JP2009501256A - ハイドロフォビンを含むモノマーの水乳濁液 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
WO03/10331には、ハイドロフォビンを塗布したセンサ、例えば、他の物質、例えば電気活性物質、抗体又は酵素が共有結合的に結合していない測定用電極が開示されている。
本発明の乳濁液はハイドロフォビンを含有する。本発明において、「ハイドロフォビン」とは、一般構造式(I)で表されるタンパク質を意味するものとする。
Xn−C1−X1-50−C2−X0-5−C3−X1-100−C4−X1-100−C5−X1-50−C6−X0-5−C7−X1-50−C8−Xm (I)
式中、Xは、20種の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかである。ただし、Xは、いずれの場合も、同一であっても異なっていてもよい。Xの添字は、いずれの場合も、アミノ酸の数である。Cは、システイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニン又はトレオニンであり、C基のうち少なくとも4個はシステインであり、添字のnとmは、独立して、0〜500、好ましくは15〜300の自然数のである。
Xn−C1−X3-25−C2−X0-2−C3−X5-50−C4−X2-35−C5−X2-15−C6−X0-2−C7−X3-35−C8−Xm (II)
が、本発明を実施するのに使用される。なお、式中、XとC及びXとCの添字は、上記と同じであるが、添字のnとmは、相互に独立して、0〜300の自然数である。好ましくは、このタンパク質はさらに上記の接触角変化により規定される。
Xn−C1−X5-9−C2−C3−X11-39−C4−X2-23−C5−X5-9−C6−C7−X6-18−C8−Xm (III)
式中、XとC及びXとCの添字は、上記と同じであるが、添字のnとmは、相互に独立して、0〜200の自然数である。好ましくは、このタンパク質は、さらに上記の接触角変化により規定される。したがって、Cの基のうち少なくとも6個がシステインであることが好ましい。特に、すべてのC基がシステインであることが好ましい。
本発明において使用されるハイドロフォビン類は、既知のペプチド合成法、例えばメリフィールドの固相合成法により化学的に製造可能である。
本発明の乳濁液用の適当なモノマーには、原則としてすべて疎水性モノマーが含まれる。ここで、疎水性とは、モノマーを水と混合した場合二層を形成する、つまりそのモノマーが水に混和不能又はほんの少量しか溶解しないことを意味する。
本発明によれば、本乳濁液はピッカリング乳化剤として作用する無機粒子を含有する。このような粒子は、例えば、Aveyard et al., Adv. Coll. Interf. Sci., 100-102 (2003), 503-546に記載されている。
本発明の乳濁液は、水、モノマー、無機粒子(ピッカリング乳化剤)及びハイドロフォビン以外に、他の成分を含んでいる。
本乳濁液は、水とモノマー、ピッカリング乳化剤、ハイドロフォビン及び、適当なら他の成分とをバッチ的に又は連続的に混合(分散)して製造される。本方法において、供給材料は、一緒又は別途に、同時又は異なる時期に、一挙にバッチ式で、又はいくつかに分けて、又は、例えば直線的、漸増、漸減、指数、累進なとの数学関数的に連続式で添加することができる。
本発明の乳濁液は、連続相としての水と分散相としてのモノマー液滴とからなる。モノマー液滴の直径は、供給材料の種類や量及び混合条件により広い範囲内で変動するが、
数平均液滴径d50(いずれの場合も、50%の粒子がd50直径より少ないか多い)として、通常100〜2000μm、好ましくは800〜1200μm、特に好ましくは900〜1000μmである。
当初に記載したように、本発明の乳濁液は、懸濁重合の供給材料に利用される。この利用も、本発明により提供されるものである。
A:本発明で使用されるハイドロフォビン類の調整と試験
実施例1: yaad−His6 /yaaE−His6 のクローニングのための前処理
オリゴヌクレオチドHal570とオリゴヌクレオチドHal571(Hal572/Hal573)とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。枯草菌からのゲノムDNAをテンプレートDNAとして使用した。得られたPCRフラグメントは、枯草菌の遺伝子yaaD/yaaEのコード配列を含み、いずれの場合も、末端にNcol又はBgIII制限酵素認識部位を有していた。このPCRフラグメントを精製し、制限酵素のNcolとBgIIIで切断した。このDNAフラグメントをインサートとして用い、前もって制限酵素のNcolとBgIIIとで線状化したキアゲンのベクターpQE60に導入した。このようにして得られたこれらのベクターpQE60YAAD#2とpQE60YaaE#5は、YAAD::HIS6又はYAAE::HIS6からなるタンパク質の発現に用いることができる。
Hal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572:ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
オリゴヌクレオチドKaM416とオリゴヌクレオチドKaM417とを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。カビのアスペルギルス・ニジュイアンスのゲノムDNAをテンプレートDNAとして用いた。得られたPCRフラグメントは、ハイドロフォビン遺伝子dewAのコード配列と、N−端末のXa因子プロテイナーゼ切断部位とを有していた。このPCRフラグメントを精製し、制限酵素BamHIで切断した。このDNAフラグメントをインサートとして用い、制限酵素BgIIIで前もって直線状にしたベクターpQE60YAAD#2に導入した。
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
プラスミド#508と同様に、オリゴヌクレオチドKaM434とオリゴヌクレオチドKaM435を用いて、プラスミド#513をクローニングした。
KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
プラスミド#508と同様に、オリゴヌクレオチドKaM417とオリゴヌクレオチドKaM418とを用いて、プラスミド#507をクローニングした。
KaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
プラスミド#508と同様に、オリゴヌクレオチドKaM417とオリゴヌクレオチドKaM418とを用いて、プラスミド#506をクローニングした。
合成DNA配列のハイドロフォビンBASF2を、テンプレートDNAとして用いた(附表参照).
KaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
プラスミド#508と同様に、オリゴヌクレオチドKaM464とオリゴヌクレオチドKaM465とを用いてプラスミド#526をクローニングした。
シゾフィラム・コミューンのcDNAを、テンプレートDNAとして用いた(附表参照)。
KaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
yaad−ハイドロフォビンDewA−His6 を発現する大腸菌菌株を含む3mlのLB液体培地を15mlのグラナーチューブで培養する。200rpmのシェーカー上で、37℃で8時間培養する。250mlのLB培地(+100μg/mlのアンピシリン)を入れた2個の1lのじゃま板付エルレンマイアーフラスコに、1mlの前培養物を入れ、180rpmのシェーカー上で、37℃で9時間培養する。
100gのセルペレット(100〜500mgのハイドロフォビン)を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、pH 7.5で希釈して総体積を200mlとし、再懸濁させる。この懸濁液をウルトラタラックスT25型(ヤンケアンドクンケル; IKAラボテクニック)で10分間処理し、次いで500ユニットのベンゾナーゼ(メルク、独国;注文番号:1.01697.0001)とともに室温で1時間培養して、核酸を分解させる。細胞破砕の先立ち、ガラスカートリッジ(P1)で濾過する。細胞破砕と残存するゲノムDNAのせん断のために、1.500barで二回、ホモジナイズ処理する(マイクロフルイダイザーM−110EH;マイクロフルイディックス社)。ホモジネートを遠心分離(ソルバールRC−5B、GSA回転子、250mlの遠心ビーカー、60分、4℃、12000rpm、23000g)して上澄液を氷上で冷却し、ペレットは、100mlのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5で再懸濁させる。遠心分離と再懸濁を三回繰返し、三回目には1%のSDSを含むリン酸ナトリウム緩衝液を用いる。再懸濁の後、混合物を一時間攪拌し、最後の遠心分離を行う(ソルバールRC−5B、GSA回転子、250mlの遠心ビーカー、60分、4℃、12000 rpm、23000g)。SDS−PAGE分析の結果、最後の遠心分離の後の上澄液に、ハイドロフォビンが存在していることがわかる(図1)。実験の結果、ハイドロフォビンが、大腸菌細胞中に封入体の形で存在しているようにみえる。ハイドロフォビンを含む50mlの上澄液を、前もって50mMのTris−Cl、pH8.0の緩衝液で平衡化させた50mlのニッケル−セファローズ高性能17−5268−02カラム(Amersham)にかける。このカラムを、50mMのTris−Cl、pH8.0緩衝液で洗い、上記のハイドロフォビンを、200mMのイミダゾールを含む50mMのTris−Cl、pH8.0緩衝液で溶離させる。イミダゾールを除くため、溶液を、50mMのTris−Cl、pH8.0緩衝液に対して透析させる。
レーン2:初期溶離液:洗浄時の溶出物
レーン3〜5:溶離フラクションのOD280ピーク
−基板:ガラス(窓ガラス、スードドイチェガラス、独国)
−ハイドロフォビン濃度: 100 ug/mL
−ガラス板を、50mMの酢酸ナトリウム、pH4、+0.1 %ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(ツイーン(R)20)中で一夜培養(温度:80℃)−塗布後、蒸留水で洗浄
−次いで、蒸留水中で培養、10分/80℃/1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液
−蒸留水で洗浄
脱イオン水を用いた。本発明の乳濁液の調製にあたり、実施例8で得たハイドロフォビン(融合タンパク質)yaad−Xa−dewA−his(配列番号19)の水溶液を用いた。その溶液中のハイドロフォビン濃度は、100mg/l(0.02重量%)であった。
Claims (19)
- ピッカリング乳化剤として作用する無機粒子とハイドロフォビンとを含むことを特徴とする疎水性モノマーの水乳濁液。
- 前記モノマーがスチレンであり、α−メチルスチレン、環ハロゲン化スチレン、環アルキル化スチレン、アクリロニトリル、アクリル酸又はメタクリル酸とC1-8−アルコールとのエステル類、N−ビニル化合物、ブタジエン、ジビニルベンゼン及びブタンジオールジアクリレートから選択されるコモノマーを併用してもよい請求項1に記載の乳濁液。
- 前記無機粒子が、ピロリン酸マグネシウム、硫酸バリウム、酸化亜鉛及びリン酸カルシウムから選択される粒子である請求項1又は2に記載の乳濁液。
- 前記ハイドロフォビンが、一般式(I)で表される:
Xn−C1−X1-50−C2−X0-5−C3−X1-100−C4−X1-100−C5−X1-50−C6−X0-5−C7−X1-50−C8−Xm (I)
(式中、Xは、20種の天然アミノ酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)のいずれかであり、Xは、いずれの場合も、同一であっても異なっていてもよく;Xの添字はアミノ酸の数を表し;Cはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニン又はトレオニン、を表し、少なくとも4個のC基がシステインであり;添字nとmが、相互に独立して、0〜500の自然数である)請求項1〜3のいずれか1項に記載の乳濁液。 - 前記ハイドロフォビンが一般式(II)で表される:
Xn−C1−X3-25−C2−X0-2−C3−X5-50−C4−X2-35−C5−X2-15−C6−X0-2−C7−X3-35−C8−Xm (II)
(式中、X、C及びXの添字は、請求項4で規定した意味を有し;添字nとmが、相互に独立して、0〜300の自然数である)請求項1〜4のいずれか1項に記載の乳濁液。 - 前記ハイドロフォビンが、dewA型、rodA型、hypA型、hypB型、sc3型、basf1型、及びbasf2型から選択される請求項1〜5のいずれか1項に記載の乳濁液。
- 前記モノマーがスチレンであり、前記無機粒子がピロリン酸マグネシウムを含み、前記ハイドロフォビンが明細書中の配列番号19(SEQ ID NO:19)で表されるものである請求項1〜6のいずれか1項に記載の乳濁液。
- 有機乳化剤又は界面活性剤を含んでいない請求項1〜7のいずれか1項に記載の乳濁液。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の乳濁液の製造方法であって、前記モノマーを、ハイドロフォビンを併用して、ピッカリング乳化剤として作用する無機粒子の存在下で、水に分散することを特徴とする方法。
- 前記乳濁液が、請求項1〜8に記載の特徴の少なくとも一つを有している請求項9に記載の方法。
- 疎水性モノマーの水乳濁液の製造においてハイドロフォビンを使用する方法。
- 前記乳濁液が、請求項1〜8に記載の特徴の少なくとも一つを有している請求項11に記載の方法。
- 疎水性モノマーを、ピッカリング乳化剤として作用する無機粒子とハイドロフォビンとを使用して、水中で懸濁重合することを特徴とする方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の乳濁液を供給材料として使用する請求項13に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の乳濁液を懸濁重合における供給材料としての使用する方法。
- 発泡剤を併用して未発泡又は既発泡の熱可塑性ポリマー粒子の製造方法であって、ポリマー粒子を請求項13に記載の方法により製造することを特徴とする方法。
- 請求項16に記載の方法により得られる未発泡又は既発泡のポリマー粒子。
- 請求項17に記載の未発泡又は既発泡のポリマー粒子を発泡体又は発泡成形体の製造に使用する方法。
- 前記ポリマー粒子がポリスチレン粒子であり、前記発泡体又は発泡成形体が発泡ポリスチレンである請求項18に記載の方法。
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