CN101273065B - 芳基/脂族烃基琥珀酸酐乙酰透明质酸衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以芳基-或脂族烃基琥珀酸酐(ASA)修饰透明质酸(HA)以产生芳基-/脂族烃基琥珀酸酐HA衍生物(ASA-HA)，涉及这样的衍生物，并涉及它们的应用和用途，尤其是在化妆品和生物医学工业中的应用和用途。预期所述ASA-HA衍生物具有令人感兴趣的性质，这些性质可用于高级的配制物(与不修饰的HA相比，更强地结合于皮肤)，通过包囊(纳米/微米胶囊剂)或形成纳米/微米球也可能用于活性剂或药物的递送系统中。此外，预期低分子量ASA-HA衍生物比相同分子量的不修饰的HA更有效地透过皮肤。

Description

芳基/脂族烃基琥珀酸酐乙酰透明质酸衍生物
发明领域
本发明涉及以芳基-或脂族烃基琥珀酸酐(ASA)修饰透明质酸(HA)以产生芳基/脂族烃基琥珀酸酐HA衍生物(ASA-HA)，涉及这样的ASA-HA衍生物，并涉及它们的应用和用途，尤其是在化妆品(cosmetics)和生物医学工业中的应用和用途。 
背景 
人体最丰富的杂多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是无支链的糖聚合物，由重复的二糖单元组成(仅硫酸角质素在糖的核心区是分支的)。所述二糖单元通常包含两种修饰的糖-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作为第一糖单元。另一单元通常是糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。 
糖胺聚糖是负电分子，并且在溶液中(in solution)具有赋予高粘性的延伸构象。糖胺聚糖主要位于细胞表面上或胞外基质中。糖胺聚糖在溶液中还具有低压缩性，并因此理想的作为生理润滑液体，例如关节(joint)。糖胺聚糖的刚性为细胞提供结构的整体性并且提供细胞之间允许细胞迁移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明质酸(hyaluronan)、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。多数糖胺聚糖通过特异的寡糖结构共价结合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明质酸与某些蛋白聚糖形成大聚集体(large aggregate)，但例外是游离糖链与蛋白聚糖形成非共价复合体。 
已鉴定乙酰透明质酸在人体中的许多功能(参见，Laurent T.C.和Fraser J.R.E.，1992，FASEB J.6：2397-2404；和Toole B.P.，1991，“Proteoglycans和hyaluronan in morphogenesis and differentiation.”In：Cell Biology of theExtracellular Matrix，pp.305-341，Hay E.D.，ed.，Plenum，New York)。乙酰透明质酸存在于透明软骨、滑膜关节液(synovial joint fluid)以及真皮和表皮皮肤组织中。还猜测乙酰透明质酸在许多生理功能中具有作用，例如粘附、发育、细胞运动性、癌症、血管发生和愈伤。由于乙酰透明质酸独特的物理和生物 特性，将其使用在眼和关节外科中，并且正在其它医学操作(procedure)中对其进行评估。 
术语“乙酰透明质酸”或“透明质酸”用于文献中的意思是具有不同分子量的酸性多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的残基构成，其天然存在于细胞表面、脊椎动物结缔组织的基本胞外物质(basic extracellularsubstance)、关节的滑液、眼内球液(endobulbar fluid)、人脐带组织和鸡冠(cocks’comb)中。 
术语“透明质酸”事实上通常用来指具有不同分子量的带有交替D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基的全系列多糖，或甚至其降解的级分，并且因此看上去使用复数术语“透明质酸”更加正确。然而该单数术语将仍然用在本说明书中；另外，将频繁地使用缩写“HA(透明质酸；透明质酸)”以代替此集合术语。 
HA在生物体中扮演重要的角色，作为许多组织(例如皮肤、腱、肌肉和软骨)的细胞的机械支持，其是胞间基质的主要成分。HA在生物过程中也扮演其它重要的角色，例如组织的润湿和润滑作用。 
尽管HA可从上述天然组织中提取，但现今优选通过微生物方法制备HA以最小化传递传染物质(infectious agent)的潜在风险，并且提高产品的均匀性、质量和可用性。 
已将HA和它不同分子大小的级分和它们各自的盐用作药物，特别在治疗关节病(arthropathy)方面；作为天然器官和组织的辅助和/或替代物，特别在眼科学和整容手术方面；以及作为化妆品制品中的试剂(agent)。也已开发乙酰透明质酸的产品用于整形外科学(orthopaedics)、风湿病学(rheumatology)和皮肤病学(dermatology)。 
还可使用HA作为用于卫生和外科用品的多种聚合材料(例如聚氨酯、聚酯等)的添加剂，其具有使这些材料生物相容的效果。 
ASA修饰或衍生化在造纸工业中沿用已久，其中已使用脂族烃基琥珀酸酐以使纸表面(纤维素的)更加防水(water resistant)(Chen，G.C.I.，Woodward，T.W.(1986)Optimizing the emulsification and sizing of alkenyl succinicanhydride，Tappi Journal，August，95-97)。在食品工业中，已使用2-辛烯-1-基琥珀酸酐(2-octen-1-yl succinic anhydride)(OSA)改性的淀粉(modified starch)以使油/水乳剂(例如，低脂人造奶油(low fat margarine)和蛋黄酱(mayonnaises)) 稳定化，(Jarowenko，W.(In：Properties and uses of modifled starches，1986，Ed.：O.Wurzburg)Acetylated starch和miscellaneous organic esters，pp 55-77)。此外，OSA改性的淀粉的流变性质(rheological properties)与未-改性的淀粉相比是非常不同的(Park，S.，Chung，M.-G.，Yoo，B.(2004)Effects of octenylsuccinylationon rheological properties of corn starch pastes，Starch 56：399-406)。 
ASA衍生化方法的优势在于，例如，产物是无毒的，化学品价廉，以及反应是一步过程(Trubiano，PC.[In：Properties and uses of modified starches，1986，Ed.：O.Wurzburg]Succinate and substituted succinate derivatives of starch，pp 131-147；Wurzburg，OB.1995.Modifled starches，In：Food Science andTechnology，Vol.67，New York，pp.67-97)。 
根据先前对于淀粉的研究，伯羟基和仲羟基均与OSA反应(Shogren，RL，Viswanathan，A.，Felker，F.，Gross，RA(2000)，Distribution of octenyl succinategroups in octenyl succinic anhydride modified waxy maize starch，Starch52：196-204)。 
发明概述 
对于与未-修饰的HA相比具有某些改变特性的透明质酸类化合物或衍生物存在着需要，尤其是在化妆品和生物医学工业中。感兴趣的性质是改进的稳定泡沫物质的能力，和与非-亲水材料混合的能力，这些性质通常用于化妆品产品。 
本发明提供了两亲性HA-衍生产物，具有在化妆品或生物医学应用中有益的性质。这些产品更强地结合于皮肤，以使它们不那么容易洗掉。ASA-HA衍生物还适用于更先进的化妆品或生物医学制剂，例如形成纳米胶囊/微胶囊(nano/macro capsule)或纳米球/微球(nano/macro sphere)用于递送活性化合物或药物。较低分子量(MW)的ASA-HA衍生物将比具有可比较的MW的非-衍生化HA更有效地穿透皮肤。 
在本文的实例中，在水中在碱性条件下(pH＞8.0)用脂族烃基/芳基琥珀酸酐(ASA)修饰透明质酸(HA)。纯化所得的产物(沉淀或透析)。这些纯化的产物在水中形成部分水不溶性的聚集物(aggregate)。显示1％溶液使泡沫稳定化(减少的表面张力+增加的界面粘性)。1H NMR光谱证实，在所得产物中HA“骨架”的化学结构不变，只是ASA半-酯基的引入多至取代度(degree of substitution)(DS)为大约18％。 
因此，在第一个方面，本发明涉及透明质酸衍生物，其包含‘n’个重复单元并在pH 8-9具有结构通式(Ⅰ)： 
Figure DEST_PATH_AB0000000000017143560000011
其中在至少一个重复单元中，R1、R2、R3、R4中的一个或多个包含在pH 8-9具有结构通式(Ⅱ)的酯键合的脂族烃基-/芳基-琥珀酸，其余的R1、R2、R3、R4是羟基OH(wherein in at least one repeating unit one or more of R1，R2，R3，R4comprises an esterbound alkyl-/aryl-succinic acid having the generalstructural fomula(Ⅱ)at pH 8-9，and otherwise R1，R2，R3，R4are hydroxylgroups，OH)： 
Figure DEST_PATH_AB0000000000017143560000012
其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基-或芳基，其余的R5、R6、R7、R8是氢原子H，而且其中标记“酯”的氧参与与结构(Ⅰ)形成酯键。 
换句话说，本发明的一方面涉及透明质酸衍生物，其中透明质酸的一个或多个羟基在与一个或多个脂族烃基-/芳基-琥珀酸酐(ASA)的反应中被取代，以形成透明质酸和所得的一个或多个脂族烃基-/芳基-琥珀酸之间的酯键。 
在第二个方面，本发明涉及产生透明质酸衍生物的方法，其包括如下步骤： 
(a)在碱性条件下在水溶液中，使透明质酸(HA)与一种或多种具有(Ⅲ) 
Figure DEST_PATH_AB0000000000017143560000013
中所示结构通式的脂族烃基-/芳基-琥珀酸酐(ASA)反应，由此形成所述透明质酸衍生物；和 
(b)回收所述透明质酸衍生物。 
在第三个方面，本发明涉及组合物，其包含如第一个方面限定的透明质酸衍生物，和活性成分，优选所述活性成分是药理学活性剂。 
本发明的第四个方面涉及药用组合物，其包含有效量的如第一个方面限定的透明质酸衍生物，连同可药用的载体、赋形剂或稀释剂。 
第五个方面涉及药用组合物，其包含有效量的如第一个方面限定的透明质酸衍生物作为媒介物，连同药理学活性剂。 
第六个方面涉及化妆品用品，其包含有效量的如第一个方面限定的透明质酸衍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的组合物作为活性成分。 
在第七个方面，本发明涉及卫生、医药或外科用品，其包含如第一个方面限定的透明质酸衍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的组合物，优选所述用品是尿布、卫生巾、外科海绵(surgical sponge)、愈伤海绵(woundhealing sponge)，或包含于急救绷带(band aid)或其它创伤敷裹材料中的部分。 
重要的方面涉及药物胶囊，微胶囊(microcapsule)，纳米胶囊(nanocapsule)、微球(microsphere)或纳米球(nanosphere)，其包含如第一个方面限定的透明质酸衍生物或如第三、第四或第五方面中任一方面限定的组合物。 
本发明最后的方面涉及方法，其为在眼科学中、在治疗骨关节炎或癌症、脱发或秃发中执行程序(performing procedure)的方法，处理创伤的方法，药理学活性剂的皮肤施用或透皮施用(dermal or transdermal administration)的方法，或皮肤施用化妆品的方法，改进，其包含使用如第一个方面限定的透明质酸衍生物或如第二、第三或第四方面中任一方面限定的组合物。 
许多方面涉及如第一个方面所限定的透明质酸衍生物或第三、第四或第五方面中任一方面所限定的组合物的用途，其用于制备治疗骨关节炎、癌症的药物，制备用于眼科治疗的药物，制备用于创伤处理的药物，制备用于血管发生的药物，制备用于治疗脱发或秃发的药物，或制备保湿剂(moisturizer)。 
附图简述 
图1.示意性的HA的ASA修饰描述于图1。 
图2.实施例5和6中100kDa OSA-HA(14919-033)部分确定的(assigned) 1HNMR光谱。 
图3.用于修饰HA的ASA的化学结构。 
图4.Haug氏三角(Haug’s triangle)总结了不同聚合物构象的Rg和Mw之间的关系。通过在双对数标度(double logarithmic scale)中将回转半径(radius ofgyration)(Rg)对分子量(Mw)作图，可得到关于聚合物构象的信息。 
图5.下面实施例12中ASA修饰的LMW HA的浓度分布曲线(Concentration profile)(RI)。 
图6.如实施例13所述，使用表面张力计(surface tensiometer)(Wilhelmy片(Wilhelmy plate))在LMW OSA-HA上进行表面张力测量的结果。 
图7.显示如实施例15所述用棕榈酸乙基己酯(ethylhexyl palmitate)(化妆油(cosmetic oil))配制24小时和8周后ASA-HA的乳化性质。 
图8.如实施例18所述，通过量热法(calorimetry)测定OSA-HA衍生物的临界聚集浓度(critical aggregation concentration)(CAC)，如图8所示，随时间记录样品池(sample cell)中的焓变(Enthalpy variation)(ΔH)。 
图9.将实施例18的焓变(ΔH)绘制为样品池中OSA-HA浓度的函数，并在曲线的转折(break)测定OSA-HA的CAC。将每个实验重复三次并作为平均值提供CAC。例如，取代度(DS)为16％的OSA-HA的CAC是0.45mg/mL。 
图10.显示如实施例19所述，最大发射波长作为缓冲液1中OSA-HA(DS＝44％)浓度的函数。 
图11.显示如实施例20所述，最大发射波长作为OSA-HA(DS＝44％)浓度的函数，而CAC随NaCl浓度增加而减小。 
图12.显示如实施例21所测定的，10-3M NaCl中OSA-HA(DS＝44％，1mg/mL)的ζ电势(Zeta potential)。 
图13.显示实施例22的OSA-HA(DS＝44％)聚合微团(polymeric micelle)的电子透射显微照片(transmission electron micrograph)，它们是球形的并具有通常为50至200nm的亚微粒尺度(submicronic dimension)。 
发明详述 
透明质酸
“透明质酸(hyaluronic acid)”在本文中定义为：由通过交替的β-1，4和β-1，3 糖苷键连接到一起的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单元组成的未硫酸化糖胺聚糖。透明质酸也称作乙酰透明质酸(hyaluronan)、透明质酸盐(hyaluronate)或HA。术语乙酰透明质酸和透明质酸在本文可以互换使用。 
鸡冠是乙酰透明质酸重要的商业来源。微生物是可替换的来源。美国专利No.4,801,539公开了用于制备透明质酸的发酵方法，其涉及兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)菌株，报道的产率是每升约3.6g透明质酸。欧洲专利No.EP0694616公开了使用改进的兽瘟链球菌菌株的发酵方法，报道的产率是每升约3.5g透明质酸。如完整并入本文的WO 03/054163(Novozymes)中所公开的，可以重组地产生透明质酸或其盐，例如在革兰氏阳性芽孢杆菌属宿主中重组产生。 
已描述了乙酰透明质酸合酶来自于脊椎动物、细菌病原体和藻病毒(DeAngelis，P.L.，1999，Cell.Mol.Life Sci.56：670-682)。WO 99/23227公开了来自似马链球菌(Streptococcus equisimilis)的I组透明质酸盐合酶(hyaluronatesynthase)。WO 99/51265和WO 00/27437描述来自多杀巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)的II组透明质酸盐合酶。Ferretti等公开了酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的乙酰透明质酸合酶操纵子，其由三个基因hasA、hasB和hasC组成，其分别编码透明质酸盐合酶、UDP葡糖脱氢酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，4658-4663，2001)。WO 99/51265描述具有似马链球菌乙酰透明质酸合酶编码区的核酸片段。 
由于重组芽孢杆菌属细胞的乙酰透明质酸直接表达至培养基，可以使用简单的方法从该培养基中分离乙酰透明质酸。首先，将芽孢杆菌属细胞和细胞碎片从培养基中物理去除。如果需要，首先可将培养基稀释以降低培养基的粘性。用于从培养基去除细胞的许多方法对于本领域那些技术人员是已知的，例如离心和微滤。如果需要，然后可将剩余的上清液(例如通过超滤)过滤以进行浓缩和从乙酰透明质酸去除小分子污染物。去除细胞和细胞碎片之后，通过已知机制从培养基简单沉淀乙酰透明质酸。盐、醇或盐和醇的组合可以用于从滤液沉淀乙酰透明质酸。一旦变为(reduce to)沉淀物，能够容易地将乙酰透明质酸通过物理方法从溶液中分离。可通过使用本领域已知的蒸发技术(例如喷雾干燥)，从滤液溶液干燥或浓缩乙酰透明质酸。 
本发明的第一个方面涉及透明质酸衍生物，其包含n个重复单元并在pH 8-9具有结构通式(I)： 
Figure 197643DEST_PATH_AB0000000000017143560000021
其中在至少一个重复单元中，R1、R2、R3、R4中的一个或多个包含在pH 8-9具有结构通式(Ⅱ)的酯键合的脂族烃基-/芳基-琥珀酸，其余的R1、R2、R3、R4是羟基OH： 
Figure 114784DEST_PATH_AB0000000000017143560000022
其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基-或芳基，其余的R5、R6、R7、R8是氢原子H，而且其中标记“酯”的氧参与与结构(Ⅰ)形成酯键。 
在第一个方面的优选实施方案中，R1、R2、R3、R4中的两个或更多个包含在pH 8-9具有结构通式(Ⅱ)的一个或多个酯键合的脂族烃基-/芳基-琥珀酸；优选R1、R2、R3、R4中的三个或更多个包含在pH 8-9具有结构通式(Ⅱ)的一个或多个酯键合的脂族烃基-/芳基-琥珀酸。 
在第一个方面的另一个优选实施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基，优选R5、R6、R7、R8中的至少两个包含脂族烃基，更优选R5、R6、R7、R8中的至少三个包含脂族烃基；优选所述脂族烃基包含C1-C20脂族烃基，优选丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。 
又一个优选实施方案涉及第一个方面的HA衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含芳基，优选R5、R6、R7、R8中的至少两个包含芳基，更优选R5、R6、R7、R8中的至少三个包含芳基；且优选所述芳基是苯基。 
优选R5、R6、R7、R8包含两个或更多个不同的脂族烃基和/或芳基，优选选自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。 
分子量 
可以根据改进的咔唑方法(Bitter和Muir，1962，Anal Biochem.4：330-334)测定透明质酸的水平。此外，可以使用本领域的标准方法测定透明质酸的平均分子量，例如由Ueno et al.，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta 272：1-40；和Wyatt Technologies，1999，“Light ScatteringUniversity DAWN Course Manual”和“DAWN EOS Manual”Wyatt TechnologyCorporation，Santa Barbara，California所述的那些方法。 
在优选实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸衍生物具有大约800至大约10,000,000Da的分子量。在更优选的实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸衍生物具有大约1,000至大约9,000,000Da；大约2,000至大约10,000,000Da；大约4,000至大约10,000,000Da；大约8,000至大约10,000,000Da；大约10,000至大约10,000,000Da；或大约25,000至大约5,000,000Da的分子量。在甚至更优选的实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸衍生物具有大约50,000至大约3,000,000Da的分子量。 
另一个优选实施方案涉及第一方面的产品，其中所述透明质酸或其盐具有300,000-3,000,000；优选400,000-2,500,000；更优选500,000-2,000,000；和最优选600,000-1,800,000的分子量。 
将重组产生的透明质酸或其盐用于本发明的方法以制备本发明的产物或组合物时，对于一些应用可有利地先降低透明质酸或其衍生物或盐的平均分子量。例如，其已由所谓的透明质酸低分子量级分的几个制造者所述，能够穿透皮肤屏障(skin barrier)以在皮肤中重建透明质酸的天然含量，因此，这样的级分特别适于作为抗皮肤老化剂和抗皱剂出售的化妆品组合物。对于食品应用，已显示低MW透明质酸穿透胃肠道屏障(gastrointestinal barrier)，由此增加其生物可用性。最后，低MW透明质酸显示抗炎作用(anti-inflammatoryeffect)并在炎性疾病的治疗中具有潜在应用。减小透明质酸或其衍生物或盐的平均分子量可通过本领域的标准方法实现，例如，简单热处理、酶降解、超声声处理(ultrasound sonication)或酸水解(acid hydrolysis)。参见，例如，美国专利6,020,484，其描述了包括NaOCl作为添加剂的HA的超声处理技术(ultrasonication technique)，和T.Miyazaki等(2001)Polymer Degradation andStability，74：77-85。 
因此，优选的实施方案涉及本发明的HA衍生物，其中透明质酸或其衍 生物或盐的低平均分子量为800-10,000,000Da；优选10,000-1,500,000Da；优选10,000-50,000Da；或优选50,000-500,000Da；甚至更优选80,000-300,000Da。 
取代度(Degree of substitution)(DS)
根据如下实施例6，通过1H NMR光谱测定DS(10mg/ml，D2O，80℃，128扫描，400MHz)，其中使用2D-NMR(gCOSY)确定OSA基团的峰。通过比较OSA的乙烯基质子的强度(5.4和5.6ppm)与乙酰基质子的强度(2.0ppm)来计算DS。 
在优选的实施方案中，第一方面的HA衍生物的取代度(DS)为0.1-100％，优选1-90％，更优选2-80％，还更优选4-70％，甚至更优选8-60％，或10-50％，14-40％，16-30％或最优选18-25％。 
脂族烃基-/芳基-琥珀酸酐(ASA)
在本发明的优选实施方案中，一个或多个脂族烃基-/芳基-琥珀酸酐(ASA)具有结构通式(III)： 
在一个优选实施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基，优选R5、R6、R7、R8中的至少两个包含脂族烃基，更优选R5、R6、R7、R8中的至少三个包含脂族烃基；而且优选所述脂族烃基包含C1-C20脂族烃基，优选丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基或2-十八烯基。 
在另一个优选的实施方案中，R5、R6、R7、R8中的至少一个包含芳基，优选R5、R6、R7、R8中的至少两个包含芳基，更优选R5、R6、R7、R8中的至少三个包含芳基，其优选包含苯基。 
在又一个优选的实施方案中，优选R5、R6、R7、R8包含两个或更多个不同的脂族烃基和/或芳基，优选选自丙基、2-辛烯基、2-壬烯基、2-十二烯基、2-十六烯基、2-十八烯基，和苯基。 
在又一个优选的实施方案中，一个或多个ASA包含图3所示的任何结构式。 
生产
在本发明的方法中，可使用重组产生的HA，其是通过如下方法产生的，其中使用本领域已知的方法在适于产生透明质酸的营养培养基中培养产生HA的宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中以及允许涉及透明质酸合成的酶表达和允许透明质酸分离的条件下，在实验室中或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域已知的方法进行培养。合适的培养基可以从商业供应商获得，或可以根据已公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。分泌的透明质酸能够直接从培养基中回收。 
可以通过本领域已知的方法分离所得透明质酸。例如，可以从营养培养基中通过常规方法分离透明质酸，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可以通过本领域已知的多种方法进一步纯化分离的透明质酸，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。 
宿主细胞
优选实施方案涉及所述透明质酸或其盐是在何处重组产生的，优选通过革兰氏-阳性细菌或宿主细胞，更优选通过芽孢杆菌属(genus Bacillus)细菌重组产生。 
宿主细胞可以是适于重组产生透明质酸的任何芽孢杆菌属细胞。芽孢杆菌属宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌属细胞或其突变体。在本发明的实践中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌 (Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。特别适于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞在WO 98/22598有所描述。无被囊的(non-encapsulating)芽孢杆菌属细胞在本发明中是特别有用的。 
在优选的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、Bacillusclausii、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是Bacillus clausii细胞。在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是迟缓芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在最优选的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌A164Δ5(参见美国专利号5,891,701)或枯草芽孢杆菌168Δ4。 
可通过如下方法实现用本发明的核酸构建体转化芽孢杆菌属宿主细胞，例如，通过原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168：111-115)，通过使用感受态细胞(参见，例如，Young andSpizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau andDavidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，通过电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)，或通过接合(参见，例如，Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。 
盐和交联的HA 
优选的实施方案涉及第一方面的透明质酸衍生物，其包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴。 
EP 0 161 887 B1中公开了交联的HA或其盐的制备物，其通过用多官能环氧化合物交联HA来制备。HA与脂族醇全部或部分交联的酯和这些偏酯与无机或有机碱形成的盐公开于US 4,957,744。交联HA的其它方式公开于美 国专利号5,616,568、5,652,347和5,874,417。 
交联的HA还可通过用硼酸处理HA来制备，如下：将通过发酵(WO03/054163；Novozymes)在枯草芽孢杆菌中重组产生的干燥的透明质酸钠(Na-HA，203mg)溶于0.2M NaOH以得到4％溶液。加入硼酸(35mg(大约1当量的HA二糖)并在室温将该样品搅拌1.5h，然后在5℃贮存大约2.5天。完全如上所述平行地制备对照样品，只是不加硼酸。使用Carrimed CSL可控的应力流变仪(controlled stress rheometer)(锥体几何形状(cone geometry)：6cm，2°)在25℃测定所得HA-硼酸盐水凝胶(HA-borate hydrogel)的粘度。该粘度取决于剪切速率并且与对照样品相比在HA-硼酸盐水凝胶中增加到至少4-倍(4.2-至8.4倍)，这说明形成了交联网络。与Na-HA的标准光谱相比，在HA-硼酸盐水凝胶的FT-IR光谱上观察到在1200和945cm-1的新的峰，其对应于在交联的HA-硼酸盐水凝胶中新形成的硼酸酯的存在。 
因此，优选的实施方案涉及第一个方面的HA衍生物，其包含交联的透明质酸或其盐，优选透明质酸与硼酸交联，更优选交联的透明质酸包含硼酸酯。 
粒度(Particle size)
第一个方面的优选的HA衍生物具有50百分位数(percentile)的粒度，其D50 为10-1,000微米，优选100-1,000微米，更优选150-900微米，甚至更优选200-800微米，如通过悬浮于异丙醇中的粒子的激光衍射测量法(laserdiffraction measurement)所测定的。 
在优选的实施方案中，将第一个方面的HA衍生物的多分散性(polydispersity)测定为SPAN值，其根据下式计算：SPAN＝(D90-D10)/D50，且SPAN值为1.0-2.5；优选SPAN值为1.2-2.2；更优选SPAN值为1.5-1.9；和最优选SPAN值为1.6-1.8。 
微粒(Microparticles)
如下面的实施例所示，本发明提供ASA-HA衍生物，其能够形成微粒或纳米粒子，或微胶囊或纳米胶囊。这些粒子或胶囊或包含这些的组合物可用于大量的商业和科学应用，如用于化妆品或用于一般的药物输送(drug-delivery)。 
其它成分 
在优选实施方案中，包含本发明的HA衍生物的组合物还可包含其它成分，优选一种或多种活性成分，优选一种或多种药理学活性物质，并且还优选水溶性赋形剂，例如乳糖。 
可用于本发明中的活性组分或药理学活性物质的非限定性实例包括蛋白质和/或肽药物，例如，人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、生长激素释放激素/肽、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、骨形态形成性蛋白质(bone morphogenicprotein)、干扰素或其衍生物、胰岛素或其衍生物、心房肽III(atriopeptin-III)、单克隆抗体、肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、白细胞介素、肿瘤退化因子(tumor degenerating factor)、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminigen activator)、因子VII、因子VIII和尿激酶。 
可包括水溶性赋形剂用于稳定活性成分的目的，这种赋形剂可包括蛋白质，例如，白蛋白或明胶；氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和它们的盐；糖例如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖和硫酸软骨素；无机盐例如磷酸盐；表面活性剂例如TWEEN
Figure 2006800354457_0
(ICI)、聚乙二醇，及其混合物。可以按产品重量计0.001至99％的量使用赋形剂或稳定剂。 
本发明的几个方面涉及各种组合物和药物，其中包含有效量的如第一方面所限定的产品，和活性成分，优选所述活性成分是药理学活性剂；可药用的载体、赋形剂或稀释剂，优选水溶性赋形剂，并且最优选乳糖。 
此外，本发明的多个方面涉及用品(article)，其包含如第一方面所定义的HA衍生物或如上多个方面和实施方案中所限定的组合物，例如化妆品、卫生用品、医药或外科用品。在最后的方面，本发明涉及药物胶囊或微胶囊，其包含如第一方面所限定的产品或如本发明其它方面和实施方案所限定的组合物。 
实施例 
材料
高分子量(High-MW)透明质酸(HA)： 
-(批号(batch)MAG 30014) 
-(批号MAF 145 SD) 
低分子量(Low-MW)HA： 
-100kDa(批号14919-021) 
-30kDa(批号14919-032) 
-23kDa 
-14kDa 
脂肪烃基/芳基琥珀酸酐： 
-顺/反-2-辛烯-1-基琥珀酸酐(OSA)，Aldrich Chemical Company(d.：1.000，MW 220.27，97％纯度)。 
-苯基琥珀酸酐(PhSA)(干粉，MW 176.17)。 
-壬烯基琥珀酸酐(NSA)Aldrich Chemical Company(d.：1.032，MW224.30，95+％纯度，1JS38，246-00198-1)。 
-十二烯基琥珀酸酐(DSA)(d.：1.01，MW 266.38，1JS38，246-00168)。 
-四丙基琥珀酸酐(TpSA)。 
-十六烯基琥珀酸酐(HDSA) 
-十八烯基琥珀酸酐(ODSA) 
-ODSA和HDSA的混合物(50∶50) 
乙醇96％，变性的。 
4M HCl和4M NaOH。 
Na2CO3
 Milli-Q
Figure 2006800354457_1
超纯水(Millipore)。 
再生纤维素的透析管，其截留分子量为12-14kDa，Spectr/PorTM(SpectrumMedical Industries)。 
超滤膜(MWCO 10kDa和3kDa)。 
实施例1.高-MW OSA-HA，初始pH9.0，乙醇沉淀 
在室温将HA(批号MAF 145 SD，1.42g)过夜溶于Milli-Q水(200mL)中， 然后用4M NaOH将pH调节到9.0。在强的搅拌下加入OSA(1mL，4.54mmol)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。加入20mL饱和NaHCO3以缓冲反应。反应后，用1M HCl将pH调节到6.8。加入96％乙醇(4体积)以得到80％v/v的终浓度从而通过乙醇沉淀回收产物。通过离心(3000rpm，15min和4℃)回收沉淀物。用96％乙醇洗涤沉淀，然后再溶于MQ水并冷冻干燥(freeze drying)。 
实施例2.高-MW OSA-HA，初始pH11，乙醇沉淀 
向Milli-Q水的三个50mL溶液中每一个加入HA(批号MAF 145 SD，1.13g)，并在室温溶解过夜。用4M NaOH将pH调节到11。在强的搅拌下将不同量的OSA(1.10mL(5.23 mmol)，0.505mL(2.62mmol)，0.110mL(0.52mmol)加入三个溶液中的每一个。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应21小时。反应后所有的样品具有大约4-5的pH。加入96％乙醇(4体积)以得到80％v/v的终浓度从而通过乙醇沉淀回收产物。通过离心(3000rpm，15min和4℃)回收沉淀物。用96％乙醇洗涤沉淀，然后再溶于MQ水并冷冻干燥。 
实施例3.高-MW OSA-HA，初始pH9.0，pH保持在9-11，透析 
在室温将HA(批号MAF 145 SD，0.75g)过夜溶于Milli-Q水(150mL)，然后将pH调节到9.0。在强搅拌下加入OSA(1.42mL，6.25mmol)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(pH stat)(加入1M NaOH)将pH维持在大约9-11。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻(frozen)并冻干(lyophilised)。 
实施例4.高-MW OSA-HA，初始pH8.5，pH保持在9-11，透析 
在室温将HA(批号MAG 30014，0.75g)过夜溶于Milli-Q水(150mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下加入OSA(1.42mL，6.25mmol)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(pH stat)(加入1M NaOH)将pH维持在大约9-11。通过使用1M HCl将pH调节到6.5。将产物相对于0.2M NaOH透析3×3h，并相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。 
实施例5.低-MW OSA-HA(30和100kDa) 
在室温将低-MW HA(30或100kDa，2.5g)过夜溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下加入等摩尔量的OSA(3.35mL，HA∶OSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的OSA(0.35mL，HA∶OSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(pH stat)(加入1M或0.5M NaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。 
实施例6.产物表征-结果和讨论 
分子量 
使用SEC-MALLS-VISC(流动相：150mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH7.0，0.5ml/min，注射体积(injected volume)：0.5ml)分析实施例5的100kDaOSA-HA。使用的柱：PL水凝胶(aquagel)OH-40/OH-50/OH60。系统：WatersAlliance HPLC系统Waters 2410 RI检测器和Wyatt MALLS检测器。使用来自Wyatt Technology Corp.的ASTRA V软件处理数据。 
取代度(DS) 
通过1H NMR光谱测定DS(10mg/ml，D2O，80℃，128扫描，400MHz)。通过使用2D-NMR(gCOSY)确定OSA基团的峰。 
结果和讨论；高-MW HA 
在高-MW HA的所有实验过程中，观察是相同的：OSA形成琥珀色油滴(amber-coloured oil drop)，其由于搅拌逐渐分成较小的滴。在反应结束时，溶液是白色的和不透明像奶一样，这能够解释为形成微团或微尺度聚集物/液滴。甚至在通过沉淀或透析进行纯化后，此时将过量的OSA除去，仍在不同程度观察到此现象。 
在高-MW HA的第一个实验过程中，使用在80％乙醇中的沉淀以除去OSA修饰的剩余物/副产物(surplus/by-product)。然而，由于使所述产物沉淀完全的问题，选择对Milli-Q水的透析作为更好的方法。 
高-MW OSA-HA的初始制备物都显示溶液性质的变化。一个实施例是它 们都使泡沫非常有效的稳定若干小时；这通过摇动1％溶液继之以目视检查(visual inspection)来简单地测试。在第一个实验过程中另一个观察是，溶液的pH值在反应过程中逐渐下降。因此，需要缓冲该系统，例如用NaCO3缓冲或使用恒pH器。重要的是，将pH值保持在8.0以上以使反应进行，且在9.0以下以避免通过水解除去OSA基团。 
尝试高-MW OSA-HA产物的NMR光谱，但由于溶解度问题，仅仅观察到OSA和HA的一些非常弱的峰，而且不能测出DS。在所有情况下，产量接近或稍高于起始材料HA的量(通过称量冻干的产物来测定)。 
结果和讨论；低-MW HA 
进行四个单独的实验，并连同1H-NMR光谱的DS和产量(yield)总结于表1。通过比较OSA的乙烯基质子的强度(5.4和5.6ppm)与乙酰基质子的强度(2.0ppm)来计算DS。 
通过2D NMR光谱(gCOSY)阐明了30kDa OSA-HA的1H NMR光谱，并在图2中给出了部分确定的峰，显示100kDa OSA-HA(14919-033)的1H NMR光谱。 
最终，在这些实验中，高-和低-MW透明质酸均用2-辛烯-1-基琥珀酸酐(OSA)成功地修饰。 
表1.制备低-MW OSA-HA的结果。 
批号 14658-129 14658-131 14658-133 14919-033 14919-038
HA∶OSA 1∶1 1∶1 10∶1 1∶1 10∶1
MW 30kDa 30kDa 30kDa 100kDa 100kDa
产量 2.1g 2.1g 2.8g 2.7g 2.0g
DS 11.5％ 12％ 2.6％ 18.8％ 1.6％
实施例7.低-MW OSA-HA衍生物(14kDa) 
在室温将低-MW HA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下加入等摩尔量的OSA(3.35mL，HA∶OSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的OSA(0.34mL，HA∶OSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(加入0.5MNaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。纯化和冷冻-干燥后的产量分别为2.1g 和2.1g。如实施例6所述，DS分别测定为11.5％和2.6％。 
实施例8.低-MW苯基-琥珀酸酐(PhSA)HA衍生物(14kDa) 
在室温将低-MW HA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下逐渐加入等摩尔量的PhSA(2.8g，HA∶PhSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的PhSA(0.28g，HA∶PhSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(加入0.5MNaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。纯化和冷冻-干燥后的产量分别为2.5g和2.4g。如实施例6所述，DS分别测定为15.1％和2.6％。 
实施例9.低-MW2-壬烯-1-基琥珀酸酐(NSA)HA衍生物(14kDa) 
在室温将低-MW HA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下加入等摩尔量的NSA(3.55mL，HA∶NSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的NSA(0.35mL，HA∶NSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(加入0.5MNaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。纯化和冷冻-干燥后的产量分别为2.4g和2.2g。如实施例6所述，DS分别测定为11.4％和2.1％。 
实施例10.低-MW 2-十二烯-1-基琥珀酸酐(DSA)HA衍生物(14kDa) 
在室温将低-MW HA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调节到8.5。在强搅拌下加入等摩尔量的DSA(4.20mL，HA∶DSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的DSA(0.42mL，HA∶DSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(加入0.5MNaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L，MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。纯化和冷冻-干燥后的产量分别为2.2g和2.2g。如实施例6所述，DS分别测定为2.2％和1.7％。 
实施例11.低-MW四丙基琥珀酸酐(TpSA)HA衍生物(14kDa) 
在室温将低-MW HA(14kDa，2.5g)溶于Milli-Q水(50mL)，然后将pH调 节到8.5。在强搅拌下加入等摩尔量的TpSA(3.25mL，HA∶TpSA比例1∶1)或为HA的摩尔浓度1/10的TpSA(0.33mL，HA∶TpSA比例10∶1)。使溶液维持在环境温度在强搅拌下(大约600rpm)反应16小时。通过使用恒ph器(加入0.5M NaOH)将pH维持在大约8.5-9.0。将产物相对于MQ水透析3×3h(4℃，7L， MWCO 12-14,000Da)，冷冻并冻干。 
实施例12.不同的低-MW ASA HA衍生物(14kDa) 
进行十一个单独的实验，其中用五种不同的ASA(ASA名称、结构和缩写参见图3)以两种不同的HA∶ASA摩尔比例(1∶1和10∶1)修饰LMW HA(14kDa)。通过透析纯化所得的产物以除去过量的试剂和副产物。通过1H NMR光谱基于单体(on monomer basis)测定取代度(DS)。通过重量分析冷冻干燥的样品来测定产量。通过SEC-MALLS-VISC测定分子量。为了避免材料粘在GPC柱上，将自动注射器(auto-injector)中的温度从4℃调节到15℃。分析的所有结果总结于表2中。 
表2.制备和表征ASA修饰的LMW HA(14kDa起始材料)的结果。 
   样品     ASA  比例 (ASA∶HA) 取代度 (％) 产量 (g) 分子量， Mw(kDa) 构象图因数；v (Rg～Mv)
  14658-142   OSA 1∶1.25 9.7 2.70 17.0 0.35±0.04
  14658-144   OSA 1∶0.125 3.5 2.37 14.2 0.56±0.05
  14658-148   PhSA 1∶1.25 1.8 2.19 13.8 0.62±0.04
  15286-017a   PhSA 1∶1.25 15 1.80 15.9 0.67±0.02
  14658-150   PhSA 1∶0.125 3.4 2.19 14.3 0.58±0.02
  15286-010   NSA 1∶1.25 11 2.35 21.1c 0.04±0.02
  15286-012   NSA 1∶0.125 2.1 2.24 14.4 0.20±0.01
  15286-014b   DSA 1∶1.25 2.2 2.20 14.1 0.61±0.02
  15286-020b   DSA 1∶0.125 1.7 2.24 14.0 0.49±0.02
  15286-028   TpSA 1∶1.25 * * * *
  15286-037   TpSA 1∶0.125 * * * *
(a)：14658-148的重复且按比例缩减的形式。以小部分添加PhSA而不是立即全部加入。(b)：DSA的问题-太浓以致于不能以正常搅拌有效分散；在透析过程中形成油相，其必须通过吸取去除和丢弃。(c)：双峰式分布(Bimodaldistribution)；第1个峰：15.5kDa，第2个峰：27.2kDa；(*)：目前正在分析中。 
如总结于表2的结果所示，当较低的DS是预期结果时，衍生化反应进行更加顺利。所得的DS十分类似于所有不同的ASA，除了在水中显然非常不稳定的PhSA，其对于样品14658-148得到低DS值(2.19)。重复实验，其中 将PhSA粉逐渐加入HA-溶液。这样得到15％的DS(15286-017)，这显示逐渐加入ASA可为在HA上增加取代的方法。 
对于用DSA修饰的LMW HA，在较高的ASA∶HA比例，DS值也是非常低的。这可能是由于DSA相的高粘度造成的。此外，在透析和冷冻干燥之后仍然可以看到不反应的ASA的小滴。它们必须通过吸液器人工去除。 
可能地，可通过在与更强的搅拌组合的反应过程中增加温度来改进DSA-HA的DS和纯度。逐渐增加DSA还可增加与HA反应的DSA的量。 
TpSA样品(15286-037和15286-028)还未进行分析。 
通过在双对数标度中绘制回转半径(radius of gyration)(Rg)相对于分子量(Mw)的图，可得到关于聚合物构象的信息。Rg和Mw的关系总结于Haug氏三角(Haug’s triangle)中(图4)。 
对于所有不同的ASA-HA绘制构象图，并在表2中给出结果。大部分样品显示的因数(factor)类似于随机卷曲(random coil)，随机卷曲也是未修饰的HA的构象。仅有的例外是高度修饰的OSA-HA，其具有类似于球体的构象，以及也显示非常低的构象因数(0.20和0.04)的NSA-HA，显示出聚集或不良的(impaired)柱分离，或许是由于与柱材料的相互作用。类似地，考察来自SEC-MALLS-VISC分析的浓度分布曲线(concentration profile)(RI-信号)(参见图5)，对于样品15286-010(11％NSA)在较早的洗脱时间(在大约35min)存在聚集峰。还通过样品14658-142(9.7％OSA修饰的HA)和15286-010(11％修饰的NSA-HA)的表观MW的轻微增加(表2)显示此聚集现象。 
总之，用不同的脂族烃基-/芳基琥珀酸酐成功修饰了低MW透明质酸(14kDa)。OSA-HA和NSA-HA的高DS产物显示一些聚集趋势和构象改变，其可能是由于疏水相互作用引起的。 
实施例13 OSA-HA(14kDa)在水溶液中表面活性 
根据表3中给出的浓度，在MQ-水中制备14kDa OSA-HA(DS＝9.7％，批号14658-142)和未修饰的LMW HA(30kDa)的溶液。使用表面张力计(surfacetensiometer)(Wilhelmy片)在通过表面张力测量来分析样品。用同样的方法测定溶剂(水)的表面张力为72mN/m。表面张力测量的结果在图6中给出并总结于表3。可以看出，表面张力随OSA-HA浓度增加而减小。与纯溶剂(MQ-水)和LMW-HA(30kDa)相比，HA衍生物的表面张力低得多。 
此外，可以看出OSA-HA的表面张力以时间依赖性方式继续降低。这可通过OSA-HA作为高MW表面活性剂的事实来解释，其使用长时间扩散到溶液的表面(由于扩散速度与MW成反比)。表面活性更高的(More surface active)聚合物在表面给出较低的表面张力。此时间依赖性也是OSA部分不仅在溶液中与HA共存而且实际上共价连接于HA的进一步证据。 
这进一步暗示HA的OSA修饰并未赋予其疏水性，而赋予其两亲性(amphiphillic)。这些性质可能在如下系统中充分利用：需要更低的表面张力的系统(例如，局部的眼科系统)或需要乳化性质使化妆品或药物制剂中的乳剂或泡沫稳定的系统。 
表3.OSA-HA溶液在MQ-水中在3200秒(second)的表面张力测量。 
浓度(％) LMW OSA-HA(14kDa，DS＝9.7％) LMW HA(30kDa)
0.01 64mN/m -
0.1 52mN/m 64mN/m
1.0 40mN/m -
实施例14.通过高剪切混合制备高MW ASA衍生物 
将HA(4g，MAG30021)过夜溶于400mL MQ水。将溶液保持在室温(25℃)或加热到60℃，然后在剪切(ULTRA-TURRAX 24000min-1，5min)下加入Na2CO3(2g)。然后根据表4中提供的反应方案加入ASA并在强剪切(ULTRA-TURRAX 24000min-1，5min)下混合。使得到的乳剂在给定的温度(表4)反应6小时，然后移至室温过夜。将pH调节到中性，然后通过超滤(MWCO 10 000)纯化产物直到电导率(conductivity)低于15μSi/cm。将产物冷冻和冻干。NMR光谱证实所有的产物均被修饰。所有样品都得到在0.1M NaCl中浓度为1％w/v的混浊溶液。 
表4.用于制备高MW ASA-衍生物的反应方案 
样品ID      ASA      碳链    ASA∶HA  摩尔比   反应温度  [℃]
    1     OSA     C8     1∶1     25
    2     OSA     C8     1∶10     25
    3     ODSA     C18     1∶1     60
    4     ODSA     C18     1∶10     60
    5     HDSA     C16     1∶1     60
    6     DSA     C12     1∶1     60
    7     DSA     C12     1∶10     60
ODSA：十八烯基琥珀酸酐，HDSA：十六烯基琥珀酸酐，DSA：十二烯 基琥珀酸酐。 
实施例15.ASA HA稳定O/W乳剂 
根据如下配方，将实施例14中制备的ASA-HA编号1，3，4，5，6，7和未修饰的HA(MAG30014)与三种化妆油(矿物油(mineral oil)、碳酸二乙基己酯(diethylhexyl carbonate)和棕榈酸乙基己酯(ethylhexyl palmitate))配制在一起： 
1.将6mL油加入14mL 0.1M NaCl和0.29％ASA-HA的水溶液 
2.在强剪切(ULTRA-TURRAX在24000min-1)下将所述溶液混合25秒。 
3.将乳剂在室温在黑暗中保持8周，在24小时和8周后通过目视评价稳定性。 
所有衍生物与对照和未修饰的起始HA相比显示增加的乳剂稳定性(参见图7棕榈酸乙基己酯的24小时和8周后的样品)。这显示可将ASA-HA用作化妆品中的乳剂或基于乳剂的高级给药系统(advanced drug delivery system)。 
实施例16.具有长脂族烃基链的各种低-MW ASA HA衍生物 
如用于高MW HA的实施例15所述制备低MW ASA HA，仅有的差别是HA(23kDa)的起始浓度为2％w/v。表5中所有样品在60℃制备并通过超滤(MWCO 3000kDa)和冻干进行纯化。如实施例6所述，通过1H NMR光谱测定DS。 
表5.制备具有较长脂族烃基链的低MW HA衍生物的反应方案。 
   样品#    ASA  比例 (HA/ASA) DS (NMR光谱)     产量  
  15286-109-1  (HA：23kDa) DSA  1∶1,25  2,12％      4,09g 
  15286-109-2  (HA：23kDa) DSA  1∶0,125  确认修饰      3,44g 
  15286-118-1  (HA：23kDa) HDSA/ODSA(50∶50) 1∶1,25  13,14％      6,73g 
  15286-118-2  (HA：23kDa) HDSA/ODSA(50∶50) 1∶0,125  1,06％      3,84g 
  15286-120-1  (HA：23kDa) ODSA  1∶1,25  12,94％      6,15g 
  15286-120-2  (HA：23kDa) ODSA  1∶0,125  0,08％      2,96g 
实施例17.苯基琥珀酸的自由基清除性质(Free radical scavengingproperties) 
通过扫描照相机(streak camera)观察和光散射(light scattering)(DLS/SLS)研究监测，已显示在羟基(hydroxyl radical)(通过Cu2+/H2O2产生)存在下，水溶液中的PhSA-HA(14kDa)(10mg/ml)比未修饰的HA降解快得多。这显示PhSA-HA具有作为自由基清除剂可能用于化妆品制剂的潜力。 
实施例18.测定辛烯基琥珀酸酐-透明质酸衍生物(OSA-HA，DS 16％)的临界聚集浓度(critical aggregation concentration)(CAC) 
使用等温滴定(isothermal titration)量热计VP-ITC(Microcal LLC，USA)通过量热法(calorimetry)OSA-HA衍生物的临界聚集浓度(CAC)。使用OSA-HA的浓缩溶液(0.294mL，15mg/mL溶于蒸馏水)滴定(titrate)量热计样品池中的蒸馏水(1.4615mL)。每300秒注入OSA-HA的溶液(2μL，15mg/mL)，并如图8所示随时间记录样品池中的焓变(ΔH)。 
将ΔH绘制为样品池中OSA-HA浓度的函数，并在曲线的转折处(at thebreak of the curve)测定OSA-HA的CAC。每个实验重复三次并将CAC作为平均值提供。例如，取代度(DS)为16％的OSA-HA的CAC为0.45mg/mL(图9)。 
此研究证实OSA-HA的结合性(associative properties)的存在。而且，显示可能将这些衍生物配制成微团和/或微粒/纳米粒子，这使它们适用于胶囊化(encapsulation)和递送疏水的化合物，如疏水的化妆品生物活性剂和药物。 
实施例19.测定辛烯基琥珀酸酐-透明质酸衍生物(OSA-HA，DS 44％)的临界聚集浓度(CAC) 
使用以水浴(Julabo F10，Merck，United States)恒温的荧光分光光度计(FluoroMax，Spex，United States)，通过荧光光谱测定取代度为44％的OSA-HA的CAC。使用尼罗红(Nile Red)作为荧光探针。对于在不同的磷酸盐缓冲液(表7)中制备的一定范围的OSA-HA溶液(表6)测量荧光。 
表6：OSA-HA溶液 
  溶液     OSA-HA浓度(mg/mL)
    1     0.0001
    2     0.0002
    3     0.0006
    4     0.001
    5     0.002
    6     0.006
    7     0.01
    8     0.02
    9     0.06
    10     0.1
    11     0.2
    12     0.6
    13     1.0
表7：磷酸盐缓冲液 
缓冲液   浓度NaCl(M)   浓度NaH2PO4(M)
    1     0.15     0.01
    2     0.50     0.01
    3     1.00     0.01
    4     1.50     0.01
将尼罗红(3.184mg)溶于THF和丙酮的混合物(50/50，10mL)。在搅拌、过夜、黑暗和室温的条件下将此溶液(10μL)与各OSA-HA溶液(10mL)温育。在25℃在543nm的激发波长(excitation wavelength)分析各溶液，同时记录580至700nm的发射光谱(emission spectra)。激发狭缝设为1并对于各溶液调节发射狭缝。荧光发射(I)的强度绘制为波长(λ)的函数。 
通过相对于λ用六次多项式函数拟合曲线I来测定对应于最大强度的波长(λmax)。每个λmax值是三次测量的平均值。 
为了测定CAC，将λmax绘制为聚合物浓度(C)的函数。在λmax相对C的曲线的转折点(inflexion point)推断CAC(图10)。 
在图10，OSA-HA(DS＝44％)的CAC为0.003-0.004mg/mL中的某处。而未修饰的HA观察不到此现象。实际上，在任何HA浓度都检测不到荧光，这表示不可能在HA溶液中使尼罗红增溶(solubilize)。这证明了在OSA-HA溶液中聚合装配体(polymeric assemblies)的存在。 
实施例20.盐浓度对OSA-HA(DS＝44％)的CAC的影响 
使用与前面实施例中所述相同的实验配置(set-up)来研究盐浓度对OSA-HA(DS＝44％)的CAC值的影响。结果示于下表8以及图11中。 
表8. 
  NaCl的浓度  (M) CAC的开始(Onset)(mg/mL) 转变的范围(extend of thetransition)(mg/mL) CAC(mg/mL)
  0.15     0.002     0.002-0.006 0.003-0.004
  0.5     0.0006     0.0006-0.006 0.003
  1.0     0.0006     0.0006-0.006 0.002
  1.5     0.0002     0.0002-0.002 0.0006-0.0007
实施例21.OSA-HA(DS＝44％)聚合微团的ζ电势(zeta potential) 
通过与多普勒激光干涉仪(Doppler laser interferometer)偶联的毛细管电泳(capillary electrophoresis)(Zetasizer 3000HS，Malvern，英国)测定OSA-HA(DS＝44％)聚合微团的ζ电势。在25℃记录测量结果。在测量之前将OSA-HA溶于10-3M NaCl(浓度为1mg/mL)。将OSA-HA(DS＝44％，在10-3M NaCl中为1mg/mL)的ζ电势确定为大约-25mV(图12)。 
实施例22.OSA-HA(DS＝44％)聚合微团的透射电子显微术(Transmission electron microscopy)。 
使用透射电子显微镜(transmission electron microscope)(EM 410，Philips，荷兰)进行OSA-HA(DS＝44％)聚合微团的显微观察(Microscopicobservation)。将样品沉积(deposit)在离子化的碳涂覆的铜网(ionised carboncoated copper grids)上并用乙酸双氧铀(uranyl acetate)水溶液(2％)染色。显微快照(Microscopic snapshot)明确显示OSA-HA聚合微团是球形的并具有通常为50至200nm的亚微粒尺度(数据未显示)。这示于图13。 

Claims (45)

1.一种透明质酸衍生物，其包含n个重复单元并在pH 8-9具有结构通式(I)：
其中在至少一个重复单元中，R1、R2、R3、R4中的一个或多个包含在pH 8-9具有结构通式(II)的酯键合的脂族烃基-或芳基-琥珀酸，其余的R1、R2、R3、R4是羟基OH：
Figure FSB00000534914800012
其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基或芳基，其余的R5、R6、R7、R8是氢原子H，而且其中标记“酯”的氧参与与结构(I)形成的酯键，
其中所述透明质酸衍生物的平均分子量为800-10,000,000Da。
2.权利要求1的透明质酸衍生物，其中R1、R2、R3、R4中的两个或更多个包含一个或多个在pH 8-9具有结构通式(II)的酯键合的脂族烃基-或芳基-琥珀酸。
3.权利要求1或2的透明质酸衍生物，其中R1、R2、R3、R4中的三个或更多个包含一个或多个在pH 8-9具有结构通式(II)的酯键合的脂族烃基-或芳基-琥珀酸。
4.权利要求1的透明质酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基。
5.权利要求4的透明质酸衍生物，其中所述脂族烃基包含C1-C20脂族烃基。
6.权利要求4的透明质酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含芳基。
7.权利要求6的透明质酸衍生物，其中所述芳基是苯基。
8.权利要求1的透明质酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8包含两个或更多个不同的脂族烃基和/或芳基。
9.权利要求1的透明质酸衍生物，其平均分子量为10,000-50,000Da。
10.权利要求1的透明质酸衍生物，其平均分子量为50,000-500,000Da。
11.权利要求1的透明质酸衍生物，其中透明质酸是重组产生的。
12.透明质酸衍生物，其中透明质酸的一个或多个羟基在与一个或多个脂族烃基-或芳基-琥珀酸酐的反应中被取代，以形成透明质酸和所得的一个或多个脂族烃基-或芳基-琥珀酸之间的酯键，其中所述透明质酸衍生物的平均分子量为800-10,000,000Da。
13.权利要求12的透明质酸衍生物，其平均分子量为10,000-1,500,000Da。
14.权利要求13的透明质酸衍生物，其平均分子量为20,000-50,000Da。
15.权利要求13的透明质酸衍生物，其平均分子量为50,000-500,000Da。
16.权利要求12-15中任一项的透明质酸衍生物，其中所述一个或多个脂族烃基-或芳基-琥珀酸酐具有结构通式(III)：
Figure FSB00000534914800021
其中(III)中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基或芳基。
17.权利要求16的透明质酸衍生物，其中所述脂族烃基包含C1-C20脂族烃基。
18.权利要求16的透明质酸衍生物，其中所述芳基包含苯基。
19.权利要求16的透明质酸衍生物，其中R5、R6、R7、R8包含两个或更多个不同的脂族烃基和/或芳基。
20.权利要求12-15中任一项的透明质酸衍生物，其中透明质酸是重组产生的。
21.产生透明质酸衍生物的方法，包括如下步骤：
(a)在碱性条件下在水溶液中，使透明质酸与一种或多种具有(III)中所示结构通式的脂族烃基-或芳基-琥珀酸酐反应，
其中(III)中R5、R6、R7、R8中的至少一个包含脂族烃基或芳基，
由此形成所述透明质酸衍生物；和
(b)回收所述透明质酸衍生物，
其中所述透明质酸衍生物的平均分子量为800-10,000,000Da。
22.权利要求21的方法，其中所述脂族烃基包含C1-C20脂族烃基。
23.权利要求21的方法，其中所述芳基是苯基。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述一个或多个脂族烃基-或芳基-琥珀酸酐包含任一以下结构式
2-辛-1-烯基琥珀酸酐
2-壬-1-烯基琥珀酸酐
2-十二-1-烯基琥珀酸酐
Figure FSB00000534914800034
苯基琥珀酸酐
Figure FSB00000534914800035
25.权利要求21-23中任一项的方法，其中R5、R6、R7、R8包含两个或更多个不同的脂族烃基和/或芳基。
26.权利要求21-23中任一项的方法，其中透明质酸的平均分子量为10,000-1,500,000Da。
27.权利要求26的方法，其中透明质酸的平均分子量为20,000-50,000Da。
28.权利要求26的方法，其中透明质酸的平均分子量为50,000-500,000Da。
29.权利要求21-23中任一项的方法，其中透明质酸是重组产生的。
30.一种组合物，其包含权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物和活性成分。
31.根据权利要求30的组合物，其还包含水溶性赋形剂。
32.药用组合物，其包含有效量的权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物，连同可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
33.药用组合物，其包含有效量的权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物作为媒介物，连同药理学活性剂。
34.一种化妆品，其包含权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物。
35.一种化妆品，其包含有效量的权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物作为活性成分。
36.卫生、医药或外科用品，其包含如权利要求1-20中任一项所限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物。
37.药物胶囊、微胶囊、纳米胶囊、微球或纳米球，其包含如权利要求1-20中任一项所限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物。
38.进行皮肤施用化妆品的方法，所述方法的改进包含使用权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物，或权利要求30-33中任一项限定的组合物。
39.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备治疗骨关节炎的药物的用途。
40.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备眼科学治疗的药物的用途。
41.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
42.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备处理创伤的药物的用途。
43.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备用于血管发生的药物的用途。
44.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备保湿剂的用途。
45.权利要求1-20中任一项限定的透明质酸衍生物或权利要求30-33中任一项限定的组合物用于制备治疗脱发或秃发的药物的用途。
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