KR101506593B1

KR101506593B1 - Ｐｄｇｆ 양친매성 중합체 복합체

Info

Publication number: KR101506593B1
Application number: KR1020087009706A
Authority: KR
Inventors: 기 뒤브레코; 라티파 다리-코레이아; 호세 코레이아; 다비드 뒤라쉐; 레미 수라; 올리비에 수라; 제라르 수라
Original assignee: 아도시아
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2015-03-30
Also published as: EP1940448B1; ZA200902008B; US20070254828A1; DK1940448T3; US20110301086A1; CN101631804B; RU2424824C2; CA2623529C; PL1940448T3; WO2007034321A3; ES2406229T3; ZA200803500B; PT1940448E; CN103203023A; AU2006293613A1; WO2007034321A2; KR20080080278A; RU2008116585A; WO2007034320A2; EP1940448A2

Abstract

본 발명은 약학적 적용을 위한 치료용 단백질의 물리적 및 화학적인 인비트로 및 인비보 안정성을 개선하기 위한 양친매성 중합체에 결합된 신규한 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수성 용매의 존재 하 및 단백질의 변성을 야기할 수 있는 유기 용매의 부존재 하에 상기 중합체/PDGF-BB를 제조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 PDGF-양친매성 중합체 복합체의 제조방법 및 국소적으로 궤양을 치료하기 위한 치료학적 상처-치료 조성물을 제조하기 위한 상기 PDGF-양친매성 중합체 복합체의 용도에 관한 것이다.

PDGF 양친매성 중합체 복합체

Description

ＰＤＧＦ 양친매성 중합체 복합체{PDGF amphiphilic polymer complex}

본 발명은 인 비트로 및 인 비보에서, 약학적 적용을 위한 치료적 단백질의 물리적 및 화학적 안정성을 개선시키기 위한 양친매성 중합체와 결합된 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)의 신규한 복합체에 관한 것이다.

PDGF는 두 개의 디설피드 브릿지를 통해 상호 연결된 두 개의 폴리펩티드 사슬로 구성된, 약 30,000 달톤의 당단백질이다. 사슬의 4가지 유형은 A, B, C 및 D로 식별되어 왔다. 원형(native) 단백질은 호모다이머 또는 AB-타입 헤테로다이머의 형태로 존재한다(Oefner C. EMBO J. 11, 3921-2926, 1992).

PDGF는 혈소판에서 최초로 분리되었다. PDGF는 혈액 응고시 분비되는 성장인자이고, 다양한 세포 유형의 성장을 촉진할 수 있다(Ross R. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 1207; Kohler N. & Lipton A., Exp. Cell Res., 1974, 87, 297). PDGF는 혈소판을 제외한 특정 수의 세포에 의해 생성되고, 간엽조직(mesenchyme), 즉, 혈액, 근육, 뼈 및 연골 세포에서 유래된 대부분의 세포 및 또한 결합 조직 세포에 대해 유사분열촉진성(mitogenic)이 있는 것으로 알려져 있다(Raines E.W., in “Biology of Platelet-Derivated Growth Factor", 1993, Westermark, B. and C. Sorg, Ed. Basel, Kerger, p.74). 또한 많은 문헌들은 대식 세포-유래 PDGF가 평활근(smooth muscle) 세포에 대한 화학주성 및 유사분열촉진성 작용제처럼 작용하고, 동맥경화증을 특징으로 하는 동맥 벽의 근내막 비후화(myointimal thickening)에 기여하는 것으로 기술하는 경향이 있다(Ross R. 등, Science, 1990, 248, 1009). 추가적이고 구체적으로, PDGF의 활성은 중호중 단핵구(neutrophilic monocyte)에 의한 과립 분비의 자극(Tzeng D.Y. 등, Blood, 1985, 66, 179), 레이디그 세포(Leydig cell)에 의한 스테로이드 합성의 촉진(Risbridger G.P., Mol. Cell. Endocrinol., 1993, 97, 125), 호중구 식세포작용의 자극(Wilson E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 2213), 트롬보스폰딘(thrombospondin)의 발현 및 분비의 조절(Majak R.A. 등, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8821), 및 혈관 평활근 세포의 ICAM-1 유전자의 후-조절(Morisaki N. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612)을 포함한다.

이들 다양한 특성들이 개시되면서, 약학 분야에서의 재조합 PDGF의 용도는 이미 고려되고 있었다. 특히 PDGF의 용도는 당뇨 발 궤양의 치료(Regranex, J&J) 및 치주 치료(GEM 21S, Biomimetic)를 위해 허가되었다.

일반적인 피부 치료와 같이, 궤양 치료는 시간 및 공간에 있어서, 수많은 유형의 세포들의 조합된 개입이 요구되는 복잡한 현상이고, 이는 3 단계, 즉 염증 단계, 증식 단계 및 재구성 단계로 요약될 수 있다.

통상적인 치료의 경우 약 7일인, 염증 단계에서는, 대식세포가 박테리아를 죽이고, 손상된 조직을 제거하며 조직을 재생한다. 이를 수행하기 위해, 대식세포는 콜라게나아제, 시토킨 및 성장 인자를 분비한다.

통상적인 치료의 경우 3일차 내지 3주차인, 증식 단계의 과정에서는, 세가지 사건이 순차적으로 뒤따른다. 상처는 과립화 조직으로 채워지고, 혈관신생화가 진행되며 상처는 상피 세포로 뒤덮혀 진다. 상기 과립화 조직은 가장자리에서 중앙으로 성장한다. 섬유아세포(fibroblast)는 타입 III 콜라겐을 풍부하게 생성한다.

3주차 내지 1년 또는 심지어 2년까지인, 재구성(remodeling) 단계에서는, 과립화 조직은 성숙되고, 섬유아세포는 콜라겐을 덜 생성한다. 과립화 동안 생성된 쓸모없는 혈관은 아포토시스(apoptosis)에 의해 제거된다. 타입 III 콜라겐은 타입 I 콜라겐으로 대체되고, 장력(tension) 및 가교(crosslink)의 선을 따라 조직화된다.

이 과정에서, PDGF는 필수적인 역할을 수행한다. 상처의 형성 동안, 혈소판은 응집하고 PDGF를 분비한다. PDGF는 호중구, 대식세포 및 섬유아세포를 상처에 끌어들이고 강력한 미토겐(mitogen)이다. 뒤이어 대식세포 및 내피 세포는 PDGF를 합성하고 분비한다. PDGF는 섬유아세포에 의한 신규한 외세포성 메트릭스, 글리코사미노글리칸 및 흡착 단백질과 같은 본질적으로 비-콜라겐 화합물의 생성을 자극한다(J. F. Norton 등, Essentiai practice of surgery, Springer, 2003, chapter 7, 77-89).

당뇨 발 궤양, 정맥 궤양 및 욕창(pressure ulcer)과 같은 만성적인 상처는 치료 과정이 정상적으로 일어나지 않기 때문에 매우 느리고 때로는 불완전한 치료의 특수성을 갖는다(R. Lobmann 등, J. of Diabetes and its complications, 2006, 20, 329-335).

치료 과정은 사실상 조직에 대한 손상을 제거하기 위해 필요한 파괴 과정과 새로운 조직의 생성을 가져오는 재생 과정 간의 정교한 균형이다. 프로테아제 및 성장 인자는 이러한 균형을 조절하여 이 과정에서 필수적인 역할을 수행한다. 만성적인 상처의 경우, 이러한 균형은 분해에 우세하게 교란되기 때문에, 이들 상처의 치료는 느려지게 된다. 상이한 유형의 만성적 상처가 존재하지만, 그들는 높은 수준의 프로테아제를 야기하여 성장 인자의 활성을 감소시키는 지속적인 염증 단계를 특징으로 한다는 점에서 생화학적으로 비교적 유사하다(G. Lauer 등 J. Invest. Dermatol. 115 (2000) 12-18). 이러한 성장 인자의 분해는 치료에 기여하지 않는, 이들 만성적인 상처와 관련된 전체적인 조직의 손실의 원인이 된다(D. R. Yager 등 J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748).

상품명 Regranex^®으로 판매되는, 국제적인 관용 명칭(non-proprietory name) "베카플레르민(becaplermin)"에 해당하는, 인간 재조합 PDGF-BB-기반 약물이 현재 시장에 존재한다. 이 약물은 당뇨병에 있어서 하지 궤양(lower limb ulcer)의 치료용으로 표시된다. 이 약물은 국소 적용을 위한 겔 형태로 존재하고 궤양 치료의 촉진을 가능하게 한다. 특히, 이 약물은 내생성 PDGF와 같이, 세포 증식 및 그에 따른 새로운 조직의 형성을 촉진할 수 있다.

비록 임상 연구는 치료 및 치료에 요구되는 기간에 있어서 개선을 보여주고 있지만(Greenhalgh 등, American Journal of pathology, 136, 1235-1246, 1990; Ladin Plastic and Reconstructive Surgery, 105, 1230-1231, 2000; Holloway 등, Wounds, 5/4, 198-206; Mandracchia 등, Clinics in Podiatric Me decine and Surgery, 18, 189-209, 2001; Wieman T.J. American Journal of Surgery, 176, 74S-79S, 1998) 이러한 치료는 제한된 효능을 갖는다(Cullen 등, The International journal of biochemistry & Cell Biology 34, 1544-1556, 2002).

J&J에 의해 판매되는 PDGF-BB를 포함하는 상기 Regranex 제품은 상처의 표준 치료만을 받은 환자의 회복률이 36%에 불과한 것에 반해 치료된 환자에 있어서, 회복률을 50%로 증가시켜 그 효능을 입증하고 있다. 당뇨 발 궤양의 치료에 있어서 이러한 상당한 개선에도 불구하고, 환자의 50%만이 장기간의 비싼 치료 후에 회복을 경험한다는 것을 주목해야 한다. 비-회복(non-recovery)의 경우, 결과는 매우 심각할 수 있고, 많은 경우 하지를 절단해야 할 수도 있다. 치료의 평균 기간은 매우 장기간으로, 약 20 주이고, 그의 적용은 상처가 아침에 세척되고 Regranex가 적용되며, 뒤이어 12시간 후에 상처를 세척해야 하기 때문에, 비싸고 제한적이라는 것이 추가되어야 한다. 이들 두 가지 절차는 가장 일반적으로 간호사에 의한 관리를 요구한다. 또한, 20주 동안 지속되는 상기 치료의 평균 비용은 과도하게 높다(1400 미국 달러 수준).

불완전한 효능은 치료되는 상처에서 PDGF의 급격한 분해에 의해 설명될 수 있다. 만성적인 상처의 경우, 이러한 분해는 상처에서, 프로테아제의 과생성의 촉진에 기인한 PDGF에 적대적인 환경을 발생하는 지속적인 염증 상태로부터 야기된다.

분해의 조절이 상처의 치료를 위해 필요하나, 과도한 단백질분해 활성은 세 포외 매트릭스의 분해(F. Grinnell 등, J. Invest. Dermatol. 106 (1996) 335-341 및 C.N. Rao 등, J. Invest. Dermatol. 105 (1995) 572-578) 및 성장 인자와 같은 핵심적인 기능성 역할을 갖는 분자의 분해(V. Falanga 등, J. Derm. Surg. Onc. 18 (1992) 604-606; D.R. Yager 등, Wound Rep. Reg. 5 (1997) 23-32. 및 M. Wlaschek 등, Br. J. Dermatol. 137 (1997) 646-647)를 일으키기 때문에 해롭다. 사실상, PDGF, TGFβ 또는 bFGF와 같은 성장 인자는 세포 이동, 증식, 단백질 합성 및 매트릭스 형성을 유도하는 능력 및, 더 일반적으로, 그들이 회복 과정을 조절한다는 사실 때문에 치료 과정에서 핵심적인 요소이다. 그러나, 이들 성장 인자는 단백질 분자이기 때문에, 결과적으로 단백질분해효소에 의한 분해에 민감하다. 여러 연구는 만성적인 상처가 고농도의 메탈로프로테나아제를 포함하기 때문에 PDGF와 같은 성장 인자가 만성적인 상처에서 기원하는 체액에 접촉하게 되었을 때 그들의 분해가 훨씬 더 신속하다는 것을 개시한다(D. R. Yager 등, J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748).

문헌에 기록된 파일럿 임상 연구에서(TJ. Wieman, Wounds, 2003, vol. 15, No. 8, 257-264), 동맥 궤양의 치료에 관하여, Regranex는 압박 치료(compression treatment)와 병행하는 상처의 정기적인 세척에 기반한 통상의 치료의 적은 개선만을 보여주었다.

예를 들어, PDGF의 불안정성 문제는 상기 단백질의 생성시에 드러났다. PDGF는 특히 번역-후 단백질분해에 민감하고(Hart 등, Biochemistry 29:166-172, 1990 및 미국특허 제07/557호, 219), 특히, 상기 단백질의 성숙한 사슬의 32번 위치의 아르기닌 아미노산과 33번 위치의 쓰레오닌 아미노산 사이의 결합 수준에서 민감하다는 것이 알려져 있다. PDGF의 B 사슬의 79번 위치의 아르기닌과 80번 위치의 라이신 사이의 결합, 또는 27번 위치의 아르기닌과 28번 위치의 아르기닌 사이의 결합과 같은, 기타 부위들이 단백질분해에 민감하다.

이러한 단백질분해성 불안정성은 미국특허 제4,845,075호에 기술된 방법에 의해 효모에서 재조합 방식으로 생성되는, 단백질의 수득에서 주요한 문제를 야기한다. 구체적으로, 미국특허 제7,084,262호는 PDGF-BB의 분석 및 정제가 번역-후 내부단백질분해성 분열(post-translational endoproteolytic cleavage)에서 야기되는 21개의 아형(isoform)의 생성을 가져온다는 것을 교시한다. 이러한 큰 구조적인 이질성은 성숙한 형태의 완전한 단백질과 비교하여 유전 공학에 의해 생성되는 단백질 활성의 50%의 감소를 야기한다.

또한, 2006년 8월 14일자(www.prnewswire.com) 언론 발표문에 의하면, 14주 후에 회복되지 않은 당뇨 발 궤양에 관한 카르디움(Cardium)에 의한 최근 임상 결과는 PDGF-BB에 의한 치료가 제공할 수 있는 가능성을 보여준다. 카르디움에 의해 제안된 해결책은 상처 세포에 PDGF-BB의 발현 유전자를 도입하여 이를 국소적으로 과발현시키는 것을 포함한다. 아데노벡터를 수단으로 하는 이 유전자 치료는 15명의 환자의 군으로부터, 통상적인 치료에 대해 정하는 이들 당뇨 발 궤양 환자의 약 80%를 치료할 수 있었다. 이 치료적 해결책은 유망하다. 그러나, 현재까지 유전자 치료를 기반으로 하는 치료의 약학적 개발은 아데노바이러스-타입 바이러스 벡터의 사용과 관련된 안전성의 이유로 여전히 매우 위험하다.

따라서 당뇨 발 궤양의 치료를 위한 통상적인 치료를 PDGF로 개선해야 할 필요성 및 가능성이 있다.

당뇨 발 궤양 치료의 경우 최종 목적은 하기의 세가지이다.

- 회복을 가속화하는 것.

- 회복률을 증가시키는 것.

- 치료 프로토콜을 단순화하는 것.

또한, 상당한 고통 및 매우 심각한 의학적 합병증의 원인인, 동맥 궤양 및 욕창의 경우도 있다.

따라서 해결되어야 할 문제점은 본질적으로 만성적 상처에서 PDGF를 보호하는 것이다.

다양한 해결책이 제안되어 왔다.

미국특허 제5,905,142호는 잠재적인 분열 부위(cleavage site)에 근접한 하나 이상의 라이신 또는 아르기닌 아미노산을 치환 또는 결실시켜, 단백질분해성 공격에 대한 증가된 저항성을 갖는 단백질 변이체를 생성하여, PDGF에 관한 단백질분해 문제점을 개선하는 수단을 개시한다. 상기 단백질이 프로테아제에 대해 더 큰 저항성을 갖게 하는 이 전략은 만족스럽지 않다. PDGF의 이와 같은 유전적 변형은 독물학상의 문제점을 야기할 수 있는, 그의 다양한 수용체에 관한 상이한 친화력과 함께, 생물학적 활성의 변형을 야기할 수 있다. 또한, PDGF의 변형은 극단적으로 비싸고 위험한, 새로운 약학적인 개발을 요구한다.

단백질이 많이 연구되었던 때인 1970년대에, PDGF는 양이온성 및 소수성에 기인한 "아주 끈적한 단백질"이기 때문에 정제가 극단적으로 까다로운 것으로 알려 졌다(Heldin, C.H. EMBO J. 11: 4251-4259, 1992; Raines and Ross, J. Biol. Chem. 257(9): 5154-5160, 1982; Antoniades, PNAS 78:7314, 1981; Deuel 등, J. Biol. Chem. 256:8896, 1981). PDGF는 실제로, 등전위점이 9.8 내지 10.5인, 고도의 양이온성 단백질이다. Wei 등과 같은, 다른 저자들은 이러한 특성을 확인하고(Journal of controlled release 112:103-110, 2006) PDGF가 용기의 표면 상으로 서서히 흡수되고 그 용기의 내부에 용액 상태로 존재하는 것을 설명한다. 상기 저자들은 상기 혼합물에, 0.1% BSA 또는 0.1% BSA/Tween 20 혼합물을 첨가하여 상기 문제점을 해결한다. 이들 해결책은 상기 단백질의 95% 이상이 용액 내에서 발견되기 때문에 상기 문제점을 많은 부분 해결한다. 그러나, 이들 해결책은 BSA의 동물 기원 및 광우병(bovine spongiform encephalopathy)과 관련된 위험들을 고려할 때, 약학적인 관점에서는 충분하지 않다.

동일한 저자들에 의해 제안된 또 다른 해결책은 용액 내에 PDGF를 용액으로 유지할 수 있게 하는, 더욱 강력한 음이온성 계면 활성제(SDS)를 첨가하는 것을 포함한다. 안타깝게도, SDS는 또한 상기 단백질의 부분적인 변성을 유도하여, 생물활성의 손실을 야기한다. 따라서, 이 해결책은 상기 단백질을 안정화하는데 충분하지 않다.

국제특허공개 제93/08825호에서, 본 발명자들은 정제된 PDGF가 국소 적용을 위해 겔 형태로 제조될 때 큰 불안정성을 보인다는 것을 입증했다. 일 예로, 그들은 메틸셀룰로오즈 또는 히드록시프로필셀룰로오즈와 같은 통상적으로, 약학적 생 성물을 제조하기 위해 사용되는 다수의 생성물 및 또한 벤질 알코올과 같은 특정한 통상의 보존제와 PDGF의 부적합성(incompatibility)을 개시한다. 상기 저자들은 우수한 장기적 안정성을 갖는 동시에 경구 투여를 위한 겔 형태로 PDGF를 제제화할 필요가 있음을 설명하여 문제점을 제기한다. 동일한 저자들은 용액 상태의 PDGF가 중성 pH에서 탈아미드화 과정에 의해 분해되고 상기 단백질이 약산성 pH에서 더욱 안정화하는 것을 개시한다. 상기 저자들은 여러 파라미터, 상기 단백질과 어떠한 상호작용도 보이지 않는 중합체, 약산성 pH에서 탈아미드화 반응을 제한할 수 있는 버퍼 및 상기 단백질에 관하여 중성인 보존제를 조합하여, 약학적인 관점에서 안정적인 제제를 얻기 위하여 PDGF를 제제화할 수 있음을 개시한다.

상기 저자들은 상기 제제가 탈아미드화에 의해 상기 단백질을 분해하는 반응을 피할 수 있도록 약산성 pH에서 유지되는 것을 전제로 하여, 상기 단백질과 어떠한 상호작용도 보이지 않는 중합체의 첨가를 통해 저장-안정성 제제(storage-stable formulation)를 얻을 수 있음을 개시한다. 그러나, 이러한 해결책은 성장 인자를 인 비보, 생리학적 pH에서 단백질분해성 분해로부터 보호할 수 없기 때문에 충분하지 않다.

겔 형태의 PDGF 제제를 기술하고 있는, 국제특허공개 제97/12601호에서, 저자들은 그들이 사용하는 셀룰로오즈 유도체가 저장시 잠재적인 활성의 손실에 대하여 성장 인자를 안정화시킬 수 있음을 개시한다. 이를 위해, 그들은 기반으로 미국특허 제4,717,717호에서 EGF에 관하여 이미 얻어진 결과를 사용한다. 그러나, 그들은 또한 PDGF를 포함하는 셀룰로오즈 겔의 안정성이 대전된 아미노산 또는 금속 이 온과 같은 대전된 화학 종을 상기 제제에 첨가하여 크게 개선될 수 있음을 개시한다. 또한 이러한 해결책도 생성물의 저장시 제제 내의 성장 인자를 안정화할 수 있지만, 생리학적 pH에서 만성적인 상처에 존재하는 프로테아제에 관한 이들 성장 인자의 안정화를 제공하지는 못한다.

따라서, 만성적인 상처의 치료 및, 더 구체적으로 당뇨 발 궤양 상처의 치료에 있어서, 그의 효능을 증가시키기 위하여, 성장 인자, 특히 PDGF를 안정화시키고 보호하는 치료학적 이점이 존재한다. 따라서 본 발명은 양친매성 중합체와 PDGF 간의 복합체를 개발하여, 인비트로 및 인비보, 생리학적 pH에서 발생할 수 있는 화학적 또는 물리학적 분해에 대한 PDGF를 안정화시키는 것에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 PDGF에 인비트로 및 인비보, 생리학적 pH에서 분해에 대한 화학적 및 물리학적 안정화를 제공하는 복합체인, 양친매성 중합체와 PDGF 간의 복합체(양친매성 중합체-PDGF)의 형성에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 하기 사항을 특징으로 하는, 물리적 및 화학적으로 안정한, 수용성의, 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

- 상기 양친매성 중합체는 하기 일반식을 갖는, 소수성 치환기 및 친수성 작용기로 기능화된 친수성 중합체 골격으로 구성된다;

DP = m 단량체 유닛

ㆍ R 및 R'은 선택적으로 하나 이상의 O, N, 및/또는 S와 같은 헤테로원자를 포함하는 분지된 및/또는 불포화된, 1개 내지 18개의 탄소를 포함하는 결합 또는 사슬로 존재하고,

R 및 R'은 서로 동일하거나 상이하며,

ㆍ F 및 F'은 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카르보네이트, 카르바메이트, 에테르, 티오에테르, 아민이고,

F 및 F'은 서로 동일하거나 상이하며,

ㆍ X는 카르복실레이트, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 포스포네이트일 수 있는 친수성 작용기로 존재하며,

ㆍ Y는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 포스포네이트일 수 있는 친수성 작용기로 존재하며,

ㆍ Hy는 선택적으로 불포화되고 및/또는 하나 이상의 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자를 포함하는, C₈ 내지 C₃₀의 선형 또는 분지된 알킬일 수 있거나,

선택적으로 불포화되고 및/또는 선택적으로 헤테로원자를 포함하는, C₈ 내지 C₁₈의 선형 또는 분지된 알킬아릴 또는 아릴알킬일 수 있거나, 또는

선택적으로 불포화된 C₈ 내지 C₃₀의 폴리사이클일 수 있는, 소수성 작용기로 존재하며,

n 및 o는 1 내지 3이며,

h는 0.01 내지 0.5의 단량체 유닛에 관한 소수성 유닛의 몰 분획을 나타내며,

x는 0 내지 2.0의 단량체 유닛에 관한 친수성 유닛의 몰 분획을 나타내며,

y는 0 내지 0.5의 단량체 유닛에 관한 친수성 유닛의 몰 분획을 나타내며,

상기 PDGF는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자)의 군으로부터 선택된다.

본 발명은 상기 PDGF가 2개의 B 사슬을 포함하는 인간 재조합 PDGF(rhPDGF-BB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체에 관한 것이다.

본 발명은 상기 PDGF가 PDGF-BB인 것을 특징으로 하는 복합체에 관한 것이다.

상기 양친매성 중합체의 치환기는 제어된 방식으로 또는 랜덤하게 분포된다. 치환기의 제어된 분포를 갖는 중합체 중에서, 예를 들어, 블럭 공중합체 및 교차 공중합체(alternating copolymer)로 구성되는 것이 언급될 수 있다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 또한 상기 중합체가 치환기가 랜덤하게 분포되는 중합체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

일 구체예에서, 본 발명은 또한 상기 양친매성 중합체가 폴리아미노산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 폴리아미노산은 폴리글루타메이트 또는 폴리아스파르테이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 상기 폴리아미노산은 호모폴리글루타메이트이다.

일 구체예에서, 상기 폴리아미노산은 호모폴리아스파르테이트이다.

일 구체예에서, 상기 폴리아미노산은 아스파르테이트 및 글루타메이트의 공중합체이다. 이들 공중합체는 블럭 공중합체 또는 랜덤 공중합체이다.

일 구체예에서, 본 발명은 또한 상기 중합체가 다당류로부터 선택되는 것을 특징을 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 다당류는 히알루로난, 알기네이트, 키토산, 갈락투로난, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 및 셀룰로오즈로 구성되는 군으로부터 선택된다.

상기 셀룰로오즈의 군은 카르복시메틸-셀룰로오즈와 같은, 산으로 기능화된 셀룰로오즈로 구성된다.

상기 덱스트란의 군은 카르복시메틸-덱스트란과 같은, 산으로 기능화된 덱스트란으로 구성된다.

일 구체예에서, 상기 다당류는 하기 식 (I)에 해당하는 가용성 덱스트란 유도체이다;

DMC_aB_bSu_c (I)

상기에서,

- D는 바람직하게는 일련의 글루코시드 유닛으로 구성되는, 다당류 사슬을 나타내고,

- MC는 메틸카르복실 작용기를 나타내고,

- B는 N-벤질메틸렌카르복사미드 작용기를 나타내고,

- Su는 설페이트기(글루코시드 유닛에 의한 유리(free) 히드록시기의 황산화)를 나타내고,

- a, b 및 c는 각각 상기 MC, B 및 Su 군의 치환도(ds)를 나타내며,

i) a는 0보다 반드시 크고,

ii) b는 b가 0.3보다 크거나 같고 c는 0.1 내지 0.5이거나,

또는 b는 반드시 0.3 미만이고 c는 하기 식 (1),

c ≥ 8.5 b² - 5.41 b + 0.86 (1)에 따른 것이다.

식 (I)의 이들 덱스트란 유도체, 및 또한 그의 제조방법은 국제특허공개 제99/29734호에 더 일반적으로 기술되어 있다. 이들 식 (I)의 덱스트란 유도체는 관용적으로 DMCBSu로 불리고 R-OH 및 R-OX 서브유닛으로 구성된 공중합체로 간주되며, 상기에서, X는 메틸카르복실릭(MC), 벤질아미드(B) 또는 설페이트(Su) 작용기일 수 있다. 따라서, 메틸카르복실기에 의한 0.6의 치환도(ds)를 갖는 메틸카르복실 덱스트란(DMC)은 글루코시드 유닛 당, 0.6 치환기(R-MC) 및 2.4 히드록실기(R-OH)를 포함한다.

일 구체예에서, D는 1000 내지 2,000,000 Da의 몰중량을 갖고, 일 구체예에서, 70,000 Da 미만이다.

일 구체예에서, 상기 덱스트란 유도체는 b가 0.35보다 크거나 동일한 것인 식 (I)의 화합물로부터 선택된다.

이 경우, 및 일 구체예에 의하면, 상기 덱스트란 유도체는 a는 0.5 내지 0.8이고, c는 0.1 내지 0.5인 것인 상기 식 (I)의 화합물로부터 선택된다.

일 구체예에서, 상기 다당류는 히알루로난, 알기네이트 및 키토산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

이들 다양한 다당류는 하기와 같이 표현될 수 있다;

갈락투로난

히아루로난

R = 수소, 덱스트란

R = CH₂COOH 또는 수소, 카르복시메틸 덱스트란

키토산

알기네이트

상기 다당류는 10 내지 10,000의 평균 중합화 정도를 가질 수 있다.

일 구체예에서, 상기 다당류는 평균 10 내지 5,000의 평균 중합화 정도, m을 가질 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 다당류는 10 내지 500의 평균 중합화 정도, m을 가질 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 또한 상기 소수성 작용기 Hy가 지방산, 지방성 알코올, 지방성 아민, 벤질 아민, 콜레스테롤 유도체 및 페놀로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 콜레스테롤 유도체는 콜산이다.

다른 구체예에서, 상기 페놀은 알파-토코페롤이다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 양친매성 중합체-PDGF 복합체는 가역적이다.

사용되는 상기 중합체는 당업자에게 알려진 기술에 의해 합성되거나, 또는 예를 들어, Sigma-Aldrich, NOF Corp. 또는 CarboMer Inc.와 같은 공급자로부터 구매된다.

상기 PDGF는 당업자에게 알려진 기술에 의해 얻어지는 인간 재조합 PDGF로부터 선택되거나, 또는 예를 들어, Gentaur사 (미국) 또는 Research Diagnosis Inc. (미국)와 같은 공급자로부터 구매된다.

화학적 및 물리적인 안정화 모두의 입증은 구체적으로 하기 테스트를 이행하여 수행할 수 있다;

$ 겔 전기영동(Gel Mobility Shift Assay)에 의해 수행되는, 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 입증에 대한 테스트;

$ 프로테아제에 접촉시켜 수행되는, 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 효소에 의한 분해를 둔화시키는 것에 대한 테스트;

$ SDS-Page에 의해 수행되는, 생리학적 pH에서 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 물리적인 안정화에 대한 테스트.

또한 본 발명은 화학적 및 물리적 안정화의 입증을 위한 테스트, 즉 상기 복합체의 입증에 대한 테스트(Gel Mobility Shift Assay), 프로테아제에 접촉시켜 효소에 의한 분해의 둔화에 대한 테스트, SDS-Page에 의해 수행되는, 생리학적 pH에서의 물리적인 안정화에 대한 테스트를 통과하는 것을 특징으로 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

Gel Mobility Shift Assay에 의해 수행되는 상기 복합체의 입증에 대한 테스트는 전기장의 효과 하에서 이온의 이동(displacement)에 기반한다. 음이온성 복합체는 양극으로 이동하고, 양이온성 복합체는 음극으로 이동한다. 이동 후, 단백질은 PVDF 막 상으로 모세관 작용에 의해 전달되고 퍼록시다아제가 결합된 2차 항체에 의해 인식되는, 상기 단백질에 특이적인 항체에 의해 관찰된다. 상기 단백질 자체는 거의 또는 전혀 이동하지 않고, 양친매성 중합체와의 단백질 복합체는 상기 복합체의 전체 전하에 따라 양극 또는 음극으로 이동한다.

상기 효소에 의한 분해의 둔화에 대한 테스트는 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체가 프로테아제와 접촉된 후 상기 단백질의 무결성(integrity)의 확인에 기반한다. 프로테아제(트립신, 키모트립신 등)의 용액이 복합체 용액에 첨가되고 동역학(kinetics)이 결정된다. 상기 반응은 상기 효소에 특이적인 억제제(인돌, 벤자이미딘)의 첨가를 통해 정지된다. 그 후 상기 단백질의 무결성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Page)에 의해 분석된다.

PDGF의 물리적 안정화에 대한 테스트는 pH 7.4에서 PDGF 만의 용액과 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 용액을 용액 내의 단백질 농도에 의해 비교하여, 단백질의 무결성을 확인하는 것에 근거한다. 이들 두 용액을 주위 온도에서 48시간 동안 교반 장치(shaking bench)에 배치하고, 그 후 원심분리한다. 각각의 용액 내의 PDGF 농도는 SDS-Page에 의해 측정된다.

본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체는 상기 단백질을 변성시킬 수 있는 임의의 유기 용매를 사용하지 않고 생리학적 pH에서 수용액에 PDGF 및 양친매성 중합체를 용해시켜 생성된다. 상기 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 생성은 자발적이며 PDGF와 양친매성 중합체 사이의 어떠한 공유 결합도 포함하지 않는다. 이러한 결합은 본질적으로 소수성 및 이온성 상호작용인 약한 결합을 통해 일어난다.

또한 본 발명은 PDGF 및 양친매성 중합체가 생리학적인 pH인 용액 내에서 접촉되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 생성의 입증을 완료하기 위하여 다른 테스트가 구축될 수 있다.

$ 원형 2색성(dichroism)에 의해 결정되는, PDGF의 3차 구조의 유지에 대한 테스트;

$ 스트레스 하에서 생리학적 pH에서 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체 내의 PDGF의 안정성에 대한 테스트. 상기 스트레스는 특이한 교반 방법, 염의 존재 등일 수 있다.

또한 본 발명은 PDGF/양친매성 중합체 비율이 1/5 내지 1/5000인 것을 특징으로 하는 양친매성 중합체-PDGF 복합체에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 비율은 1/100 내지 1/5000이다.

다른 구체예에서, 상기 비율은 1/300 내지 1/700이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료학적 조성물에 관한 것이다.

상기 "치료학적 조성물(therapeutic composition)"이라는 용어는 인간용 약물 또는 수의학적 약물에 사용될 수 있는 조성물을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 국소 투여를 위한 겔, 크림, 스프레이, 분말 또는 패치의 제형일 수 있는 조성물이다.

본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체와 함께 제제화될 수 있는 부형제의 속성은 그의 제시 형태(presentation form)의 함수로서, 갈레닉스(galenics) 분야 전문가의 통상적인 지식에 의해 선택된다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물이 겔 제형으로 존재하는 경우, 겔 제형은 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오즈(CMC), 비닐 중합체, PEO-PPO 타입의 공중합체, 다당류, PEO, 아크릴아미드 또는 아크릴아미드 유도체와 같은 중합체로부터 제조되는 겔이다.

pH를 조절하기 위한 버퍼, 등장성을 조절하기 위한 작용제, 메틸 파라-히드록시벤조에이트, 프로필 파라-히드록시벤조에이트, m-크레솔 또는 페놀과 같은 보존제, 또는 그 밖의 L-라이신 히드로클로라이드와 같은 항산화제와 같은, 기타 부형제가 상기 제제의 파라미터를 조절하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 치료학적 조성물은 PDGF의 ml당 약 100 ㎍의 투여가 가능한 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 국소 적용에 의한 궤양 치료의 용도를 위한, 치료 작용을 갖는 치료학적 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 양친매성 중합체-PDGF 복합체의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 치료 부위에, 본 발명에 의한 양친매성 중합체-PDGF를 포함하는 치료학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 또는 수의학적 용도를 위한 치료학적 치료방법에 관한 것이다.

실시예 1 : PDGF-BB/DMCBSu 복합체

벤질아민으로 변형된 황산화 카르복시메틸 덱스트란(DMCBSu)의 합성

당류(saccharide) 유닛 당 카르복시메틸에 의한, 1.0의 치환도 및 40,000 g/mol의 평균 몰 질량을 갖는 카르복시메틸 덱스트란으로부터 양친매성 중합체를 합성했다. 상기 벤질아민을 수용성 카르보디이미드(carbodiimide)의 존재 하에 물에서 통상적인 커플링 방법으로 이 중합체의 산에 융합시켰다. ¹H NMR로 결정된, 당류 유닛 당 벤질아민에 의한, 상기 치환도는 0.4였다. 그 후 이 중합체를 SO₃/피리딘 중합체로 황화시켰다. 당류 유닛 당 설페이트에 의한, 치환도는 0.3이었다.

PDGF-BB/DMCBSu 복합체의 제조

0.1 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕를 50 mg/ml의 DMCBSu 용액 90㎕에 첨가했다. 상기 PDGF-BB 및 DMCBSu 용액을 pH 7.4 및 300 mOsm에서 완충했다. 이 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 서서히 교반한 후 4℃에서 보관했다.

PDGF-BB/DMCBSu 복합체 생성의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/DMCBSu 복합체 용액 10㎕를 아가로즈 겔 상에 로딩했다. 전기장의 효과(20OmA - 4 시간) 하에서 상기 화합물의 이동을 수행했다. 이동 후, 상기 PDGF-BB를 밤새 PVDF 막 상으로 전달시키고, 그 후 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움)에 의해 가시화되는 HRP 퍼록시 다아제에 결합된 항-염소 IgG 2차 항체에 결합하는, 염소 항-PDGF-BB 항체로 면역블롯링에 의해 관찰했다.

상기 PDGF-BB/DMCBSu 복합체는 양극으로 이동했다. 상기 복합체의 음전하는 상기 복합체가 PDGF-BB보다 DMCBSu가 훨씬 더 풍부한 조성물을 갖는다는 사실에 의해 설명될 수 있다. PDGF-BB만으로 구성된 대조군은 이동하지 않았다.

PDGF/DMCBSu 복합체 용액의 안정성 입증

pH 7.4, 0.01 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕ 및 상기 기술된 pH 7.4의 PDGF-BB/DMCBSu 복합체 용액 10㎕를 주위 온도에서 48시간 동안 교반 장치에 놓았다. 원심분리 후, 각 용액에서의 PDGF-BB 농도를 SDS-Page로 측정했다. PDGF-BB/DMCBSu 복합체의 경우에 있어서 용액 내의 PDGF-BB의 농도는 변하지 않았고, 반면에 PDGF-BB만의 용액 내의 농도는 감소하는 것으로 나타났다.

상기 PDGF-BB/DMCBSu 복합체에서 트립신에 대한 PDGF-BB 보호의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/DMCBSu 복합체의 용액 10㎕를 37℃, 10 ng/ml의 트립신 용액 90㎕에 첨가했다.

10㎕의 샘플을 매 30분마다 취하고 10㎍/ml의 인돌 용액 10㎕를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 PDGF-BB의 농도를 Elisa로 측정했다.

이들 동력학은 상기 PDGF-BB 단독은 1시간 30분 내에 완전하게 분해되었고, 반면에 PDGF-BB/DMCBSu 복합체에서는 그렇지 않았다는 것을 보여주었다.

PDGF-BB/DMCBSu 복합체의 생물학적 활성의 확인

CO₂ (5%)가 풍부하고 포화 습도인 대기에서 송아지 태반 혈장(FCS) 10% 및 페니실린-스트렙토마이신 1%를 포함하는 αMEM 배지에서 37℃에서 인간 피부 섬유아세포(성인 피부 섬유아세포(HDFa))의 1차 배양을 수행했다. 배지를 4일마다 교체했다. 그 후 상기 96-웰 플레이트(Nunc 사)에 5000개의 세포/웰의 농도로 배양 접시에 접종하기 위해 배양 배지의 세포 현탁액의 희석액을 준비했다.

각 배치(batch)의 세포에 대해, 상기 복합체의 다양한 농도에 의한 PDGF-BB-안정화 효과를 트리티움화 티미딘(100㎕ 내 5000개의 세포/웰)의 결합에 의해 확인했다. 24시간의 중지(withdrawal) 후, 상기 섬유아세포를 상기 양친매성 중합체의 부재 또는 1㎕/ml의 농도에서의 존재 하에, 0.1 내지 100 ng/ml의 다양한 농도의 PDGF-B 첨가로 자극했다. 상기 트리티움화 티미딘 결합을 상기 복합체의 존재 또는 부재하에서 PDGF-BB에 의한 자극 후 18시간 후에, 50μCi/ml의 용액, 즉, 0.5μCi/웰의 용액 첨가로 수행했다. 방사성활성을 카운팅 바이알에서 회수하고, 상기 웰을 100㎕의 100mM NaOH로 세척하고, 자동 카운터 상에서, 1ml 섬광 액체(scintillation fluid)(Zinsser Analytic)를 첨가한 후 카운팅했다.

산출된 결과를 섬유아세포에 결합된 트리티움화 티미딘의 양(Dpm×10³)이 ㎍/ml으로 표시된 PDGF-BB의 농도의 함수로 표현된 것인, 첨부된 도 1에 나타냈다.

실선 곡선은 덱스트란 유도체의 1㎍/ml의 농도에서 본 발명에 따른 상기 복 합체의 결과를 나타내고, 점선 곡선은 상기 덱스트란 유도체의 부재시의 결과를 나타낸다.

ED50은 인간 섬유아세포의 50% 증식을 얻기 위한 PDGF-BB의 농도에 해당한다. 비율 R은 상기 ED50 값의 비율이고, 이는 하기의 식에 의해 계산된다.

R = ED50 (PDGF-BB)/ED50 (PDGF-BB + DMCBSu)

이들 결과는 PDGF-BB가 단독으로 사용되는 경우, 50% 증식을 얻기 위해 6 ㎍/ml의 PDGF를 사용하는 것이 필요하지만, 반면에 상기 PDGF-BB가 식 (I)의 덱스트란 유도체와 복합체를 형성하는 경우, 50% 증식을 달성하기 위해 2㎍/ml가 충분하다는 것을 보여준다. 이 경우, 상기 비율 R은 3이다.

실시예 2 : PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체

트립토판 메틸 에스테르로 변형된 카르복시메틸 덱스트란(DMCTrpOMe)의 합성

당류 유닛 당 카르복시메틸에 의한, 1.0의 치환도 및 40,000 g/mol의 평균 몰 질량을 갖는 카르복시메틸 덱스트란으로부터 양친매성 중합체를 합성했다. 상기 트립토판 메틸 에스테르를 수용성 카르보디이미드의 존재 하에 물에서 통상적인 커플링 방법으로 이 중합체의 산에 융합시켰다. ¹H NMR로 결정된, 당류 유닛 당 트립토판에 의한, 상기 치환도는 0.3이었다.

PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체의 제조

0.1 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕을 50 mg/ml의 DMCTrpOMe 용액 90㎕에 첨가했다. 상기 PDGF-BB 및 DMCTrpOMe 용액을 pH 7.4 및 300 mOsm에서 완충했다. 이 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 서서히 교반한 후 4℃에서 보관했다.

PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체 생성의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체 용액 10㎕를 면역학적 가시화를 갖는 겔 전기영동을 위해 아가로즈 겔 상에 로딩했다. 전기장의 효과(20OmA - 4 시간) 하에서 상기 화합물을 이동시켰다. 이동 후, 상기 PDGF-BB를 밤새 PVDF 막 상으로 전달시켰고, 그 후 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움)에 의해 가시화되는, 퍼록시다아제에 결합된 항-염소 IgG 2차 항체에 결합하는, 염소 항-PDGF-BB 항체에 의한 면역블롯팅에 의해 관찰했다.

상기 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체는 양극으로 이동했다. 상기 복합체의 음전하는 그의 조성물이 PDGF-BB보다 DMCTrpOMe가 훨씬 풍부하다는 사실에 의해 설명될 수 있다. PDGF-BB만으로 구성된 대조군은 이동하지 않았다.

PDGF/DMCTrpOMe 복합체 용액의 안정성 입증

pH 7.4, 0.01 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕ 및 상기 기술된 pH 7.4의 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체 용액 10㎕를 주위 온도에서 48시간 동안 교반 장치에 놓았다. 각 용액에서의 PDGF-BB 농도를 SDS-Page로 측정했다. PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체의 경우 용액 내 PDGF-BB의 농도는 변하지 않았지만, 반면에 PDGF-BB만의 용액 내 농 도는 감소하는 것으로 나타났다.

상기 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체에서 트립신에 대한 PDGF-BB 보호의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체의 용액 10㎕을 37℃에서, 10ng/ml의 트립신 용액 90㎕와 함께 반응시켰다. 10㎕의 샘플을 매 30분마다 취하고 10㎍/ml의 인돌 용액 10㎕를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 PDGF-BB의 구조적 무결성을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Page)으로 측정했다.

이들 동력학은 상기 PDGF-BB 단독은 1시간 30분 내에 완전하게 분해되나, 반면에 PDGF-BB/DMCTrpOMe 복합체에서는 그렇지 않았다는 것을 보여준다.

실시예 3 : PDGF-BB/CMCBSu 복합체

벤질아민으로 변형된 황산화 카르복시메틸셀룰로오즈(CMCBSu)의 합성

당류 유닛 당 카르복시메틸에 의한, 1.2의 치환도 및 30,000 g/mol의 평균 몰 질량을 갖는 카르복시메틸셀룰로오즈로부터 양친매성 중합체를 합성했다. 상기 벤질아민을 수용성 카르보디이미드의 존재 하에 물에서 통상적인 커플링 방법으로 이 중합체의 산에 융합시켰다. ¹H NMR로 결정된, 당류 유닛 당 벤질아민에 의한, 치환도는 0.2였다. 상기 황화를 SO₃-피리딘 복합체의 존재 하에서 수행했고, 설페이트에 의한 치환도는 0.30이었다.

PDGF-BB/CMCBSu 복합체의 제조

0.1 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕를 50 mg/ml의 CMCB 용액 90㎕에 첨가했다. 상기 PDGF-BB 및 CMCBSu 용액을 pH 7.4 및 300mOsm에서 완충했다. 이 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 서서히 교반한 후 4℃에서 보관했다.

PDGF-BB/CMCBSu 복합체 생성의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/CMCBSu 복합체 용액 10㎕를 면역학적 가시화를 갖는 겔 전기영동을 위해 아가로즈 겔 상에 로딩했다. 전기장의 효과(20OmA - 4 시간) 하에서 상기 화합물을 이동시켰다. 이동 후, 상기 PDGF-BB를 밤새 PVDF 막 상으로 전달시켰고, 그 후 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움)에 의해 가시화되는 HRP 퍼록시다아제에 결합된 항-염소 IgG 2차 항체에 결합하는, 염소 항-PDGF-BB 항체에 의한 면역블롯팅에 의해 관찰했다.

상기 PDGF-BB/CMCBSu 복합체는 양극으로 이동했다. 상기 복합체의 음전하는 그의 조성물에서 PDGF-BB보다 CMCBSu가 훨씬 더 풍부하다는 사실로 설명될 수 있다. PDGF-BB만으로 구성된 대조군은 이동하지 않았다.

PDGF/CMCBSu 복합체의 안정성 입증

pH 7.4, 0.01 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕ 및 상기 기술된 pH 7.4의 PDGF-BB/CMCBSu 중합체의 용액 10㎕을 주위 온도에서 48시간 동안 교반 장치에 놓았다. 원심분리 후에 각 용액에서의 PDGF-BB 농도를 SDS-Page로 측정했다. PDGF- BB/CMCBSu 복합체의 경우 용액 내 PDGF-BB의 농도는 변하지 않았고, 반면에 PDGF-BB만의 용액 내 농도는 감소하는 것으로 나타났다.

PDGF-BB/CMCBSu 복합체에서 트립신에 대한 PDGF-BB의 보호의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/CMCBSu 복합체의 용액 10㎕를 37℃에서 10ng/ml의 트립신 용액 90㎕과 함께 반응시켰다. 10㎕의 샘플을 매 30분마다 취하고 10㎍/ml에 인돌 용액 10㎕를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 PDGF-BB의 구조적 무결성을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Page)으로 측정했다.

이들 동력학은 상기 PDGF-BB 단독은 1시간 30분 내에 완전하게 분해되나, 반면에 PDGF-BB/CMCBSu 복합체에서는 그렇지 않았다는 것을 보여주었다.

반대 실시예(counter example) 1 : PDGF-BB/CMCB 복합체

벤질아민으로 변형된 카르복시메틸셀룰로오즈(CMCB)의 합성

당류 유닛 당 카르복시메틸에 의한, 1.2의 치환도 및 30,000 g/mol의 평균 몰 질량을 갖는 카르복시메틸 셀룰로오즈로부터 양친매성 중합체를 합성했다. 상기 벤질아민을 수용성 카르보디이미드의 존재 하에 물에서 통상적인 커플링 방법으로 상기 중합체의 산에 융합시켰다. ¹H NMR로 결정된, 당류 유닛 당 벤질아민에 의한, 치환도는 0.2였다.

PDGF-BB/CMCB 복합체의 제조

0.1 mg/ml의 PDGF-BB 용액 10㎕를 50 mg/ml의 CMCB 용액 90㎕에 첨가했다. 상기 PDGF-BB CMCB 용액을 pH 7.4 및 300 mOsm에서 완충했다. 이 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 서서히 교반한 후 4℃에서 보관했다.

PDGF-BB/CMCB 복합체의 불-형성(non-formation)의 입증

상기 기술된 PDGF-BB/CMCB 복합체 용액 10㎕를 면역학적 가시화를 갖는 겔 전기영동을 위해 아가로즈 겔 상에 로딩했다. 전기장의 효과(20OmA - 4 시간) 하에서 상기 화합물을 이동시켰다. 이동 후, 상기 PDGF-BB를 밤새 PVDF 막 상으로 전달시켰고, 그 후 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움)에 의해 가시화되는, HRP 퍼록시다아제에 결합된 항-염소 IgG 2차 항체에 결합하는, 염소 항-PDGF-BB 항체에 의한 면역블롯팅에 의해 관찰했다.

상기 양친매성 중합체를 갖는 PDGF-BB 단독의 어떠한 이동도 관찰되지 않았다. 상기 CMCB와 PDGF-BB 사이에서 어떠한 복합체의 생성도 없었다.

Claims

물리적 및 화학적으로 안정하고, 수용성인, 양친매성 중합체-PDGF-BB 복합체로서, 상기 양친매성 중합체는 하기 일반식을 갖는, 소수성 치환기 및 친수성 작용기로 기능화된 친수성 중합체 골격으로 구성되며:

식 중에서,

ㆍ 중합체는 덱스트란 및 셀룰로오즈로 구성되는 군으로부터 선택되고,

ㆍ R 및 R'은, 선택적으로 하나 이상의 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자를 포함하는 분지되거나, 불포화되거나, 또는 분지되고 불포화된 1개 내지 18개의 탄소를 포함하는 결합 또는 사슬이고,

R 및 R'은 서로 동일하거나 상이하며,

ㆍ F 및 F'은 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카르보네이트, 카르바메이트, 에테르, 티오에테르, 및 아민으로 구성된 군으로부터 선택되고,

F 및 F'은 서로 동일하거나 상이하고,

ㆍ X는 카르복실레이트, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 친수성 작용기이고,

ㆍ Y는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 친수성 작용기이고,

ㆍ Hy는 선택적으로 불포화되거나, 하나 이상의 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자를 포함하거나, 또는 선택적으로 불포화되고 하나 이상의 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자를 포함하는, C₈ 내지 C₃₀의 선형 또는 분지된 알킬,

선택적으로 불포화되거나, 선택적으로 헤테로원자를 포함하거나, 또는 선택적으로 불포화되고 헤테로원자를 포함하는, C₈ 내지 C₁₈의 선형 또는 분지된 알킬아릴 또는 아릴알킬 및,

선택적으로 불포화된 C₈ 내지 C₃₀의 폴리사이클로 구성되는 군으로부터 선택되는, 소수성 작용기이며,

n 및 o는 1 내지 3이고,

h는 0.01 내지 0.5의 단량체 유닛에 관한 소수성 유닛의 몰 분율을 나타내고,

x는 0 내지 2.0의 단량체 유닛에 관한 친수성 유닛의 몰 분율을 나타내고,

y는 0 내지 0.5의 단량체 유닛에 관한 친수성 유닛의 몰 분율을 나타내며,

상기 PDGF-BB는 PDGF(혈소판-유래 성장 인자)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 PDGF-BB는 2개의 B 사슬을 포함하는 인간 재조합 PDGF(rhPDGF-BB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 중합체는 치환기가 랜덤하게 분포되는 중합체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 소수성 작용기 Hy는 지방산, 지방성 알코올, 지방성 아민, 벤질 아민, 콜레스테롤 유도체 및 페놀로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 셀룰로오즈로 구성된 군은 산으로 기능화된 셀룰로오즈로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 덱스트란으로 구성된 군은 산으로 기능화된 덱스트란으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 중합체는 트립토판 메틸 에스테르로 변형된 카르복시메틸 덱스트란인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양친매성 중합체-PDGF-BB 복합체의 형성은 가역적인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 화학적 및 물리적 안정화의 입증을 위한 테스트를 통과하는 것을 특징으로 하는 복합체.
제9항에 있어서, 상기 화학적 및 물리적 안정화의 입증을 위한 테스트는 상기 복합체의 입증에 대한 테스트(Gel Mobility Shift Assay), 프로테아제에 접촉시켜 효소에 의한 분해를 둔화시키는 것에 대한 테스트 및 SDS-Page에 의해 수행되는 생리학적 pH에서의 물리적인 안정화에 대한 테스트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDGF-BB/양친매성 중합체 비율은 1/5 내지 1/5000인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDGF-BB/양친매성 중합체 비율은 1/100 내지 1/5000인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDGF-BB/양친매성 중합체 비율은 1/300 내지 1/700인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 양친매성 중합체/PDGF-BB 복합체의 제조방법으로서, 상기 중합체/PDGF-BB 복합체는 수성 매질에서, 단백질을 변성시킬 수 있는 유기 용매의 부재 하에 제조되는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 양친매성 중합체-PDGF-BB 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 만성적인 상처를 치료하기 위한 치료용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 치료용 조성물은 PDGF-BB의 ml당 100 ㎍의 투여가 가능한 것을 특징으로 하는 치료용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 적용에 의한 궤양 치료에서의 사용을 위한 복합체.
제1항에 있어서, 상기 셀룰로오즈는 카르복시메틸 셀룰로오즈인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 덱스트란은 카르복시메틸 덱스트란인 것을 특징으로 하는 복합체.
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