JP2763815B2 - 表皮成長因子を含有する安定化された組成物 - Google Patents
表皮成長因子を含有する安定化された組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト表皮成長因子（EGF）を含有する製剤
学的組成物、およびこのような組成物を調製とする方法
に関する。とくに、本発明は、金属カチオン、例えば、
亜鉛と組み合わせた結果、増加した安定性を有するこの
ような製剤学的組成物に関する。
学的組成物、およびこのような組成物を調製とする方法
に関する。とくに、本発明は、金属カチオン、例えば、
亜鉛と組み合わせた結果、増加した安定性を有するこの
ような製剤学的組成物に関する。
本発明は、要約すれば、次の通りである：本発明は、
製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（EGF）および、
前記EGFの劣化を防止するために十分な量の製剤学的に
許容されうる金属、カチオンからなる製剤学的組成物を
提供する。
製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（EGF）および、
前記EGFの劣化を防止するために十分な量の製剤学的に
許容されうる金属、カチオンからなる製剤学的組成物を
提供する。
ヒトEGF（また、ウロガストロンとして知られてい
る）は、上皮細胞および間葉細胞を包含する、ある種の
種類の細胞についてミトゲン活性を有する、53アミノ酸
のポリペプチドの成長因子である。ヒトEGFポリペプチ
ドの変異型、例えば、52アミノ酸のガンマ−ウロガスト
ロンは報告された。EGFは、そのミトゲン効果の結果、
創傷の治癒速度の増加において有用であると報告され
た。EGFは、また、胃潰瘍の処置に有用であると、報告
された。EGFの概観は次の文献に記載されている：カー
ペンター（Carpenter） et al.、「表皮成長因子、そ
の受容体および関係するタンパク質（Epidermal Growt
h Factor,Its Receptor and Related Protein
s）」、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp.Cel
l Res.）、164:1−10（1986）。
る）は、上皮細胞および間葉細胞を包含する、ある種の
種類の細胞についてミトゲン活性を有する、53アミノ酸
のポリペプチドの成長因子である。ヒトEGFポリペプチ
ドの変異型、例えば、52アミノ酸のガンマ−ウロガスト
ロンは報告された。EGFは、そのミトゲン効果の結果、
創傷の治癒速度の増加において有用であると報告され
た。EGFは、また、胃潰瘍の処置に有用であると、報告
された。EGFの概観は次の文献に記載されている：カー
ペンター（Carpenter） et al.、「表皮成長因子、そ
の受容体および関係するタンパク質（Epidermal Growt
h Factor,Its Receptor and Related Protein
s）」、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp.Cel
l Res.）、164:1−10（1986）。
EGFの治療学的使用における重要な目的は、長い貯蔵
寿命を有しそして、長い時間にわたってEGFの主として
活性な単一の種としてとどまることができる、安定な製
剤学的EGFの配合物の開発である。しかしながら、EGFの
固有の不安定性のために、このような安定なEGF配合物
の開発において困難に直面した。例えば、EGFは湿気の
存在下に生物学的活性を損失する。米国特許第4,717,71
7号は、このような生物学的活性の損失に対してEGFを安
定化する組成物および方法を記載している。また、ヒト
EGFは経時的に活性を損失しそして、高性能液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により同定された、EGF分子の多
数の種を産生する。EGFのこれらの多数の種は、EGFの化
学的変性から生ずる、EGFまたは誘導の劣化から生ずる
破壊産生物であると信じられる。少なくとも３つのこの
ような劣化産生物が存在すると信じられ、それらのある
ののまたはすべてはEGF生物学的活性を有する。45℃に
おけるEGFのインキュベーションは、周囲温度における
長期間の貯蔵で通常発見される劣化産生物の形成を促進
する。このような劣化、およびEGFの生物学的活性の関
連する損失は、EGFの水性または固定の調製物の延長し
た時間にわたって貯蔵することを不可能とするので、不
利である。
寿命を有しそして、長い時間にわたってEGFの主として
活性な単一の種としてとどまることができる、安定な製
剤学的EGFの配合物の開発である。しかしながら、EGFの
固有の不安定性のために、このような安定なEGF配合物
の開発において困難に直面した。例えば、EGFは湿気の
存在下に生物学的活性を損失する。米国特許第4,717,71
7号は、このような生物学的活性の損失に対してEGFを安
定化する組成物および方法を記載している。また、ヒト
EGFは経時的に活性を損失しそして、高性能液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により同定された、EGF分子の多
数の種を産生する。EGFのこれらの多数の種は、EGFの化
学的変性から生ずる、EGFまたは誘導の劣化から生ずる
破壊産生物であると信じられる。少なくとも３つのこの
ような劣化産生物が存在すると信じられ、それらのある
ののまたはすべてはEGF生物学的活性を有する。45℃に
おけるEGFのインキュベーションは、周囲温度における
長期間の貯蔵で通常発見される劣化産生物の形成を促進
する。このような劣化、およびEGFの生物学的活性の関
連する損失は、EGFの水性または固定の調製物の延長し
た時間にわたって貯蔵することを不可能とするので、不
利である。
本発明は、EGF分子の劣化および生物学的活性の生ず
る損失を減少する手段を提供する。
る損失を減少する手段を提供する。
本発明は、製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（EG
F）および前記EGFの劣化を防止するために十分な量の製
剤学的に許容されうる金属カチオンからなる製剤学的組
成物を提供する。好ましい実施態様において、金属カチ
オンは二価の亜鉛イオンである。また、劣化および生物
学的活性損失に対して安定化された亜鉛およびEGFの複
合体の塩からなる、結晶質EGF組成物が提供される。本
発明は、さらに、EGFの劣化を防止することができる、
適当な金属カチオンとEGFを混合することによって、EGF
を安定化する方法を提供する。
F）および前記EGFの劣化を防止するために十分な量の製
剤学的に許容されうる金属カチオンからなる製剤学的組
成物を提供する。好ましい実施態様において、金属カチ
オンは二価の亜鉛イオンである。また、劣化および生物
学的活性損失に対して安定化された亜鉛およびEGFの複
合体の塩からなる、結晶質EGF組成物が提供される。本
発明は、さらに、EGFの劣化を防止することができる、
適当な金属カチオンとEGFを混合することによって、EGF
を安定化する方法を提供する。
ヒトEGFは、次の文献に記載されているような、ポリ
ペプチド配列またはそれらの任意の実質的な部分を有す
るEGFを呼ぶ：ウルデア（Urdea）、M.S.et al.、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80:6461
−6465（1983）。ヒトEGFは、また、ヒトEGF変異型、例
えば、ガンマ−ウロガストロンを呼ぶ。EGFは、組み換
えDNA技術を使用して産生されたか、あるいは化学的合
成により調製された、自然源から分離することができ
る。EGFの生物学的活性な断片、類似体または人造の化
学的合成された誘導体を、全体の天然に産生する分子の
代わりに、本発明において使用することができるが、た
だしこのような断片、類似体または誘導体は天然に産生
するEGFの生物学的活性を保持することを条件とする。E
GFの生物学的活性は、上皮細胞および間葉細胞について
のミトゲン活性および胃酸分泌の抑制を呼ぶ。ここで使
用するとき、EGFは、前述の方法および生物学的に活性
な断片、類似体または誘導体および関係するそれらのポ
リペプチドにより産生されるEGFを包含する。
ペプチド配列またはそれらの任意の実質的な部分を有す
るEGFを呼ぶ：ウルデア（Urdea）、M.S.et al.、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80:6461
−6465（1983）。ヒトEGFは、また、ヒトEGF変異型、例
えば、ガンマ−ウロガストロンを呼ぶ。EGFは、組み換
えDNA技術を使用して産生されたか、あるいは化学的合
成により調製された、自然源から分離することができ
る。EGFの生物学的活性な断片、類似体または人造の化
学的合成された誘導体を、全体の天然に産生する分子の
代わりに、本発明において使用することができるが、た
だしこのような断片、類似体または誘導体は天然に産生
するEGFの生物学的活性を保持することを条件とする。E
GFの生物学的活性は、上皮細胞および間葉細胞について
のミトゲン活性および胃酸分泌の抑制を呼ぶ。ここで使
用するとき、EGFは、前述の方法および生物学的に活性
な断片、類似体または誘導体および関係するそれらのポ
リペプチドにより産生されるEGFを包含する。
EGFの用語「類似体」は、１または２以上のアミノ酸
が化学的に類似するアミノ酸で置換されている、EGFに
実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを呼
ぶ。用語「類似体」は、また、１または２以上のアミノ
酸がEGFのポリペプチドから欠失されているか、あるい
はそれに付加されたいるが、なおEGFに対するアミノ酸
の実質的相同性保持する、ポリペプチドを包含するであ
ろう。実質的な配列の相同性は50％より大きい相同性で
ある。EGFの用語「断片」は、少なくとも10のアミノ酸
残基およびEGFと同一の生物学的活性を有する、EGFのよ
り短いバージョン（version）を呼ぶ。句「化学的誘導
体」は、１または２以上のアミノ酸がアミノ酸の官能的
側基の反応により合成的に化学的に誘導化された、天然
に産生するEGFのポリペプチドから誘導されるポリペプ
チドを呼ぶ（すなわち、それは１または２以上の工程に
より親EGF分子から誘導される）。
が化学的に類似するアミノ酸で置換されている、EGFに
実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを呼
ぶ。用語「類似体」は、また、１または２以上のアミノ
酸がEGFのポリペプチドから欠失されているか、あるい
はそれに付加されたいるが、なおEGFに対するアミノ酸
の実質的相同性保持する、ポリペプチドを包含するであ
ろう。実質的な配列の相同性は50％より大きい相同性で
ある。EGFの用語「断片」は、少なくとも10のアミノ酸
残基およびEGFと同一の生物学的活性を有する、EGFのよ
り短いバージョン（version）を呼ぶ。句「化学的誘導
体」は、１または２以上のアミノ酸がアミノ酸の官能的
側基の反応により合成的に化学的に誘導化された、天然
に産生するEGFのポリペプチドから誘導されるポリペプ
チドを呼ぶ（すなわち、それは１または２以上の工程に
より親EGF分子から誘導される）。
EGFの「製剤学的的に有効量」は、種々の投与の養生
法において治療学的効果を与える量を呼ぶ。例えば、創
傷の治癒に使用するとき、それは創傷の治癒速度を増強
する量である。約0.01〜約1,000μg/ml水性配合物の範
囲内の量のEGFを含有する、本発明の組成物を、調製す
ることができる。好ましくは、濃度は１〜500μg/ml、
より好ましくは１〜100μg/mlの範囲である。
法において治療学的効果を与える量を呼ぶ。例えば、創
傷の治癒に使用するとき、それは創傷の治癒速度を増強
する量である。約0.01〜約1,000μg/ml水性配合物の範
囲内の量のEGFを含有する、本発明の組成物を、調製す
ることができる。好ましくは、濃度は１〜500μg/ml、
より好ましくは１〜100μg/mlの範囲である。
前述のように、EGFは経時的に劣化して、劣化した産
生物であると信じられるEGF分子の多種の種を形成す
る。EGFの劣化は、自然の老化プロセスを呼び、このプ
ロセスにより出発物質として使用するEGF分子の分子構
造（例えば、53アミノ酸の形態またはその変異型）は、
（ａ）化学的に変性して、天然に産出するまたは環境的
に誘発された化学反応、例えば、異性化、酸化または脱
アミド化の結果として、EGF変異型を形成するか、ある
いは（ｂ）破壊または分解してより小さい分子となる。
このような劣化は、次の環境的因子の結果として自然に
起こる：例えば、光、これは光酸化を引き起こし得る;p
Hの変化；イオン強度の変化；温度の変化；および分子
の物理学的操作。３つのこのような劣化産生物はこの時
点において同一された。第１図はEGFの逆相HPLCのクロ
マトグラムを描写し、逆相HPLC上に自然EGF（ピーク
Ｄ）、ならびに３つの劣化産生物（ピークＣ、Ｘおよび
Ｙ）を示す。EGFの主要な老化産生物は、ピークＸおよ
びＹにより表されるものであると思われる。本発明は、
ピークＸおよびＹの形成を形成することが示され、こう
してEGFの主に活性な種の維持に寄与し、すなわち、出
発物質の90％より多くは不変化である。
生物であると信じられるEGF分子の多種の種を形成す
る。EGFの劣化は、自然の老化プロセスを呼び、このプ
ロセスにより出発物質として使用するEGF分子の分子構
造（例えば、53アミノ酸の形態またはその変異型）は、
（ａ）化学的に変性して、天然に産出するまたは環境的
に誘発された化学反応、例えば、異性化、酸化または脱
アミド化の結果として、EGF変異型を形成するか、ある
いは（ｂ）破壊または分解してより小さい分子となる。
このような劣化は、次の環境的因子の結果として自然に
起こる：例えば、光、これは光酸化を引き起こし得る;p
Hの変化；イオン強度の変化；温度の変化；および分子
の物理学的操作。３つのこのような劣化産生物はこの時
点において同一された。第１図はEGFの逆相HPLCのクロ
マトグラムを描写し、逆相HPLC上に自然EGF（ピーク
Ｄ）、ならびに３つの劣化産生物（ピークＣ、Ｘおよび
Ｙ）を示す。EGFの主要な老化産生物は、ピークＸおよ
びＹにより表されるものであると思われる。本発明は、
ピークＸおよびＹの形成を形成することが示され、こう
してEGFの主に活性な種の維持に寄与し、すなわち、出
発物質の90％より多くは不変化である。
本発明の方法は、また、亜鉛の結合で活性アミノ酸残
基の遮断により他のタンパク質を安定化することができ
ると考えられる。このような他のタンパク質は、タンパ
ク質構成体内のアミノ酸残基が劣化産生物、例えば、異
性化した中間体を安定化する作用をするものを包含す
る。また、このような他のタンパク質は、EGFに対して
同様な作用するアミノ酸ドメインを有するもの、例え
ば、他の他の成長因子、例えば、線維芽成長因子を包含
する。
基の遮断により他のタンパク質を安定化することができ
ると考えられる。このような他のタンパク質は、タンパ
ク質構成体内のアミノ酸残基が劣化産生物、例えば、異
性化した中間体を安定化する作用をするものを包含す
る。また、このような他のタンパク質は、EGFに対して
同様な作用するアミノ酸ドメインを有するもの、例え
ば、他の他の成長因子、例えば、線維芽成長因子を包含
する。
過去において、ある種の濃度の亜鉛は中性インスリン
溶液へ安定化作用を及ぼすことが報告された。参照、米
国特許第4,476,118号；およびラーフヒード（Loughee
d）、W.D.、ダイアベトロギア（Diabetologia）19:1−
９（1980）。しかしながら、亜鉛はインスリン分子の劣
化（その用語がここで使用されるように）を防止するた
めに使用されなかったが、むしろ溶液からの凝集したイ
ンスリンの沈澱を防止した。インスリンは不均質に凝集
し、そしてより大きい分子量の凝集物、例えば、インス
リンヘキサマーを形成する傾向があり、そして前記凝集
物は非常には可溶性ではなく、そして溶液から沈澱する
傾向がある。亜鉛は、インスリンの可溶性がより低いヘ
キサマーの形態をより可溶性とすることによって、それ
を「安定化した」。亜鉛のこのような安定化作用を報告
した早期の参考文献において、インスリンは経時的生物
学的活性の有意の減少を示すことが報告されていないの
で、用語「安定化」は溶解度の増加を意味するために使
用されたが、劣化を意味するために使用されなかった。
亜鉛は、また、インスリンおよび亜鉛−インスリン結晶
の形成のための結晶化促進金属として使用された。参
照、米国特許第4,764,592号。
溶液へ安定化作用を及ぼすことが報告された。参照、米
国特許第4,476,118号；およびラーフヒード（Loughee
d）、W.D.、ダイアベトロギア（Diabetologia）19:1−
９（1980）。しかしながら、亜鉛はインスリン分子の劣
化（その用語がここで使用されるように）を防止するた
めに使用されなかったが、むしろ溶液からの凝集したイ
ンスリンの沈澱を防止した。インスリンは不均質に凝集
し、そしてより大きい分子量の凝集物、例えば、インス
リンヘキサマーを形成する傾向があり、そして前記凝集
物は非常には可溶性ではなく、そして溶液から沈澱する
傾向がある。亜鉛は、インスリンの可溶性がより低いヘ
キサマーの形態をより可溶性とすることによって、それ
を「安定化した」。亜鉛のこのような安定化作用を報告
した早期の参考文献において、インスリンは経時的生物
学的活性の有意の減少を示すことが報告されていないの
で、用語「安定化」は溶解度の増加を意味するために使
用されたが、劣化を意味するために使用されなかった。
亜鉛は、また、インスリンおよび亜鉛−インスリン結晶
の形成のための結晶化促進金属として使用された。参
照、米国特許第4,764,592号。
ここで使用するとき、用語「亜鉛」、「亜鉛陽イオ
ン」、または「亜鉛イオン」のすべては、二価の亜鉛イ
オンを意味する。本発明は亜鉛の二価陽イオンの使用に
より例示されるが、他の適当な陽イオンは同一効果を達
成することができると考えられる。このような適当な陽
イオンは「製薬学的に許容されうる」ものでなくてはな
らなず、これは前記陽イオンがヒトに対して無毒であり
かつ、ヒトに投与したとき、有害なまたは望ましくない
副作用をもたないことを意味する。このような適当な陽
イオンはEGFの劣化を引き起こしてはならず、むしろこ
のような劣化を防止することができなくてはならない。
また、このような陽イオンはフリーラジカルの形成を引
き起こすか、あるいは誘発してはならない。また、陽イ
オンはEGFの生物学的活性に悪影響を及ぼしてはなら
ず、むしろこのような性質を維持しなくてはならない。
こうして、適当な陽イオンは、製剤学的に許容されうる
ことができ、フリーラジカルの形成を引き起こさず、そ
してEGFの生物学的活性の防止性質およびEGFの生物学的
活性を維持する性質を有するものである。このような性
質を有する一価、二価または三価の陽イオンは本発明の
範囲内であると考えられる。ランタン（三価）はEGFを
使用する結晶質沈澱を形成することが示された。次の物
質の陽イオンは、フリーラジカルの形成を引き起こない
ので、適当ではない：マンガン、銅、鉄およびコバル
ト。適当でありうる他の陽イオンは、マンガン、カルシ
ウム、カドミウム、ニッケル、スズ、カリウムおよびリ
チウム。
ン」、または「亜鉛イオン」のすべては、二価の亜鉛イ
オンを意味する。本発明は亜鉛の二価陽イオンの使用に
より例示されるが、他の適当な陽イオンは同一効果を達
成することができると考えられる。このような適当な陽
イオンは「製薬学的に許容されうる」ものでなくてはな
らなず、これは前記陽イオンがヒトに対して無毒であり
かつ、ヒトに投与したとき、有害なまたは望ましくない
副作用をもたないことを意味する。このような適当な陽
イオンはEGFの劣化を引き起こしてはならず、むしろこ
のような劣化を防止することができなくてはならない。
また、このような陽イオンはフリーラジカルの形成を引
き起こすか、あるいは誘発してはならない。また、陽イ
オンはEGFの生物学的活性に悪影響を及ぼしてはなら
ず、むしろこのような性質を維持しなくてはならない。
こうして、適当な陽イオンは、製剤学的に許容されうる
ことができ、フリーラジカルの形成を引き起こさず、そ
してEGFの生物学的活性の防止性質およびEGFの生物学的
活性を維持する性質を有するものである。このような性
質を有する一価、二価または三価の陽イオンは本発明の
範囲内であると考えられる。ランタン（三価）はEGFを
使用する結晶質沈澱を形成することが示された。次の物
質の陽イオンは、フリーラジカルの形成を引き起こない
ので、適当ではない：マンガン、銅、鉄およびコバル
ト。適当でありうる他の陽イオンは、マンガン、カルシ
ウム、カドミウム、ニッケル、スズ、カリウムおよびリ
チウム。
ここで使用するとき、「亜鉛−EGF」または「亜鉛−E
GF複合体」は、亜鉛がEGFに配位結合をしている複合体
のイオンを意味する。水溶液において、亜鉛−EGF複合
体はpH4.0〜7.0、好ましくは5.5〜6.0の範囲内に維持し
なくてはならない。この範囲外では、亜鉛−EGF複合体
はモノマーのEGFおよび亜鉛陽イオンに解離する。こう
して、亜鉛−EGFの水溶液を緩衝化してこのようなpHを
維持することが好ましい。pHを4.0〜7.0、好ましくは5.
5〜6.0の範囲内に維持する任意の系は適当であるが、た
だし緩衝液中に存在する反対イオンは亜鉛をキレート化
しないか、そうでなければそれを溶液から沈澱させな
い。例えば、リン酸塩または炭酸塩を含有する緩衝液系
は、亜鉛を沈澱させるであろうから、適当ではない。適
当な緩衝液系は、次の反対イオンに基づくものである：
酢酸、コハク酸、塩素、硫酸、酒石酸、リンゴ酸、マレ
イン酸のイオンなど。好ましい緩衝液系は酢酸塩の緩衝
液系である。好ましい実施態様において、酢酸亜鉛はEG
Fの溶液に添加して、EGFを安定化する。酢酸亜鉛は亜鉛
イオンを提供してEGFおよび酢酸塩の反対イオンに結合
させて、pHを好ましい範囲内に維持するという二重の機
能を有する。別の実施態様において、他の可溶性の亜鉛
塩、例えば、塩化亜鉛を使用する場合、緩衝液は、ま
た、使用することができる。
GF複合体」は、亜鉛がEGFに配位結合をしている複合体
のイオンを意味する。水溶液において、亜鉛−EGF複合
体はpH4.0〜7.0、好ましくは5.5〜6.0の範囲内に維持し
なくてはならない。この範囲外では、亜鉛−EGF複合体
はモノマーのEGFおよび亜鉛陽イオンに解離する。こう
して、亜鉛−EGFの水溶液を緩衝化してこのようなpHを
維持することが好ましい。pHを4.0〜7.0、好ましくは5.
5〜6.0の範囲内に維持する任意の系は適当であるが、た
だし緩衝液中に存在する反対イオンは亜鉛をキレート化
しないか、そうでなければそれを溶液から沈澱させな
い。例えば、リン酸塩または炭酸塩を含有する緩衝液系
は、亜鉛を沈澱させるであろうから、適当ではない。適
当な緩衝液系は、次の反対イオンに基づくものである：
酢酸、コハク酸、塩素、硫酸、酒石酸、リンゴ酸、マレ
イン酸のイオンなど。好ましい緩衝液系は酢酸塩の緩衝
液系である。好ましい実施態様において、酢酸亜鉛はEG
Fの溶液に添加して、EGFを安定化する。酢酸亜鉛は亜鉛
イオンを提供してEGFおよび酢酸塩の反対イオンに結合
させて、pHを好ましい範囲内に維持するという二重の機
能を有する。別の実施態様において、他の可溶性の亜鉛
塩、例えば、塩化亜鉛を使用する場合、緩衝液は、ま
た、使用することができる。
約10〜20ミリモルの亜鉛陽イオンを約250μg/mlの濃
度であるEGFの水溶液に添加するとき、EGFの最大の安定
性が得られる決定された。こうして、本発明の好ましい
実施態様において、10〜20ミリモルの亜鉛を各250μｇ
のEGF/mlにつき使用する。これらの量は、当業者によ
り、安定化すべきEGFの量または所望の結晶質亜鉛−EGF
の量に依存して変化させることができる。例えば、EGF
の濃度を増加するとき、亜鉛の濃度を比例的に増加する
ことが必要である。より高い量、例えば、各250μｇのE
GF/mlについて50ミリモルまでの亜鉛は、また、反応を
完結することができる。より少ない量を使用することが
できるが、EGFのすべては安定化される必要はない。こ
のような変化を行うことは、当業者の技量の範囲内であ
る。
度であるEGFの水溶液に添加するとき、EGFの最大の安定
性が得られる決定された。こうして、本発明の好ましい
実施態様において、10〜20ミリモルの亜鉛を各250μｇ
のEGF/mlにつき使用する。これらの量は、当業者によ
り、安定化すべきEGFの量または所望の結晶質亜鉛−EGF
の量に依存して変化させることができる。例えば、EGF
の濃度を増加するとき、亜鉛の濃度を比例的に増加する
ことが必要である。より高い量、例えば、各250μｇのE
GF/mlについて50ミリモルまでの亜鉛は、また、反応を
完結することができる。より少ない量を使用することが
できるが、EGFのすべては安定化される必要はない。こ
のような変化を行うことは、当業者の技量の範囲内であ
る。
本発明は、また、長期間の貯蔵可能性の利点を有す
る、亜鉛およびEGFの複合体の塩からなる、結晶質EGF組
成物を提供する。亜鉛−EGF塩の陽イオンは、亜鉛−EGF
の塩の形成を行う任意の陽イオンであることができ、そ
れらの例は次の通りである：ナトリウム、カリウム、リ
チウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまた
はバリウム。前述のように、pHが4.0〜7.0の範囲内であ
るかぎり、亜鉛−EGF複合体は溶液から沈澱するであろ
う。この範囲外で、複合体は解離する。EGFは解離し
て、それが生体内の生物学的効果をもたなくてはならな
い。こうして、亜鉛−EGFは、水性または結晶の形態
で、創傷または他の生物学的表面に直接適用して、EGF
の解放を遅くすることができる。体液の生理学的pHは、
すなわち、中性のpHは、亜鉛−EGFをゆっくり解離させ
てモノマーのEGFを解放するであろう。
る、亜鉛およびEGFの複合体の塩からなる、結晶質EGF組
成物を提供する。亜鉛−EGF塩の陽イオンは、亜鉛−EGF
の塩の形成を行う任意の陽イオンであることができ、そ
れらの例は次の通りである：ナトリウム、カリウム、リ
チウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまた
はバリウム。前述のように、pHが4.0〜7.0の範囲内であ
るかぎり、亜鉛−EGF複合体は溶液から沈澱するであろ
う。この範囲外で、複合体は解離する。EGFは解離し
て、それが生体内の生物学的効果をもたなくてはならな
い。こうして、亜鉛−EGFは、水性または結晶の形態
で、創傷または他の生物学的表面に直接適用して、EGF
の解放を遅くすることができる。体液の生理学的pHは、
すなわち、中性のpHは、亜鉛−EGFをゆっくり解離させ
てモノマーのEGFを解放するであろう。
結晶質亜鉛−EGFは任意の数の方法において調製する
ことができる。一般に、可溶性亜鉛塩は、例えば、酢酸
亜鉛または塩化亜鉛をEGFの水性混合物に添加する。必
要に応じて、pHは4.7〜7.0、好ましくは5.5〜6.0の範囲
内に調節する。次いで、結晶質亜鉛−EGFを室温におい
て混合せずに溶液から沈澱する。あるいは、任意の形
態、例えば、凍結乾燥した形態でEFGを緩衝化した亜鉛
イオンの溶液に添加することができる。
ことができる。一般に、可溶性亜鉛塩は、例えば、酢酸
亜鉛または塩化亜鉛をEGFの水性混合物に添加する。必
要に応じて、pHは4.7〜7.0、好ましくは5.5〜6.0の範囲
内に調節する。次いで、結晶質亜鉛−EGFを室温におい
て混合せずに溶液から沈澱する。あるいは、任意の形
態、例えば、凍結乾燥した形態でEFGを緩衝化した亜鉛
イオンの溶液に添加することができる。
亜鉛−EGF結晶はこの分野において知られている方法
で回収することができる。例えば、結晶を含有する水溶
液を遠心して結晶を詰めることができる。次いで、上澄
み液を注ぎ出し、そして結晶を濾過し、洗浄し、次いで
乾燥した。
で回収することができる。例えば、結晶を含有する水溶
液を遠心して結晶を詰めることができる。次いで、上澄
み液を注ぎ出し、そして結晶を濾過し、洗浄し、次いで
乾燥した。
EGFは創傷の治癒において使用すると記載してきたの
で、本発明の組成物を使用して創傷を処置して、その治
癒速度を増加することができる。本発明の組成物を使用
して治癒することができる創傷の種類は、上皮の損傷を
引き起こす偶発的または医学的損傷から生ずるものであ
り、それらの例は次の通りである：目の創傷、例えば、
角膜の潰瘍、ラジアルケラトトミー（radialkeratotom
y）、角膜移植、エピケアラトファキア（epikeratophak
ia）および目における他の外科的に誘発される創傷；お
よび皮膚の創傷、例えば、熱傷、皮膚移植からの供与部
位および潰瘍（皮膚、とこずれ、うっ血および糖尿
病）。さらに、皮膚が損傷された皮膚科学の状態、例え
ば、乾癬、日焼けおよび皮膚の発疹を本発明の組成物で
処理することができる。組成物は創傷部位に、創傷のタ
イプに依存して、局所的にあるいは内部的に適用するこ
とができる。
で、本発明の組成物を使用して創傷を処置して、その治
癒速度を増加することができる。本発明の組成物を使用
して治癒することができる創傷の種類は、上皮の損傷を
引き起こす偶発的または医学的損傷から生ずるものであ
り、それらの例は次の通りである：目の創傷、例えば、
角膜の潰瘍、ラジアルケラトトミー（radialkeratotom
y）、角膜移植、エピケアラトファキア（epikeratophak
ia）および目における他の外科的に誘発される創傷；お
よび皮膚の創傷、例えば、熱傷、皮膚移植からの供与部
位および潰瘍（皮膚、とこずれ、うっ血および糖尿
病）。さらに、皮膚が損傷された皮膚科学の状態、例え
ば、乾癬、日焼けおよび皮膚の発疹を本発明の組成物で
処理することができる。組成物は創傷部位に、創傷のタ
イプに依存して、局所的にあるいは内部的に適用するこ
とができる。
創傷を治癒する速度を増加する方法は、本発明お組成
物を創傷部位に局所的に適用することによって創傷部位
に直接適用または接触することからなる。組成物を創傷
と十分な時間接触させて維持して、創傷部位における細
胞の増殖速度を増加することである。このような方法
は、本発明の組成物を、製剤学的に許容されうる制御さ
れた解放する組成物、例えば、クリーム、ゲル、エアゾ
ールスプレー、マイクロカプセル、フィルムまたは凍結
乾燥した泡または水性配合物中に混入するか、あるいは
ガーゼ包帯を組成物の水溶液でソーキングし、次いでこ
のような配合物または包帯を創傷部位に適用することを
包含する。
物を創傷部位に局所的に適用することによって創傷部位
に直接適用または接触することからなる。組成物を創傷
と十分な時間接触させて維持して、創傷部位における細
胞の増殖速度を増加することである。このような方法
は、本発明の組成物を、製剤学的に許容されうる制御さ
れた解放する組成物、例えば、クリーム、ゲル、エアゾ
ールスプレー、マイクロカプセル、フィルムまたは凍結
乾燥した泡または水性配合物中に混入するか、あるいは
ガーゼ包帯を組成物の水溶液でソーキングし、次いでこ
のような配合物または包帯を創傷部位に適用することを
包含する。
本発明の組成物は、点眼配合物、目のゲル、目のクリ
ーム、リポソームまたはミセルの配合物、水性賦形剤、
ソーキングしたガーゼ包帯、熱傷の包帯、人工的皮膚、
縫合糸およびステープルコーティングのための水性賦形
剤、軟膏またはクリーム、ゲル配合物、泡などにおいて
有用である。追加の材料、例えば、緩衝液、防腐剤、張
度調節剤、酸化防止性、粘度調節または増量剤硫酸アン
モニウム溶液使用するポリマー、および賦形剤を組成物
において使用することができる。このような他の材料の
特定の例は、次のものを包含する：酢酸塩またはホウ酸
塩；チメロゾル、ソルビン酸、メチルまたはプロピルパ
ラベンおよびクロロブタロールの防腐剤；張度を調節す
るための塩化ナトリウムおよび／または糖；および賦形
剤、例えば、マンニトール、ラクトースまたはスクロー
ス。
ーム、リポソームまたはミセルの配合物、水性賦形剤、
ソーキングしたガーゼ包帯、熱傷の包帯、人工的皮膚、
縫合糸およびステープルコーティングのための水性賦形
剤、軟膏またはクリーム、ゲル配合物、泡などにおいて
有用である。追加の材料、例えば、緩衝液、防腐剤、張
度調節剤、酸化防止性、粘度調節または増量剤硫酸アン
モニウム溶液使用するポリマー、および賦形剤を組成物
において使用することができる。このような他の材料の
特定の例は、次のものを包含する：酢酸塩またはホウ酸
塩；チメロゾル、ソルビン酸、メチルまたはプロピルパ
ラベンおよびクロロブタロールの防腐剤；張度を調節す
るための塩化ナトリウムおよび／または糖；および賦形
剤、例えば、マンニトール、ラクトースまたはスクロー
ス。
金属の結合の結果としてEGFの構造的安定性は、EGF、
および媒質のpHおよびイオン強度に対する金属の化学量
論の関数である。金属−タンパク質複合体の形成におけ
る他の重要な変数は、誘電率（DIE）およびタンパク質
の表面上の水活性である。中性の化合物は、水の構造お
よび媒質中のDIEに影響を及ぼすことが示された。DIEの
減少はイオンの相互作用（例えば、金属−EGF複合体）
を増加させ、これにより金属のEGFへの結合を増加し、
そして安定性を増加する。DIEを減少するという二次効
果は分子間の水素結合を増加することであり、これはま
たEGFの安定性に寄与するであろう。こうして、DIEを減
少する因子は水の極性を変化させ、タンパク質の回りの
水和のエンベロープを変更しそしてある場合においてタ
ンパク質の表面と直接相互作用することによって、EGF
タンパク質への安定化作用を有する。DIEを減少するこ
とができる中性化合物の例は、次の通りである:1価およ
び多価のアルコール、例えば、エタノール、イソプロパ
ノール、マンニトール、ソルビトール、イソシトール、
スクロース、ラクトース、グリセリンなど；ポリヒドロ
キシル化合物、例えば、グリセロール、ポリエチレング
リコール、プロピレングリコール、ポリオキシマー:Plu
ronic Ｆ−68）、ポビドン、ヒドロキシメチル（エチ
ルまたはプロピル）セルロース、オクトキシノール−９
など；界面活性剤、例えば、ポリソルベート（Twee
n）、Brij、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステ
ルおよびトリエステルなど；アミノ酸、例えば、グリシ
ン、ロイシン、ポリアミノ酸など；および他の化合物、
例えば、ゼラチンまたは加水分解したゼラチンおよびデ
キストラン。このような化合物はすべてFDA承認であり
かつ水溶性である。本発明の組成物へのこれらの中性の
帯電した製剤学的化合物のいずれの添加も、EGFの安定
化をさらに増加すると信じられる。
および媒質のpHおよびイオン強度に対する金属の化学量
論の関数である。金属−タンパク質複合体の形成におけ
る他の重要な変数は、誘電率（DIE）およびタンパク質
の表面上の水活性である。中性の化合物は、水の構造お
よび媒質中のDIEに影響を及ぼすことが示された。DIEの
減少はイオンの相互作用（例えば、金属−EGF複合体）
を増加させ、これにより金属のEGFへの結合を増加し、
そして安定性を増加する。DIEを減少するという二次効
果は分子間の水素結合を増加することであり、これはま
たEGFの安定性に寄与するであろう。こうして、DIEを減
少する因子は水の極性を変化させ、タンパク質の回りの
水和のエンベロープを変更しそしてある場合においてタ
ンパク質の表面と直接相互作用することによって、EGF
タンパク質への安定化作用を有する。DIEを減少するこ
とができる中性化合物の例は、次の通りである:1価およ
び多価のアルコール、例えば、エタノール、イソプロパ
ノール、マンニトール、ソルビトール、イソシトール、
スクロース、ラクトース、グリセリンなど；ポリヒドロ
キシル化合物、例えば、グリセロール、ポリエチレング
リコール、プロピレングリコール、ポリオキシマー:Plu
ronic Ｆ−68）、ポビドン、ヒドロキシメチル（エチ
ルまたはプロピル）セルロース、オクトキシノール−９
など；界面活性剤、例えば、ポリソルベート（Twee
n）、Brij、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステ
ルおよびトリエステルなど；アミノ酸、例えば、グリシ
ン、ロイシン、ポリアミノ酸など；および他の化合物、
例えば、ゼラチンまたは加水分解したゼラチンおよびデ
キストラン。このような化合物はすべてFDA承認であり
かつ水溶性である。本発明の組成物へのこれらの中性の
帯電した製剤学的化合物のいずれの添加も、EGFの安定
化をさらに増加すると信じられる。
本発明の組成物は、また、抗バクテリア化合物、例え
ば、スルファジアジン化合物および、とくに、銀スルフ
ァジアジンおよび亜鉛スルファジアジンと組み合わせる
ことができる。亜鉛スルファジアジン化合物は、抗バク
テリアを提供しかつ組成物の性質を安定化するという二
重の目的を有するであろう。
ば、スルファジアジン化合物および、とくに、銀スルフ
ァジアジンおよび亜鉛スルファジアジンと組み合わせる
ことができる。亜鉛スルファジアジン化合物は、抗バク
テリアを提供しかつ組成物の性質を安定化するという二
重の目的を有するであろう。
本発明の組成物は凍結乾燥して、EGFをさらに安定化
することができる。凍結乾燥の方法はこの分野において
よく知られている。成長因子を含有する安定な凍結乾燥
した配合物は、本出願人に係る同時係属の米国特許出願
第098,817号に記載されている、その開示をここに引用
によって加える。
することができる。凍結乾燥の方法はこの分野において
よく知られている。成長因子を含有する安定な凍結乾燥
した配合物は、本出願人に係る同時係属の米国特許出願
第098,817号に記載されている、その開示をここに引用
によって加える。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。本発
明は、特許請求の範囲による以外、これらの実施例によ
り限定されない。
明は、特許請求の範囲による以外、これらの実施例によ
り限定されない。
実施例１ 組み換え的に産生されたヒトEGF（Chiron Corporati
on、カリフォルニア州エメリービレ）を、次の実験にお
いて使用した。亜鉛イオンを有するEGFの安定性をpH5.5
〜6.5において試験した。凍結乾燥したEGFを50ミリモル
の酢酸ナトリウム中でpH5.5において再構成した。次い
で、塩化亜鉛の溶液をこのEGF溶液に添加した。あるい
は、酢酸亜鉛の溶液または亜鉛塩の結晶を添加した。pH
を5.5〜6.5の範囲に維持し、そして亜鉛−EGFを室温に
おいて溶液から沈澱させた。
on、カリフォルニア州エメリービレ）を、次の実験にお
いて使用した。亜鉛イオンを有するEGFの安定性をpH5.5
〜6.5において試験した。凍結乾燥したEGFを50ミリモル
の酢酸ナトリウム中でpH5.5において再構成した。次い
で、塩化亜鉛の溶液をこのEGF溶液に添加した。あるい
は、酢酸亜鉛の溶液または亜鉛塩の結晶を添加した。pH
を5.5〜6.5の範囲に維持し、そして亜鉛−EGFを室温に
おいて溶液から沈澱させた。
試料を28日間にわたって老化させ、次いでHPLC分析を
使用して、種々の貯蔵条件下に新規な配合物の存在下に
EGFの新しい種（例えば、ピークＣ、ＸおよびＹ）の配
合物を包含する構造の変化を研究した。逆相HPLCはEGF
の定量的および定性的分析に使用することができる。HP
LCの結果を下表１に記載する。
使用して、種々の貯蔵条件下に新規な配合物の存在下に
EGFの新しい種（例えば、ピークＣ、ＸおよびＹ）の配
合物を包含する構造の変化を研究した。逆相HPLCはEGF
の定量的および定性的分析に使用することができる。HP
LCの結果を下表１に記載する。
亜鉛−EGF複合体は、HPLCカラム上にそのままで展開
することができないので、HPLC分析前に解離しなくては
ならない。したがって、HPLCの前に、分析すべき試料の
pHを3.0に調節した。あるいは、EDTA（キレート化剤）
を使用して、結晶化を逆転することができる。逆相HPLC
はバイダグ（Vydac）Ｃ−４カラム（4.6mm×25cm、５μ
ｍ）を使用して実施した。流速は26℃において26分にわ
たって26％〜32％のアセトニトリル（0.1％のTFA）の直
線の勾配を使用して0.8ml/分であった。
することができないので、HPLC分析前に解離しなくては
ならない。したがって、HPLCの前に、分析すべき試料の
pHを3.0に調節した。あるいは、EDTA（キレート化剤）
を使用して、結晶化を逆転することができる。逆相HPLC
はバイダグ（Vydac）Ｃ−４カラム（4.6mm×25cm、５μ
ｍ）を使用して実施した。流速は26℃において26分にわ
たって26％〜32％のアセトニトリル（0.1％のTFA）の直
線の勾配を使用して0.8ml/分であった。
表１から理解できるように、ピークＹおよびＸにより
表される劣化の種の形成は、亜鉛イオンの存在下に配合
したとき、亜鉛イオンを含有しない配合物と比較して、
大きく減少した。それ以上の試験おいて、ピークＸおよ
びＹの種はピークＤの自然EGFより生物学的活性が40％
損失したことが示された。ピークＣの種は生物学的活性
の変化を示さなかった。こうして、亜鉛によるEGFの安
定化は、ピークＸおよびＹの種の形成を減少させること
によってEGFの生物学的活性の有意に増加させる。
表される劣化の種の形成は、亜鉛イオンの存在下に配合
したとき、亜鉛イオンを含有しない配合物と比較して、
大きく減少した。それ以上の試験おいて、ピークＸおよ
びＹの種はピークＤの自然EGFより生物学的活性が40％
損失したことが示された。ピークＣの種は生物学的活性
の変化を示さなかった。こうして、亜鉛によるEGFの安
定化は、ピークＸおよびＹの種の形成を減少させること
によってEGFの生物学的活性の有意に増加させる。
実施例２ この実験は、亜鉛−EGF複合体の安定性が大きい不溶
性の複合体による水の排除から生ずるか、あるいはタン
パク質中で特定のアミノ酸との亜鉛イオンの直接の相互
作用から生ずるかという問題を解決するために案出され
た。亜鉛−EGF溶液および対照を実施例１におけるよう
に調製し、そして試料をpH4.6に調節した。このpHにお
いて、EGFは、その等電点にあるので、溶液から自然に
沈澱した。酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.6において沈
澱したEGFの２つの組を46℃において７日間インキュベ
ーションした。一方の組は存在する亜鉛イオンを含有し
たが、他方はを含有しなかった。HPLCの結果を表２に記
載する。
性の複合体による水の排除から生ずるか、あるいはタン
パク質中で特定のアミノ酸との亜鉛イオンの直接の相互
作用から生ずるかという問題を解決するために案出され
た。亜鉛−EGF溶液および対照を実施例１におけるよう
に調製し、そして試料をpH4.6に調節した。このpHにお
いて、EGFは、その等電点にあるので、溶液から自然に
沈澱した。酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.6において沈
澱したEGFの２つの組を46℃において７日間インキュベ
ーションした。一方の組は存在する亜鉛イオンを含有し
たが、他方はを含有しなかった。HPLCの結果を表２に記
載する。
表２が示すように、亜鉛−EGF複合体は、沈澱した形
態のEGF単独を含有する配合物と比較して、ピークＸお
よびＹを有意に減少させた。これが示唆するように、EG
Fと亜鉛との直接の相互作用は重要であり、そして亜鉛
−EGF複合体は水性および結晶の形態の両者において安
定である。
態のEGF単独を含有する配合物と比較して、ピークＸお
よびＹを有意に減少させた。これが示唆するように、EG
Fと亜鉛との直接の相互作用は重要であり、そして亜鉛
−EGF複合体は水性および結晶の形態の両者において安
定である。
実施例３ この適用の目的のため、亜鉛−EGF複合体の生物学的
活性を受容体結合アッセイ（RBA）において試験した。
このアッセイはEGFのその受容体への結合を測定し、そ
してアッセイは15〜30％の変動性の範囲を有する。それ
はEGFの生物学的活性を決定する認められた方法であ
る。使用した受容体結合アッセイは、サベイジ（Savag
e）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）、111、p.195以降（1981）に記載されている
方法である。RBAは、また、米国特許第4,717,717号に記
載されており、その開示をここに引用によって加える。
EGFを100μg/mlの濃度で亜鉛イオンと混合して、沈澱を
形成する。沈澱した物質を２つの等しい体積に分割し
た。EDTAを試料に亜鉛イオンのモルレベルの２倍で添加
した。これは沈澱を含有しない透明溶液を生成した。他
方の試料は沈澱した形態で変化させないで放置し、そし
て３つの試料をRBAでアッセイし、そして結果を表３に
記載する。RBAにおいて使用した緩衝液はリン酸塩緩衝
液pH7.4であった。このpHにおいて、亜鉛−EGFはそのモ
ノマーの形態に解離し、そして亜鉛は亜鉛リン酸塩とし
て沈澱した。亜鉛を含まないEGFを対照として処理し
た。
活性を受容体結合アッセイ（RBA）において試験した。
このアッセイはEGFのその受容体への結合を測定し、そ
してアッセイは15〜30％の変動性の範囲を有する。それ
はEGFの生物学的活性を決定する認められた方法であ
る。使用した受容体結合アッセイは、サベイジ（Savag
e）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）、111、p.195以降（1981）に記載されている
方法である。RBAは、また、米国特許第4,717,717号に記
載されており、その開示をここに引用によって加える。
EGFを100μg/mlの濃度で亜鉛イオンと混合して、沈澱を
形成する。沈澱した物質を２つの等しい体積に分割し
た。EDTAを試料に亜鉛イオンのモルレベルの２倍で添加
した。これは沈澱を含有しない透明溶液を生成した。他
方の試料は沈澱した形態で変化させないで放置し、そし
て３つの試料をRBAでアッセイし、そして結果を表３に
記載する。RBAにおいて使用した緩衝液はリン酸塩緩衝
液pH7.4であった。このpHにおいて、亜鉛−EGFはそのモ
ノマーの形態に解離し、そして亜鉛は亜鉛リン酸塩とし
て沈澱した。亜鉛を含まないEGFを対照として処理し
た。
表３における結果が示すように、沈澱した形態の亜鉛
の存在下のEGF活性の損失は存在せず、亜鉛−EGF複合体
が可逆であることを示唆する。
の存在下のEGF活性の損失は存在せず、亜鉛−EGF複合体
が可逆であることを示唆する。
本発明をある種の好ましい実施態様および実施例を参
照してここに記載した。明らかな変化は当業者にとって
可能であり、本発明はそれらに限定されず、特許請求の
範囲によってのみ限定される。
照してここに記載した。明らかな変化は当業者にとって
可能であり、本発明はそれらに限定されず、特許請求の
範囲によってのみ限定される。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
１、製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（EGF）およ
び前記EGFの劣化を防止するために十分な量の亜鉛イオ
ンからなる製剤学的組成物。
び前記EGFの劣化を防止するために十分な量の亜鉛イオ
ンからなる製剤学的組成物。
２、亜鉛およびEGFの複合体の塩からなる、結晶質EGF組
成物。
成物。
３、前記EGFおよび亜鉛イオンを配合する工程からな
る、上記第１項記載の組成物の調製方法。
る、上記第１項記載の組成物の調製方法。
４、EGFを含有する製剤学的組成物中に、生物学的活性
の損失に対して前記EGFを安定化するために十分な量の
亜鉛イオンを混入することからなる、前記製剤学的組成
物を安定化する方法。
の損失に対して前記EGFを安定化するために十分な量の
亜鉛イオンを混入することからなる、前記製剤学的組成
物を安定化する方法。
５、緩衝化水溶液である、上記第１項記載の組成物。
６、ゲルである、上記第１項記載の組成物。
７、クリームである、上記第１項記載の組成物。
８、中性の誘電率減少化合物をさらに含む、上記第１項
記載の組成物。
記載の組成物。
９、約4.0〜約7.0の範囲内のpHを有する、上記第１項記
載の化合物。
載の化合物。
10、pHは約5.5〜約6.0の範囲内である、上記第９項記載
の組成物。
の組成物。
11、約10〜20ミリモルの亜鉛陽イオン/250μｇのEGF/ml
を有する、上記第１項記載の組成物。
を有する、上記第１項記載の組成物。
12、緩衝液は酢酸塩の緩衝液である、上記第５項記載の
組成物。
組成物。
13、工程： ａ）EGFの水溶液を準備し、 ｂ）亜鉛を水性または固定の形態で前記EGFの溶液に
添加して、亜鉛およびEGFの混合物を形成し、ここで10
〜20ミリモルの亜鉛を250mgのEGF/ml当たりに使用し、 ｃ）前記混合物のpHを4.0〜7.0の範囲内に調節し、 ｄ）亜鉛−EGFの結晶の形成を起こさせ、そして ｅ）前記混合物から結晶質亜鉛−EGFを回収する、 からなる、結晶質ヒトEGFを生成する方法。
添加して、亜鉛およびEGFの混合物を形成し、ここで10
〜20ミリモルの亜鉛を250mgのEGF/ml当たりに使用し、 ｃ）前記混合物のpHを4.0〜7.0の範囲内に調節し、 ｄ）亜鉛−EGFの結晶の形成を起こさせ、そして ｅ）前記混合物から結晶質亜鉛−EGFを回収する、 からなる、結晶質ヒトEGFを生成する方法。
14、EGFを十分な亜鉛イオンと組み合わせて、前記EGFを
劣化に対して安定化することからなる、安定化されたEG
F組成物を調製する方法。
劣化に対して安定化することからなる、安定化されたEG
F組成物を調製する方法。
第１図は、老化させたEGFの溶液を逆相HPLCによつて分
析した後のEGFピークＣ、Ｄ、ＸおよびＹの関係を示し
たクロマトグラムである。
析した後のEGFピークＣ、Ｄ、ＸおよびＹの関係を示し
たクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−192818（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−221697（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−65822（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/485 C07K 1/00 A61K 37/02 C07K 1/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（EG
F）および前記EGFの劣化を防止するために十分な量の亜
鉛イオンからなる製剤学的組成物。 - 【請求項２】亜鉛およびEGFの複合体の塩からなる、結
晶質EGF組成物。 - 【請求項３】前記EGFおよび亜鉛イオンを配合する工程
からなる、特許請求の範囲第１項記載の組成物の調製方
法。 - 【請求項４】EGFを含有する製剤学的組成物中に、生物
学的活性の損失に対して前記EGFを安定化するために十
分な量の亜鉛イオンを混入することからなる、前記製剤
学的組成物を安定化する方法。 - 【請求項５】工程： ａ）EGFの水溶液を準備し、 ｂ）亜鉛を水性または固体の形態で前記EGFの溶液に添
加して、亜鉛およびEGFの混合物を形成し、ここで10〜2
0ミリモルの亜鉛を250mgのEGF/ml当たりに使用し、 ｃ）前記混合物のpHを4.0〜7.0の範囲内に調節し、 ｄ）亜鉛−EGFの結晶の形成を起こさせ、そして ｅ）前記混合物から結晶質亜鉛−EGFを回収する、 からなる、結晶質ヒトEGFを生成する方法。 - 【請求項６】EGFを十分な亜鉛イオンと組み合わせて、
前記EGFを劣化に対して安定化することからなる、安定
化されたEGF組成物を調製する方法。
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