CN101212956A - 生产干肉碱粉末或颗粒的喷雾干燥法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含有肉碱化合物的大体上未纯化的原料制备干燥的大体上纯的和/或工业纯的肉碱粉末或颗粒的新方法，还涉及由此生产的干肉碱粉末或颗粒。

Description

生产干肉碱粉末或颗粒的喷雾干燥法
本发明涉及从含肉碱的液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的新方法，具体是干燥L-肉碱粉末或颗粒，它们大体上为纯的和/或工业纯，还涉及这样生产的肉碱粉末或颗粒。
L-肉碱是自然界中广泛分布的维生素类物质，具有广范围的药物、食品和饲料用途。L-肉碱通过将脂肪酸从细胞溶质输送到线粒体基质进行β-氧化，而在脂肪酸代谢中起重要作用。在所有组织中，作为能源的长链脂肪酸氧化是具有肉碱依赖性的。通过施用L-肉碱可补偿体内不足的L-肉碱产生。L-肉碱不但直接对动物或人体的能量代谢，而且对心血管系统、循环和肌肉及神经系统有正面影响。此外，L-肉碱可用于其它目的，包括刺激酵母菌和细菌的生长。
在世界范围内，对L-肉碱需求的日益增长促使人们寻找合成光学纯的L-肉碱的方法。化学合成制得了外消旋混合物，该但方法的经济学因L-异构体分离必需经由昂贵的选择性沉淀而降低。同样地，产量很低，而且为了降低成本，必需回收和循环使用拆解剂。虽然今天生产某一部分的L-肉碱包括这些方法，但人们越来越趋向于通过廉价易得的底物的生物转化获得L-肉碱。与化学合成相比，生物转化的优点之一是生物技术方法更有利于环境。生物转化中废水、总有机碳、盐和焚烧废物的量都是相当低的。已知生物技术生产L-肉碱的几种方法。
EP0158194B1描述了基于巴豆甜菜碱和/或4-丁内铵盐作为起始化合物，微生物法生成L-肉碱的方法。在上方法中，微生物能从例如4-丁内铵盐生产L-肉碱，但在生长基质存在的情况下，用起始化合物巴豆甜菜碱(crotonobetaine)和/或丁内铵盐培养的微生物不能分解代谢L-肉碱。
EP0722500B1描述了生产L-肉碱的生物技术方法，其中通过含一个或多个编码参与L-肉碱生物合成的酶的基因的重组微生物，在合适的碳和氮源存在的情况下发酵前体巴束甜菜碱和/或γ-丁内铵盐。
WO02/061094描述了基于甜菜碱酯作为前体生产L-肉碱的微生物方法，其中在第一步中，甜菜碱酯通过分离的水解酶或含这种水解酶的微生物转化为4-丁内铵盐；在第二步中，通过能将此甜菜碱转化为L-肉碱的微生物，此甜菜碱转化为L-肉碱。
在这些全细胞生物催化方法中，产生的L-肉碱分泌入培养基中，即待分离和纯化的发酵液。因此，发酵后含L-肉碱的培养基进行几个纯化步骤以获得可进一步加工的纯L-肉碱。通常发酵液首先进行超滤步骤以分离生物物质，由此回收含L-肉碱的渗透液。然后得到的渗透液进行浓缩步骤，活性炭处理以进行脱色，脱盐步骤，再进行浓缩，得到浓缩的很纯的L-肉碱溶液。然后对具有高纯度的纯化的L-肉碱进行干燥步骤。
由于其吸水性高，固体L-肉碱物质及其简单的粉末混合物具有差的可贮藏性和稳定性，具体来说是色稳定性，这引起严重的问题，如在人食品、动物饲料或药品工业中，含肉碱的纯固体肉碱或粉状混合物的进一步加工期间不足的流动性。因此，为了减小干燥的L-肉碱产物的吸水性，在最后浓缩步骤后得到的高纯度L-肉碱通常进行结晶、重结晶和/或喷雾干燥过程。可继之以进一步的加工步骤，如压实等，这取决于得到的干L-肉碱产物的用途。
因此，在生物技术生产L-肉碱的常规方法中，总是对发酵液应用不同的纯化方法获得很纯的L-肉碱溶液，然后进行结晶或重结晶和/或喷雾干燥步骤以得到干燥、吸水性小或非吸水性的L-肉碱产物，之后该产物可贮存或根据预期用途进一步加工。然而，迄今为止这些常规方法未提供发酵后从得到的未纯化培养基或从进行预纯化(如应用仅一个或几个纯化步骤)的预纯化培养基中直接获得L-肉碱。这些不同的分离和纯化步骤在含L-肉碱的发酵液的常规下游过程中进行，由于进行各种纯化步骤必需不同技术设备，使整个生物技术方法不但费力和耗时，而且成本高。因此，从操作和经济观点来看，发酵液的常规下游过程有若干缺点。
因此，本发明处理的技术问题是提供从含肉碱的未纯化或预纯化的原料(具体是除含肉碱以外，还含有许多其它不同小分子物质的原料)简单、有效地纯化肉碱的方法，一方面提供从原料纯化肉碱的总效率和速度且显著降低成本；另一方面确保分离的肉碱的高产量和高纯度。
本发明通过提供从含肉碱的液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的第一种方法解决了上述技术问题，该方法包括以下步骤：
a)将原料与载体混合
b)对a)中得到的混合物进行干燥过程和
c)回收稳定的干肉碱粉末或颗粒。
本发明还通过提供从含肉碱的液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的第二种方法解决了此技术问题，所述方法包括以下步骤：
a)对原料进行干燥过程获得干燥产物
b)将a)中得到的干燥产物与载体混合
c)回收稳定的干肉碱粉末或颗粒。
本发明的发明者惊奇而意外地发现，若对来源于生产L-肉碱的生物技术方法的预纯化或基本上未纯化的发酵液，具体是通过超滤此发酵液获得的含L-肉碱的渗透物进行喷雾干燥过程，可获得稳定的干L-肉碱，其具有可与用常规方法(即对很纯L-肉碱溶液进行喷雾干燥)得到的干L-肉碱产物相当的特征。
已知发明者在这些实验中使用的原料，即通过超滤发酵液得到的渗透物，仍是含许多不同其它物质的复杂培养基。采用初步纯化步骤，如超滤，例如采用具截断值(cut-off)为50000KDA的膜，仅除去一定尺寸的伴随物质，具体来说是分子量大于50000KDA的悬浮固体和溶质，如悬浮颗粒、胶体、大分子、细胞和细胞碎片，而伴随物质具低分子量的有机化合物、废物和盐则占在渗透液中得到全部伴随物质的大多数。由于喷雾干燥过程使用的这种未纯化原料仍含许多不同的伴随物质，因此惊人的是，发明者指出通过以下方法可从其中得到大体上纯的和/或工业级干L-肉碱产物：渗透物首先与合适的颗粒载体材料混合，然后进行干燥过程，具体是喷雾干燥过程，或者渗透物首先进行干燥过程，具体是喷雾干燥过程，然后立即与颗粒载体材料混合。这表明与常规方法相比，能省去生物技术生产肉碱的下游加工中传统上进行的大部分纯化步骤。
由本发明方法得到的稳定干粉末肉碱产物主要由肉碱化合物和混合的载体材料组成，而原料中原本存在的所有其它组分，如低分子有机物质的含量很少。与通过对常规方法纯化的很纯的肉碱溶液进行喷雾干燥得到的粉末相比，用本发明方法得到的肉碱产物中伴随物质的含量并没有显著增大。因此，用本发明方法得到的肉碱产物大体上是纯的。此外，与用喷雾干燥纯肉碱溶液得到的肉碱产物相比，按照本发明得到的肉碱产物显示相似的低吸水性，相似的高流动性，相似的极好可贮藏性和相当的加工性。由于它们的显著和有利的性质，用本发明方法得到的干肉碱产物可采用与喷雾干燥纯肉碱溶液得到的肉碱粉末相类似的方法进行加工。用本发明方法得到干肉碱产物有利地具有低水含量，特别适合生产动物饲料，但也可用于生产食品、药物组合物和化妆品组合物。
因此，与常规的纯化方法相比，本发明方法造操作性和经济特性方面具有显著优点。由于按照本发明方法，在喷雾干燥之前待进行不超过一个纯化或分离步骤，而不是像常规方法中那样进行五个或更多个步骤，因此本发明方法能迅速制得喷雾干燥的纯肉碱粉末或颗粒。所以可省去进行这些纯化步骤通常需要的设备。因此，还因为按照本发明喷雾干燥步骤，可使用已得到的常规喷雾干燥装置，本发明的方法提供显著的成本效益。
因此，本发明提供的特别简单、有效和经济的方法用于提供具有极佳流动性、稳定性和贮藏性及低吸水性的大体上纯的和/或工业纯的干肉碱汾末。
在本发明的上下文中，“肉碱”或“肉碱化合物”包括但不限于，例如L-肉碱、烷酰基-L-肉碱、其衍生物、其盐或其混合物。烷酰基-L-肉碱是具有烷酰基的肉碱化合物，烷酰基优选直链基或支链基，其含有2-8个碳原子，更优选2-6个碳原子。特别优选的烷酰基-L-肉碱是乙酰基-、丙酰基-、丁酰基-、戊酰基-、或异戊酰基-L-肉碱。
肉碱化合物的盐可包括，例如L-肉碱和烷酰基-L-肉碱的天冬氨酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、富马酸盐、乳酸盐、马来酸盐、草酸盐、羟基柠檬酸盐或酒石酸盐。
根据本发明，液体原料可以是大体上未纯化的液体原料、纯化的液体原料或其混合物。在本发明的上下文，“大体上未纯化的液体原料”是含可用于干燥步骤(具体是喷雾干燥步骤)的肉碱化合物的预纯化液体原料，通过所述干燥步骤以获得具有低吸水性的大体上纯的粉状或粒状肉碱产物，且准备用于食品和饲料用途，特别是动物饲料。预纯化液体原料是来源于已进行初步纯化的未纯化液体原料，由此仅已进行几个纯化和/或分离步骤。在本发明的上下文，“纯化步骤”是一种方法，它适合获得一定纯度级别的特定化学物质。纯化方法的例子包括但不限于，过滤如超滤、活性碳脱色、离心、结晶、沉淀等。“初步纯化”优选包括单一纯化和/或分离步骤，如整体过滤方法，例如超滤，或离心以除去原来存在于未处理原料中的某一部分伴随物质。在本发明的上下文，表述“除去一部分伴随物质”意指通过初步纯化，从原料中完全或几乎完全除去特定伴随物质或大分子，而其它伴随物质完全或几乎完全留在预纯化的原料中。例如，可通过初步纯化，使得属于具有共同特征(如某种粒度)的特定类的化合物的伴随物质完全或几乎完全从原料中除去，而属于另一粒度类的其它伴随物质则完全或几乎完全留在所述预纯化原料中。然而，“除去一部分伴随物质”还意指所有或几乎所有不同的伴随物质的量部分减少。根据本发明，初步纯化除去原来存在于未纯化原料中的约20％-90％的伴随物质，优选约40％-90％的伴随物质，更优选约60％-90％的伴随物质。最优选初步纯化除去原来存在的约80％-90％的所有伴随物质。
因此，在本发明的上下文中，除肉碱化合物和液体或溶剂(具体是水)以外，预纯化液体原料含至少一类的附加杂质或伴随物质，例如一种或多种盐，一个或多个发酵过程的废物，肉碱化合物的未转化的前体分子等。预纯化原料通常含有许多不同的伴随物质。根据本发明使用的未纯化液体原料一般含有5到约70重量％的干物质。因此，根据干物质的含量，基本未纯化的液体原料可有溶液、悬浮液或糊料的形式。在预纯化原料中，总干物质中肉碱化合物的比例为50％-90％，更优选60％-90％，最优选约80-90％。总干物质中所有伴随物质或杂质的比例为10％到小于50％，优选10％到小于40％，更优选约10％-20％。
在本发明的一个优选实施方式中，基本未纯化的液体原料是渗透液，其来源于生物技术生产肉碱过程中得到的发酵液的超滤液。此发酵液可例如来源于全细胞生物催化方法如培养基，在培养基中培养微生物，以使其将合适的反应物(如4-丁内铵盐)转化成肉碱化合物。
在本发明的上下文，“超滤”是含大分子物质的溶液的选择性分离技术。超滤是应用液体静力压操作的膜分离技术。通常使用的压力高达145磅/英寸2(10巴)。使用的膜包括平膜、螺旋膜、管式/杆式膜和陶瓷膜。通过超滤可分离分子量大于1000KDA，优选大于50000KDA的悬浮固体和溶质，如浮颗粒、胶体、大分子、细菌或病毒。得到的超滤液或渗透液含有低分子量有机溶质和盐。
在本发明的另一优选实施例中，基本未纯化的原料是来源于大规模化学合成肉碱化合物的液体反应混合物，肉碱化合物进行初步纯化，例如色谱步骤。例如大规模合成L-肉碱的已知技术特别包括外消旋混合物的光学拆分，使用拆解剂，分离不需要的对映体；巴豆甜菜碱或γ-丁内铵盐的立体定向水合；使用单金属或双金属钌催化剂，使得丁酰基-4-氯-3-氧代酯发生对应选择性还原，形成相应的3-羟基衍生物，该3-羟基衍生物通过与三甲基胺反应和酯基的水解，转化为L-肉碱；或者4-氯-3-氧代丁酸烷基酯或4-氯-3-氧代丁酰胺的对映选择性还原。
在本文的上下文中，“纯化的液体原料”是来源于未纯化液体原料的液体原料，其已进行几个纯化和/或分离步骤，由此伴随物质或杂质完全或几乎完全除去。根据本发明，通过这些纯化和/或分离步骤，已除去原来存在于未纯化原料中的大于约90％的伴随物质，优选大于约95％的伴随物质，更优选大于约97％的伴随物质。
本发明的一个特别优选的实施例涉及从含L-肉碱的基本未纯化的液体原料制备干L-肉碱粉末或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)原料与载体混合，b)对在a)中得到的混合物进行干燥处理，c)回收稳定的干L-肉碱粉末或颗粒。
本发明的另一优选实施方式涉及从含L-肉碱的基本未纯化的液体原料制备干-肉碱粉末或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)对原料进行干燥过程获得干产物，b)将a)中得到的干产物与载体混合，c)回收稳定的干L-肉碱粉末或颗粒。
在本发明的上下文中，“载体”或“载体材料”是优选由离散颗粒组成的化学惰性物质。优选地，载体由特定粒度范围的微粒组成。一方面合适的载体材料包括无机材料，例如盐类或基于二氧化硅的材料；另一方面包括有机化合物，例如糖类。载体的选择取决于在本发明方法的结尾回收的L-肉碱粉末的用途。若肉碱粉末或颗粒，例如L-肉碱粉末或颗粒，例如加工成治疗或预防，具体是治疗和/或预防动物疾病用的成品，优选使用的载体选自医药(galenic)助剂。医药助剂的例子包括但不限于，化合物如乳糖、多芽糖糊精、糊精、干葡萄糖、淀粉、微晶纤维素、化学和/或物理改性的微晶纤维素或其衍生物、微晶纤维素和二氧化硅的混和物、聚乙二醇、硬脂酸镁、沉淀硅酸、沉淀二氧化硅、分散二氧化硅、山梨醇、甘露醇或其混合物。
若肉碱粉末或颗粒，例如L-肉碱粉末或颗粒用于生产动物饲料，优选将小麦细糠、沉淀二氧化硅、二氧化硅微粒、粉状或粒状硅藻土、碳酸钙和/或其混合物用作载体。
小麦细糠是小麦研磨工业的副产物。已知小麦细糠是微粒化饲料用的极好粘结材料。由于其粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维的含量，小麦细糠含有大约与燕麦相等的能量。
沉淀二氧化硅是市售的，例如拜尔有限公司(Bayer AG)的商标为“Silcasil”的商品。这些产品是通过用酸使水玻璃沉淀生产的无定形合成二氧化硅。平均粒度大于100微米的特殊类型的Silcasil可用作粉状饲料的载体和用作具有防结块作用的流动促进剂。其它无定形衬垫二氧化硅包括罗迪亚二氧化硅公司(Rhodia Silicas)销售的Tixosil。
具有宽粒度范围和不同形状的二氧化硅微粒是市售可得的，例如德古萨(Degussa)公司的商标为“Supernat”的产品。例如，Sipernat 50是主要为球形微粒的二氧化硅，其粒度约为7.5μm。Sipernat 22的平均粒度为7.0-7.5μm。Sipernat 2200是粒度约为320μm的微粒二氧化硅。
粉状和粒状硅藻土是市售的，其商品名为“Diamol”。粉状Diamol中大于90％的颗粒的粒度在5和63微米之间，而粒状Diamol颗粒的粒度在mm范围内。
碳酸钙，例如方解石，优选以磨碎的形式使用。
根据本发明制备干肉碱粉末或颗粒的第一种方法，含肉碱的纯化的或基本未纯化的液体原料首先与载体或不同载体的混合物混合，然后进行干燥过程。相反，根据本发明制备干肉碱粉末或颗粒的第二种方法，纯化的或预纯化的原料首先进行干燥过程，然后与载体混合。在后一种方法中，优选在干燥原料后，得到的干产物立即与载体混合，干产物应过筛以除去任何块团。
在本发明的上下文中，“干燥过程”是通过加热或通过加入水分结合剂(moisture binding agent)，通过化学方式使流体(如水或无机或有机溶剂)从液体、气体或固体材料中解离除去的过程。在热干燥中，通过蒸发除去水分。
在本发明的一个优选实施方式中，用于干燥肉碱和载体材料的混合物的干燥过程包括进行喷雾干燥过程。根据本发明，喷雾干燥优选用于干燥液体原料(如溶液或悬浮液)。这种液体原料的干燥物质含量可约为40％到80％或更小。优选地，干物质含量小于40重量％，小于30重量％或小于20重量％。特别优选进行喷雾干燥的液体原料中干物质的含量小于10重量％。
在本发明的上下文中，“喷雾干燥”是用于对含一种或多种化合物进行脱水或干燥，以干燥粉末和/或颗粒产物的形式回收这些化合物的过程。喷雾干燥很适合从液体原料(如溶液、乳液和可泵送悬浮液)连续生产粉末、颗粒或聚集体形式的干固体。优选地，喷雾干燥过程的产物是具有明显特征(如粒度分布、残留含水量、堆积密度和颗粒形状)的自由流动颗粒产物。
喷雾干燥由至少四个独立过程阶段组成，即a)液体原料雾化成液滴的喷雾，b)液滴在干燥室中与热空气接触，c)干燥，即水分从液滴蒸发并形成干燥颗粒，和d)从干燥空气分离干产物。雾化包括形成具有所需液滴大小分布的液滴。雾化一般通过使用单流体喷嘴、双流单体喷嘴或旋转雾化器完成。液滴形成后，在干燥器内与干燥空气接触。根据产物的干燥特征和粉末规格选择干燥器的设计和操作条件。在干燥器中可以并流方式、逆流方式或混流方式进行液滴和干燥空气间的接触。在控制的温度和气流条件下，水分从液滴蒸发并形成干燥颗粒。干燥步骤在两个阶段中出现。第一阶段是恒速步骤，水分迅速从表面蒸发，毛细管作用从颗粒内抽出水分。在第二阶段，水向表面的扩散控制干燥速率。当水分含量降低时，扩散速率也下降。在单级干燥器中，除去最后一些百分数的水分占用了干燥器中大部分的停留时间。
根据本发明，液体原料的雾化，即形成具有所需液滴大小分布的喷雾的过程可通过单流体(或压力)喷嘴、双流体喷嘴或旋转雾化器完成。旋转雾化器也称为转盘或转轮。使用单流体喷嘴允许具有更强的多用性，包括与喷雾室的定位，这样可改变喷雾角度和喷雾方向。由于粒度至少部分取决于进料速度，喷嘴在产品特征和操作速率方面有更多局限性。一旦喷嘴就位，仅能通过压力改变速率。在高容量操作中，几个喷嘴通常位于室内并定位，使得在各喷嘴周围维持恒定的蒸发情况。对更粘的进料，可使用双流体喷嘴，使用空气作为第二介质，用来使进料移动并使进料有效地雾化。空气可在喷嘴内部或喷嘴外部混合。也可通过旋转圆盘或转盘上的离心力，使液体进料分散和雾化。在此情况下，粒度主要由轮速控制。通过使用旋转圆盘，液体进料分布到圆盘的中央，越过作为薄膜的表面，且作为小液滴从边缘甩出。总的来说，喷嘴和轮能产生实际上相同的颗粒类型。通过附加的测量可进一步改变颗粒外观。例如注入蒸气除去液滴中的空气，产生高致密、较高堆密度的粉末。
根据本发明，由雾化形成的液滴与干燥室中热空气之间的接触可通过并流方式、逆流方式或通过混流方式完成。并流方式的特征在于干燥空气和颗粒沿相同方向经过干燥室，在逆流移动中，干燥空气和颗粒沿相反方向移动。当使用此方式时，离开干燥器的粉末温度高于排气温度。在混流方式中，颗粒移动经历并流和逆流阶段。此方式适合包含更粗粉末的产物。混流方式可通过喷嘴雾化器进行，该雾化器喷出液滴，向上进入入射气流或喷雾液滴向下流向整体流化床。
根据本发明，在喷雾干燥的最后阶段，干肉碱产物以无污染物的形式从空气中除去，其中优选分别地收集细粉，例如用旋风分离器、袋式过滤器、静电沉降器或洗涤器。因此优选收集的细粉返回到另一凝聚过程。
如在WO92/18164和WO94/08627中更详细的披露，可控制粒制喷雾干燥的条件，以获得特定粒度，例如0.1-50μm的微粒，或者粒度5-500μm的微粒。根据使用的液体原料、例如流体的类型和采用的载体材料改变喷雾干燥的精确条件。若流体是水，根据本发明进入的干燥空气的温度通常在120-350℃。特别优选进入的干燥空气的温度大约为210-270℃。最优选在进入的干燥空气的温度范围为230-250℃的范围内进行喷雾干燥。根据本发明，出口的空气温度范围优选在100-140℃，特别优选在115-125℃。在本发明的另一优选实施方式中，在旋转干燥器中对肉碱化合物和载材料的混合物进行干燥过程。根据本发明，在旋转干燥器中的干燥可优选用于干燥其中干燥物质含量大于40重量％，特别大于50重量％到约70重量％的液体原料。
根据本发明方法的又一实施方式，可以在在干燥之前将一种或多种附加化合物加入所述原料中和/或载体中，以及/或者在干燥之后，加入到所述干肉碱粉末或颗粒中。此方法有可能得到组合产物，例如其含有除肉碱化合物外的附加活性组分。
这些附加化合物可以是适合作为食品组分或食品添加剂的物质。在本发明的上下文，术语“食品组分”意指单一物质或物质的混合物，任选地可含一种或多种添加剂，且用于人的营养，且可以未加工、加工和/或配制的状态被人消耗。“食品添加剂”是一种物质，其加到食品中改变此食品的某些特点，如外观、结构、稠度、味道、气味、可贮藏性、可加工性等，或者出于生理或营养原因而加入。食品添加剂的例子包括但不限，甜味剂、膨胀剂、调味剂、酸化剂、防腐剂、矿物质、维生素、氨基酸、抗氧化剂、酶、颜料、乳化剂、改进致密度的试剂等。
这些附加化合物也可以是适合作为饲料组分或饲料添加剂的物质。在本发明的上下文，术语“饲料组分”意指单一物质或物质的混合物，任选地可含一个或多个添加剂，且以未加工、加工和/或配制状态指定喂给动物，例如家禽、猪、牛、马、鱼和宠物。“饲料添加剂”是一种物质，其加到饲料中改变饲料的某些特点，如外观、结构、稠度、味觉、气味、可贮藏性、可加工性等，或者为了生理或营养原因而加入。饲料添加剂的例子包括但不限于，矿物质、维生素、氨基酸、尿素、膨胀剂、防腐剂、调味剂、酸化剂、改进生长或利用饲料组分的试剂、抗氧化剂、酶、颜料、乳化剂、改进致密度的试剂等。
附加化合物也可以是常规用于制备药物组合物的物质或物质混合物，而本身不是活性组分或试剂。“药物组合物”是一种物质或制剂，当施用到动物或人时或在动物或人体内可治疗或治愈和/或缓解和/或预防某些疾患、疾病、痛苦或损伤，或者可使人体组织或器官的某些功能恢复到正常。通常用于制备药物组合物且本身不是活性剂的物质包括但不限于，赋形剂、润滑剂、调味剂、崩解剂、粘合剂等。
还可能的是，附加化合物是常规用于制备化妆品组合物的物质。
还可能的是，与肉碱化合物相比，附加物质是具有相似或不同生物活性的活性剂。
加入一种或多种附加化合物可能获得一种组合产物，根据添加的特定化合物，组合产物可分别直接用作食品、饲料、化妆品制剂和药物组合物，或者用于其制备。
根据本发明，在原料与载体混合之前或原料干燥之前，可在原料中加入此附加化合物。然而，也可能在载体加入液体或加入已干燥的原料中之前，在载体中加入此附加化合物。然而，根据本发明还可能在包含肉碱和载体的干肉碱粉末中加入此附加化合物。
在一个优选实施方式中，附加化合物是氨基酸，具体是赖氨酸。从美国专利5,124,357中已知对肥育猪(finishing pig)喂给补充L-肉碱和赖氨酸的食料可增加重量和饲料利用率，该专利的全部内容纳入本文作为参考。
在另一优选实施方式中，附加物质是铬化合物。铬是微量矿物质，它积极参与碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的代谢。通过增加葡萄糖和细胞内碳水化合物及脂质代谢的细胞的摄取，铬增强胰岛素作用。从美国专利2002/019185A1中已知，在妊娠、哺乳、饲养和/或预饲养期间，对母猪喂给补充L-肉碱加三铬盐如苦酮酸铬(III)或烟酸铬的食物能增强繁殖能力，该专利的全部内容纳入本文作为参考。
在又一个优选实施方式中，添加的附加物质是维生素，如烟酸或烟酰胺、维生素C、维生素A、维生素E等。附加物质也可以是辅酶Q10。
在另一个优选实施方式中，附加物质是α-硫辛酸。α-硫辛酸是线粒体基质中丙酮酸脱氢酶复合体用的辅酶。它是α-酮酸脱氢酶反应中代谢的必要辅酶。口服补充此维生素物质以有利于健康，也作为治疗剂用于治疗各种肝和神经性病症。
在本发明的另一个实施例中，附加化合物是雷托帕明(ractopamine)，它属于能结合β-肾上腺素能受体和促进肌肉蛋白的增积，同时减少体脂的一类化合物。从美国专利2003/0235646A1中已知，对肥育猪喂给补充L-肉碱加雷托帕明的食物导致肉质量的提高，该专利的全部的内容纳入本文作为参考。
本发明的另一方面涉及从肉碱化合物的未纯化液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)对原料进行预纯化，具体是进行一个纯化步骤
b)将所述预纯化的原料与载体混合
c)对b)中得到的混合物进行干燥过程
d)回收具低水含量的稳定干肉碱粉末或颗粒
本发明的另一方面涉及从肉碱化合物的未纯化液体原料制备肉碱粉末或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)对原料进行初步纯化，具体是一个纯化步骤
b)对预纯化的原料进行干燥过程以得到干产物
c)将b)中得到的干产物与载体混合
d)回收具低水含量的稳定干肉碱粉末或颗粒。
还通过提供制备L-肉碱粉末或颗粒的方法解决了本发明的技术问题，此方法特别适合于生产饲料产品，该方法包括以下步骤：
a)进行生物催化过程，在液体培养基中生产L-肉碱
b)对所述培养基进行预纯化步骤，得到含L-肉碱的预纯化液体
c)对所述预纯化液体进行干燥过程得到干产物，将所述干产物与载体混合，或者将所述预纯化液体与载体混合，对得到的混合物进行干燥过程，和
d)得到L-肉碱的干燥粉末。
因此，本发明方法的第一步骤包含用于生产L-肉碱的生物催化过程。根据本发明，“生物催化过程”或“生物转化”是一种非天然底物(即前体)的酶催化转化成所需产物。在本发明的上下文中，生物催化过程还包括一个或多个化学合成步骤，例如用于得到中间产物的合成步骤，然后通过生物方法将该中间产物转化成所需产物或其它的中间产物。可以许多形式使用生物催化过程中需要的酶。它们可以是野生型，或重组，或基因修饰以增加特异性或活性。生物催化过程中需要的一种或多种或所有的酶也可存在于全细胞中，特别是微生物或哺乳动物细胞中，所述细胞可以是活细胞或死细胞。活细胞包括例如生长、静息或固定化细胞。或者，无细胞酶，特别是可使用分离和/或纯化的酶。采用的酶可用于溶液、膜反应器，作为悬浮液，以交联形式或作为固定化酶。酶反应用的培养基可以是含水、有机或两相的。
因此，根据本发明，在生物催化过程中，细胞(优选微生物细胞)或者分离的酶用来将一种前体化合物如4-丁内铵盐转化为L-肉碱。然而，生物催化过程还包括联合使用全细胞(shole cell)和分离的酶。
在一个优选的实施方式中，用于生产L-肉碱的生物催化过程包括使用至少一种能从合适的前体化合物生产L-肉碱的微生物。在使此前体转化为L-肉碱使L-肉碱分泌入培养基的条件下，在一种含有L-肉碱的前体的合适的培养基(例如含有4-丁基的甜菜碱和/或巴豆甜菜碱的发酵培养基)中培养此微生物。
优选地，在生物催化过程中，使用的微生物含一种或多种或所有的编码4-丁基甜菜基-辅酶A合成酶、4-丁内铵盐基-辅酶A脱氢酶、巴豆甜菜碱基辅酶A水解酶和硫酶的基因，形成天然存在的将4-丁内铵盐转化为L-肉碱的途径。酶4-丁内铵盐基-辅酶A合成酶可将4-丁内铵盐转化为4-丁内铵盐基辅酶A，然后可通过4-丁内铵盐基-辅酶A脱氢酶转化为巴豆甜菜碱基-辅酶A。巴豆甜菜碱基-辅酶A通过巴豆甜菜碱基-辅酶A水解酶转化为L-肉碱基-辅酶A，然后通过硫酯酶转化为L-肉碱。使用这种微生物生产L-肉碱的生物转化过程有高能量需求，这是因为需要辅因子再生和加到培养基中的前体4-丁内铵盐穿过细胞膜转运入细胞，产生自L-肉碱穿过细胞膜转入培养基。为此，应使用生长中的细胞或处于维持状态的细胞进行生物催化过程，这些细胞具有低生物物质产生和高代谢活性的优点。
使用的微生物细胞可天然地含一种或多种或所有的编码4-丁内铵盐基-辅酶A合成酶、4-丁内铵盐基-辅酶A脱氢酶、巴豆甜菜碱基-辅酶A水解酶和硫酯酶的基因。或者，使用的微生物细胞可以是重组细胞，其中通过DNA重组技术引入一种或多种或所有这些基因。优选地，用于生产L-肉碱的生物催化过程的微生物不能分解代谢L-肉碱，或其分解代谢L-肉碱的能力完全或部分地受到抑制。因此，为了防止L-肉碱的降解，用于生物催化过程的微生物细胞不含编码肉碱脱氢酶的基因或携带此基因中的突变。
特别优选的是，生物催化过程使用的微生物是Zimmermann等在《工业中的手性II(Chirality in Industry II)》(A.N.Collins；G.N.Sheldrake′J.Crosby编)，约翰威利和散有限公司(John Wiley and Sons Ltd)，奇切斯特(Chichester)(1997)，287-305页中描述的微生物，该文献的全部内容纳入本文作为参考。此微生物属于农杆菌属(Agrobacterium)和根瘤菌属(Rhizobium)。
当然，在EP0722500B1中描述了还有一些微生物可用于生物催化过程，该文献的全部内容纳入本文作为参考。在该实施方式中，使用的重组微生物可含有L-肉碱生物合成途径的一种或多种基因60cC、60cA/B和60cD。这些微生物可属于大肠杆菌属(Escherichia)、单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和丛毛单胞菌属(Comamonas)。这些微生物可将前体化合物巴豆甜菜碱和/或4-丁内铵盐转化为L-肉碱。
另外，在生物催化生产L-肉碱中使用的微生物包括在WO02/061094中描述的微生物，该专利的全部内容纳入本文作为参考。这些微生物含脱氢酶，此酶可将甜菜碱酯(如4-丁内铵盐甲基酯)转化为4-丁内铵盐。
根据本发明，用于生物催化过程的L-肉碱前体的优选例子包括但不限于，巴豆甜菜碱、4-丁内铵盐和甜菜碱酯、如4-丁内铵盐甲基酯。
为了有效地将前体化合物生物转化为L-肉碱所需的用来培养微生物细胞的合适培养基的组成和培养微生物细胞的条件是本领域中已知的。合适的培养基和培养条件例如在WO02/061094，EP0722500B1和EP0158194B1中描述，有关培养基成分和培养条件的披露内容纳入本文作为参考。
本发明的另一方面涉及通过任何一种本发明方法可得到干肉碱粉末或颗粒。
通过本发明的任何一种方法得到的肉碱粉末由离散颗粒(具体是微粒)的均一混合物组成。这些颗粒通常具有约0.1-50μm的粒度范围。肉碱颗粒由颗粒(具体是微粒)的均一混合物组成。事实上，颗粒是附聚颗粒。颗粒通常具有约5-500μm的粒度范围。
本发明的干肉碱粉末或颗粒“大体上纯”，它由肉碱和一定量用于干燥过程的载体材料组成，而原来在液体原料中存在的杂质或伴随物质的含量仅仅很小。在得到的干肉碱粉末中伴随物质的量取决于液体原料的纯度。若例如使用的原料是含渗透物的L-肉碱，即大体上未纯化原料，然后伴随物质相对于L-肉碱的含量不大于10％。因此，本发明肉碱汾末或颗粒的纯度至少是工业级的。然而，若使用纯化液体原料，本发明肉碱粉末或颗粒的纯度更高。优选地，本发明肉碱粉末或颗粒中伴随物质的含量小于10％，更优选小于7％，甚至更优选小于5％，最优选小于2-3％。本发明干燥粉末或颗粒中肉碱的含量至少约8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如大于60％、70％或80％。若在制备干肉碱粉末或颗粒期间添加附加化合物(如氨基酸或铬化合物)，粉末/颗粒含相应量的所述附加化合物。
本发明粉末或颗粒是干的，它们具有低水含量。“干”具体指水含量小于22％。特别优选L-肉碱粉末的水含量小于12％，小于8％或小于6％。根据本发明，粉状L-肉碱产物的水含量最优选小于4％，或甚至小于2％。
根据本发明的干微粒状肉碱粉末具有极好的流动性，良好的稳定性和可贮藏性。与干肉碱化合物(如干L-肉碱)相比，它显示显著减小的吸水性。因此，根据本发明的肉碱粉末或颗粒可以在容器长时间保存而不吸水(即作为干燥粉末/颗粒)。容器的特性并不重要。例如它可以是玻璃缸或塑料箱。仅仅规定一个贮藏环境，在此环境内不需要除去水分或控制条件。在贮藏期间或在配制中，本发明的粉状或粒状肉碱产物可与任何合适的膨胀剂、其它活性组分、营养物等混合，且可用任何所需的技术加工，制得具有具有用于最终食品、饲料或治疗用途的性质。这些技术是本领域技术人员已知的。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，干肉碱粉末或颗粒是干L-肉碱粉末或颗粒。根据本发明，干L-肉碱粉末或颗粒含L-肉碱的量(相对于总干物质)至少约为8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如相对于总干物质大于60％、70％或80％。
在另一优选实施方式中，干肉碱粉末或颗粒包含L-酒石酸的肉碱的盐作为肉碱化合物。特别优选干肉碱粉末或颗粒包含肉碱酒石酸盐，见美国专利5,073,376，其全部内容纳入本文作为参考。根据本发明，干肉碱-酒石酸盐粉末或颗粒含有肉碱酒石酸盐，具体是L-肉碱酒石酸盐，其含量(相对于总干物质)至少约为8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如相对于总干物质大于60％、70％或80％。
在又一优选实施例中，干肉碱粉末或颗粒包含肉碱的盐作为肉碱化合物，具体是与柠檬酸、(-)羟基柠檬酸或抗坏血酸形成的盐。肉碱的盐，具体是与柠檬酸、(-)-羟基柠檬酸或抗坏血酸形成的的L-肉碱盐可进一步包含至少一种碱土金属阳离子，所述金属阳离子优选选自镁和钙。此类盐在EP1326502B1中披露，该专利的全文纳入本文作为参考。
在一个特别优选实施方式中，干肉碱粉末或颗粒包含L-肉碱-镁柠檬酸盐。美国专利5,071,874中披露了L-肉碱-镁柠檬酸盐，其全部内容纳入本文作为参考。根据本发明，干L-肉碱-镁柠檬酸盐粉末或颗粒中L-肉碱-镁柠檬酸盐的含量(相对于总干物质)至少约为8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如相对于总干物质大于60％、70％或80％。与L-肉碱-镁柠檬酸盐相比，本发明的L-肉碱-镁柠檬酸盐粉末或颗粒的吸水性显著减小。
在一个特别优选的实施方式中，干肉碱粉末或颗粒包含肉碱-羟基柠檬酸盐，优选L-肉碱-羟基柠檬酸盐。肉碱-羟基柠檬酸盐粉末或颗粒中肉碱-羟基柠檬酸盐的量(相对于总干物质)至少约为8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如相对于总干物质大于60％、70％或80％。
在又一个特别优选实施方式中，EP1326502B1中披露了干肉碱粉末或颗粒包含肉碱-羟基柠檬酸盐，其中镁、肉碱化合物和羟基柠檬酸盐优选以1∶1∶1摩尔比存在。肉碱-镁-羟基柠檬酸盐粉末或颗粒中肉碱-镁羟基柠檬酸盐的量(相对于总干物质)至少约为8-10％，优选大于约30％，更优选大于约40％，最优选大于约50％，例如相对于总干物质大于60％、70％或80％。
通过任何一种本发明方法得到的干肉碱粉末或颗粒可分别地直接用作食品、饲料、化妆品制剂和药物组合物，或用于其制备。
因此，本发明的另一方面涉及含至少一种本发明干肉碱粉末或颗粒的成品，具体来说是含至少一种本发明肉碱粉末或颗粒的固体成品。可以例如通过将本发明干燥的大体纯的和/或工业纯的肉碱粉末或颗粒与一种或多种附加物质如氨基酸(例如赖氨酸)或铬化合物混合，从而制得所述成品。或者，可通过将一种或多种所述附加物质掺合到加入所述原料的载体材料中，制得所述成品。在一个特别优选的实施例中，成品是食品、饲料、药物组合物或化妆品组合物。
在一个特别优选的实施方式中，根据本发明的成品是包含L-肉碱粉末的饲料产品。
实施例
使用的材料：
含L-肉碱的预纯化原料
L-肉碱超滤渗透物1(L-肉碱＝8.02％w/w、干物质9.87％w/w、盐+杂质1.85％w/w，pH＝6.5)
L-肉碱超滤渗透物2(L-肉碱＝7.90％w/w、干物质9.35％w/w、盐+杂质1.45％w/w，pH7.0)
载体材料：
小麦细糠批号S-224/04，CaCO3磨碎的(S-219/04)
Sipernat50、Sipernat2200、Sipernat22、Silcasil MG、TIX-O-SIL68、DiamolDI100克
设备：
厨房掺混器ETA 0010
装有轮式雾化器的实验室喷雾干燥器
用来干燥糊料的实验室旋转干燥器，指定用于Funnel试验
方法：
a)制备混合物
计算量的L-肉碱超滤渗出物或粉末与相应量的载体(和吡啶甲酸铬)在实验室烧杯或在厨房掺混器中混合。
b)干燥
L-肉碱超滤渗透液或悬浮液或乳状液贮存于4℃，在实验室喷雾干燥器中干燥，进口/出口温度＝250/115-120℃，或者在实验室旋转干燥器中干燥，进口/出口温度＝250/115-115℃。
c)其它方法
用HPLC测定L-肉碱、4-丁内铵盐、巴豆甜菜碱和去甲肉碱(norcarnite)的浓度。于105℃烘箱中干燥直到恒重为止，以测定干物质含量。采用经典的Car-Fisher滴定法测定水的含量。采用测定流度的Funnel试验测定最终产物的流度(参见德古萨公司的Technical Bulletin Pigments第3期)。
实施例1-喷雾干燥的L-肉碱渗透物与载体的混合
在此实验中，L-肉碱渗透物在喷雾干燥器中喷雾干燥，然后与合适的载体混合。渗透物在Niro雾化器(容量10升水/小时)中干燥(入口温度230℃，出口温度115℃)。由此得到干燥但高度吸水的含结块的粉末(肉碱的含量约为86.2％)。粉末迅速过筛除去结块，接着在厨房混合器中与不同量的各种载体材料混合，任选地载体材料先与吡啶甲酸铬混合。表1显示这样得到的干L-肉碱粉末的组成。
表1
  L-肉碱粉末 干燥的渗透物(克)   小麦细糠(克)     CaCO3(克)     Diamol(克) 吡啶甲铬(克)
    1     40.5     206.2     103.1     0     0
    2     206     0     0     146.5     0
    3     206     0     0     140.9     5.6
由于干渗透物的吸水特征，在干燥用的装置中难以阻止干材料的固定和结块的形成。因此采用过筛除去结块。使用氮气气氛可预防过筛后的材料发生再湿润的危险。
实施例2-L-肉碱渗透物和载体的混合物的干燥
在上面的实验中，L-肉碱渗透物与载体混合，接着在合适的干燥装置中干燥。若混合物是液体，使用喷雾干燥器。若混合物呈糊形式，则使用旋转干燥器。
表2显示这样得到的干L-肉碱粉末的组成。
表2
肉碱粉末编号   小麦细糠(克)   方解石(calcite)(克) Diamol(克) 吡啶甲酸铬(克)   渗透物(克)   混合物的稠性 使用的干燥器
    4     206.2     103.1     0     0     437.5   块状   旋转
    5     103.1     206.2     0     0     437.5   稀糊状
    6     0     309.3     0     0     437.5   浆状   喷雾
    7     0     0     146.5     0     2188   稀浆状   喷雾
    8     0     0     140.9     5.6     2188   稀浆状   喷雾
L-肉碱粉末4-8号的总体特征，如外观、流动性、稳定性和可加工性优于在实施例1中制备的L-肉碱粉末1-3号。L-肉碱粉末4号的物理特征极好。由粗颗粒组成的产物与由细颗粒组成的粉末6、7和8号相比，有潮湿的趋势，稍微较粗的颗粒组成的粉末4号没有潮湿的趋势。
L-肉碱粉末4-8号的组成在表3中显示。
    L-肉碱粉末(编号)   L-肉碱的含量(％)   水的含量(％)
    4     9.05     9.13
    6     10.76     1.01
    7     48.2     2.19
    8     50.21     2.78
实施例3-在生产规模下对L-肉碱渗透物和微颗粒化载体的混合物的干燥
在此生产实验中，L-肉碱渗透物与载体混合，接着在合适的干燥装置中干燥，由此得到流体混合物。使用具有流化床的喷雾干燥器进行干燥。表4显示得到的干L-肉碱微颗粒的组成。
表4
肉碱粉末编号 小麦细糠(克) 方解石(克)  TilX-O-SIL68(公斤) 吡啶甲酸铬(公斤) 渗透物(克) 混合物的稠性 使用的干燥器
9  0  0  1430  0  21880 稀浆状 具流化床的喷雾干燥器
10  1440  56  22000 稀浆状 具流化床的喷雾干燥机
L-肉碱粉末9和10号的总体特征，如外观、流动性、稳定性和可加工性优于粉末3、6、7和8号。由粗的规则颗粒(70％的粒度为106-212μm)组成的两种产物具有可忽视量的粉尘(粒度在53μm以下的颗粒小于0.1％)。
L-肉碱粉末9-10号的组成在表5中显示。
    L-肉碱粉末(编号)   L-肉碱的含量(％)   水的含量(％)
    9     52.3     2.38
    10     51.8     2.22

Claims (25)

1.从含肉碱的液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将原料与载体混合
b)对a)中得到的混合物进行干燥过程
c)回收干燥的肉碱粉末或颗粒。
2.从含肉碱的液体原料制备干肉碱粉末或颗粒的方法，其包括以下步骤：
a)对所述原料进行干燥过程，制得干燥产物
b)将a)中得到的干燥产物与载体混合
c)回收稳定的干肉碱粉末或颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述干燥产物进行过筛以除去结块，然后与载体混合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，肉碱是L-肉碱、烷酰基-L-肉碱、其衍生物、其盐或其混合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，原料有溶液、悬浮液或糊料的形式。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，原料是通过发酵液的超滤得到的渗透物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，干燥过程是喷雾干燥。
8.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，在旋转干燥器中进行干燥。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，载体选自小麦细糠、沉淀二氧化硅、二氧化硅颗粒、粉状或粒状硅藻土和碳酸钙。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，在干燥之前将一种或多种附加化合物加入所述原料中或加入所述载体中，或者加入在干燥之后得到的干肉碱粉末中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述附加组分是铬化合物。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述附加组分是氨基酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，干肉碱粉末的水含量小于12％，优选小于4％。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，干肉碱粉末适合生产饲料产品。
15.制备干燥的大体上纯的L-肉碱粉末或颗粒的方法，所述L肉碱粉末或颗粒特别适合生产饲料产品，所述方法包括以下步骤：
a)进行生物催化过程，在液体培养基中生产L-肉碱
b)对所述培养基进行预纯化步骤，得到含L-肉碱的预纯化液体
c)对所述预纯化的液体进行权利要求1-14中任一项所述的方法
d)得到稳定的干L-肉碱粉末或颗粒。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，生物催化过程包括：在能够产生L-肉碱和使其分泌入培养基的条件下，在含合适的前体的培养基中培养至少一种能由该前体化合物产生L-肉碱的微生物。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述预纯化学步骤包括对含L-肉碱的液体培养基进行超滤，以得到含L-肉碱的渗透物。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于，L-肉碱的前体是巴豆甜菜碱、γ-丁内铵盐、甜菜碱酯或其混合物。
19.干肉碱粉末或颗粒，其可通过权利要求1-18中任一项所述的方法制得。
20.如权利要求19所述的干肉碱粉末或颗粒，其水含量小于12％，优选小于4％。
21.如权利要求19或20所述的干肉碱粉末或颗粒，其特征在于，所述肉碱化合物是L-肉碱。
22.如权利要求19或20所述的干肉碱粉末或颗粒，其特征在于，所述肉碱化合物是肉碱与柠檬酸、(-)-羟基柠檬酸或抗坏血酸的盐。
23.如权利要求22所述的干肉碱粉末或颗粒，其特征在于，肉碱与柠檬酸、(-)-羟基柠檬酸或抗坏血酸的盐还包含至少一种选自镁和钙的碱土金属阳离子。
24.如权利要求23所述的干肉碱粉末或颗粒，其特征在于，所述肉碱盐是肉碱镁羟基柠檬酸盐。
25.饲料产品，其包含可按照权利要求19-24中任一项所述的肉碱粉末或按照权利要求1-18中任一所述的方法得到的肉碱粉末。
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