Leu515 520

<210> SEQ ID NO: 23<211> Comprimento: 1952<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: fase de leitura aberta (ORF) para Nsfl de linhagemde milho GA20 9

<221> Nome/Chave: CDS<222> Localização: (1)...(1017)

<400> Seqüência: 23

atg gat aag gcc tac ate gcc gcc ctc tcc gcc gcc gcc ctc ttc ttg 48Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu15 10 15

ctc cac tac ctc ctg ggc cgg cgg gcc ggc gtc gag ggc aag gcc aag 96Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Val Glu Gly Lys Ala Lys20 25 30

ggc tcg cgg cgg cgg ctc ccg ccg age cct ccg gcg ate ccg ttc ctg 144Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Leu35 40 45

ggc cac ctc cac ctc gtc aag gcc ccg ttc cac ggg gcg ctg gcc cgc 192Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu Ala Arg50 55 60

ctc gcg gcg cgc cac ggc ccg gtg ttc tcc atg cgc ctg ggg acc cgg 240Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly Thr Arg65 70 75 80

cgc gcc gtg gtc gtg tcg tcg ccg gac tgc gcc agg gag tgc ttc acg 288Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr85 90 95gag cac gac gtg aac ttc gcg aac cgg ccg ctg ttc ccg tcg atg cgg 336Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser Met Arg100 105 110

ctg gcg tcc ttc gac ggc gcc atg ctc tcc gtg tcc age tac ggc ccg 384Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr Gly Pro115 120 125

tac tgg cgc aac ctg cgc cgc gtc gcc gcc gtg cag ctc ctc tcc gcg 432Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala130 135 140

cac cgc gtc ggg tgc atg gcc ccc gcc ate gaa gcg cag gtg cgc gcc 480His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val Arg Ala145 150 155 160

atg gtg cgg agg atg gac cgc gcc gcc gcg gcc ggc ggc ggc ggc gtc 528Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Val165 170 175

gcg cgc gtc cag ctc aag cgg cgg ctg ttc gag ctc tcc ctc age gtg 576Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val180 185 190

ctc atg gaa acc ate gcg cac acc aag acg tcc cgc gcc gag gcc gac 624Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu Ala Asp195 200 205

gcc aac tcg gac atg tcg acc gag gcc cac gag ttc aag caa ate gtc 672Ala Asn Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln Ile Val210 215 220

aac gag ctc gtg ccg tac ate ggc acg gcc aac tgc tgg gac tac ctg 720Asn Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Cys Trp Asp Tyr Leu225 230 235 240

ccg gtg ctg cgc tgg ttc gac gtg ttc ggc gtg agg aac aag ate ctc 768Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu245 250 255

gac gcc gtg ggc aga agg gac gcg ttc cta ggg cgg ctc ate gac ggg 816Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile Asp Gly260 265 270

gag cgg cgc agg ctg gac gct ggc gac gag age gaa agt aag age atg 864Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys Ser Met275 280 285

att gcg gtg ctg ctc act ctg cag aag tcc gag cca gag gtc tac act 912Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val Tyr Thr290 295 300

gac act gtg ate act gct ctg tta gea act ctg tcg gct agg gea cga 960Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Leu Ala Thr Leu Ser Ala Arg Ala Arg305 310 315 320

aca aca gtc gct aga gat gta gag aac gct aga ggt gtg gag aac agg 1008Thr Thr Val Ala Arg Asp Val Glu Asn Ala Arg Gly Val Glu Asn Arg325 330 335

aaa ata tga cgtggggaag aagaacaagc cgccagagaa cgcagaacct 1057

Lys Ilegatgtttgtttggtatgccaatttgggctcttctctcgtcacatttttagcacgtccaccgaaggcgcagcgtgccccaccgcgccgctggccgcgcggcggaggacccggcgcctgctggcggaccgtctggagctcagggaggccatg

attttctcgattcttacagtctttgacgctgtccttgtgctccagtctatacgacggaatgccgagatcgctcacctaccctgctgccgcacgatgctgcgacaggttcgatgccgttcggggctggtgcgttgacatgatgcaggccgc

tagccccttcatggaatacacctcggcttctcactcggatttcgtatttggggccatgtcacgcggcggttgcagtgcatacgagtccgctggtcaacgttgccggagcgggatggggcgtcgccacgctaggctagcgggtacagctat

cctcggccaccggcccaatttcgccttagcgagggatgttcgcgaacctaactgctgctggggcacctcccgtcgacgagcgcggactgcgcacgcggtcgttcgagggcgcgcaagtgcgctccagtgccgggctgaccgcgtggtgtt

caatccctatagcagtccagtgctcacatcgacatttttattcggcgccgaaccaccgggcgcctggtgaacgctgcgccacggtcggcgcacagggaccgccggcggcacccggggagattcgactgggatgccccgggcttaagaggc

atatggtttctctatttcgtggctcctttcgtgaaacactgaacggagacaggcgctcaaccgcggacgatgcacccggcgctacgacgtccgcggtgtgaggccgagggcgctcgcgctacacggttgaccgtcccgtttctga

111711771237129713571417147715371597165717171777183718971952

<210> SEQ ID NO: 24<211> Comprimento: 338<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: peptideo Nsfl de : linhagem de milho GA209 <400> Seqüência: : 24 Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu1 5 10 15 Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Val Glu Gly Lys Ala Lys 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Leu 35 40 45 Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Gly Ala Leu Ala Arg 50 55 60 Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly Thr Arg65 70 75 80Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr 85 90 95 Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser Met Arg 100 105 110 Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr Gly Pro 115 120 125 Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala 130 135 140 His Arg Val Gly Cys Met Ala Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val Arg Ala145 150 155 160Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Val 165 170 175 Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val 180 185 190 Leu Met Glu Thr Ile Ala His Thr Lys Thr Ser Arg Ala Glu Ala Asp 195 200 205 Ala Asn Ser Asp Met Ser Thr Glu Ala His Glu Phe Lys Gln Ile Val 210 215 220 Asn Glu Leu Val Pro Tyr Ile Gly Thr Ala Asn Cys Trp Asp Tyr Leu225 230 235 240Pro Val Leu Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu 245 250 255 Asp Ala Val Gly Arg Arg Asp Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ile Asp Gly 260 265 270 Glu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Gly Asp Glu Ser Glu Ser Lys Ser Met275 280 285

Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Glu Pro Glu Val Tyr Thr

290 295 300

Asp Thr Val Ile Thr Ala Leu Leu Ala Thr Leu Ser Ala Arg Ala Arg305 310 315 320

Thr Thr Val Ala Arg Asp Val Glu Asn Ala Arg Gly Val Glu Asn Arg325 330 335

Lys Ile

<210> SEQ ID NO: 25<211> Comprimento: 1932<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: outra função (misc_feature)<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: fase de leitura aberta (ORF) para Nsfl de linhagem

de milho W703A

<221> Nome/Chave: CDS

<222> Localização: (1)...(843)

<400> Seqüência: 25

atg gat aag gcc tac ate gcc gcc ctc tcc gcc gcc gcc ctc ttc ttg 48

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu15 10 15

ctc cac tac ctc ctg ggc cgg cgg gcc ggc gtc gag ggc aag gcc aagLeu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Val Glu Gly Lys Ala Lys20 25 30

96

age tcg cgg cgg cgg ctc ccg ccg age cct ccg gcg ate ccg ttc ctgSer Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Leu35 40 45

144

ggc cac ctc cac ctc gtc aag gcc ccg ttc cac gcg gcg ctg gcc cgcGly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Ala Ala Leu Ala Arg50 55 60

192

ctc gcg gcg cgc cac ggc ccg gtg ttc tcc atg cgc ctg ggg acc cgcLeu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly Thr Arg65 70 75 80

240

cgc gcc gtg gtc gtg tcg tcg ccg gac tgc gcc agg gag tgc ttc acgArg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr85 90 95

288

gag cac gac gtg aac ttc gcg aac cgg ccg ctg ttc ccg tcg atg cggGlu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser Met Arg100 105 110

336

ctg gcg tcc ttc gac ggc gcc atg ctc tcc gtg tcc age tac ggc ccgLeu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr Gly Pro115 120 125

384

tac tgg cgc aac ctg cgc cgc gtc gcc gcc gtg cag ctc ctc tcc gcgTyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala130 135 140

432

cac cgc gtc gcg tgc atg gtc ccc gcc ate gaa gcg cag gtg cgc gcc

480His Arg Val Ala Cys Met Val Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val Arg Ala145 150 155 160

atg gtg cgg agg atg gac cgc gcc gcc gcg gcc ggc ggc gcg cgt cgc 528Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Arg165 170 175

gcg cgt cca gct caa gcg gcg gct gtt cga gct ctc cct cag cgt gct 576Ala Arg Pro Ala Gln Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Gln Arg Ala180 185 190

cat gga aac cat cgc gca cac caa gac gtc ccg cgc caa ctc gaa yat 624His Gly Asn His Arg Ala His Gln Asp Val Pro Arg Gln Leu Glu Xaa195 200 205

gtc gac cga ggc cca cga gtt caa gca rrt cgt caa cga gct cgt gcc 672Val Asp Arg Gly Pro Arg Val Gln Ala Xaa Arg Gln Arg Ala Arg Ala210 215 220

gta cat cgg cgc ggc caa ccg ctg gga cta cct gcc ggt gct gcg ctg 720Val His Arg Arg Gly Gln Pro Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ala Leu225 230 235 240

gtt cga cgt gtt cgg cgt gag gaa caa gat cct cga cgc cgt ggg cag 7 68Val Arg Arg Val Arg Arg Glu Glu Gln Asp Pro Arg Arg Arg Gly Gln245 250 255

aag gga cgc gtt cct gag gcg gct cat cga cgg gga gcg gcg gag gctLys Gly Arg Val Pro Glu Ala Ala His Arg Arg Gly Ala Ala Glu Ala260 265 270

816

gga cgc tgg cga cga cag cga aag taa gagcatgatt gcggtgctgc 863

Gly Arg Trp Arg Arg Gln Arg Lys 275 280

tcactctgca gaagtccgag ccagaggtct acactgacac tgtgatcact gctctgttag 923

caactctgtc ggctagrgca cgaacaacag tcgctagaga tgtagagaac gctagaggtg 983

tggagaacag gaaaatatga cgtggggaag aagaacaagc cgccagagaa cgcagaacct 1043

gatgtttgtt attttctcga tagccccttc cctcggccac caatccctat atatggtttc 1103

tggtatgcca ttcwtacagt atggaataca cggccyaatt agcagtccag tctatttcgt 1163

atttgggctc ctttgacgct cctcggcttc tcgccttagc tgctcacatc ggctcctttc 1223

ttctctcgtc gtccttgtgc tcactcggat gagggatgtt gacattttta gtgaaacatt 1283

acatttttag tccagtctat ttcgtatttg cgcgaaccta ttcggcgccg gaacggagac 1343

cacgtccacc acgacggaat gggccatgtc gctgctgctg aaccaccggg aggcgctcaa 1403

gaaggcgcag gccgagatcg acgcggcggt gggcacctcc cgcctggtga ccgcggacga 1463

cgtgccccac ctcacctacc tgcagtgcat cgtcgacgag acgctgcgcc tgcaccccgc 1523

cgcgccgctg ctgctgccgc acgagtccgc cgcggactgc acggtcggcg gctacgacgt 1583

gccgcgcggc acgatgctgc tggtcaacgt gcacgcggtc cacagggacc ccgcggtgtg 1643

ggacgacccg gacaggttcg tgccggagcg gttcgagggc ggcaaggccg aggggcgcct 1703

gctgatgccg ttcgggatgg ggcggcgcaa gtgccccggg gagacgctcg cgctgcggac 17 63

cgtcgggctg gtgctcggca cgctgctcca gtgcttcgac tgggacacgg ttgatggagc 1823

tcaggttgac atgaaggcta gcggcgggct gaccatgccc cgggccgtcc cgttggaggc 1883

catgtgcagg ccgcgtacag ctatgcgtga tgttcttaag aggctctga 1932

<210> SEQ ID NO: 26<211> Comprimento: 280<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/Chave: PEPTÍDEO

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras Informações: peptídeo Nsfl de linhagem de milho W703A<221> Nome/Chave: VARIANTE<222> Localização: 208, 218

<223> Outras Informações: Xaa = qualquer aminoácido<400> Seqüência: 26

Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Leu Phe Leu1 5 10 15 Leu His Tyr Leu Leu Gly Arg Arg Ala Gly Val Glu Gly Lys Ala Lys 20 25 30 Ser Ser Arg Arg Arg Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Leu 35 40 45 Gly His Leu His Leu Val Lys Ala Pro Phe His Ala Ala Leu Ala Arg 50 55 60 Leu Ala Ala Arg His Gly Pro Val Phe Ser Met Arg Leu Gly Thr Arg65 70 75 80Arg Ala Val Val Val Ser Ser Pro Asp Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr 85 90 95 Glu His Asp Val Asn Phe Ala Asn Arg Pro Leu Phe Pro Ser Met Arg 100 105 110 Leu Ala Ser Phe Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ser Ser Tyr Gly Pro 115 120 125 Tyr Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala 130 135 140 His Arg Val Ala Cys Met Val Pro Ala Ile Glu Ala Gln Val Arg Ala145 150 155 160Met Val Arg Arg Met Asp Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Arg 165 170 175 Ala Arg Pro Ala Gln Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Gln Arg Ala 180 185 190 His Gly Asn His Arg Ala His Gln Asp Val Pro Arg Gln Leu Glu Xaa 195 200 205 Val Asp Arg Gly Pro Arg Val Gln Ala Xaa Arg Gln Arg Ala Arg Ala 210 215 220 Val His Arg Arg Gly Gln Pro Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ala Leu225 230 235 240Val Arg Arg Val Arg Arg Glu Glu Gln Asp Pro Arg Arg Arg Gly Gln 245 250 255 Lys Gly Arg Val Pro Glu Ala Ala His Arg Arg Gly Ala Ala Glu Ala 260 265 270 Gly Arg Trp Arg Arg Gln Arg Lys 275 280

Claims (42)

1. Polinucleotideo isolado caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) seqüência de nucleotideos codificando umpolipeptideo capaz de conferir resistência apelo menos um herbicida, em que o herbicidacitado é um membro de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese depigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintéticaem que o polipeptideo possui uma seqüência deaminoácidos de pelo menos 85% de j identidade,quando comparado com a SEQ ID NO: 1 baseado noalgoritmo de alinhamento Needleman-Wunsch, ou(b) complemento da seqüência de nucleotideos, em queo complemento e a seqüência de nucleotideosconsistem no mesmo número de nucleotideos e são 100% complementares.

2. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é capaz deconferir resistência a pelo menos dois herbicidas, em quecada herbicida é um membro de uma classe diferente deherbicidas selecionadas do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.

3. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é capaz deconferir resistência a pelo menos três herbicidas, em quecada herbicida é um membro de uma classe diferente deherbicidas selecionadas do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.

4. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é capaz deconferir resistência a pelo menos quatro herbicidas, em quecada herbicida é um membro de uma classe diferente deherbicidas selecionadas do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.

5. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é capaz deconferir resistência a pelo menos cinco herbicidas, em quecada herbicida é um membro de uma classe diferente deherbicidas selecionadas do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.

6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidosdo polipeptídeo e a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 possuem pelo menos 90% de identidade baseada no algoritmode alinhamento Needleman-Wunsch.

7. Polinucleotideo de acordo com a reivindicação I7caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidosdo polipeptideo e a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 possuem pelo menos 95% de identidade baseada no algoritmode alinhamento Needleman-Wunsch.

8. Polinucleotideo de acordo com a reivindicação I7caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotideoscompreende a SEQ ID NO: 1.

9. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende10 polinucleotideo de acordo com a reivindicação 1.

10. Construção de DNA recombinante caracterizada pelo fatode que compreende polinucleotideo de acordo com areivindicação 1 operacionalmente ligado a pelo menos umaseqüência reguladora.

11. Método para transformar uma célula caracterizado pelofato de que compreende transformar uma célula compolinucleotideo de acordo com a reivindicação 1.

12. Célula de planta caracterizada pelo fato de quecompreende construção de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10.

13. Método para produzir uma planta caracterizado pelofato de que compreende transformar uma célula de planta coma construção de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10 e regenerar uma planta a partir da célulade planta transformada.

14. Planta caracterizada pelo fato de que compreendeconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10.

15. Semente caracterizada pelo fato de que compreendeconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10.

16. Planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a planta citada é uma monocotiledônea.

17. Planta de acordo com a reivindicação 16, caracterizadapelo fato de que a monocotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em milho, trigo, cevada, aveia,graminea, sorgo e arroz.

18. Planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a planta citada é uma dicotiledônea.

19. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de que a dicotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em soja, canola, batata, algodão egirassol.

20. Planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a planta citada compreende adicionalmenteum segundo gene de resistência a herbicida.

21. Planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a planta citada compreende adicionalmenteum gene que codifique um polipeptideo com atividade deglifosato N-acetiltransferase.

22. Planta de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que a planta citada compreende adicionalmenteum segundo gene de resistência a herbicida que codifique umpolipeptideo conferindo tolerância a inibidores de ALS.

23. Planta de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a planta citada compreende adicionalmenteum gene que codifique um polipeptideo inseticida.

24. Planta com tolerância aprimorada a pelo menos umherbicida caracterizada pelo fato de que compreende a construção de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10, em que a planta citada compreendeadicionalmente um segundo gene de resistência a herbicidaproporcionando um nivel de tolerância a herbicidaselecionado de uma classe de herbicidas selecionada dogrupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.em que a construção recombinante de acordo com areivindicação 10 confere à planta um nível de tolerância aoherbicida maior que o nível de tolerância mostrado por umaplanta compreendendo o segundo gene de resistência aherbicida mas não compreendendo a construção recombinantede acordo com a reivindicação 10.

25. Método para conferir ou aprimorar a resistência a pelomenos um herbicida caracterizado pelo fato de que oherbicida citado é selecionado de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.compreendendo transformar uma planta com a construção deDNA recombinante de acordo com a reivindicação 10,conferindo ou aprimorando assim a resistência a pelo menosum herbicida.

26. Método para conferir ou aprimorar a resistência a pelomenos dois herbicidas caracterizado pelo fato de que cadaherbicida é selecionado de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.compreendendo transformar uma planta com a construção deDNA recombinante de acordo com a reivindicação 10,conferindo ou aprimorando assim a resistência a pelo menosdois herbicidas.

27. Método para conferir ou aprimorar a resistência a pelomenos três herbicidas caracterizado pelo fato de que cadaherbicida é selecionado de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.compreendendo transformar uma planta com a construção deDNA recombinante de acordo com a reivindicação 10,conferindo ou aprimorando assim a resistência a pelo menostrês herbicidas.

28. Método para conferir ou aprimorar a resistência a pelomenos quatro herbicidas caracterizado pelo fato de que cadaherbicida é selecionado de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de síntese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.compreendendo transformar uma planta com a construção deDNA recombinante de acordo com a reivindicação 10,conferindo ou aprimorando assim a resistência a pelo menosquatro herbicidas.

29. Método para conferir ou aprimorar a resistência a pelomenos cinco herbicidas caracterizado pelo fato de que cadaherbicida é selecionado de uma classe de herbicidasselecionada do grupo que consiste em:(a) classe de inibidores de ALS;(b) classe de inibidores de sintese de pigmento;(c) classe de inibidores de PPO;(d) classe de inibidores de PS II; e(e) classe de auxina sintética.compreendendo transformar uma planta com a construção deDNA recombinante de acordo com a reivindicação 10,conferindo ou aprimorando assim a resistência a pelo menoscinco herbicidas.

30. Método para alterar o nivel de expressão de umaproteína capaz de conferir resistência a pelo menos umherbicida em uma célula de planta caracterizado pelo fatode que compreende:(a) transformar uma célula de planta com aconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10; e(b) cultivar a célula de planta transformada sobcondições que sejam adequadas para a expressãoda construção de DNA recombinante em que aexpressão da construção de DNA recombinanteresulta na produção de níveis alterados de umaproteína capaz de conferir resistência a pelomenos um herbicida na hospedeira transformada;em que o pelo menos um herbicida é selecionado de umaclasse de herbicidas selecionada do grupo que consiste em:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese de pigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintética.

31. Método para alterar o nível de expressão de umaproteína capaz de conferir resistência a pelo menos doisherbicidas em uma célula de planta caracterizado pelo fatode que compreende:(a) transformar uma célula de planta com aconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10; e(b) cultivar a célula de planta transformada sobcondições que sejam adequadas para a expressãoda construção de DNA recombinante em que aexpressão da construção de DNA recombinanteresulta na produção de níveis alterados de umaproteína capaz de conferir resistência a pelomenos dois herbicidas na hospedeiratransformada;em que cada dos pelo menos dois herbicidas é selecionado deuma classe de herbicidas selecionada do grupo que consisteem:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese de pigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintética.

32. Método para alterar o nível de expressão de umaproteína capaz de conferir resistência a pelo menos trêsherbicidas em uma célula de planta caracterizado pelo fatode que compreende:(a) transformar uma célula de planta com aconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10; e(b) cultivar a célula de planta transformada sobcondições que sejam adequadas para a expressãoda construção de DNA recombinante em que aexpressão da construção de DNA recombinanteresulta na produção de níveis alterados de umaproteína capaz de conferir resistência a pelomenos três herbicidas na hospedeiratransformada;em que cada dos pelo menos três herbicidas é selecionado deuma classe de herbicidas selecionada do grupo que consisteem:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese de pigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintética.

33. Método para alterar o nível de expressão de umaproteína capaz de conferir resistência a pelo menos quatroherbicidas em uma célula de planta caracterizado pelo fatode que compreende:(a) transformar uma célula de planta com aconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10; e(b) cultivar a célula de planta transformada sobcondições que sejam adequadas para a expressãoda construção de DNA recombinante em que aexpressão da construção de DNA recombinanteresulta na produção de níveis alterados de umaproteína capaz de conferir resistência a pelomenos quatro herbicidas na hospedeiratransformada;em que cada dos pelo menos quatro herbicidas é selecionadode uma classe de herbicidas selecionada do grupo queconsiste em:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese de pigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintética.

34. Método para alterar o nível de expressão de umaproteína capaz de conferir resistência a pelo menos cincoherbicidas em uma célula de planta caracterizado pelo fatode que compreende:(a) transformar uma célula de planta com aconstrução de DNA recombinante de acordo com areivindicação 10; e(b) cultivar a célula de planta transformada sobcondições que sejam adequadas para a expressãoda construção de DNA recombinante em que aexpressão da construção de DNA recombinanteresulta na produção de níveis alterados de umaproteína capaz de conferir resistência a pelomenos cinco herbicidas na hospedeiratransformada;em que cada dos pelo menos cinco herbicidas é selecionadode uma classe de herbicidas selecionada do grupo queconsiste em:(i) classe de inibidores de ALS;(ii) classe de inibidores de síntese de pigmento;(iii) classe de inibidores de PPO;(iv) classe de inibidores de PS II; e(v) classe de auxina sintética.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o herbicida éselecionado da classe de herbicidas de inibidores de ALS eé selecionado do grupo que consiste em:(a) nicosulfuron;(b) rimsulfuron;(c) primisulfuron;(d) imazetapir;(e) clorsulfuron;(f) clorimuron etil;(g) triasulfuron;(h) flumetsulam; e(i) imazaquin.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o herbicida éselecionado da classe de herbicidas de inibidores desíntese de pigmento e é selecionado do grupo que consisteem:(a) isoxaflutol;(b) topramezona;(c) sulcatriona; e(d) tembotriona.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o herbicida éselecionado da classe de herbicidas de inibidores de PPO eé selecionado do grupo que consiste em:(a) acifluofen;(b) flumioxan; e(c) sulfentrazona.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o herbicida éselecionado da classe de herbicidas de inibidores de PS IIe é selecionado do grupo que consiste em:(a) diuron;(b) linuron;(c) bentazon; e(d) clorotoluron.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o herbicida édicamba.

40. Método para determinar a presença de polinucleotideode acordo com a reivindicação 1 em uma planta caracterizadopelo fato de que compreende pelo menos um de:(a) isolar moléculas de ácido nucléico da plantacitada e determinar se um gene Nsfl estápresente por tentativa de amplificar seqüênciashomólogas ao polinucleotideo de acordo com areivindicação 1, ou(b) isolar moléculas de ácido nucléico da plantacitada e executar uma hibridização Southern ounorthern, ou(c) isolar proteínas da planta citada e executar umwestern blot utilizando anticorpos contraproteína NSF1, ou(d) isolar proteínas da planta citada e executar umensaio ELISA utilizando anticorpos contraproteína NSF1, determinando assim a presença dopolinucleotideo de acordo com a reivindicação 1na planta citada.

41. Método para determinar a presença do locus Nsfl em umaplanta caracterizado pelo fato de que compreende pelo menosum de:(a) isolar moléculas de ácido nucléico da plantacitada e determinar se um gene Nsfl estápresente por tentativa de amplificar seqüênciashomólogas ao polinucleotideo de acordo com areivindicação 1, ou(b) isolar moléculas de ácido nucléico da plantacitada e executar uma hibridização Southern ounorthern, ou(c) isolar proteínas da planta citada e executar umwestern blot utilizando anticorpos contraproteína NSF1, ou(d) isolar proteínas da planta citada e executar umensaio ELISA utilizando anticorpos contraproteína NSF1, determinando assim a presença dolocus Nsfl na planta citada.

42. Planta de soja caracterizada pelo fato de quecompreende polinucleotideo de acordo com a reivindicação 1,em que a planta de soja citada também mostra resistência anematódeo de cisto da soja, em que o polinucleotideo citadofoi incorporado através de técnicas de transformação oucruzamento de plantas e em que a planta de soja citada foigerada do germoplasma selecionado do grupo que consiste em:(a) Peking;(b) ΡΙ8 8788;(c) PI8 97 72;(d) PI90763;(e) PI209332;(f) PI40418 9A;(g) PI437654;(h) PI4 38 4 8 9B;(i) PI467312;(j) PI468916;(k) Hartwig;(1) J87-233; e(m) progênie derivada das origens (a) até (1)