CN101316607A - 两亲聚合物-pdgf复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子(PDGF)的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物理和化学稳定性。本发明还涉及制备PDGF－两亲聚合物复合物的方法，其特征在于在含水介质中和在不存在可能导致蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备这种聚合物/PDGF－BB复合物并涉及所述两亲聚合物－PDGF复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。

Description

两亲聚合物-PDGF复合物
技术领域
本发明涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子(PDGF)的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物理和化学稳定性。
背景技术
PDGF类是通过经由两个二硫化物桥彼此连接的两个多肽链构成的大约30000道尔顿的糖蛋白类。已经识别出四种类型的链：A、B、C和D。天然蛋白质以同二聚体或AB型异二聚体的形式存在(OefnerC.EMBO J.11，3921-2926，1992)。
PDGF最初分离自血小板。PDGF类是在血液凝结过程中释放出来的能够促进各种细胞类型的生长的生长因子(Ross R等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，1207；Kohler N.& Lipton A.，Exp.Cell Res.，1974，87，297)。已知的是，血小板以外的某些细胞也会产生PDGF，其对于多数源自间叶细胞的细胞即血液、肌肉、骨骼和软骨细胞以及结缔组织细胞来说是促有丝分裂的(Raines E.W.，“Biology of Platelet-Derivated Growth Factor(血小板源生长因子生物学)”，1993，Westermark，B.和C.Sorg，Ed.Basel，Kerger，第74页)。许多文章往往也证实，巨噬细胞源PDGF对于平滑肌细胞起到趋化和促有丝分裂剂的作用并且其有助于动脉硬化特有的动脉壁的肌内膜增厚(Ross R等人，Science(科学)，1990，248，1009)。PDGF的活性此外还特别包括刺激嗜中性单核细胞的微粒释放(TzengD.Y等人，Blood(血液)，1985，66，179)，促进间质细胞的类固醇合成(Risbridger G.P.，Mol.Cell，Endocrinol.，1993，97，125)，刺激嗜中性吞噬作用(Wilson E等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84，2213)，调节凝血栓蛋白表达和分泌(Majak R.A等人，J.Biol.Chem.，1987，262，8821)，以及血管平滑肌细胞中ICAM-1基因的后调节(Morisaki N等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1994，200，612)。
由于这些不同性质，已经设想了重组PDGF类在制药领域中的应用。PDGF已经特别被批准用于糖尿病足部溃疡的治疗(Regranex，J&J)和用于牙周修补(GEM 21S，Biomimetic)。
溃疡愈合，就像一般来说的皮肤愈合一样，是一种复杂的现象，其要求许多细胞类型随时间和在空间上的协调干预，这可以概括为三个阶段：发炎阶段、增殖阶段和重塑阶段。
在对正常愈合而言大约7天的发炎阶段中，巨噬细胞杀死细菌，清除受损组织并使组织再生。为此，巨噬细胞分泌出胶原酶、细胞因子和生长因子。
在对正常愈合而言从第3天到第三周的增殖阶段的过程中，相继发生三个事件。伤口被肉芽组织填充，血管生成且伤口被上皮细胞覆盖。肉芽组织从边缘向中心生长。成纤维细胞大量产生III型胶原。
在从第3周到1甚至2年的重塑过程中，肉芽组织成熟，且成纤维细胞产生较少胶原。通过细胞凋亡消除肉芽形成过程中形成的没用的血管。III型胶原被I型胶原替代，其依照张力线组织和交联。
在此过程中，PDGF起到基本作用。在伤口形成过程中，血小板聚集并释放PDGF。PDGF将嗜中性白细胞、巨噬细胞和成纤维细胞引向伤口并且是有力的促细胞分裂剂。巨噬细胞和内皮细胞又合成和分泌PDGF。PDGF刺激成纤维细胞产生新的细胞外基质，基本是非胶原化合物，例如葡胺聚糖和粘着蛋白(J.F.Norton等人，Essentialpractice of surgery(外科基本实践)，Springer，2003，第7章，77-89)。
慢性伤口例如糖尿病足部溃疡、静脉溃疡和压疮具有愈合非常缓慢且有时不完全的特性，这是因为愈合过程不是正常进行(R.Lobmann等人，J.of Diabetes and its complications(糖尿病及其并发症杂志)，2006，20，329-335)。
愈合过程实际上是消除对组织的损伤所必须的破坏过程与引起新组织形成的修复过程之间的精妙平衡。蛋白酶和生长因子在此过程中通过调节此平衡来发挥基本作用。在慢性伤口的情况下，这种平衡向着有利于破坏的方向被扰乱，因此这些伤口的愈合缓慢。尽管存在不同类型的慢性伤口，但是在它们以持续发炎阶段(这造成高的蛋白酶含量并因此降低生长因子活性)为特征的意义上，它们在生物化学上相对类似(G.Lauer等人，J.Invest.Dermatol.115(2000)12-18)。这种生长因子的劣化造成与这些慢性伤口有关的组织的整体损失，这不利于愈合(D.R.Yager等人，J.Invest.Dermatol.107(1996)743-748)。
目前在市场上存在与国际非有产权名称“becaplermin(贝卡普勒明)”对应的，以商品名
Figure A20068004423300081
出售的人重组PDGF-BB-基药品。这种药品用于糖尿病的下肢溃疡的治疗。其是局部施用的凝胶形式并且能够促进溃疡愈合。其就像内源PDGF一样特别能够促进细胞增殖并因此促进新组织的形成。
这种治疗的效力有限(Cullen等人，The international journalof biochemistry & Cell Biology(国际生物化学与细胞生物学杂志)34，1544-1556，2002)，即使临床研究已经显示了在愈合和愈合所需的时间周期方面的改进(Greenhalgh等人，American Journal ofpathology(美国病理学杂志)，136，1235-1246 1990；Ladin Plasticand Reconstructive Surgery(Ladin整形和重建外科学)，105，1230-1231 2000；Holloway等人，Wounds，5/4，198-206；Mandracchia等人，Clinics in Podiatric Medecine and Surgery(足病医学和外科学临床)，18，189-209 2001；Wieman T.J.AmericanJournal of Surgery(美国外科学杂志)，176，74S-79S 1998)。
J&J出售的含有PDGF-BB的Regranex产品已经通过将治疗的患者的康复率提高至50％而证实了其效力，与之相比，仅接受标准伤口治疗的患者的康复率仅为36％。尽管在糖尿病足部溃疡的治疗中具有这种显著改进，但必须指出，只有50％患者在长期和昂贵的治疗后实现康复。在未康复的情况下，后果可能极其严重，在许多情况下则导致下肢切除。应该补充的是，该治疗的平均持续时间非常长，大约20周，且其施用昂贵并有限制，这是因为必须清洁伤口并在早晨施用Regranex，然后在12小时后清洁伤口。这两个程序大多需要护士的护理。此外，持续20周的平均治疗成本过高(大约1400美元)。
可以通过PDGF在要治疗的伤口上的迅速降解来解释这种部分效力。这种降解在慢性伤口的情况下来自持续的发炎状态，这由于刺激蛋白酶的过度生产而在伤口上产生对PDGF不利的环境。
尽管降解控制对于伤口愈合是必须的，但过度的蛋白水解活性是有害的，因为其造成细胞外基质的降解(F.Grinnell等人，J.Invest.Dermatol.106(1996)335-341和C.N.Rao等人，J.Invest.Dermatol.105(1995)572-578)和具有关键功能性作用的分子如生长因子的降解(V.Falanga等人，J.Derm.Surg.Onc.18(1992)604-606；D.R.Yager等人，Wound Rep，Reg.5(1997)23-32.和M.Wlaschek等人，Br.J.Dermatol.137(1997)646-647)。实际上，生长因子如PDGF、TGFβ或bFGF由于它们诱发细胞迁移、增殖、蛋白质合成和基质形成的能力，并且更一般地由于它们控制修复过程的事实而成为愈合过程中的关键因素。但是，这些生长因子是蛋白质分子并因此对蛋白水解降解敏感。一些研究表明，在它们与来自慢性伤口的流体接触时，如PDGF这样的生长因子的降解快得多，这是因为它们含有高浓度的金属蛋白酶(D.R.Yager等人，J.Invest.Dermatol.107(1996)743-748)。
对于静脉溃疡的治疗，在出版物(T.J.Wieman，Wounds，2003，卷15，No.8，257-264)中报道的试验性临床研究中，与基于用加压疗法常规清洁伤口的现有治疗相比，Regranex仅表现出轻微改进。
在蛋白质生成过程中体现出例如PDGF的不稳定性的问题。已知的是，PDGF对转译后的蛋白水解特别敏感(Hart等人，Biochemistry(生物化学)29：166-172，1990和美国专利序列号07/557,219)，尤其是在蛋白质的成熟链的位置32处的精氨酸氨基酸与位置33处的苏氨酸氨基酸之间的结合程度上。其它位置对蛋白水解敏感，例如PDGF的B链的位置79处的精氨酸与位置80处的赖氨酸之间的结合，或位置27处的精氨酸与位置28处的精氨酸之间的结合。
这种蛋白水解不稳定性在获得这种蛋白质方面具有严重问题，其根据美国专利No.4,845,075中所述的方法在酵母中以重组方式制成。具体而言，美国专利No.7,084,262教导我们，PDGF-BB的分析和提纯导致由转译后内切蛋白酶解裂解产生21种异型。这种极大的结构异质性因此导致基因工程产生的蛋白质活性与成熟形式的完整蛋白质相比降低50％。
此外，根据日期为2006年8月14日的关于在14周后尚未康复的糖尿病足部溃疡的新闻公报(www.prnewswire.com)，Cardium最近的临床结果表明使用PDGF-BB的治疗可以提供的潜力。Cardium提出的解决方案在于在伤口细胞中引入表达PDGF-BB的基因以使其局部过度表达。借助腺病毒载体的这种基因疗法在15位患者组中能够使耐受普通治疗的这些糖尿病足部溃疡愈合接近80％。这种治疗方案是有前途的。但是，由于与腺病毒型病毒载体的使用有关的安全性，基因疗法的制药发展迄今仍然非常危险。
因此需要改进和有可能改进使用PDGF的糖尿病足部溃疡的现有治疗。
在糖尿病足部溃疡治疗的情况下，最终目的是三重的：
-加速康复
-提高康复率
-简化治疗程序。
也存在静脉溃疡和压疮的情况，它们会造成相当大的疼痛和非常严重的医疗并发症。
因此，要解决的问题基本上是保护慢性伤口上的PDGF。
已经提出各种解决方案。
美国专利5,905,142描述了通过产生对蛋白水解侵袭具有更高抗性的蛋白质突变体，通过取代或通过删除一个或多个接近潜在裂解位点的赖氨酸或精氨酸氨基酸来减轻与PDGF有关的这些蛋白水解问题。制造更耐受蛋白酶的蛋白质的这种策略并不令人满意。PDGF的这种基因改性会导致生物活性的改变，产生不同的与其各种受体的亲合力，这也可能引发毒理学问题。此外，PDGF的这种改性要求新的药物开发，这是极其昂贵和冒险的。
在1970年代，大量研究了这种蛋白质，据发现，提纯极其棘手，因为PDGF由于其阳离子和疏水性质而是“非常粘的蛋白质”(Heldin，C.H.EMBO J.11：4251-4259，1992；Raines和Ross，J.Biol.Chem.257(9)：5154-5160，1982；Antoniades，PNAS 78：7314，1981；Deuel等人，J.Biol.Chem.256：8896，1981)。PDGF实际上是高度阳离子性的蛋白质，其等电点为9.8至10.5。其它作者证实了这一性状，例如Wei等人(Journal of controlled release(受控释放杂志)112：103-110，2006)，其解释了PDGF容易吸附到容器表面上，其在该容器中处于溶解状态。该作者通过在该混合物中加入0.1％BSA或0.1％BSA/Tween20混合物来解决该问题。这些解决方案在很大程度上解决了该问题，因为多达95％的蛋白质被发现处于溶解状态。但是，考虑到BSA的动物来源和与牛绵状脑病相关的风险，从制药角度看，这些解决方案并不令人满意。
相同的作者提出的另一解决方案在于加入更有力的阴离子表面活性剂(SDS)，其能够使PDGF保持溶解。遗憾地，SDS也引发蛋白质的部分变性，造成生物活性的损失。这种解决方案因此对于蛋白质的稳定化并不令人满意。
在专利WO93/08825中，发明人已经证实，纯化的PDGF在以局部施用的凝胶形式配制时具有极大的不稳定性。作为例子，他们举出PDGF与某些传统用于配制药品的产品如甲基纤维素或羟丙基纤维素以及某些传统防腐剂如苄基醇的不相容性。作者通过解释需要在具有良好长期稳定性的同时配制局部施用的凝胶形式PDGF来提出此问题。相同的作者表示，溶解的PDGF由于在中性pH值下的脱酰胺作用而降解且蛋白质在微酸性pH值下更稳定。该作者表示，通过结合几种参数-没有与蛋白质表现出任何相互作用的聚合物、能够限制脱酰胺反应的在微酸性pH值下的缓冲剂和对于蛋白质为中性的防腐剂，从而可以配制PDGF以获得从制药角度来看稳定的制剂。
该作者表示，通过加入没有与蛋白质表现出任何相互作用的聚合物可以获得储存稳定的制剂，只要该制剂保持在微酸性pH值下以避免通过脱酰胺作用使蛋白质降解的反应。但是，这一解决方案并不令人满意，因为其不能保护生长因子避免在生理pH值下的体内蛋白水解降解。
在专利WO 97/12601中描述了凝胶形式的PDGF制剂，作者解释到，他们使用的纤维素衍生物能够使生长因子稳定化以避免储存过程中可能的活性损失。为此，他们使用之前在美国专利4,717,717中对EGF获得的结果作为基础。但是，他们还解释到，通过在制剂中加入带电化学物质如带电氨基酸或金属离子，可以极大改进含有PDGF的纤维素凝胶的稳定性。在此，该解决方案能够使制剂中的生长因子在产品储存过程中稳定化，但不能使这些生长因子在生理pH值下对慢性伤口中存在的蛋白酶稳定化。
因此在稳定化和保护生长因子(特别是PDGF)方面存在治疗优点，从而提高其在慢性伤口治疗，更特别是糖尿病足部溃疡伤口治疗中的效力。本发明因此涉及通过开发出两亲聚合物与PDGF之间的复合物，从而在体外和体内在生理pH值下可能发生的化学或物理降解方面使PDGF稳定化。
发明内容
本发明因此涉及两亲聚合物与PDGF之间的复合物(两亲聚合物-PDGF)的形成，这种复合物为蛋白质提供了对于在体外和体内在生理pH值下在降解方面的化学和物理稳定性。
本发明因此涉及水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于：
-该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成：
Figure A20068004423300131
DP＝m个单体单元
·R、R’是键或包含1至18个碳的链，任选地支化和/或不饱和，包含一个或多个杂原子，例如O、N和/或S，
R和R’彼此相同或不同
·F、F’是酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、胺、
F和F’彼此相同或不同
·X是亲水基团，其可以是：
о羧酸根
о硫酸根
о磺酸根
о磷酸根
о膦酸根
·Y是亲水基团，其可以是：
о硫酸根
о磺酸根
о磷酸根
о膦酸根
·Hy是疏水基团，其可以是：
оC8至C30直链或支化烷基，任选不饱和和/或含有一个或多个杂原子，例如O、N或S，
оC8至C18直链或支化烷基芳基或芳基烷基，任选不饱和和/或任选含有杂原子，
οC8至C30多环，任选不饱和。
n和o为1至3，
h代表疏水单元相对于单体单元的摩尔分数，其为0.01至0.5，
x代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至2.0，
y代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至0.5。
-PDGF从PDGF类(血小板源生长因子类)的组中选择。
本发明涉及一种复合物，其特征在于PDGF从由含有两个B链的人重组PDGF类(rhPDGF-BB)构成的组中选择。
本发明涉及一种复合物，其特征在于PDGF是PDGF-BB。
两亲聚合物的取代基以受控或无规的方式分布。在具有取代基受控分布的聚合物中，可以提到例如嵌段共聚物和交替共聚物。
无规共聚物
Figure A20068004423300141
嵌段共聚物
Figure A20068004423300142
交替共聚物
Figure A20068004423300143
因此，在一种实施方案中，本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于该聚合物选自其取代基无规分布的聚合物。
在一种实施方案中，本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于两亲聚合物选自聚氨基酸。
在一种实施方案中，聚氨基酸选自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
在一种实施方案中，聚氨基酸是均聚谷氨酸。
在一种实施方案中，聚氨基酸是均聚天冬氨酸。
在一种实施方案中，聚氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸的共聚物。这些共聚物是嵌段共聚物或无规共聚物。
在一种实施方案中，本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于该聚合物选自多糖。
在一种实施方案中，多糖从由乙酰透明质酸(hyaluronanes)、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚半乳糖醛酸(galacturonanes)、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素构成的组中选择。
纤维素的组由用酸官能化的纤维素如羧甲基纤维素构成。
葡聚糖的组由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖构成。
在一种实施方案中，多糖是与下式(I)对应的可溶性葡聚糖的衍生物：
DMCaBbSuc    (I)
其中：
-D代表多糖链，优选由糖苷单元的链状连接
Figure A20068004423300151
构成，
-MC代表甲基羧基基团，
-B代表N-苄基亚甲基甲酰胺(carboxamide)基团，
-Su代表硫酸根基团(糖苷单元所带的游离羟基官能团的硫酸化(sulfatation))，
-a、b和c分别代表基团MC、B和Su的取代程度(ds)，其中
i)a严格大于0；
ii)b为：
·要么b大于或等于0.3且c为0.1至0.5；
·要么b严格小于0.3且c符合下式(1)：
c≥8.5b2-5.41b+0.86    (1)。
式(I)的这些葡聚糖衍生物及其制备方法更一般性地描述在专利申请WO99/29734中。式(I)的这些葡聚糖衍生物俗称DMCBSu并且被视为由R-OH和R-OX子单元构成的共聚物，X可以是甲基羧基基团(MC)、苄基酰胺(B)或硫酸根(Su)基团。因此，甲基羧基基团的取代程度(ds)为0.6的甲基羧基葡聚糖(DMC)每个糖苷单元含有0.6个被取代的基团(R-MC)和2.4个羟基基团(R-OH)。
在一种实施方案中，D具有1000至2000000Da的摩尔质量，并且在一种实施方案中，小于70000Da。
在一种实施方案中，葡聚糖的衍生物选自其中b大于或等于0.35的式(I)化合物。
在此情况下，并且根据一种实施方案，葡聚糖的衍生物选自其中a为0.5至0.8且c为0.1至0.5的式(I)化合物。
在一种实施方案中，多糖从由乙酰透明质酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖构成的组中选择。
这些不同的多糖可以如下表示：
Figure A20068004423300161
聚半乳糖醛酸
Figure A20068004423300162
乙酰透明质酸
Figure A20068004423300163
R＝H，葡聚糖
R＝CH2COOH或H，羧甲基葡聚糖
Figure A20068004423300171
脱乙酰壳多糖
Figure A20068004423300172
藻酸盐。
该多糖可以具有10至10000的平均聚合程度m。
在一种实施方案中，其具有10至5000的平均聚合程度m。
在另一实施方案中，其具有10至500的平均聚合程度m。
在一种实施方案中，本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于疏水基团Hy从由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、苄胺、胆固醇衍生物和酚的组中选择。
在一种实施方案中，胆固醇衍生物是胆酸。
在另一实施方案中，酚是α-生育酚。
在一种实施方案中，本发明的两亲聚合物-PDGF复合物是可逆的。
所用聚合物根据本领域技术人员已知的技术来合成，或者购自例如Sigma-Aldrich，NOF Corp.或CarboMer Inc.的供应商。
PDGF选自根据本领域技术人员已知的技术获得的或者购自如Gentaur公司(USA)或Research Diagnostic Inc.(USA)的供应商的人重组PDGF。
化学和物理的同时稳定性的验证尤其可以通过实施下列试验来进行：
·通过凝胶电泳(凝胶迁移率变动分析(Gel Mobility ShiftAssay))进行的验证本发明两亲聚合物-PDGF复合物的试验；
·通过与蛋白酶接触进行的本发明两亲聚合物-PDGF复合物的酶促降解减缓的试验；
·通过SDS-Page进行的本发明两亲聚合物-PDGF复合物在生理pH值下的物理稳定性的试验。
本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于其满足验证化学和物理稳定性的试验，即对复合物的验证试验(凝胶迁移率变动分析)、通过与蛋白酶接触进行的酶促降解减缓的试验以及通过SDS-Page进行的在生理pH值下的物理稳定性的试验。
通过凝胶迁移率变动分析进行的复合物验证试验基于离子在电场作用下的位移。阴离子复合物向阳极迁移，而阳离子复合物向阴极位移。在迁移后，通过毛细作用使蛋白质转移到PVDF膜上并借助该蛋白质的特异性抗体揭示，该特异性抗体由与过氧化物酶偶合的二抗来识别。单独的蛋白质极少或完全不迁移，与两亲聚合物复合的蛋白质向阳极或阴极迁移，这取决于复合物的总电荷。
酶促降解减缓的试验基于本发明的两亲聚合物-PDGF复合物与蛋白酶接触后的蛋白质完整性的检验。将蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)的溶液添加到复合物溶液中并实现动力学。通过添加该酶的特异性抑制剂(吲哚、苄脒)来停止反应。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Page)分析蛋白质的完整性。
PDGF的物理稳定性的试验基于通过比较本发明的两亲聚合物-PDGF复合物溶液与单独的PDGF的溶液在pH7.4下的溶液中蛋白质浓度来进行的蛋白质完整性的检验。将这两种溶液在摇振台上在环境温度下放置48小时，然后离心处理。通过SDS-Page评测每种溶液中的PDGF浓度。
在不使用任何可使蛋白质变性的有机溶剂的情况下，通过在生理pH值下制成PDGF和两亲聚合物的水溶液来形成本发明的两亲聚合物-PDGF复合物。两亲聚合物-PDGF复合物的形成是自发的并且不涉及PDGF与两亲聚合物之间的任何共价键。这种结合经由基本上是疏水相互作用和离子相互作用的弱键来实现。
本发明还涉及制备本发明两亲聚合物-PDGF复合物的方法，其特征在于使PDGF和两亲聚合物在生理pH值下在溶液中接触。
可以建立其它试验以完成对本发明两亲聚合物-PDGF复合物的形成的验证：
·通过圆振二向色性测定的PDGF三级结构的保持试验；
·本发明的两亲聚合物-PDGF复合物中的PDGF在生理pH值下在应力下的稳定性试验。该应力可以是特定搅拌方式、盐的存在等。
本发明还涉及一种两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于PDGF/两亲聚合物比率为1/5至1/5000。
在一种实施方案中，其为1/100至1/5000。
在另一实施方案中，其为1/300至1/700。
本发明还涉及一种治疗性组合物，其特征在于其包含本发明的两亲聚合物-PDGF复合物。
术语“治疗性组合物”是指可用在人药或兽药中的组合物。
本发明的药物组合物优选为局部施用的组合物，其可呈现为凝胶、乳膏、喷雾剂、糊料或贴剂的形式。
可以与本发明的两亲聚合物-PDGF复合物一起配制的赋形剂的种类根据草本学家(galénist)的一般知识随其呈现形式来选择。
因而，当本发明的组合物是凝胶形式时，其例如是由聚合物如羧甲基纤维素(CMC)、乙烯基聚合物、PEO-PPO型共聚物、多糖、PEO、丙烯酰胺或丙烯酰胺衍生物获得的凝胶。
可以在本发明中使用其它赋形剂来调节配制剂的参数，例如用于调节pH值的缓冲剂，用于调节等渗性的试剂，防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，间甲酚或苯酚，或者抗氧化剂如盐酸L-赖氨酸。
根据本发明，该治疗性组合物的特征在于，其能够以大约100微克/毫升的PDGF施用。
本发明还涉及本发明的两亲聚合物-PDGF复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。
本发明还涉及人用或兽用治疗方法，其特征在于其包括在治疗位置施用包含本发明的两亲聚合物-PDGF复合物的治疗性组合物。
具体实施方式
实施例
实施例1：PDGF-BB/DMCBSu复合物
用苄胺改性的硫酸化羧甲基葡聚糖(DMCBSu)的合成
该两亲聚合物由每个糖单元的羧甲基取代程度为1.0且平均摩尔质量为40000克/摩尔的羧甲基葡聚糖合成。根据传统偶联方法在水中在水溶性碳化二亚胺存在下将苄胺接枝到这种聚合物的酸上。每个糖单元的苄胺取代程度通过1H NMR测定为0.4。然后用SO3/吡啶复合物将该聚合物硫酸化。每个糖单元的硫酸根取代程度为0.3。
PDGF-BB/DMCBSu复合物的制备
将10微升的0.1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50毫克/毫升DMCBSu溶液中。将PDGF-BB和DMCBSu溶液在pH7.4和300mOsm下缓冲。将该溶液在环境温度下温和搅拌2小时，然后储存在4℃下。
PDGF-BB/DMCBSu复合物的形成的验证
将10微升上述PDGF-BB/DMCBSu复合物溶液加载到琼脂糖凝胶上。化合物的迁移在电场(200mA-4小时)作用下进行。在迁移后，将PDGF-BB转移到PVDF膜上过夜，然后通过用山羊抗-PDGF-BB抗体的免疫印迹法来揭示，在该抗体上固定有偶联到HRP过氧化物酶上的抗-山羊IgG二抗，该HRP过氧化物酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑)来揭示。
PDGF-BB/DMCBSu复合物向阳极迁移。其负电荷可以通过其组成中的DMCBSu比PDGF-BB多得多的事实来解释。仅由PDGF-BB构成的对照物不迁移。
PDGF/DMCBSu复合物的溶液的稳定性的验证
将pH值为7.4的10微升的0.01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述pH值为7.4的10微升PDGF-BB/DMCBSu复合物溶液在摇振台上在环境温度下放置48小时。在离心后，通过SDS-Page评测每种溶液中的PDGF-BB浓度。其表明，在PDGF-BB/DMCBSu复合物的情况下溶解的PDGF-BB的浓度不变，而单独的PDGF-BB的溶液的该浓度降低。在该PDGF-BB/DMCBSu复合物中针对胰蛋白酶的PDGF-BB保护的验证
将10微升上述BMP-2/DMCTrpOMe复合物溶液倒入37℃的90微升的10纳克/毫升胰蛋白酶溶液中。
每30分钟提取10微升样品，并在通过添加10微升的10微克/毫升吲哚溶液来停止酶促反应后通过Elisa测量PDGF-BB的浓度。
这些动力学表明，单独的PDGF-BB在1小时30分钟内完全降解，而这不是PDGF-BB/DMCBSu复合物的情况。
PDGF-BB/DMCBSu复合物的生物活性的检验
在37℃的温度下在含有10％胎牛血清(SVF)和1％青霉素-链霉素的αMEM培养基中在湿度饱和并富含CO2(5％)的气氛中实现人皮肤成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞-成人(HDFa))的原代培养。该培养基每4天更新。然后实现细胞悬浮液在培养基中的稀释以便对96孔板(Nunc公司)以5000个细胞/孔的密度接种培养皿。
对于每一批细胞，通过引入氚化的胸腺嘧啶核苷(在100微升中5000个细胞/孔)，检验借助各种浓度的复合物的PDGF-BB稳定化作用。在提取24小时后，通过在不存在或存在浓度为1微克/毫升的两亲聚合物的情况下添加0.1至100纳克/毫升的各种浓度下的PDGF-B来刺激成纤维细胞。在存在或不存在该复合物的情况下用PDGF-BB刺激后18小时，通过添加50μCi/ml，即0.5μCi/孔的溶液来进行氚化的胸腺嘧啶核苷的引入。在计数瓶中恢复放射性，用100微升的100mM NaOH漂洗孔，并在加入1毫升闪烁流体(Zinsser Analytic)后在自动计数器上计数放射性。
所得结果表示在附图1中，其中通过成纤维细胞引入的氚化的胸腺嘧啶核苷的量(Dpm×103)作为以微克/毫升(μg/ml)计的PDGF-BB浓度的函数表示。
实线曲线代表本发明复合物在1微克/毫升葡聚糖衍生物浓度下的结果，虚线曲线代表不存在葡聚糖衍生物时的结果。
ED50对应于用于实现50％人成纤维细胞增殖的PDGF-BB浓度。比率R是如下计算的ED50值的比率：
R＝ED50(PDGF-BB)/ED50(PDGF-BB+DMCBSu)
这些结果表明，当单独使用PDGF-BB时，必须使用6微克/毫升以获得50％增殖，而在PDGF-BB与式(I)的葡聚糖衍生物复合时，2微克/毫升就足以获得50％增殖。在这种情况下，比率R等于3。
实施例2：PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物
用色氨酸甲酯改性的羧甲基葡聚糖(DMCTrpOMe)的合成
该两亲聚合物由每个糖单元的羧甲基取代程度为1.0且平均摩尔质量为40000克/摩尔的羧甲基葡聚糖合成。根据传统偶联方法在水中在水溶性碳化二亚胺存在下将色氨酸甲酯接枝到这种聚合物的酸上。每个糖单元的色氨酸取代程度通过1H NMR测定为0.3。
PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物的制备
将10微升的0.1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50毫克/毫升DMCTrpOMe溶液中。将PDGF-BB和DMCTrpOMe溶液在pH7.4和300mOsm下缓冲。将该溶液在环境温度下温和搅拌2小时，然后储存在4℃下。
PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物的形成的验证
将10微升上述PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物溶液加载到琼脂糖凝胶上以便进行利用免疫印迹法的凝胶电泳。化合物在电场(200mA-4小时)作用下迁移。在迁移后，将PDGF-BB转移到PVDF膜上过夜，然后通过用山羊抗-PDGF-BB抗体的免疫印迹来揭示，在该抗体上固定有偶联到过氧化物酶上的抗-山羊IgG二抗，该过氧化物酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑)来揭示。
PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物向阳极迁移。其负电荷可以通过其组成中的DMCTrpOMe比PDGF-BB多得多的事实来解释。仅由PDGF-BB构成的对照物不迁移。
PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物的稳定性的验证
将pH值为7.4的10微升的0.01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述pH值为7.4的10微升PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物溶液在摇振台上在环境温度下放置48小时。通过SDS-Page评测每种溶液中PDGF-BB的浓度。其表明，在PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物的情况下溶液中PDGF-BB的浓度不变，而单独的PDGF-BB的溶液的该浓度降低。在该PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物中针对胰蛋白酶的PDGF-BB保护的验证
将10微升上述PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物溶液用37℃的90微升的10纳克/毫升胰蛋白酶溶液培养。每30分钟提取10微升样品，并在通过添加10微升的10微克/毫升吲哚溶液来停止酶促反应后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Page)评测PDGF-BB的结构完整性。
这些动力学表明，单独的PDGF-BB在1小时30分钟内完全降解，而这不是PDGF-BB/DMCTrpOMe复合物的情况。
实施例3：PDGF-BB/CMCBSu复合物
用苄胺改性的硫酸化羧甲基纤维素(CMCBSu)的合成
该两亲聚合物由每个糖单元的羧甲基取代程度为1.2且平均摩尔质量为30000克/摩尔的羧甲基纤维素合成。根据传统偶联方法在水中在水溶性碳化二亚胺存在下将苄胺接枝到这种聚合物的酸上。每个糖单元的苄胺取代程度通过1H NMR测定为0.2。在SO3-吡啶复合物存在下进行硫酸化，硫酸根取代程度为0.30。
PDGF-BB/CMCBSu复合物的制备
将10微升的0.1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50毫克/毫升CMCB溶液中。将PDGF-BB和CMCBSu溶液在pH7.4和300mOsm下缓冲。将该溶液在环境温度下温和搅拌2小时，然后储存在4℃下。
PDGF-BB/CMCBSu复合物的形成的验证
将10微升上述PDGF-BB/CMCBSu复合物溶液加载到琼脂糖凝胶上以便进行利用免疫印迹法的凝胶电泳。化合物在电场(200mA-4小时)作用下迁移。在迁移后，将PDGF-BB转移到PVDF膜上过夜，然后通过用山羊抗-PDGF-BB抗体的免疫印迹法来揭示，在该抗体上固定有偶联到HRP过氧化物酶上的抗-山羊IgG二抗，该HRP过氧化物酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑)来揭示。
PDGF-BB/CMCBSu复合物向阳极迁移。这种负电荷可以通过其组成中的CMCBSu比PDGF-BB多得多的事实来解释。仅由PDGF-BB构成的对照物不迁移。
PDGF-BB/CMCBSu复合物的稳定性的验证
将pH值为7.4的10微升的0.01毫克/毫升PDGF-BB溶液和上述pH值为7.4的10微升PDGF-BB/CMCBSu复合物溶液在摇振台上在环境温度下放置48小时。通过SDS-Page评测每种溶液中PDGF-BB的浓度。其表明，在PDGF-BB/CMCBSu复合物的情况下溶液中PDGF-BB的浓度不变，而单独的PDGF-BB的溶液的该浓度降低。
在该PDGF-BB/CMCBSu复合物中针对胰蛋白酶的PDGF-BB保护的验证
将10微升上述PDGF-BB/CMCBSu复合物溶液用37℃的90微升的10纳克/毫升胰蛋白酶溶液培养。每30分钟提取10微升样品，并在通过添加10微升的10微克/毫升吲哚溶液来停止酶促反应后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Page)评测PDGF-BB的结构完整性。
这些动力学表明，单独的PDGF-BB在1小时30分钟内完全降解，而这不是PDGF-BB/DMCBSu复合物的情况。
对比例1：PDGF-BB/CMCB复合物
用苄胺改性的羧甲基纤维素(CMCB)的合成
该两亲聚合物由每个糖单元的羧甲基取代程度为1.2且平均摩尔质量为30000克/摩尔的羧甲基纤维素合成。根据传统偶联方法在水中在水溶性碳化二亚胺存在下将苄胺接枝到这种聚合物的酸上。每个糖单元的苄胺取代程度通过1H NMR测定为0.2。
PDGF-BB/CMCB复合物的制备
将10微升的0.1毫克/毫升PDGF-BB溶液添加到90微升的50毫克/毫升CMCB溶液中。将PDGF-BB和CMCB溶液在pH7.4和300mOsm下缓冲。将该溶液在环境温度下温和搅拌2小时，然后储存在4℃下。
PDGF-BB/CMCB复合物的未形成的验证
将10微升上述PDGF-BB/CMCB复合物溶液加载到琼脂糖凝胶上以便进行利用免疫印迹法揭示的凝胶电泳。化合物在电场(200mA-4小时)作用下迁移。在迁移后，将PDGF-BB转移到PVDF膜上过夜，然后通过用山羊抗-PDGF-BB抗体的免疫印迹法来揭示，在该抗体上固定有偶联到HRP过氧化物酶上的抗-山羊IgG二抗，该HRP过氧化物酶借助底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑)来揭示。
该揭示没有显示出单独同两亲聚合物的PDGF-BB的任何迁移。在CMCB与PDGF-BB之间没有形成复合物。

Claims (26)

1.水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于：
-该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成：
Figure A2006800442330002C1
DP＝m个单体单元
·R、R’是键或包含1至18个碳的链，任选地支化和/或不饱和，包含一个或多个杂原子，例如O、N和/或S，
R和R’彼此相同或不同
·F、F’是酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、胺，
F和F’彼此相同或不同
·X是亲水基团，其可以是：
ο羧酸根
ο硫酸根
ο磺酸根
ο磷酸根
ο膦酸根
·Y是亲水基团，其可以是：
ο硫酸根
ο磺酸根
ο磷酸根
ο膦酸根
·Hy是疏水基团，其可以是：
οC8至C30直链或支化烷基，任选不饱和和/或含有一个或多个杂原子，例如O、N或S，
οC8至C18直链或支化烷基芳基或芳基烷基，任选不饱和和/或任选含有杂原子，
οC8至C30多环，任选不饱和；
n和o为1至3，
h代表疏水单元相对于单体单元的摩尔分数，其为0.01至0.5，
x代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至2.0，
y代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至0.5；
-PDGF从PDGF类(血小板源生长因子类)的组中选择。
2.根据权利要求1的复合物，其特征在于PDGF从由含有两个B链的人重组PDGF类(rhPDGF-BB)构成的组中选择。
3.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于聚合物选自取代基无规分布的聚合物。
4.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于两亲聚合物选自聚氨基酸。
5.根据权利要求4的复合物，其特征在于聚氨基酸选自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
6.根据权利要求5的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚谷氨酸。
7.根据权利要求6的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚天冬氨酸。
8.根据权利要求7的复合物，其特征在于聚氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸的共聚物。
9.根据权利要求1至5之一的复合物，其特征在于该聚合物选自多糖。
10.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚半乳糖醛酸、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素构成的组中选择。
11.根据权利要求10的复合物，其特征在于纤维素的组由用酸官能化的纤维素如羧甲基纤维素构成。
12.根据权利要求10的复合物，其特征在于葡聚糖的组由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖构成。
13.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖构成的组中选择。
14.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由与下式(I)对应的可溶性葡聚糖的衍生物所构成的组中选择：
DMCaBbSuc    (I)
其中：
-D代表多糖链，优选由糖苷单元的链状连接构成，
-MC代表甲基羧基基团，
-B代表N-苄基亚甲基甲酰胺基团，
-Su代表硫酸根基团(糖苷单元所带的游离羟基官能团的硫酸化)，
-a、b和c分别代表基团MC、B和Su的取代程度(ds)，其中
i)a严格大于0；
ii)b为：
·要么b大于或等于0.3且c为0.1至0.5；
·要么b严格小于0.3且c符合下式(1)：
c≥8.5b2-5.41b+0.86    (1)。
15.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于疏水基团Hy从由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、苄胺、胆固醇衍生物和酚构成的组中选择。
16.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于两亲聚合物-PDGF复合物的形成是可逆的。
17.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于其满足验证化学和物理稳定性的试验。
18.根据权利要求17的复合物，其特征在于验证化学和物理稳定性的试验选自：复合物的验证试验(凝胶迁移率变动分析)、通过与蛋白酶接触进行的酶促降解减缓的试验以及通过SDS-Page进行的在生理pH值下的物理稳定性的试验。
19.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于PDGF/两亲聚合物比率为1/5至1/5000。
20.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于PDGF/两亲聚合物比率为1/100至1/5000。
21.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于PDGF/两亲聚合物比率为1/300至1/700。
22.制备根据前述权利要求任一项的两亲聚合物-PDGF复合物的方法，其特征在于在含水介质中在不存在可使蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备这种聚合物/PDGF-BB复合物。
23.治疗用组合物，其特征在于其包含根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物。
24.根据权利要求20的治疗用组合物，其特征在于其能够以100微克/毫升的PDGF施用。
25.根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。
26.人用或兽用治疗方法，其特征在于其包括在治疗位置施用包含根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物的治疗性组合物。
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