CN101208361A - 含有疏水蛋白的水单体乳剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在无机颗粒和疏水蛋白中的疏水单体的乳剂，所述无机颗粒包含水并且用作固体稳定乳化剂；并且还涉及这些乳剂的生产和用途。

Description

含有疏水蛋白的水单体乳剂
技术领域
本发明涉及水中的疏水单体的乳剂，其包含作为固体稳定乳化剂(Pickering emulsifiers)的无机颗粒和疏水蛋白，也涉及制备这些乳剂的方法，其中单体在作为固体稳定乳化剂作用的无机颗粒的存在下分散在水中，其中共同使用疏水蛋白。
本发明也涉及疏水蛋白用于制备水中疏水单体乳剂的用途，并且涉及在水中的疏水单体与共同使用的作为固体稳定乳化剂的无机颗粒悬浮聚合的方法，其中共同使用疏水蛋白。
另外，本发明涉及乳剂作为悬浮聚合中加料材料的用途。
最后，本发明涉及用共同使用的推进剂来生产可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的方法，其中聚合体颗粒通过悬浮聚合的特定方法制备，本发明也涉及通过此方法所获得的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，并涉及这些可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒用于产生泡沫或泡沫塑型的用途。
背景技术
水中的疏水单体乳剂用作(尤其是在聚合过程中)起始材料。例如，水中的苯乙烯乳剂能通过悬浮聚合而聚合形成聚苯乙烯颗粒。如果在其中共同使用推进剂，则可以获得含推进剂的聚合体颗粒，其依赖于压力和温度条件而成为可发型或膨胀型，尤其可以产生泡沫和泡沫塑型。
在许多情况下通过乳化剂来稳定水中的特定单体乳剂(也类似于其他水包油乳剂)，该乳化剂防止分散于水相的单体小滴聚结。所用乳化剂通常是有机化合物，特别是表面活性剂(例如肥皂、烷基磺酸盐、脂肪醇化合物)。然而，它们具有发泡倾向，而发泡会使乳剂的操作更为困难，并且例如使其不可能利用泵运输。
所谓的固体稳定乳化剂尤其在水单体乳剂的悬浮聚合中使用，并且也在其他领域使用。此类乳化剂指不溶于水的无机化合物，例如焦磷酸镁或磷酸钙。它们以在乳剂中的精细分散形式使用，并且防止在聚合过程中聚合的单体小滴粘附在一起。它们具有更小的发泡倾向，且可以在聚合完成之后通过洗去而分离开。然而，固体稳定乳化剂的作用并不一定令人满意，即用它们并不一定能够制备稳定的乳剂。例如固体稳定乳化剂颗粒的可湿性并不一定导致其具有界面活性。
DE 42 20 225 A1公开了通过苯乙烯的聚合在添加推进剂的水悬浮液中制备串珠状可发型苯乙烯聚合体的方法，其中所用的悬浮液稳定剂是焦磷酸镁、作为膨胀剂的烷基磺酸盐、和碱土金属羧酸盐的混合物。
疏水蛋白是约100-150个氨基酸的小蛋白，其为丝状真菌(例如普通裂褶菌(Schizophyllum commune))的特征蛋白。它们通常含有8个半胱氨酸单位。疏水蛋白可以从天然来源中分离出来。然而，也可以通过化学和/或生物技术制备方法合成非天然存在的疏水蛋白。
疏水蛋白对于接触面有显著的亲和力，因此适合用于包被表面。因此可能通过用疏水蛋白包被例如聚四氟乙烯(Teflon)来获得亲水表面。
疏水蛋白可以从天然来源中分离出来。更早的德国专利申请文件参考DE 102005007480.4，日期为02.17.05，公开了制备疏水蛋白的方法，其在本发明的先前日期未公布。
疏水蛋白对于多种应用的用途也已经在现有技术中提出。
WO 01/57528公开了在30-80℃温度下用含有疏水蛋白的溶液包被窗户、隐性眼镜、生物传感器、医疗器械、用于实验或储存的器皿、船外壳、固体颗粒或载客运输工具的底盘或车体。
WO 01/57066描述用疏水蛋白包被的特定方法。
WO 03/53383公开了疏水蛋白用于处理化妆品应用中的角蛋白材料的用途。
WO 03/10331公开了疏水蛋白包被的传感器，(例如测量电极)，该传感器上非共价连有其他物质如电活性物质、抗体或酶。
WO 96/41882在第9-10页提出疏水蛋白作为乳化剂、增稠剂、表面活性剂，用于使疏水表面亲水、改良亲水底物的抗水性、制备水包油型乳剂或油包水乳剂的用途。另外，也提出了在改良食品可保存性、药物上的应用(例如制备软膏或乳膏)、还有在化妆品上的应用(例如护肤或制备洗发香波或洗发剂)的用途。
发明内容
本发明的目的是为水单体乳剂提供可选择的组合物。乳剂不应具有发泡倾向，应该稳定几小时，即不呈现任何的分离。事实上，其应该能够通过悬浮聚合而聚合。
相应地，找到了最初所述的乳剂、方法、用途和聚合物颗粒。本发明的优选实施方案在从属权利要求中给出。所有给定的压力是绝对压力。
疏水蛋白
根据本发明的乳剂包含疏水蛋白。为了本发明的目的，术语“疏水蛋白”应优选理解为通用结构式(I)的蛋白质Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I)其中X可能是任意的20个天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。这里X可能在各情况下是相同或不同的。X旁边的指数表示在各情况下的氨基酸数。C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少4个命名为C的基团是半胱氨酸，且指数n和m是不依赖于彼此的0-500，优选15-300之间的自然数。
根据公式(I)的多肽的特征也在于，相对于相同大小的水滴与未包被的玻璃表面形成的接触角，该多肽的特性可使(玻璃表面包被后)水滴接触角增加至少20°，优选至少25°，和尤其优选30°，其中每一测量均在室温进行。
表示为C1到C8的氨基酸优选为半胱氨酸；然而，它们也可以被具有相似空间排布的其他氨基酸所取代，优选被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸所取代。然而，至少4个，优选至少5个，尤其优选至少6个和尤其至少7个C1到C8位点应该由半胱氨酸组成。根据本发明的蛋白质中的半胱氨酸可以是还原形式或者彼此形成二硫键。尤其优选在分子内形成C-C桥，尤其至少1个，优选2个，尤其优选3个和特别尤其优选4个分子内二硫键。在上述以具有相似空间排布的其他氨基酸取代半胱氨酸的情况中，最好将该C位点和与其形成分子内二硫桥的位点成对地交换。
如果在X所指的位点也使用半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，那么在通式中单独的C位点的数目可以相应地改变。
本发明优选应用具有通式(II)的疏水蛋白进行，Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm  (II)其中X、C及X和C旁边的指数与上述定义一致，然而指数n和m是不依赖于彼此的0-300之间的自然数。优选地，通过上述接触角的变化来区分蛋白质。
尤其优选应用具有通式(III)的疏水蛋白Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm    (III)其中X、C及X和C旁边的指数与上述定义一致，指数n和m在0-200之间。优选地，通过上述接触角的变化来表征蛋白质。同样优选至少6个命名为C的基团是半胱氨酸。尤其优选所有C都是半胱氨酸。
Xn和Xm基可能是天然连接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其一个或两者都不是天然连接于疏水蛋白的肽序列。这些也可理解为意指那些Xn和/或Xm基，其中疏水蛋白中天然存在的肽序列由疏水蛋白中非天然存在的肽序列所延长。
如果Xn和/或Xm不是天然连接于疏水蛋白的肽序列，此类序列通常长度为至少20个氨基酸，优选至少35个，尤其优选至少50个和特别尤其优选至少100个氨基酸。此类非天然连接于疏水蛋白的残基也指下文中的融合配偶体。这是为了说明所述蛋白质可能由至少一个疏水蛋白部分和一个融合配偶体组成，自然条件下它们并不以这种形式共同存在。
融合配偶体可能选自多种蛋白质。对于多数融合配偶体，其也可能连接于疏水蛋白部分，例如连接于疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(Xm)。然而，也可能例如两个融合配偶体连接于本发明蛋白质的一个位点(Xn或Xm)。
尤其合适的融合配偶体部分是在微生物、特别是大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中天然存在的蛋白质。此类融合配偶体部分的实例是序列yaad(SEQ ID NO：15和16)、yaae(SEQ ID NO：17和18)、和硫氧还蛋白。同样高度适用的是这些所述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、优选70-99％、尤其优选80-98％，或相对于所述序列其中个别氨基酸或核苷酸发生了改变，在各情况中所述百分比指氨基酸数。
也可修饰根据本发明使用的蛋白质的多肽序列，例如通过糖基化、乙酰化，或者化学交联(例如通过戊二醛交联)。
根据本发明使用的蛋白质的一个特征是当使用所述蛋白包被表面时，该表面性质改变。通过测量用蛋白质包被表面前后的水滴接触角并计算两次测量之差，可以试验性确定表面特性的改变。
接触角的测量过程原则上是本领域技术人员所公知的。测量适用于室温和5μl的水滴。适合于实施例的用于测量接触角的方法的精确实验条件在实验部分说明。在其中所述的条件下，根据本发明使用的蛋白质与未包被的玻璃表面与同样大小水滴的接触角相比具有增加接触角至少20°，优选至少25°，尤其优选30°的特性。
目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的极性和非极性氨基酸的位置是保守的，其在特征性的疏水性图谱中显而易见。根据生物物理学性质和疏水性的差异将目前已知的疏水蛋白分为两类，I类和II类(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol.，32，413-437)。
I类疏水蛋白组装的膜高度不可溶(即使是升高温度在1％的十二烷基硫酸钠(SDS)中也是如此)，并且只能通过浓缩的三氟乙酸(TFA)或甲酸而再次解离。与之相反，II类疏水蛋白的组装形式较不稳定。它们通过60％浓度的乙醇或1％SDS(在室温)即可再次解离。
氨基酸序列的比较揭示，在II类疏水蛋白中C3和C4半胱氨酸之间区域的长度明显小于I类疏水蛋白。II类疏水蛋白也比I类疏水蛋白具有更多带电荷的氨基酸。
实施本发明尤其优选的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2型的疏水蛋白，下文的序列表对其进行了结构表征。它们也可能仅为所述类型的部分或衍生物。也可能将相同或不同结构的两个或多个疏水蛋白部分(优选2个或3个)一起连接于并非天然连接疏水蛋白的相应适宜多肽序列上。
实施本发明尤其适合的还有具有SEQ ID NO：20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白质及其编码核酸序列，尤其是根据SEQ ID NO：19、21、23的序列。尤其优选的实施方案还包括由SEQ ID NO：20、22或24所示多肽序列起始，通过取代、插入或缺失至少1个至多10个、优选5个、更优选所有氨基酸的5％而产生的蛋白质，所述蛋白质仍然具有起始蛋白质至少50％的生物学特性。此处蛋白质的生物学特性指上述接触角至少增加20°。
疏水蛋白的优选使用量为基于乳剂的总量的20-150，尤其30-100和特别优选40-90ppmw(按重量的百万分率)。以苯乙烯作为单体，疏水蛋白的量例如为基于乳剂的20-100，尤其40-90ppmw。
疏水蛋白可以直接加入到乳剂中，或者在溶剂或分散剂中以溶解或分散的形式加入。合适的溶剂或分散剂是水。此类溶剂或分散剂的疏水蛋白含量通常为按重量的0.3-1.2％，优选0.35-0.5％。优选地，疏水蛋白以水溶液形式加入。
疏水蛋白的制备
根据本发明使用的疏水蛋白可以通过肽合成的成熟技术化学制备，例如通过Merrifield固相合成。
可以通过合适的手段将天然存在的疏水蛋白从天然来源分离出来。例如此处参考
Figure A20068002338500101
等人，Eur.J Cell Bio.63，122-129(1994)或WO 96/41882。
融合蛋白质优选通过基因工程方法制备，其中将一个编码融合配偶体的核酸序列(特别是DNA序列)与一个编码疏水蛋白部分的核酸序列(特别是DNA序列)组合，从而通过组合核酸序列的基因表达在宿主生物体中产生所需要的蛋白质。在我们的在先申请DE 102005007480.4中公开了此类制备方法。
此处用于所述制备方法的合适的宿主生物体(生产生物体)是原核生物(包括古细菌(Archaea))或真核生物，尤其是细菌包括嗜盐菌(halobacteria)和甲烷球菌(methanococci)，真菌，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞，尤其优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spec.)、乳酸杆菌(lactobacilli)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、SF9(或相关细胞)等等。
也可能使用表达构建体，所述表达构建体包含在遗传控制下的调控核酸序列、编码根据本发明使用的多肽的核酸序列，并且也可能使用包含至少一个此类表达构建体的载体。
所用构建体优选包含特定编码序列的5’上游启动子和3’下游终止序列，适用的情况下还包含各自与编码序列有效连接的其他常用调控元件。
“有效连接”指启动子、编码序列、终止子和适用情况下的其他调控元件的有序排列，从而使每个调控元件能够实现其表达编码序列所需的功能。
有效连接序列的实例为寻靶序列以及增强子、多腺苷酸化信号等等。其它调控元件包含可选标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控序列在例如Goeddel，基因表达技术：酶学方法185，学术出版社，San Diego，CA(1990)中描述。
除这些调控序列以外，可能在实际结构基因的上游仍存在对这些序列的天然调控，且适用的情况下可对之进行遗传修饰，从而通过关闭天然调控而增强基因表达。
优选的核酸构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的上述“增强子”序列，以增强核酸序列的表达。其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子也可插入到DNA序列的3’末端。
构建体中可能具有一个或多个拷贝的核酸。如果为筛选所述构建体所需，构建体也可能包含其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型补偿基因。
例如，所述方法有利的调控序列存在于启动子如cos、tac、trp、tet、trp、tet、lpp、lac、lacIq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或imλ-P启动子中，这些启动子最好在革兰氏阴性菌中使用。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02，和酵母或真菌启动子ADC1、MF α、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
也可以使用人工启动子进行调控。
为了在宿主生物体中表达，最好将核酸构建体插入例如能够使基因在宿主细胞中最优表达的载体(例如质粒或噬菌体)。除质粒和噬菌体以外，载体也指本领域技术人员所公知的所有其它载体，即例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)，转座子，IS元件，噬粒，粘粒，和线性或环状DNA，以及农杆菌系统。
这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。这些载体代表本发明的其他实施方案。合适质粒例如有大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III”3-B1、tgt11或pBdCl，链霉菌(Streptomyces)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，杆菌的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌(Corynebacterium)的pSA77或pAJ667，真菌的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2α、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可选择质粒的一小部分。其它质粒是本领域技术人员所公知的，并且能够在例如《克隆载体》(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中找到。
为了表达其它存在的基因，核酸构建体最好还包含3’-末端和/或5’-末端调控序列来增强表达，所述序列根据宿主生物和基因或所选的基因而加以选择，以达到最佳表达。
这些调控序列旨在使能够进行基因的定向表达和蛋白质表达。这意味着取决于宿主生物体，例如基因只在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。
此处优选调控序列和因子具有正面影响，并且由此增强被插入的基因的表达。因此，通过使用强转录信号(例如启动子和/或“增强子”)在转录水平增强调控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通过例如改良mRNA稳定性来增强翻译。
在载体的另一实施方案中，包含核酸构建体或核酸的载体也可能以线性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通过异源或同源重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能由线性化载体(例如质粒)组成，或仅由核酸构建体或核酸组成。
为实现生物中异源基因的最佳表达，最好根据生物中使用的特定“密码子使用”来修饰核酸序列。通过计算机分析所研究生物的其他已知基因，可以容易的确定“密码子使用”。
将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止信号或多聚腺苷酸信号融合来制备表达盒。为此目的使用的常规重组和克隆技术见于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室操作手册，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，现代分子生物学实验方法，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。
为了实现在合适宿主生物体中的表达，最好将重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体中，这可使基因在宿主中最优表达。载体是本领域技术人员所熟知的，并且能够在例如“克隆载体”(Pouwels P.H.等人，Eds.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
可以利用载体制备例如由至少一个载体转化的可用于生产本发明所用多肽的重组微生物。最好将上述重组构建体插入合适的宿主系统并表达之。在此情况下，优选使用本领域技术人员熟知的常用克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以引起所述核酸在特定表达系统中表达。合适的系统在例如现代分子生物学实验方法，F.Ausubel等人编辑，Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等人，分子克隆：实验室操作手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。
也可以制备同源重组微生物。为此，可制备包括至少一部分本发明所用基因或编码序列的载体，其中，在适用的情况下，所述编码序列中引入至少一个氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，从而修饰(例如功能性破坏)该序列(“敲除”载体)。插入的序列也可为例如相关微生物的同源物或由哺乳动物、酵母或昆虫来源衍生而来。可选择地设计用于同源重组的载体，从而使内源性基因在同源重组时发生突变或其他改变，但仍然编码功能性蛋白质(例如改变上游调控区域由此改变内源性蛋白质的表达)。本发明所用基因的改变的部分位于同源重组载体中。适合同源重组的载体的构建在例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中描述。
适合本发明使用的核酸或核酸构建体的重组宿主生物体原则上是所有原核或真核生物体。最好使用微生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物体。最好使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，特别优选使用的细菌为埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链酶菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。
依据宿主生物体，按本领域技术人员公知的方法生长或培养制备融合蛋白质的过程中使用的生物体。微生物通常生长在液体培养基中，其包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式例如酵母提取物，或例如硫酸铵等盐类)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、以及适用情况下的维生素，生长温度在0℃到100℃之间，优选10℃到60℃，同时供以氧气。此种情况培养液pH值可以维持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。可以进行分批发酵、半分批发酵或连续培养。可以在发酵最初开始时引入营养素，或以半连续或连续方式进行随后加料。可以通过实施例中所描述的方法从生物体中分离酶，或者在反应中使用酶粗提物。
可以用重组方法制备本发明使用的蛋白质或其功能生物活性片段，通过培养产生蛋白质的微生物，适用的情况下诱导表达蛋白质，而且从培养液中分离所述蛋白质。如果需要，也可以通过此种方法在工业上生产蛋白质。可以通过已知方法培养和发酵重组微生物。例如细菌可以在20-40℃，pH 6-9条件下，在TB培养基或LB培养基中繁殖。合适的培养条件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室操作手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中详细描述。
如果本发明使用的蛋白质并非分泌至培养基中，那么就要破坏细胞，通过已知的蛋白质分离方法从溶菌产物中获得产品。正如所预期的，通过高频超声、高压(例如在弗氏压碎器中)、渗透、使用去污剂、水解酶或有机溶剂、匀浆等手段，或通过所列出的方法中两个或更多的组合来破坏细胞。
本发明使用的蛋白质可以用已知的层析方法纯化，例如分子筛层析(凝胶过滤法)，例如Q琼脂糖层析，离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常用方法，例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter deGruyter，Berlin，New York or in Scopes，R.，蛋白质纯化，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述。
通过载体系统或寡核苷酸分离重组蛋白质可能有利，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸cDNA，从而编码修饰的多肽或融合蛋白质，可用于例如简化纯化。此类合适的修饰包括作为锚起作用的“标签”，例如六组氨酸锚的修饰、或能够作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，抗体：实验室操作手册，Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。其它合适的标签是例如HA、钙调节蛋白-BD、GST、MBD；几丁质-BD、链霉亲和素-BD-avi-标签、Flag-标签、T7等等。这些锚可以用于将蛋白质附着在固体载体上，例如聚合体基质，例如其可填充到层析柱中，或用于微孔滴定板或其它载体。相应的纯化方法可以从商品化的亲和标签供应商那里获得。
如所述制备的蛋白质可以作为融合蛋白直接使用或切割除去融合配偶体后以“纯化的”疏水蛋白使用。
当需要移除融合配偶体时，推荐在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶体部分之间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特定识别位点)。合适的切割位点特别是通过生物信息学工具能够确定的那些否则将既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶体部分中的肽序列。尤其合适的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介导的Xa因子切割、肠激酶切割、凝血酶、TEV切割(烟草蚀纹病毒蛋白酶)。
单体
根据本发明的乳剂的合适单体原则上是所有疏水单体。此处疏水指当单体与水组合时，形成两相，即单体不能与水混溶或仅以很小的程度与水混溶。
优选的单体为苯乙烯，适用的情况下可以共同使用共聚单体，共聚单体的用量至多为单体总重量的50％。此类共聚单体是例如α-甲基苯乙烯、环卤代苯乙烯、环烷基苯乙烯、丙烯腈、丙烯酸酯或C1-8醇的异丁烯酸酯、N-乙烯基化合物(例如乙烯基咔唑)、和少量具有两个聚合双键的化合物(例如丁二烯、二乙烯基苯或丁二醇二丙烯酸酯)。特别尤其优选单独使用苯乙烯。
因此，根据本发明的乳剂的单体优选为苯乙烯，可能共同使用选自α-甲基苯乙烯、环卤代苯乙烯、环烷基苯乙烯、丙烯腈、丙烯酸酯或C1-8醇的异丁烯酸酯、N-乙烯基化合物、丁二烯、二乙烯基苯或丁二醇二丙烯酸酯的共聚单体。
在根据本发明的乳剂中，单体与水的体积比尤其依赖于所用的单体，其通常为0.75∶1到1.5∶1，尤其0.9∶1到1.4∶1和特别优选1∶1到1.4∶1。以苯乙烯作为单体，苯乙烯与水的体积比例如为1∶1到1.5∶1，优选1.1∶1到1.4∶1和尤其1.2∶1到1.3∶1。
无机颗粒
根据本发明，乳剂包含作为固体稳定乳化剂的无机颗粒。此类颗粒例如从Aveyard等人，Adv.Coll.Interf.Sci.100-102(2003)，503-546中得知。
无机颗粒优选选自包含焦磷酸镁(MPP)、硫酸钡、氧化锌和磷酸钙的颗粒。其中最优选的是由焦磷酸镁组成的颗粒，尤其是在以苯乙烯作为单体时。
这些颗粒(固体稳定乳化剂)通过无机化学常用反应来制备，即例如通过从溶液中沉淀或通过固态反应。优选地，通过结合合适的水溶液或通过将水溶液加入固体，在使用前直接制备，该情况下颗粒作为难溶化合物沉淀出来。
例如，可以通过将碱土金属焦磷酸盐和至少化学计量所需量的镁盐混合来制备MPP颗粒，镁盐可能是固体形式或在水溶液中。特别优选通过混合焦磷酸钠(Na4P2O7)和硫酸镁(MgSO4·7H2O)的水溶液来制备MPP。优选最初引入溶解的焦磷酸钠，并加入硫酸镁溶液。加入的镁盐的量至少为化学计量所需的量，优选以准确的化学计量的量。尤其不能存在过量的碱土金属焦磷酸盐。
特别优选不能以乳剂水相的总量来制备MPP。最好用小于总量一半的水来制备乳剂。例如可以将按重量计约20％量的硫酸镁溶液加入按重量计约3％的焦磷酸钠溶液中。在DE 42 20 225 A1中给出更详细的描述。
无机颗粒(固体稳定乳化剂)的颗粒大小由沉淀条件控制，通常为10nm到10μm，优选10nm到1μm和特别优选20-100nm，表示为颗粒直径平均数d50(各情况下50％的颗粒比d50直径更小或更大)。优选颗粒具有非球形的形状。
基于乳剂，通常无机颗粒的使用量为500-1000，优选600-900和尤其700-800ppmw。以苯乙烯作为单体，其量通常为例如600-900，优选700-800ppmw。
无机颗粒可以直接加入乳剂，或优选悬浮在助悬剂中。合适的助悬剂是水。优选直接使用在制备颗粒过程中获得的水悬浮液。该悬浮液包含例如按重量计1-2％，优选1.7-1.9％的无机颗粒。特别优选使用新鲜制备的悬浮液。
乳剂的其他成分
除水、单体、无机颗粒(固体稳定乳化剂)和疏水蛋白以外，根据本发明的乳剂也包含更多的成分。
例如，如果根据本发明的乳剂进行聚合作用，则加入推进剂，从而以此方法制备含推进剂的可发或膨胀型聚合体颗粒。合适的推进剂尤其是物理推进剂，例如二氧化碳、具有2-7个碳原子的脂肪族烃，醇、酮、醚、卤代烃或水，或其混合物。例如，如果将水包苯乙烯乳剂聚合从而形成含推进剂的聚苯乙烯颗粒，那么优选使用丙烷、异丁烷、正丁烷、异戊烷、新戊烷、正戊烷、己烷、二氧化碳和其混合物。
如果添加推进剂，其用量通常为单体重量的1-10％，优选单体重量的3-8％。
然而，并不是绝对需要添加推进剂，因为众所周知含推进剂的聚合体颗粒也可以通过其他方法制备，例如通过在增加的压力和升高的温度下，用推进剂浸渍制成的聚合体颗粒，在其过程中推进剂分散到软化的颗粒中，或者用挤压的方法在挤压机中将推进剂混入溶解的聚合体中，并且将挤压出的熔化物成粒。
此外，也在乳剂中加入其他常用的添加剂，例如成核剂、可塑剂、防燃剂、抗静电剂、抗氧化剂、UV吸收剂、IR吸收剂(例如烟灰和石墨)、铝粉、可溶和非可溶染料和色素。为此，添加剂以常规量使用。在以苯乙烯作为单体或以聚苯乙烯作为聚合体颗粒的情况下，合适的成核剂是例如滑石和/或蜡，也有烟灰、石墨和烟雾硅胶，其总用量为单体重量的0.05-30％。优选的可塑剂是矿物油、低聚的苯乙烯聚合体和邻苯二甲酸盐，其总用量为单体重量的0.05-10％。
然而，乳剂中也可能不加入这些添加剂，而是在随后例如加入到所获得的聚合体颗粒中。
此外，乳剂可以包含其他有机乳化剂(表面活性剂)，例如烷基磺酸盐。其包括十二烷基苯磺酸的碱土金属盐或C12-17烷基磺酸混合物的碱土金属盐，例如至多含0.2％重量的有机结合氯的平均链长为C15的多数次级烷基磺酸钠的混合物(Bayer的商业产品Mersolat
Figure A20068002338500181
K30)。然而，优选不共同使用此类其他有机乳化剂以防止乳剂非预期的发泡。
相应地，根据本发明的乳剂优选不包含有机乳化剂或表面活性剂。
乳剂的制备
使用常规方式将水、单体、固体稳定乳化剂、疏水蛋白混合在一起，经分批或连续发酵来制备乳剂，适用的情况还加入其他成分。在该方法中，加料材料可以一起加入或者彼此分开加入，可以在同一时间加入或连续加入，可以合为一体、分批、或以几个部分、或按数学函数连续加入，该函数可能是例如线性、增加、减少、指数或渐进的。
优选地，疏水蛋白最初以溶液形式引入，并加入固体稳定乳化剂(优选新鲜配制的水悬浮液)；然后，如果需要，加入水从而建立单体/水的比率，最后加入单体。混合后获得混合物。
用已知方式进行混合，例如通过搅拌、振荡或紊流混合。依赖于所用加料材料的类型和用量，以及乳剂中预期的单体小滴的直径，使用简单搅拌器(例如磁力搅拌器、桨式搅拌器等等)即可，该搅拌器运转的每分钟转数(rpm)为500-1000，优选600-800rpm。然而，也可能使用高速搅拌器，通常运转6000-10000，尤其9000-10000rpm，例如IKA的Ultra-Turrax
Figure A20068002338500191
可选择地，也可能通过其他混合操作进行混合，例如通过将单体喷雾至水中或反之，通过在混合物中振动和形成空泡(例如超声)，通过乳化离心、胶体磨或匀浆器。
为此可以在任何合适的容器中进行混合，最简单的情况是搅拌反应器或圆底烧瓶。也可以使用级联搅拌反应器、管状反应器、静态或动态混合器。如需要可附加流动破裂剂以促进混合。
低能量输入的混合时间在多数情况为1-20小时，优选5-15小时。对于高能量输入的情况，混合通常持续60-300秒，优选60-120秒。乳剂制备过程的温度通常为20-80℃，优选20-25℃；压力通常为1-3巴，优选1-2巴。尤其在单体具有低沸点或高蒸汽压力的情况下，也可能在更低温度和/或更高压力下进行混合。
混合的时间、压力和温度尤其由所用加料材料的类型和用量以及预期的单体小滴的直径来决定。
乳剂的特性和本发明的另一主题
根据本发明的乳剂由作为连续相的水和作为分散相的单体小滴组成。单体小滴的直径可以依据加料材料的类型和用量及混合条件而在限定范围内变化，通常为100-2000μm，优选800-1200μm，特别优选900-1000μm，其表示为小滴直径的平均数d50(各情况下50％的颗粒比d50直径更小或更大)。
乳剂可长时间稳定，例如几小时，并且不具有发泡倾向。
在优选实施方案中，值得注意的是根据本发明的乳剂的单体是苯乙烯，无机颗粒包含焦磷酸镁，且疏水蛋白在本说明书的SEQ ID NO：19中被描述。
本发明也提供上述制备本发明乳剂的方法，其中单体在作为固体稳定乳化剂的无机颗粒存在下分散在水中，其中共同使用疏水蛋白。
此方法中优选乳剂至少具有权利要求1-8的特征之一。
本发明还提供疏水蛋白在制备水中疏水单体乳剂中的用途。该用途中优选乳剂至少具有权利要求1-8的特征之一。
通过悬浮聚合形成聚合体颗粒
开始已经提及根据本发明的乳剂可以用作悬浮聚合中的加料材料。本发明同样提供此种用途。
本发明也包含水中疏水单体与共同使用的作为固体稳定乳化剂的无机颗粒悬浮聚合的方法，其中也共同使用疏水蛋白。优选此方法所用的加料材料为在权利要求1-8中定义的本发明的乳剂。
悬浮聚合的方法是本领域技术人员所公知的，例如从Kunststoff-Handbuch[塑料制品手册]，V卷，聚苯乙烯，Hanser-VerlagMunich中。作为规则，使用在单体中可溶的常用聚合引发剂。此类引发剂是例如可溶于苯乙烯的化合物，例如叔丁基过苯甲酸盐或过氧化联苯甲酰。它们的通常用量为单体重量的0.001-10％。
此外，也可共同使用分子量调节剂，例如十二烷基硫醇或二聚α-甲基苯乙烯，其通常用量为单体重量的0.001-0.01％。也可使用常用的保护性胶体，例如纤维素衍生物、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯吡咯酮。它们以常规量使用。然而，优选不共同使用此类保护性胶体。
悬浮聚合过程的温度通常为0-200℃，优选50-150℃。压力通常为0.1毫巴到50巴，优选0.8-20巴。
在悬浮聚合过程中，(大部分液体的)单体小滴聚合从而形成(通常为固体的)单体颗粒，并获得聚合体颗粒在水中的悬浮液。聚合体颗粒的大小尤其依赖于单体小滴的大小，通常为800-2000μm，优选900-1100μm，其表示为小滴直径的平均数d50(各情况下50％的颗粒比d50直径更小或更大)。
在悬浮聚合过程中，共同使用推进剂从而制备含推进剂的聚合体颗粒，其类型和用量见上述。为此，在增加的压力下进行聚合，即在1-50巴以上，温度例如为50-150℃。可选择地，也可以先不加入推进剂而进行聚合，随后在第二个步骤将获得的聚合体颗粒悬浮液在增加的压力和升高的温度下处理。
在特定压力和温度条件下，加入的推进剂分散到聚合体颗粒中。如果获得的悬浮液在压力下冷却从而使推进剂不扩散到颗粒中去，那么即获得可发型聚合体颗粒。如果将热的颗粒悬浮液突然减压，推进剂扩散到软化的颗粒中，则获得膨胀型颗粒。相应地，依赖于操作步骤，聚合体颗粒可以是可发型或膨胀型。
因此本发明也提供用共同使用推进剂制备可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的方法，其中通过悬浮聚合的特定方法制备聚合体颗粒。
本发明同样提供通过此方法获得的可发或膨胀型聚合体颗粒。为此，可能例如制备泡沫(称为颗粒泡沫)或泡沫塑型。已知过程如下：为了制备膨胀型聚苯乙烯(Styropor
Figure A20068002338500211
)，首先可能例如通过在预发泡过程中加热从而将本发明的可发型含推进剂的聚苯乙烯颗粒部分膨胀。在随后的完全发泡过程中，将部分膨胀的聚苯乙烯颗粒倒入具有细孔的模子中，关闭模子，通过注入蒸汽或其它方法使颗粒膨胀，在该过程中颗粒结合在而一起形成泡沫或形成最终的泡沫塑型。
因此本发明也提供根据本发明的可发或膨胀型聚合体颗粒用于生产泡沫或泡沫塑型的用途。尤其优选根据本发明的可发或膨胀型聚苯乙烯颗粒用于生产聚苯乙烯泡沫或泡沫塑型的用途，即在该用途中聚合体颗粒是聚苯乙烯颗粒，而且泡沫或泡沫塑型是膨胀的聚苯乙烯。
实施例
A部分：根据本发明使用的疏水蛋白的制备和测试
实施例1：克隆的yaad-His 6 /yaaE-His 6 准备工作
用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal 572/Hal 573)进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是枯草芽孢杆菌基因组DNA。获得的PCR片段包含枯草芽孢杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，和分别在其末端的NcoI或BglII限制性切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到来自Qiagen的载体pQE60中，该载体预先用限制性内切酶NcoI和BglII线性化。这样获得的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5分别用于表达含有YAAD::HIS6和YAAE::HIS6的蛋白质。
Hal570：gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571：gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572：ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573：gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
实施例2：yaad疏水蛋白DewA-His 6 的克隆
用寡核苷酸KaM416和KaM417进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是构巢曲霉基因组DNA。获得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到载体pQE60YAAD#2中，该载体预先用限制性内切酶BglII线性化。
这样获得的载体#508用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS6组成的融合蛋白质。
KaM416：GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
实施例3：yaad疏水蛋白RodA-His 6 的克隆
质粒#513的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM434和KaM435。
KaM434：GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435：CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
实施例4：yaad疏水蛋白BASF1-His 6 的克隆
质粒#507的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM417和KaM418。
使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASF1-(见附录)。
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
实施例5：yaad疏水蛋白BASF2-His 6 的克隆
质粒#506的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM417和KaM418。
使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASF2(见附录)。
KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
实施例6：yaad疏水蛋白SC3-His 6 的克隆
质粒#526的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM464和KaM465。
使用的模板DNA是普通裂褶菌cDNA(见附录)。
KaM464：CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465：GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
实施例7：yaad疏水蛋白DewA-His 6 重组大肠杆菌菌株的发酵
将含有表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌株的3ml LB液体培养基接种于15ml Greiner管中。于37℃在振荡器上以200rpm培养8小时。将1ml此预培养液各自接种于2个1升有塞子锥形瓶中的250mlLB培养基中(+100μg/ml氨苄青霉素)，在37℃以180rpm振荡培养9小时。
将0.5升的预培养液(相对于水测量OD600nm1∶10)接种于13.5升的LB培养基(+100μg/ml氨苄青霉素)中，置于20升的发酵罐。在OD600nm约3.5时添加140ml的100mM IPTG。3小时以后，将发酵罐冷却到10℃，并通过离心除去发酵液。细胞沉淀用于进一步的纯化。
实施例8：重组疏水蛋白融合蛋白的纯化
(带有C-末端His6标签的疏水蛋白融合蛋白的纯化)
100g的细胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mM pH7.5的磷酸钠缓冲液补足到总体积为200ml，并将沉淀重悬。悬浮液用T25型高速分散器Ultraturrax(Janke和Kunkel；IKA-Labortechnik)处理10分钟，随后为了降解核酸，再与500单位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt；order No.1.01697.0001)在室温培育1小时。在破坏细胞之前使用玻璃萃取柱(P1)进行过滤。为了破坏细胞和剪断剩余的基因组DNA，在1.500巴进行2次匀浆处理(Microfluidizer M-110EH；Microfluidics Corp.)。将匀浆液离心(Sorvall RC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4℃，12 000rpm，23 000g)，上清置于冰上，用100ml pH7.5的磷酸钠缓冲液重悬沉淀。重复3次离心和重悬，在第3次重复时磷酸钠缓冲液中包含1％SDS。重悬以后，将溶液搅拌1小时，然后进行最终离心(Sorvall RC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4℃，12 000rpm，23 000g)。根据SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最终离心的上清液部分(图1)。实验显示疏水蛋白可以以包涵体的形式存在于相应大肠杆菌中。50ml含疏水蛋白的上清液应用于以50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液平衡的50ml镍-琼脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液洗柱，随后用包含200mM咪唑的50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液洗脱疏水蛋白。为了去除咪唑，溶液用50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液透析。
图1描述所制备的疏水蛋白的纯化
1泳道：应用于镍-琼脂糖柱的混合物(1∶10稀释)
2泳道：流出液＝清洗步骤的洗脱液
3-5泳道：洗脱级分的OD 280峰
图1的疏水蛋白分子量约为53 kD。一些较小条带代表疏水蛋白的降解产物。
实施例9：性能测试；疏水蛋白改变水滴在玻璃上接触角的特性
基质：玻璃(窗玻璃，Süddeutsche Glas，Mannheim，Germany)：
-疏水蛋白浓度：100μg/mL
-玻璃片在50mM pH4的醋酸钠+0.1％聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯(Tween
Figure A20068002338500251
20)中培育过夜(温度80℃)
-随后包被，在蒸馏水中清洗
-然后于80℃在1％十二烷基硫酸钠(SDS)的蒸馏水溶液中培育10分钟
-在蒸馏水中清洗
样品在20℃空气中干燥，且在室温下测定5μl水滴的接触角(单位为度)。
接触角的测量用Dataphysics接触角系统OCA 15+仪器，软件为SCA20.2.0.(2002年11月)。根据制造商的说明书进行测量。
未处理的玻璃接触角为30±5°，以根据实施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃接触角为75±5°。
B部分：含疏水蛋白的乳剂
实施例10：水中苯乙烯乳剂的制备和研究
使用去离子水。为制备根据本发明的乳剂，使用如实施例8制备的疏水蛋白(融合蛋白)yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：19)水溶液。溶液中疏水蛋白浓度为100mg/l(按重量的0.02％)。
所用的固体稳定乳化剂是焦磷酸镁(MPP)的水悬浮液，其按如下方法制备：在20℃将93.18g焦磷酸钠(Na4P2O7)溶解于3200ml水中。在此溶液中边搅拌边加入溶于800ml水的172.8g硫酸镁(MgSO4·7 H2O)溶液，混合物再搅拌5分钟。
使用具有磁力搅拌器和包含聚四氟乙烯(Teflon
Figure A20068002338500261
)包被搅棒的50ml宽颈瓶。开始在20℃不搅拌的情况下引入0.3-1.2g疏水蛋白溶液，并加入1.5-2.5g新鲜制备的MPP悬浮液和15-20g水。将此混合物以700rpm搅拌30秒。然后加入30g苯乙烯。选择疏水蛋白溶液、MPP悬浮液和水的精确量从而使得到的混合物中苯乙烯相∶水相的体积比为1.3，且MPP含量为780ppmw。混合物中疏水蛋白含量在下表中列出。
得到的混合物在20℃和700rpm下搅拌17小时。然后将混合物静置2小时，并对得到的混合物照相。
通过用苯乙烯或水稀释来研究混合物和乳剂的稳定性。为此，在20℃向0.1ml混合物样品中加入0.1ml苯乙烯或0.1ml水，并观察是否能够混合。此外，通过参考照片来确定苯乙烯小滴的近似大小。
结果在下表中概述。
表：结果(C指对照，nd指不确定)
实例 疏水蛋白含量[ppmw] 混合物的特征 苯乙烯小滴的大小
10-1C  0 不形成乳剂 -
10-2  21 不稳定的乳剂 nd
10-3  42 稳定的乳剂 几毫米
10-4  84 稳定的乳剂 微米和毫米范围
序列表中DNA和多肽序列的序列名
 dewA DNA和多肽序列 SEQ ID NO：1
 dewA多肽序列 SEQ ID NO：2
 rodADNA和多肽序列 SEQ ID NO：3
 rodA多肽序列 SEQ ID NO：4
 hypA DNA和多肽序列 SEQ ID NO：5
 hypA多肽序列 SEQ ID NO：6
 hypB DNA和多肽序列 SEQ ID NO：7
 hypB多肽序列 SEQ ID NO：8
 sc3 DNA和多肽序列 SEQ ID NO：9
 sc3多肽序列 SEQ ID NO：10
 basf1 DNA和多肽序列 SEQ ID NO：11
 basf1多肽序列 SEQ ID NO：12
 basf2 DNA和多肽序列 SEQ ID NO：13
 basf2多肽序列 SEQ ID NO：14
 yaad DNA和多肽序列 SEQ ID NO：15
 yaad多肽序列 SEQ ID NO：16
 yaae DNA和多肽序列 SEQ ID NO：17
 yaae多肽序列 SEQ ID NO：18
 yaad-Xa-dewA-his DNA和多肽序列 SEQ ID NO：19
 yaad-Xa-dewA-his多肽序列 SEQ ID NO：20
 yaad-Xa-rodA-his DNA和多肽序列 SEQ ID NO：21
 yaad-Xa-rodA-his多肽序列 SEQ ID NO：22
 yaad-Xa-basf1-his DNA和多肽序列 SEQ ID NO：23
 yaad-Xa-basf1-his多肽序列 SEQ ID NO：24
序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>含有疏水蛋白的水单体乳剂
<130>AE 20050377
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
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<223>
<400>1
atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg       48
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg       96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
            20                  25                  30
gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg      144
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
        35                  40                  45
atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg      192
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
    50                  55                  60
agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act      240
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc      288
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
                85                  90                  95
gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc      336
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
            100                 105                 110
gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct      384
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
        115                 120                 125
ggc gct ggt acc aag gct gag                                          405
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
    130                 135
<210>2
<211>135
<212>PRT
<213>basf-dewA
<400>2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
            20                  25                  30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
        35                  40                  45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
    50                  55                  60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
                85                  90                  95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
            100                 105                 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
        115                 120                 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
    130                 135
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<211>471
<212>DNA
<213>basf-rodA
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(471)
<223>
<400>3
atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt       96
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg      144
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
        35                  40                  45
acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct      192
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
    50                   55                  60
tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gatgag       240
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65                  70                  75                  80
ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt      288
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
                85                  90                  95
gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct      336
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp ValAla
            100                 105                 110
gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac      384
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
        115                 120                 125
att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att      432
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
    130                 135                 140
ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc                  471
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145                 150                 155
<210>4
<211>157
<212>PRT
<213>basf-rodA
<400>4
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
        35                  40                  45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65                  70                  75                  80
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
                85                  90                  95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
            100                 105                 110
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
        115                 120                 125
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
    130                 135                 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145                 150                 155
<210>5
<211>336
<212>DNA
<213>basf-HypA
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>5
atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt       48
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc       96
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
            20                  25                  30
gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac      144
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
        35                  40                  45
acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt      192
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
    50                  55                  60
gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt      240
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65                  70                  75                  80
ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc      288
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
                85                  90                  95
acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc      336
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
            100                 105                 110
<210>6
<211>112
<212>PRT
<213>basf-HypA
<400>6
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
            20                  25                  30
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
        35                  40                  45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
    50                  55                  60
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65                  70                  75                  80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
                85                  90                  95
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
            100                 105                 110
<210>7
<211>357
<212>DNA
<213>basf-HypB
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<223>
<400>7
atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc       48
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag       96
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct      144
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
        35                  40                  45
aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg      192
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
    50                  55                  60
ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct      240
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc      288
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
                85                  90                  95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc      336
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
            100                 105                 110
act ccc att aat gcc aat gtg                                          357
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
        115
<210>8
<211>119
<212>PRT
<213>basf-HypB
<400>8
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
        35                  40                  45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
                85                  90                  95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
            100                 105                 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
        115
<210> 9
<211>408
<212>DNA
<213>basf-sc3
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(408)
<223>
<400>9
atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc       48
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1               5                   10                  15
ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg       96
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
            20                  25                  30
ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg      144
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
        35                  40                  45
acc atc gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tct tgc tgc      192
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
    50                  55                  60
aac cag gtt caa tcg gcg agc agc agc cct gtt acc gcc ctc ctc ggc      240
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65                  70                  75                  80
ctg ctc ggc att gtc ctc agc gac ctc aac gtt ctc gtt ggc atc agc      288
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
                85                  90                  95
tgc tct ccc ctc act gtc atc ggt gtc gga ggc agc ggc tgt tcg gcg      336
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
            100                 105                 110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg atc aac atc      384
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
        115                 120                 125
ggt tgc acc ccc atc aac atc ctc                                      408
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
    130                 135
<210>10
<211>136
<212>PRT
<213>basf-sc3
<400>10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1               5                   10                  15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
        35                  40                  45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
    50                  55                  60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
                85                  90                  95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
            100                 105                 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
        115                 120                 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
    130                 135
<210>11
<211>483
<212>DNA
<213>basf-BASF1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(483)
<223>
<400>11
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc       96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc      144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
         35                 40                  45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc      192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
    50                  55                  60
tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc      240
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc      288
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
                85                  90                  95
ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc      336
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
            100                 105                 110
atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag      384
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
        115                 120                 125
aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc      432
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
    130                 135                 140
gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat      480
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145                 150                 155                 160
atg                                                                  483
Met
<210>12
<211>161
<212>PRT
<213>basf-BASF1
<400>12
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
        35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
    50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
            100                 105                 110
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
        115                 120                 125
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
    130                 135                 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145                 150                 155                 160
Met
<210>13
<211>465
<212>DNA
<213>basf-BASF2
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(465)
<223>
<400>13
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc       96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc      144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
        35                  40                  45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc      192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
    50                  55                  60
tac gcc ggc gac gtc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc      240
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc      288
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
                85                  90                  95
ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc      336
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
            100                 105                 110
cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc      384
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
        115                 120                 125
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc      432
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
    130                 135                 140
aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg                          465
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145                 150                 155
<210>14
<211>155
<212>PRT
<213>basf-BASF2
<400>14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
            20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
        35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
    50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
            100                 105                 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
        115                 120                 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
    130                 135                 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145                 150                 155
<210>15
<211>882
<212>DNA
<213>basf-yaad
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (882)
<223>
<400>15
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg                                              882
Met Gln Glu Arg Gly Trp
    290
<210>16
<211>294
<212>PRT
<213>basf-yaad
<400>16
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                150                  155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp
    290
<210>17
<211>591
<212>DNA
<213>basf-yaae
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (591)
<223>
<400>17
atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag       48
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa       96
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
            20                  25                  30
cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt      144
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
        35                  40                  45
gag agc acg acg atg cgc cgt ttg atc gat acg tat caa ttc atg gag      192
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
    50                  55                  60
ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt      240
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65                  70                  75                  80
gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct      288
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
                85                  90                  95
cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg      336
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
            100                 105                 110
cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag      384
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
        115                 120                 125
cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt      432
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
    130                 135                 140
gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg      480
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
145                 150                 155                 160
aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa      528
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
                165                 170                 175
gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag      576
 Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
             180                 185                 190
caa aag gca ctt gta                                                  591
Gln Lys Ala Leu Val
        195
<210>18
<211>197
<212>PRT
<213>basf-yaae
<400>18
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
            20                  25                  30
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
        35                  40                  45
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
    50                  55                  60
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
                85                  90                  95
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
        115                 120                 125
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
    130                 135                 140
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
145                 150                 155                 160
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
                165                 170                 175
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
            180                 185                 190
Gln Lys Ala Leu Val
        195
<210>19
<211>1329
<212>DNA
<213>basf-yaad-Xa-dewA-his
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1329)
<223>
<400>19
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
   130                  135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tcc att gaa ggc cgc atg cgc ttc atc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
    290                 295                 300
gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg      960
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc     1008
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
                325                 330                 335
aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg atc gct tgc tgc     1056
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
            340                 345                 350
aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg agc ggt ctg ctc     1104
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
        355                 360                 365
ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc agc gcc tgc     1152
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
    370                 375                 380
gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc gtc gac     1200
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp
385                 390                 395                 400
cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc gct tgc tgc cct     1248
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
                405                 410                 415
gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gct ggt acc     1296
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
            420                 425                 430
aag gct gag gga tct cat cac cat cac cat cac                          1329
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
        435                 440
<210>20
<211>443
<212>PRT
<213>basf-yaad-Xa-dewA-his
<400>20
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
    290                 295                 300
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro
305                 310                  315                320
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
                325                 330                 335
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
            340                 345                 350
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
        355                 360                 365
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
    370                 375                 380
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp
385                 390                 395                 400
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
                405                 410                 415
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
            420                 425                 430
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
        435                 440
<210>21
<211>1395
<212>DNA
<213>basf-yaad-Xa-rodA-his
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1395)
<223>
<400>21
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
    290                 295                 300
att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct      960
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc     1008
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
                325                 330                 335
aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag     1056
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
            340                 345                 350
gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag     1104
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
        355                 360                 365
gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct     1152
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
    370                 375                 380
ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt     1200
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385                 390                 395                 400
ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc     1248
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
                405                 410                 415
atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc     1296
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
            420                 425                 430
cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc     1344
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
        435                 440                 445
cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat     1392
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
    450                 455                 460
cac                                                                 1395
His
465
<210>22
<211>465
<212>PRT
<213>basf-yaad-Xa-rodA-his
<400>22
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
    290                 295                 300
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
                325                 330                 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
            340                 345                 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
        355                 360                 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
    370                 375                 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385                 390                 395                 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
                405                 410                 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
            420                 425                 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
    450                 455                 460
His
465
<210>23
<211>1407
<212>DNA
<213>basf-yaad-Xa-BASF1-his
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1407)
<223>
<400>23
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
    290                 295                 300
gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct      960
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc     1008
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
                325                 330                 335
cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc     1056
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
            340                 345                 350
gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac     1104
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
        355                 360                 365
gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc ctc aag aac     1152
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
    370                 375                 380
ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc otc ttc gac cag     1200
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln
385                 390                 395                 400
tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag     1248
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
                405                 410                 415
gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc     1296
Asp Leu Leu Asn Gln ValAsn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
            420                425                 430
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc     1344
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
        435                 440                 445
ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat     1392
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
    450                 455                 460
cac cat cac cat cac                                                 1407
His His His His His
465
<210>24
<211>469
<212>PRT
<213>basf-yaad-Xa-BASF1-his
<400>24
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
                85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
            100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
        115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
                165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
            180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
        195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
    210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
                245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
            260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
        275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
    290                 295                 300
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
                325                 330                 335
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
            340                 345                 350
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
        355                 360                 365
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
    370                 375                 380
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln
385                 390                 395                 400
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
                405                 410                 415
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
            420                 425                 430
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
        435                 440                 445
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
    450                 455                 460
His His His His His
465

Claims (19)

1.水中的疏水单体的乳剂，其包含作为固体稳定乳化剂的无机颗粒和疏水蛋白。
2.根据权利要求1的乳剂，其中单体是苯乙烯，其中可以共同使用的共聚单体选自α-甲基苯乙烯、环卤代苯乙烯、环烷基苯乙烯、丙烯腈、丙烯酸酯或具有C1-8-醇的异丁烯酸酯、N-乙烯基化合物、丁二烯、二乙烯基苯或丁二醇二丙烯酸酯。
3.根据权利要求1到2的乳剂，其中无机颗粒选自包含焦磷酸镁、硫酸钡、氧化锌和磷酸钙的颗粒。
4.根据权利要求1到3的乳剂，其中疏水蛋白具有通式(I)
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I)
其中X是任意的20种天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，且X可能在各情况下是相同或不同的，
X旁边的指数是氨基酸数，
C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少4个命名为C的基团是半胱氨酸，
指数n和m是不依赖于彼此的0-500之间的自然数。
5.根据权利要求1到4的乳剂，其中疏水蛋白具有通式(II)Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm(II)
其中X、C和X旁边的指数的含义与权利要求4中相同，且指数n和m是不依赖于彼此的0-300之间的自然数。
6.根据权利要求1到5的乳剂，其中疏水蛋白选自dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1和basf2型疏水蛋白。
7.根据权利要求1到6的乳剂，其中单体是苯乙烯，无机颗粒包含焦磷酸镁，且疏水蛋白在SEQ ID NO：19中被描述。
8.根据权利要求1到7的乳剂，其不包含有机乳化剂或表面活性剂。
9.根据权利要求1到8的乳剂的制备方法，其中单体在作为固体稳定乳化剂的无机颗粒存在下分散于水中，其中共同使用疏水蛋白。
10.根据权利要求9的方法，其中乳剂至少具有权利要求1到8的特性之一。
11.疏水蛋白用于制备水中疏水单体乳剂的用途。
12.根据权利要求11的用途，其中乳剂至少具有权利要求1到8的特性之一。
13.用共同使用的作为固体稳定乳化剂的无机颗粒在水中悬浮聚合疏水单体的方法，其中共同使用疏水蛋白。
14.根据权利要求13的方法，其中使用权利要求1到8中定义的乳剂作为加料材料。
15.根据权利要求1到8的乳剂在悬浮聚合中作为加料材料的用途。
16.用共同使用的推进剂来制备可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的方法，其中聚合体颗粒用根据权利要求13的方法制备。
17.通过根据权利要求16的方法可获得的可发或膨胀型聚合体颗粒。
18.根据权利要求17的可发或膨胀型聚合体颗粒在产生泡沫或泡沫塑型中的用途。
19.根据权利要求18的用途，其中聚合体颗粒是聚苯乙烯颗粒，且泡沫或泡沫塑型是膨胀型聚苯乙烯。
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