BRPI0613465A2 - emulsões de monÈmeros hidrofóbicos em água, processos para a preparação de emulsões, para a polimerização em suspensão de monÈmeros hidrofóbicos em água, e para a preparação de partìculas de polìmero termoplástico expandidas ou expansìveis, e, usos de hidrofobina, e das emulsões - Google Patents

Abstract

EMULSõES DE MONÈMEROS HIDROFóBICOS EM áGUA, PROCESSOS PARA A PREPARAçãO DE EMULSõES, PARA A POLIMERIZAçãO EM SUSPENSãO DE MONÈMEROS HIDROFóBICOS EM áGUA, E PARA A PREPARAçãO DE PERTìCULAS DE POLìMERO TERMOPLáSTICO EXPANDIDAS OU EXPANSìVEIS, E, USOS DE HIDROFOBINA, E DAS EMULSõES. A invenção refere-se às emulsões de monómeros hidrofóbicos em partículas inorgânicas, que contém água e que atuam como emulsificadores de Pickerng, e hidrofobiba, bem como à produção e ao uso destas emulsões.

Description

"EMULSÕES DE MONÔMEROS HIDROFÓBICOS EM ÁGUA, PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DE EMULSÕES, PARA A POLIMERIZAÇÃO EM SUSPENSÃO DE MONÔMEROS HIDROFÓBICOS EM ÁGUA, E PARA A PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS DE POLÍMERO TERMOPLÁSTICO EXPANDIDAS OU EXPANSÍVEIS, E, USOS DE HIDROFOBINA, E DAS EMULSÕES" Descrição

A invenção refere-se às emulsões de monômeros hidrofóbicos em água compreendendo partículas inorgânicas como emulsificadores de Pickering, e hidrofobina, e a um processo para a preparação destas emulsões, onde os monômeros estão dispersados em água na presença de partículas inorgânicas que atuam como emulsificador de Pickering, na qual hidrofobina é co-usada.

A invenção também se refere ao uso de hidrofobina na preparação de emulsões de monômeros hidrofóbicos em água, e a um processo para a polimerização em suspensão de monômeros hidrofóbicos em água com o co-uso de partículas inorgânicas como emulsificadores de

Pickering, na qual hidrofobina é co-usada.

Em adição, a invenção refere-se ao uso de emulsões como material de alimentação em uma polimerização em suspensão.

Finalmente, a invenção refere-se a um processo para produzir partículas de polímero termoplástico expandidas ou expansíveis com o co-uso de um propelente, no qual as partículas de polímero são preparadas usando o processo especificado para polimerização em suspensão, e às partículas de polímero expandidas ou expansíveis obteníveis por este processo, e ao uso destas partículas de polímero expandidas ou expansíveis para produzir espumas ou moldagens de espuma.

Emulsões de monômeros hidrofóbicos em água são usadas como material inicial, inter alia, em polimerização. Por exemplo, uma emulsão de estireno em água pode ser polimerizada por polimerização em suspensão para dar partículas de poliestireno. Se propelentes são aqui co- usados, as partículas de polímero contendo propelente são obtidas as quais são expansíveis ou expandidas dependendo das condições de temperatura e de pressão e das quais é possível, inter alia, produzir espumas e moldagens de espuma.

As emulsões de monômeros em água especificadas são em muitos casos - também como outras emulsões de óleo-em-água - estabilizadas por emulsificadores, que previnem coalescência das gotículas monoméricas distribuídas na fase aquosa. Os emulsificadores usados são normalmente compostos orgânicos, em particular tensoativos (e.g. sabões, alquil-sulfonatos, compostos de álcool graxo). Contudo, têm uma tendência para espumação, e a espuma pode tornar o manuseio da emulsão significativamente mais difícil e, por exemplo, tornar impossível o transporte usando bombas.

Os denominados emulsificadores de Pickering são conhecidos em particular da polimerização em suspensão de emulsões aquosas de monômeros, mas também de outros campos de uso. Tais emulsificadores são entendidos como significando compostos inorgânicos insolúveis em água, por exemplo pirofosfato de magnésio ou fosfato de cálcio. São usados na forma finamente distribuída na emulsão e previnem que as gotículas de monômeros de polimerização se adiram umas nas outras durante a polimerização. Possuem uma tendência muito menor para espumação e podem ser separados após a completitude da polimerização por lavagem. Contudo, a efetividade dos emulsificadores de Pickering nem sempre é satisfatória, i.e. nem sempre é possível preparar uma emulsão estável com eles. Por exemplo, a umectabilidade das partículas de emulsificador de Pickering nem sempre é tal que elas sejam interface-ativas.

DE 42 20 225 Al descreve a preparação de polímeros de estireno expansíveis como glóbulos por polimerização de estireno em suspensão aquosa com a adição de propelente, onde o estabilizador de suspensão usado é uma mistura de pirofosfato de magnésio, alquil-sulfonatos como extensor, e um carboxilato de metal alcalino-(terroso).

Hidrofobinas são proteínas pequenas de cerca de 100 a 150 aminoácidos que são características de fungos filamentosos, por exemplo Schizophyllum commune. Geralmente possuem 8 unidades de cisteína. Hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Contudo, também é possível sintetizar hidrofobinas que não ocorrem naturalmente por meio de processos de preparação química e/ou biotecnológica.

Hidrofobinas possuem uma afinidade marcante por interfaces e são portanto adequadas para revestimento de superfícies. Assim, por exemplo, Teflon® pode ser revestido por meio de hidrofobinas para dar uma superfície hidrofílica.

Hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. O depósito de pedido de patente alemã inicial de ref. DE 102005007480.4 datado de 02.17.05, que não estava publicado na data de prioridade da presente invenção, descreve um processo de preparação para hidrofobinas.

Na arte anterior, o uso de hidrofobinas tem sido proposto para várias aplicações.

WO 01/57528 descreve o revestimento de janelas, lentes de contato, biossensores, instrumentos médicos, recipientes para realização de experimentos ou para armazenagem, cascos de navios, partículas sólidas ou armações ou carroçarias de carros com uma solução compreendendo hidrofobinas em uma temperatura de 30 a 80°C.

WO 01/57066 descreve um processo específico para revestimento com hidrofobina.

WO 03/53383 descreve o uso de hidrofobina para tratamento de materiais de queratina em aplicações cosméticas.

WO 03/10331 descreve um sensor revestido com hidrofobina, por exemplo um eletrodo de medição, no qual outras substâncias, e.g. substâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas, não estão covalentemente ligadas.

WO 96/41882 propõe, nas páginas 9-10, o uso de hidrofobinas como emulsificadores, espessantes, substâncias superfície-ativas, para hidrofilização de superfícies hidrofóbicas, para melhorar a resistência à água de substratos hidrofílicos, para preparar emulsões de óleo-em-água ou emulsões de água-em-óleo. Em adição, o uso em alimentos para melhorar sua armazenabilidade, aplicações farmacêuticas, tal como a preparação de pomadas ou cremes, e também aplicações cosméticas tais como proteção de pele ou a preparação de xampus para cabelo ou enxágües para cabelo são propostos.

O objetivo foi proporcionar emulsões de monômero-em-água com uma composição alternativa. A emulsão não deve ter uma tendência para espumação e deve ser estável por várias horas, i.e. não exibir qualquer separação. Idealmente, deve ser capaz de ser polimerizada por polimerização em suspensão.

Conseqüentemente, as emulsões, os processos, os usos e as partículas de polímero especificados no início têm sido verificados. Modalidades preferidas da invenção são dadas nas reivindicações dependentes. Todas as pressões dadas são pressões absolutas. Hidrofobina

As emulsões de acordo com a invenção compreendem hidrofobina. Para os propósitos da presente invenção, o termo "hidrofobina" deve ser preferivelmente entendido como significando proteínas de fórmula estrutural geral (I)

Xn-Cl-Xi-So-C2-Xo-S-C3-Xi-Ioo-C4-Xi-Ioo-C5-Xi-So-C6-Xo-S-C7-Xi-So-C8-Xm (I)

na qual X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile3 Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Aqui, X pode em cada caso ser igual ou diferente. Os índices ao lado de X são aqui em cada caso o número de aminoácidos. C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, onde pelo menos quatro dos radicais nomeados como C são cisteína, e os índices nem, independentemente um do outro, são números naturais de O a 500, preferivelmente de 15 a 300.

Os polipeptídeos de acordo com a fórmula (I) também são caracterizados pela propriedade de que, em temperatura ambiente, após revestimento de uma superfície de vidro, acarretam um aumento no ângulo de contato de uma gota de água de pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25° e particularmente preferivelmente 30°, em cada caso comparado com o ângulo de contato de uma gota de água de tamanho idêntico com a superfície de vidro não revestida.

Os aminoácidos nomeados como C1 a C8 são preferivelmente cisteínas; contudo, também podem ser substituídos por outros aminoácidos de arranjo espacial similar, preferivelmente por alanina, serina, treonina, metionina ou glicina. Contudo, pelo menos quatro, preferivelmente pelo menos 5, particularmente preferivelmente pelo menos 6 e em particular pelo menos 7, das posições C1 a C8 devem consistir de cisteínas. Cisteínas podem estar presentes nas proteínas de acordo com a invenção quer na forma reduzida, quer na forma de pontes de dissulfeto umas com as outras. Preferência particular é dada à formação intramolecular de pontes C-C, em particular aquelas com pelo menos uma, preferivelmente 2, particularmente preferivelmente 3 e muito particularmente preferivelmente 4, pontes de dissulfeto intramoleculares. No caso da substituição descrita acima de cisteínas por aminoácidos de arranjo espacial similar, tais posições C são vantajosamente trocadas em pares que pode formar pontes de dissulfeto intramoleculares umas com as outras.

Se cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas ou treoninas também forem usadas nas posições referidas como Xi numeração das posições C individuais nas fórmulas gerais pode mudar conforme o caso.

Preferivelmente5 hidrofobinas de fórmula geral (II) Xn-C1-X3.25-C2-Xo-2-C3-X5.5o-C4-X2.35-C5-X2.i5-C6-Xo.2-C7-X3,35-C8~Xm (H)

são usadas para realizar a presente invenção, na qual X, C e os índices ao lado de X e X possuem o significado acima, mas os índices nem são, independentemente um do outro, números naturais de 0 a 300. Preferivelmente, as proteínas são adicionalmente caracterizadas pela mudança de ângulo de contato acima mencionada.

Preferência particular é dada ao uso de hidrofobinas de fórmula geral (III)

Xn-CI-X5.9-C2-C3-Xn_39-C4-X2.23-C5-X5.9-C6-C7-X6.18-C8-Xm (III)

onde X, C e os índices ao lado de X e C possuem o significado acima, os índices η e m são números de 0 a 200. Preferivelmente, as proteínas são adicionalmente caracterizadas pela mudança de ângulo de contato acima mencionada. É igualmente preferível que pelo menos 6 dos radicais nomeados como C sejam cisteína. É particularmente preferido que todos os radicais C são cisteína.

Os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeo que estão naturalmente ligadas em uma hidrofobina. Contudo, também é possível que um ou ambos os radicais sejam seqüências de peptídeo que naturalmente não estão ligadas em uma hidrofobina. Estes também são entendidos como significando aqueles radicais Xn e/ou Xm nos quais uma seqüência de peptídeo que ocorre naturalmente em uma hidrofobina seja estendida por uma seqüência de peptídeo que não ocorre naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeo que naturalmente não estão ligadas em uma hidrofobina, tais seqüências são geralmente de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 35, particularmente preferivelmente pelo menos 50 e muito particularmente preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos em comprimento. Um tal radical que naturalmente não está ligado em uma hidrofobina também será referido abaixo como parceiros de fusão. Esta expressão é intencionada para significar que as proteínas podem consistir de pelo menos uma parte de hidrofobina e um parceiro de fusão que não ocorrem juntos nesta forma na natureza.

O parceiro de fusão pode ser escolhido de um número grande de proteínas. Também é possível que uma pluralidade de parceiros de fusão sejam ligados em uma parte de hidrofobina, por exemplo na terminação amino (Xn) e na terminação carboxila (Xm) da parte de hidrofobina. Contudo, também é possível, por exemplo, que duas partes de parceiro de fusão sejam ligadas em uma posição (Xn ou Xm) da proteína de acordo com a invenção.

Partes de parceiro de fusão particularmente adequadas são proteínas que ocorrem naturalmente em microorganismos, em particular em E. coli ou BaciUus subtilis. Exemplos de tais partes de parceiro de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18), e tiorredoxina. Também são elevadamente adequados os fragmentos ou derivados destas seqüências especificadas que compreendem apenas parte, preferivelmente 70-99%, particularmente preferivelmente 80-98%, de citadas seqüências, ou nos quais aminoácidos, ou nucleotídeos individuais têm sido alterados comparados com a seqüência especificada, as percentagens dadas em cada caso referindo ao número de aminoácidos.

As proteínas usadas de acordo com a invenção também podem ser modificadas em sua seqüência de polipeptídeo, por exemplo por glicosilação, acetilação ou se não por intermédio de reticulação química, por exemplo com glutardialdeído.

Uma propriedade das proteínas usadas de acordo com a invenção é a mudança em propriedades de superfície se as superfícies estiverem revestidas com as proteínas. A mudança nas propriedades de superfície pode ser determinada experimentalmente pela medição do ângulo de contato de uma gota de água antes e após o revestimento da superfície com a proteína e calculando a diferença entre as duas medições.

O procedimento de medição de ângulos de contato é em princípio conhecido pela pessoa experiente na arte. As medições referem-se à temperatura ambiente e às gotas de água de 5 Ul As condições experimentais precisas para um método, adequado por meio de exemplo, para medição de ângulo de contato são declaradas na seção experimental. Sob as condições aqui especificadas, as proteínas usadas de acordo com a invenção possuem a propriedade para aumentar o ângulo de contato em pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25°, particularmente preferivelmente pelo menos30°, em cada caso comparado com o ângulo de contato de uma gota de água idêntica em tamanho com a superfície de vidro não revestida.

Na parte de hidrofobina das hidrofobinas conhecidas até agora as posições de aminoácidos polares e não-polares estão preservadas, o que é evidente de uma plotagem de hidrofobicidade característica. Diferenças nas propriedades biofísicas e na hidrofobicidade levaram à classificação de hidrofobinas até agora conhecidas em duas classes, I e II (Wessels et ai. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

As membranas montadas de hidrofobinas de classe I são em uma grande extensão insolúveis (até mesmo em dodecil-sulfato de Na (SDS)1% em temperatura elevada) e podem ser apenas dissociadas de novo usando ácido trifluoro-acético (TFA) concentrado, ou ácido fórmico. Em contraste com isto, as formas montadas de hidrofobinas de classe II são menos estáveis. Podem ser dissolvidas de novo usando apenas etanol de concentração 60%, ou SDS 1% (na temperatura ambiente).

Uma comparação das seqüências de aminoácidos mostra que o comprimento da região entre cisteína C3 e C4 no caso de hidrofobinas de classe II é significativamente mais curto do que no caso de hidrofobinas de classe I. Hidrofobinas de classe II também possuem aminoácidos mais carregados do que as de classe I.

Hidrofobinas particularmente preferidas para realizar a presente invenção são as hidrofobinas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl e basf2, que são caracterizadas estruturalmente no protocolo de seqüências que segue. Estas também podem ser apenas partes ou derivados delas. Também é possível que duas ou mais partes de hidrofobina, preferivelmente 2 ou 3, de estrutura idêntica ou diferente sejam ligadas juntas e ligadas em uma seqüência de polipeptídeo adequada correspondente que naturalmente não está ligada em uma hidrofobina.

De adequabilidade particular para realizar a presente invenção também são as proteínas de fusão com as seqüências de polipeptídeo mostradas em SEQ ID NO: 20, 22, 24, e as seqüências de ácido nucleico que codificam estas, em particular as seqüências de acordo com SEQ ID NO: 19, 21, 23. Proteínas que resultam partindo das seqüências de polipeptídeo mostradas em SEQID NO: 22, 22 ou 24 como um resultado de troca, inserção ou deleção de pelo menos um, até 10, preferivelmente 5, particularmente preferivelmente 5%, de todos os aminoácidos e que ainda possuem pelo menos 50% da propriedade biológica também são modalidades particularmente preferidas. Propriedade biológica das proteínas é aqui entendida como significando o aumento no ângulo de contato em pelo menos 20° como já descrito.

A hidrofobina é preferivelmente usada em uma quantidade de 20 a 150, em particular 30 a 100 e particularmente preferivelmente 40 a 90 ppmp (partes por milhão em peso), baseado na quantidade total de emulsão. Para estireno como monômero, a quantidade de hidrofobina é, por exemplo, 20 a 100, em particular 40 a 90, ppmp, baseado na emulsão.

A hidrofobina pode ser adicionada na emulsão como tal, ou na forma dissolvida ou dispersada em um solvente ou dispersante. Um solvente ou dispersante adequado é água. O conteúdo de hidrofobina de uma tal solução ou dispersão é geralmente de 0,3 a 1,2, preferivelmente 0,35 a 0,5% em peso. Preferivelmente, a hidrofobina é adicionada na forma de uma solução aquosa.

Preparação da hidrofobina

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção podem ser preparadas quimicamente por processos conhecidos de síntese de peptídeo, por exemplo por síntese em fase sólida de acordo com Merrifield.

Hidrofobinas naturalmente ocorrentes podem ser isoladas de fontes naturais usando métodos adequadas. Por meio de exemplo, referência pode ser aqui feita a Wosten et al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO 96/41882.

Proteínas de fusão podem ser preferivelmente preparadas por processos de engenharia genética nos quais uma seqüência de ácido nucleico que codifica o parceiro de fusão e uma seqüência de ácido nucleico que codifica a parte de hidrofobina, em particular seqüência de DNA, são combinadas de modo que a proteína desejada seja gerada em um organismo hospedeiro por intermédio de expressão de gene da seqüência de ácido nucleico combinada. Um tal processo de preparação é descrito em nosso depósito de pedido inicial de ref. DE 102005007480.4 mencionado no início.

Organismos hospedeiros adequados (organismos de produção) para o processo de preparação especificado podem ser aqui procariotos (incluindo os Archaea) ou eucariotos, em particular bactérias incluindo halobactérias e metanococos, fungos, células de inseto, células de planta e células de mamífero, particularmente preferivelmente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacillae, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas) etc.

Também é possível usar construtos de expressão compreendendo seqüências de ácido nucleico reguladoras sob controle genético, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo usado de acordo com a invenção, e também vetores compreendendo pelo menos um destes construtos de expressão.

Preferivelmente, construtos usados compreendem um promotor 5-a montante da seqüência codificadora particular e uma seqüência de terminador 3'-a jusante, e, se apropriados, outros elementos reguladores costumeiros, em cada caso operativamente ligados na seqüência codificadora.

Uma "ligação operativa" é entendida como significando o arranjo seqüencial de promotor, seqüência codificadora, terminador e, se apropriados, outros elementos reguladores em um tal modo que cada um dos elementos reguladores pode realizar sua função como intencionada durante a expressão da seqüência codificadora.

Exemplos de seqüências operativamente ligáveis são seqüências selecionadas ou intensifícadores, sinais de poliadenilação e semelhantes. Outros elementos reguladores compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e semelhante. Seqüências reguladoras adequadas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990).

Em adição a estas seqüências de regulação, a regulação natural destas seqüências ainda pode estar presente antes dos genes estruturais reais e, se apropriado, têm sido geneticamente modificadas de modo que a regulação natural tenha sido desligada e a expressão dos genes tenha sido aumentada.

Um construto de ácido nucleico preferido vantajosamente também compreende uma ou mais de seqüências de "intensificador" já mencionadas, funcionalmente ligadas no promotor, que permite expressão aumentada da seqüência de ácido nucleico. Seqüências vantajosas adicionais, tais como outros terminadores ou elementos regulatórios, também podem ser inseridas na extremidade-3' das seqüências de DNA.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes em uma ou mais cópias no construto. No construto, outros marcadores, tais como genes complementando resistências a antibiótico ou auxótrofos, se apropriados para seleção sobre o construto, também podem estar presentes.

Seqüências de regulação vantajosas para o processo estão presentes, por exemplo, em promotores tais como promotores cos, tac, trp, tet, trp, tet, Ipp, lac, Ipp, lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou imlambda-P, que são vantajosamente usadas em bactérias gram-negativas. Outras seqüências de regulação vantajosas estão presentes, por exemplo, nos promotores gram-positivos amy e SP02, nos promotores de fungos ou de levedura ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Também é possível usar promotores artificiais para a

regulação.

Para expressão em um organismo hospedeiro, o construto de ácido nucleico é vantajosamente inserido em um vetor, tal como, por exemplo, um plasmídeo ou fago, que permite expressão ótima dos genes no hospedeiro. À parte dos plasmídeos e fagos, vetores também são entendidos como significando todos os outros vetores conhecidos pela pessoa experiente na arte, assim e.g. vírus, tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular, e também o sistema agrobacterium.

Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou serem cromossomicamente replicados. Estes vetores representam uma outra modalidade da invenção. Plasmídeos adequados estão, por exemplo, em E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, ρΙΝ-ΙΙΓ'3-Bl, tgtll ou pBdCI, em estreptomices plJlOl, pIJ364, plJ702 or plJ361, em bacilo pUBllO, pC194 ou pBD214, em corinebactéria pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl, plL2 ou pBBlló, em leveduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos especificados representam uma seleção pequena dos plasmídeos possíveis. Outros plasmídeos são conhecidos pela pessoa experiente na arte e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et ai. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018).

Vantajosamente5 o construto de ácido nucleico para expressão de outros genes presentes adicionalmente também compreende seqüências regulatórias 3'- e/ou 5'-terminais para aumentar a expressão que são escolhidas para expressão ótima dependendo do organismo hospedeiro e do gene ou dos genes escolhidos.

Estas seqüências regulatórias devem permitir a expressão selecionada dos genes e a expressão de proteína. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expressado ou sobreexpressado apenas após indução, ou que ele é expressado e/ou sobreexpressado imediatamente.

Os fatores e seqüências regulatórias podem ter aqui preferivelmente uma influência positiva, e deste modo aumentar, a expressão de gene dos genes inseridos. Assim, um aumento nos elementos regulatórios pode vantajosamente ocorrer em nível de transcrição pelo uso de sinais de transcrição fortes tais como promotores e/ou "intensificadores". Em adição, contudo, um aumento na tradução também é possível, por exemplo, pela melhoria da estabilidade do mRNA.

Em uma outra modalidade do vetor, o vetor compreendendo o construto de ácido nucleico ou o ácido nucleico também pode ser vantajosamente inserido nos microorganismos na forma de um DNA linear e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro via recombinação heteróloga ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de um vetor linearizado tal como um plasmídeo ou apenas do construto de ácido nucleico ou o ácido nucleico.

Para expressão ótima de genes heterólogos em organismos, é vantajoso modificar as seqüências de ácido nucleico para corresponderem ao "uso de códon" específico utilizado no organismo. O "uso de códon" pode ser determinado facilmente usando avaliações de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

Um cassete de expressão é preparado pela fusão de um promotor adequado com uma seqüência de nucleotídeos codificadora adequada e um terminador ou sinal de poliadenilação. Para este propósito, é feito uso de técnicas recombinantes e de clonagem costumeiras, como descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory5 Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

Para expressão em um organismo hospedeiro adequado, o construto de gene ou construto de ácido nucleico recombinante é vantajosamente inserido em um vetor hospedeiro-específico que permite expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores são bem conhecidos pela pessoa experiente na arte e podem ser encontrados, por exemplo, em "Cloning Vectors" (Pouwels Ρ. H. et al., Ed. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Com o auxílio dos vetores é possível preparar microorganismos recombinantes que são, por exemplo, transformados com pelo menos um vetor e podem ser usados para produzir as proteínas usadas de acordo com a invenção. Os construtos recombinantes descritos acima são vantajosamente inseridos em um sistema hospedeiro adequado e expressados. Nesta conexão, preferência é dada ao uso de métodos de transfecção e de clonagem costumeiros conhecidos pela pessoa experiente ná arte, tais como, por exemplo, coprecipitação, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e semelhante, com o objetivo de fazer com que ácidos nucleicos específicos sejam expressados no sistema de expressão particular. Sistemas adequados são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biologys F. Ausubel et al., Ed. Wiley Interscience5 New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar microorganismos homogeneamente recombinantes. Para este propósito é preparado um vetor que compreende pelo menos uma seção de um gene a ser usado acordo com a invenção ou de uma seqüência codificadora na qual, se apropriado, pelo menos uma substituição, adição ou deleção de aminoácido tem sido introduzida com o objetivo de modificar, e.g. funcionalmente interromper, a seqüência (vetor "nocauteador"). A seqüência inserida pode, por exemplo, também ser um homólogo de um microorganismo relacionado ou ser derivada de uma fonte de mamífero, fonte de levedura ou fonte de inseto. O vetor usado para a recombinação homóloga pode ser alternativamente projetado em uma tal maneira que o gene endógeno seja mutado ou modificado em algum outro modo durante a recombinação homóloga, mas ainda codifique a proteína funcional (e.g. se a região regulatória a montante puder ser modificada em uma tal maneira que a expressão da proteína endógena for modificada como um resultado). A seção modificada do gene usado de acordo com a invenção está no vetor de recombinação homóloga. A construção de vetores adequados para a recombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, Κ. R. e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Organismos hospedeiros recombinantes adequados para o ácido nucleico usado de acordo com a invenção ou o construto de ácido nucleico são em princípio todos os organismos procarióticos ou eucarióticos.

Os organismos hospedeiros usados são vantajosamente microorganismos tais como bactérias, fungos ou leveduras. Bactérias gram-positivas ou gram- negativas são vantajosamente usadas, preferivelmente bactérias das famílias enterobacteriaceae, pseudomonadaceae, rhizobiaceae, streptomycetaceae ou nocardiaceae, particularmente preferivelmente bactérias dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderi a, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus.

Os organismos usados no processo de preparação para proteínas de fusão são crescidos ou cultivados na maneira conhecida pela pessoa experiente na arte dependendo do organismo hospedeiro. Microorganismos são geralmente crescidos em um meio líquido que compreende uma fonte de carbono em sua maioria na forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio em sua maioria na forma de fontes de nitrogênio orgânico tais como extrato de levedo ou sais tal como sulfato de amônio, elementos traço tais como sais de ferro, sais de manganês e sais de magnésio, e, se apropriadas, vitaminas, em temperaturas entre 0 e 100°C, preferivelmente entre 10 e 60°C sob oxigênio. Aqui, o pH do líquido nutriente pode ser mantido em um valor fixo, i.e. ser regulado ou não regulado durante o cultivo. O cultivo pode ser em batelada, semi-batelada ou contínuo. Substâncias nutrientes podem ser inicialmente introduzidas no início da fermentação ou podem ser alimentadas posteriormente semi-contínua ou continuamente. As enzimas podem ser isoladas dos organismos pelo processo descrito nos exemplos ou serem usadas como extrato bruto para a reação.

Proteínas usadas de acordo com a invenção ou seus fragmentos funcional, biologicamente ativos podem ser preparadas por meio de um processo recombinante no qual um microorganismo produtor de proteína é cultivado, se apropriado expressão das proteínas é induzida e estas proteínas são isoladas da cultura. As proteínas podem assim também serem produzidas em uma escala industrial se desejado. O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por processos conhecidos. Bactérias podem ser multiplicadas, por exemplo, em meio TB ou LB e em uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Especificamente, condições de cultivo adequadas são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se as proteínas usadas de acordo com a invenção não são secretadas para dentro do meio de cultura, as células são então rompidas e o produto é obtido do lisado por processos de isolamento de proteína conhecidos. As células podem ser rompidas como desejado por ultra-som de freqüência alta, por pressão elevada, tal como, por exemplo em uma célula de pressão French, por osmose, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por homogeneizadores ou pela combinação de dois ou mais dos processos listados.

Purificação das proteínas usadas de acordo com a invenção pode ser alcançada usando métodos cromatográficos conhecidos, tal como cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), tal como cromatografia em Q-sepharose, cromatografia de troca iônica e cromatografia hidrofóbica, e com outros métodos costumeiros, tais como ultrafiltração, cristalização, separação por salgação, diálise e eletroforese em gel nativo. Métodos adequados são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Métodos de Trabalho Bioquímico], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Pode ser vantajoso, para o isolamento da proteína recombinante, o uso de sistemas de vetor ou de oligonucleotídeos que estendem o cDNA por certas seqüências de nucleotídeos e assim codificam proteínas modificadas ou proteínas de fusão que servem, por exemplo, para purificação mais fácil. Tais modificações adequadas compreendem as denominadas "etiquetas" atuando como âncoras, tais como, por exemplo, a modificação conhecida como âncora de hexa-histidina, ou epitopos que podem ser reconhecidos como antígenos por anticorpos (descrito, por exemplo, em Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (Ν. Y.) Press). Outras etiquetas adequadas são, por exemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, esteptavidina- BD Avi Tag, Flag Tag, T7 etc. Estas âncoras podem servir para ligar as proteínas em um suporte fixado, tal como, por exemplo, uma matriz de polímero, que pode ser empacotada em uma coluna de cromatografia, ou pode ser usada sobre uma placa de microtítulo ou outro suporte. Os protocolos de purificação correspondentes estão disponíveis nos fornecedores comerciais de etiqueta de afinidade.

As proteínas preparadas como descrito podem ser quer usadas diretamente como proteínas de fusão ou se não após clivagem e separação do parceiro de fusão como hidrofobinas "puras". Se separação dos parceiros de fusão é intencionada, é

aconselhável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio de reconhecimento específico para proteases) na proteína de fusão entre a parte de hidrofobina e a parte de parceiro de fusão. Tais sítios de clivagem são, em particular, aquelas seqüências de peptídeo que de outro modo não ocorreriam na parte de hidrofobina nem na parte de parceiro de fusão, que podem ser determinados facilmente usando ferramentas de bioinformática. De adequabilidade particular são, por exemplo clivagem por BrCN em metionina, ou clivagem mediada por protease com fator Xa, enterocinase, trombina, clivagem por TEV (protease do vírus etch do tabaco). Monômeros

Monômeros adequados para a emulsão de acordo com a invenção são em princípio todos os monômeros hidrofóbicos. Aqui5 hidrofóbico significa que quando os monômeros são combinados com água, duas fases se formam, i.e. os monômeros não são miscíveis com água ou são miscíveis apenas em uma extensão pequena.

Preferivelmente, o monômero é estireno, sendo possível, se apropriado, co-usar comonômeros em quantidades de até 50% em peso, baseado na quantidade total de monômero. Tais comonômeros são, por exemplo, α-metil-estireno, estirenos de anel halogenado, estirenos de anel alquilado, acrilonitrila, ésteres de ácido acrílico ou de ácido metacrílico de alcoóis possuindo 1 a 8 átomos de carbono, N-vinil-compostos, tal como vinil-carbazol e também quantidades pequenas de compostos com duas ligações duplas polimerizáveis, e.g. butadieno, divinil-benzeno ou diacrilato de butanodiol. Preferência muito particular é dada ao próprio estireno.

Conseqüentemente, as emulsões de acordo com a invenção são preferivelmente notáveis pelo fato de que o monômero é estireno, sendo possível co-usar comonômeros que são escolhidos de a-metil-estireno, estirenos de anel halogenado, estirenos de anel alquilado, acrilonitrila, ésteres de ácido acrílico ou de ácido metacrílico de Ci_8-alcoóis, N-vinil-compostos, butadieno, divinil-benzeno ou diacrilato de butanodiol.

A razão em volume de monômero para água na emulsão de acordo com a invenção (razão em volume de fase) depende, inter alia, do monômero usado e é geralmente 0,75: 1 a 1,5: 1, em particular 0,9: 1 a 1,4: 1 e particularmente preferivelmente 1: 1 a 1,4: 1. Para estireno como monômero, a razão em volume de estireno para água é, por exemplo, 1:1a 1,5: 1, preferivelmente 1,1: 1 a 1,4: 1 e em particular 1,2: 1 a 1,3: 1.

Partículas inorgânicas

De acordo com a invenção, a emulsão compreende partículas inorgânicas como emulsificadores de Pickering. Tais partículas são conhecidas, por exemplo de Aveyard et al.s Adv. ColL Interf. Sei. 100-102 (2003), 503-546.

As partículas inorgânicas são preferivelmente escolhidas de partículas compreendendo pirofosfato de magnésio (MPP)s sulfato de bário, óxido de zinco e fosfato de cálcio. Destas, partículas compreendendo pirofosfato de magnésio são preferidas, em particular para estireno como monômero.

Estas partículas (emulsificadores de Pickering) são preparadas pelas reações costumeiras de química inorgânica, i.e. por exemplo por precipitação de uma solução ou por reações no estado sólido. Preferivelmente, as partículas são preparadas diretamente antes do uso por combinação de soluções aquosas adequadas ou pela adição de uma solução aquosa em um sólido, em cujo caso as partículas precipitam-se como composto parcamente solúvel.

Por exemplo, partículas de MPP podem ser preparadas por combinação de uma solução aquosa de um pirofosfato de metal alcalino com pelo menos a quantidade estequiometricamente requerida de um sal de magnésio, sendo possível que o sal de magnésio esteja na forma sólida ou em solução aquosa. O MPP é particularmente preferivelmente preparado por combinação de soluções aquosas de pirofosfato de sódio (Na4P2O7) e sulfato de magnésio (MgSO4 · 7 H2O). Preferência é dada à introdução inicial de pirofosfato de sódio dissolvido e adição de solução de sulfato de magnésio. O sal de magnésio é adicionado em pelo menos na quantidade estequiometricamente requerida. Em particular, não deve estar presente excesso de pirofosfato de metal alcalino.

O MPP é particularmente preferivelmente não preparado na presença da quantidade total de fase aquosa da emulsão. E vantajoso o uso de menos da metade da quantidade total de água usada para preparar a emulsão. Por exemplo, uma solução de sulfato de magnésio de concentração de aproximadamente de 20% em peso pode ser adicionada em uma solução de pirofosfato de sódio de concentração de aproximadamente 3% em peso. Outros detalhes são dados em DE 42 20 225 Al.

O tamanho de partícula das partículas inorgânicas

(emulsificadores de Pickering) é controlado pelas condições de precipitação e é normalmente de 10 nm a 10 μπι, preferivelmente 10 nm a 1 μηι e particularmente preferivelmente 20 a 100 nm, expressado como diâmetro de partícula numérico médio d5o (em cada caso 50% das partículas são menores 1 ou maiores do que o diâmetro d50). Preferivelmente, as partículas possuem uma forma não-esférica.

As partículas inorgânicas são geralmente usadas em uma quantidade de 500 a 1.000, preferivelmente 600 a 900 e em particular 700 a800 ppmp, baseado na emulsão. Para estireno como monômero, a quantidade é, por exemplo, normalmente 600 a 900, preferivelmente 700 a 800 ppmp, baseado na emulsão.

As partículas inorgânicas podem ser adicionadas na emulsão como tais, ou preferivelmente são suspensas em um agente de suspensão. Um agente de suspensão adequado é água. Preferência é dada ao uso direto de suspensão aquosa obtida durante a preparação das partículas. Uma tal suspensão compreende, por exemplo, 1 a 2% em peso, preferivelmente 1,7 a1,9% em peso, de partículas. O uso de uma suspensão recém-preparada é particularmente preferido. Outros constituintes da emulsão Além de água, monômeros, partículas inorgânicas

(emulsificadores de Pickering) e hidrofobina, a emulsão de acordo com a invenção também pode compreender outros constituintes.

Por exemplo, um propelente pode ser adicionado se a emulsão de acordo com a invenção for para ser submetida a uma polimerização e partículas de polímero expandidas ou expansíveis, contendo propelente forem para serem preparadas no processo. Propelentes adequados são, em particular, propelentes físicos, tais como dióxido de carbono, hidrocarbonetos alifáticos possuindo 2 a 7 átomos de carbono, alcoóis, cetonas, éteres, hidrocarbonetos halogenados ou água, ou suas misturas. Se, por exemplo, uma emulsão de estireno-em-água for para ser polimerizada para dar partículas de poliestireno contendo propelente, preferência será dada ao uso de propano, isobutano, n- butano, isopentano, neopentano, n-pentano, hexano, dióxido de carbono e suas misturas.

Se um propelente for adicionado, sua quantidade será normalmente de 1 a 10% em peso, preferiveímente 3 a 8% em peso, baseado na quantidade de monômero.

Contudo, não é absolutamente necessário adicionar um propelente porque, como é sabido, partículas de polímero contendo propelente também podem ser preparadas por outros processos, por exemplo por impregnação das partículas de polímero acabadas com o propelente sob pressão aumentada e temperatura elevada, durante o qual o propelente se difunde para dentro das partículas amolecidas, ou no denominado processo de extrusão por misturação do propelente em uma massa fundida de polímero em um extrusor, e granulação da massa fundida descarregada.

Além disso, outros aditivos costumeiros podem ser adicionados na emulsão, e.g. agentes nucleantes, plastificantes, retardantes de chama, antiestáticos, absorvedores de UV, absorvedores de IV tais como grafite e fuligem, pó de alumínio, pigmentos e corantes solúveis e insolúveis. Os aditivos são usados nas quantidades costumeiras para este propósito. Agentes nucleantes adequados no caso de estireno como monômero ou poliestireno como partículas de polímero são, por exemplo, talco e/ou ceras, e também fuligem, grafite e sílicas vaporizadas, em quantidades, no total, de 0,05 a 30% em peso, baseado na quantidade de monômero. Plastificantes preferidos são óleos minerais, polímeros de estireno oligoméricos e ftalatos em quantidades, no total, de 0,05 a 10% em peso, baseado na quantidade de monômero.

Contudo, também é possível não adicionar estes aditivos na emulsão, mas apenas em um tempo mais tarde, por exemplo nas partículas de

polímero obtidas.

Além disso, a emulsão pode compreender outros emulsificadores orgânicos( tensoativos), e.g. alquil-sulfonatos. Estes incluem sais de metal alcalino de ácido dodecil-benzeno-sulfônico ou sais de metal alcalino de uma mistura de ácidos C12-i7-alquil-sulfônicos, e.g. uma mistura de alquil-sulfonatos de sódio predominantemente secundários de comprimento de cadeia médio de Ci5 que compreende até 0,2% em peso de cloro organicamente ligado (produto comercial Mersolat® K30 da Bayer). Contudo, tais outros emulsificadores orgânicos são preferivelmente não co- usados para prevenir espumação indesejada da emulsão.

Conseqüentemente, as emulsões de acordo com a invenção preferivelmente não compreendem emulsificadores ou tensoativos orgânicos.

Preparação da emulsão

A emulsão é preparada em batelada ou continuamente na maneira normal por misturarão juntos (dispersando) água, monômero, emulsificadores de Pickering, hidrofobina e, se apropriados, outros constituintes. No processo, os materiais de alimentação podem ser adicionados juntos ou separadamente uns dos outros, em um instante único ou sucessivamente, em uma porção, em batelada ou em várias porções ou continuamente de acordo com uma função matemática, sendo possível que esta função seja, por exemplo, linear, crescente, decrescente, exponencial ou - graduada.

Preferivelmente, a hidrofobina é inicialmente introduzida como solução e o emulsificador de Pickering - preferivelmente como suspensão aquosa recém-preparada - é adicionado; então, se requerida, água é adicionada com o objetivo de estabelecer a razão de monômero/água, e finalmente o monômero é adicionado. A mistura obtida é misturada.

A misturarão é realizada em uma maneira per se conhecida, e.g. por agitação, vascolejamento ou misturação turbulenta. Dependendo do tipo e da quantidade de materiais de alimentação usados e do diâmetro desejado das gotículas de monômero na emulsão, agitadores simples (e.g. agitador magnético, agitador de pás, etc.) podem ser suficientes, que são operados a 500 a 1.000, preferivelmente 600 a 800, revoluções por minuto (rpm). Contudo, também é possível usar agitadores de velocidade alta, que são tipicamente operados a de 6.000 a 10.000, em particular 9.000 a 10.000 rpm, e.g. o Ultra-Turrax® de IKA.

Alternativamente, também é possível misturar por outras operações de misturação, por exemplo por pulverização do monômero para dentro de água ou vice versa, por vibrações e cavitação na mistura (e.g. ultra- som), por centrífugas de emulsificação, moinhos coloidais ou homogeneizadores

Misturação pode ser realizada em qualquer recipiente adequado para este propósito, no caso mas simples este é um reator agitado ou frasco de fundo redondo. Cascatas de reatores agitados, reatores tubulares, misturadores dinâmicos ou estáticos também podem ser usados. Se requeridos disruptores de fluxo podem ser acoplados com o objetivo de melhorar a misturação.

O tempo de misturação para uma entrada de energia baixa é na maioria dos casos de 1 a 20 horas, preferivelmente 5 a 15 horas. No caso de uma entrada de energia alta, a misturação geralmente dura 60 a 300 s, preferivelmente 60 a 120 s. A temperatura durante a preparação da emulsão é normalmente de 20 a 80°C, preferivelmente 20 a 25°C; a pressão é normalmente de 100 a 300 kPa, preferivelmente 100 a 200 kPa. Particularmente no caso de monômeros com um ponto de ebulição baixo ou pressão de vapor alta, também pode ser sensível ao trabalho em temperaturas mais baixas e/ou pressões mais altas.

Tempo, temperatura e pressão de misturação são governados, inter alia, pelo tipo e pela quantidade de materiais de alimentação usados e pelo diâmetro de gotícula de monômero desejado.

Propriedades da emulsão e outros temas da invenção

A emulsão de acordo com a invenção consiste de água como fase contínua e as gotículas de monômero como fase dispersada. O diâmetro das gotículas de monômero pode variar dentro de limites amplos dependendo do tipo e da quantidade de materiais de alimentação e das condições durante misturação e é normalmente de 100 a 2.000 μπι, preferivelmente 800 a 1.200 μπα, particularmente preferivelmente 900 a 1.000 μπι, expressado como diâmetro de gotícula numérico médio d50 (em cada caso 50% das partículas são menores ou maiores do que o diâmetro d50).

As emulsões são estáveis sobre um período prolongado, e.g. várias horas, e não possuem uma tendência para formação de espuma.

Em uma modalidade preferida, as emulsões de acordo com a invenção são notáveis pelo fato de que o monômero é estireno, as partículas inorgânicas compreendem pirofosfato de magnésio e a hidrofobina é uma descrita nesta descrição em SEQ ID NO: 19.

A invenção também proporciona o processo acima descrito para a preparação das emulsões de acordo com a invenção, onde os monômeros são dispersados em água na presença de partículas inorgânicas que atuam como emulsificador de Pickering, no qual hidrofobina é co-usada.

Preferivelmente, este processo é notável pelo fato de que a emulsão possui pelo menos uma das características das reivindicações 1 a 8.

A invenção adicionalmente proporciona o uso de hidrofobina na preparação de emulsões de monômeros hidrofóbicos em água. Este uso é preferivelmente notável pelo fato de que a emulsão possui pelo menos uma das características das reivindicações 1 a 8.

Polimerizacão em suspensão para dar partículas de polímero

Já tem sido mencionado no início que as emulsões de acordo com a invenção podem ser usadas como material de alimentação em uma polimerização em suspensão. Este uso é igualmente proporcionado pela invenção.

A invenção também compreende um processo para a polimerização em suspensão de monômeros hidrofóbicos em água com o co- uso de partículas inorgânicas como emulsificadores de Pickering, nos quais hidrofobina é co-usada. Este processo é preferivelmente notável pelo fato de que o material de alimentação usado é uma emulsão de acordo com a invenção como definido nas reivindicações 1 a 8.

Processos para polimerização em suspensão são conhecidos pela pessoa experiente na arte, e.g. do Kunststoff-Handbuch [Manual de Plásticos], volume V Polystyrene, Hanser-Verlag Munich. Como uma regra, iniciadores de polimerização costumeiros que são solúveis nos monômeros são usados. Tais iniciadores são, por exemplo, compostos solúveis em estireno tais como perbenzoato de terc-butila ou peróxido de dibenzoíla. São normalmente usados em quantidades de 0,001 a 10% em peso, baseado na quantidade de monômero.

Além disso, reguladores de peso molecular tais como terc- dodecil-mercaptano ou α-metil-estireno dimérico podem ser co-usados, normalmente em quantidades de 0,001 a 0,01% em peso, baseado nos monômeros. Colóides protetores costumeiros também podem ser usados, por exemplo derivados de celulose, poli(vinil-alcoóis), poli(ácidos acrílicos), poliacrilamidas ou poli(vinil-pirrolidonas). São usados em quantidades costumeiras. Contudo, preferivelmente tais colóides protetores não são co- usados. A temperatura durante a polimerização em suspensão é normalmente de 0 a 200°C, preferivelmente 50 a 150°C. A pressão é geralmente de 0,01 kPa a 5.000 kPa, preferivelmente 80 kPa a 2.000 kPa.

No curso da polimerização em suspensão, as gotículas de monômero (em sua maior parte líquidas) polimerizam-se para darem partículas de monômero (normalmente sólidas), e uma suspensão de partículas de polímero em água é obtida. O tamanho de partícula das partículas de polímero depende, inter alia, do tamanho de gotícula de monômero e é geralmente de 800 a 2.000 μηι, preferivelmente 900 a 1.100 μηι, expressado como diâmetro de gotícula numérico médio d50 (em cada caso50% das partículas são menores ou maiores do que o diâmetro d50).

Durante a polimerização em suspensão, um propelente pode ser co-usado para preparar partículas de polímero contendo propelente, para tipo e quantidade veja acima. Para isto, a polimerização ocorre em pressão aumentada, i.e. acima de 100 kPa a 5.000 kPa, e em temperaturas de, por exemplo, 50 a 150°C. Alternativamente, a polimerização também pode ser primeiro realizada sem propelentes e então, em uma segunda etapa, a suspensão das partículas de polímero resultantes pode ser submetida à pressão aumentada e à temperatura elevada. Sob as condições de temperatura e pressão especificadas, o

propelente adicionado se difunde para dentro das partículas de polímero. Se a suspensão obtida é esfriada sob pressão de modo que o propelente não pode ser expandido dentro das partículas, então são obtidas partículas de polímero expansíveis. Se a suspensão de partículas aquecida é decomposta repentinamente, o propelente se expande para dentro das partículas amolecidas e partículas expandidas são obtidas. Conseqüentemente, as partículas de polímero podem ser expansíveis ou expandidas dependendo do procedimento.

A invenção portanto também proporciona um processo para a preparação de partículas de polímero termoplástico expandidas ou expansíveis com co-uso de um propelente, no qual as partículas de polímero são preparadas usando o processo especificado para polimerização em suspensão.

As partículas de polímero expandidas ou expansíveis obteníveis por este processo são igualmente proporcionadas pela invenção. Destas, é possível, por exemplo, preparar espumas (denominadas espumas de partículas) ou moldagens de espuma. O procedimento é conhecido; para preparar poliestireno expandido (Styropor®), é possível, por exemplo, primeiro parcialmente expandir as partículas de poliestireno contendo propelente, expansíveis de acordo com a invenção por aquecimento no denominado pré-esponjamento. No subseqüente denominado esponjamento total, as partículas de poliestireno parcialmente expandidas são derramadas dentro de um molde proporcionado com orifícios finos, o molde é fechado e, por injeção de vapor ou em outro modo, as partículas são expandidas, durante o qual elas se soldam juntas umas nas outras para darem a espuma ou para

darem a moldagem de espuma acabada.

A invenção portanto também proporciona o uso de partículas

de polímero expandida ou expansíveis de acordo com a invenção para produzir espumas ou moldagens de espuma. Em particular, preferência é dada ao uso de partículas de poliestireno expandidas ou expansíveis de acordo com a invenção para produzir poliestireno expandido como espuma ou moldagem de espuma, i.e. um uso no qual as partículas de polímero são partículas de poliestireno e a espuma ou moldagem de espuma é poliestireno expandido. Exemplos

Parte A: Preparação e teste das hidrofobinas usadas de acordo com a invenção Exemplo 1: Trabalho preliminar para a clonagem de Vaad-Hisfi / VaaE-His6

Usando os oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal573), uma reação em cadeia de polimerase foi realizada. DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis foi usado como DNA modelo. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificadora do gene yaaD / yaaE de Bacillus subtilis, e nas extremidades em cada caso um sítio de restrição NcoI ou BglII. 0 fragmento de PCR foi purificado e clivado com as endonucleases de restrição NcoI e BgUL Este fragmento de DNA foi usado como inserto, e clonado no vetor pQEÓO de Qiagen antes linearizado com as endonucleases de restrição NcoI e BglII. Os vetores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 obtidos nesta maneira podem ser usados para a expressão de proteínas consistindo de YAAD::HIS6 ou YAAE::HIS6.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571: gcagatctceagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Exemplo 2: Clonagem de vaad-hidrofobina DewA-Hisfi

Usando os oligonucleotídeos KaM 416 e KaM 417, uma reação em cadeia de polimerase foi realizada. DNA genômico do bolor Aspergillus nidulans foi usado como DNA modelo. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificadora do gene de hidrofobina dewA e um sítio de clivagem de fator Xa proteinase N-terminal. O fragmento de PCR foi purificado e clivado com a endonuclease de restrição BamHI. Este fragmento de DNA foi usado como inserto, e clonado no vetor pQE60YAAD#2 antes linearizado com a endonuclease de restrição BglII.

O vetor #508 produzido nesta maneira pode ser usado para a expressão de uma proteína de fusão consistindo de YAAD::Xa::dewA::HIS6. KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT

CCGC

Exemplo 3: Clonagem de vaad-hidrofobina RodA-Hisf;

Plasmídeo #513 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508 usando os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435. KaM434:

GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM43 5: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Fxemplo 4: Clonagem de vaad-hidrofobina BASFl-Hisfi

Plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508

usando os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

Uma seqüência de DNA artificialmente sintetizada -

hidrofobina BASFl - foi usada como DNA modelo (veja anexo).

KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT

CCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Fxemplo 5: Clonagem de vaad-hidrofobina BASF2-His6 Plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508

usando os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

Uma seqüência de DNA artificialmente sintetizada -

hidrofobina BASF2 - foi usada como DNA modelo (veja anexo). KaM417:

CCCGT AGCT AGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT

CCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Fxemplo 6: Clonagem de vaad-hidrofobina SC3-His6

O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo

#508 usando os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.

cDNA de Schyzophyllum commune foi usado como DNA

modelo (veja anexo).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Rxemplo 7: Fermentação de cepa recombinante de E. coli expressando yaad-

hidrofobina DewA-Hisfi

Inoculação de 3 ml de meio líquido LB com uma cepa de E.

coli expressando yaad-hidrofobina DewA-His6 em tubos Greiner de 15 ml.

Incubação por 8 h a 37°C sobre um vascolejador a 200 rpm. Cada um de 2

frascos Erlenmeyer de 11 com defletores e 250 mL de meio LB (+ 100 Mg/ml

de ampicilina) são inoculados com 1 mL da pré-cultura e incubados por 9 h a37°C sobre um vascolejador a 180 rpm.

Inocular 13,5 1 de meio LB (+100 μ^πύ de ampicilina) em um

fermentador de 20 1 com 0,5 1 de pré-cultura (OD600nm 1:10 medida contra H2O). Em uma OD60nm de -3,5 adicionar 140 ml de IPTG 100 mM. Após 3 h, esfriar o fermentador para 10°C e remover o caldo de fermentação por centrifugação. Usar a pelota celular para purificação adicional. Exemplo 8: Purificação de proteína de fusão de hidrofobina recombinante (Purificação de proteínas de fusão de hidrofobina que possuem uma etiqueta

His6 C-terminal)100 g de pelota celular (100 - 500 mg de hidrofobina) são

compostos para um volume total de 200 ml com tampão fosfato de sódio 50

mM, pH 7,5, e ressuspensos. A suspensão é tratada com um Ultraturrax model

T25 (Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos e então incubada

1 hora na temperatura ambiente com 500 unidades de benzonase (Merck,

Darmstadt; Pedido No. 1.01697.0001) para degradar os ácidos nucleicos.

Antes da disrupção celular, filtração é realizada com um cartucho de vidro

(PI). Para disrupção celular e para cisalhamento do DNA genômico, são

realizadas duas corridas em homogeneizador a 150 MPa (microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). O homogeneizado é centrifugado (Sorvall RC-5B, rotor GSAs bécher de centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm,23.000 g), o sobrenadante é posicionado sobre gelo e a pelota é ressuspensa

em 100 mL de tampão fosfato de sódio, pH 7,5. Centrifugação e ressuspensão são repetidas três vezes, com o tampão fosfato de sódio compreendendo 1% de SDS na terceira repetição. Após ressuspensão, a mistura é agitada por uma hora e uma centrifogação final é realizada (Sorvall RC-5B, rotor GSA, bécher de centrífuga de 250 mL, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). De acordo com analise em SDS-PAGE, a hidrofobina está presente após a centrifiigação final no sobrenadante (Figura 1). Os experimentos mostram que a hidrofobina está provavelmente presente na forma de corpos de inclusão nas células de E. coli correspondentes. 50 ml do sobrenadante compreendendo hidrofobina são aplicados em uma coluna nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 de 50 ml (Amersham) que tem sido equilibrada usando tampão Tris-Cl 50 mM de PH 8,0. A coluna é lavada com tampão Tris-Cl 50 mM de pH 8,0 e a hidrofobina é então eluída usando tampão Tris-Cl 50 mM de pH 8,0 que compreende imidazol 200 mM. Para remover o imidazol, a solução é

dialisada contra tampão Tris-Cl 50 mM de pH 8,0. Figura 1 mostra a purificação da hidrofobina preparada:

Pista 1: Mistura aplicada na coluna nickel-Sepharose (diluição 1:10) Pista 2: Fluxo-através = eluato de etapa de lavagem Pistas 3-5: picos de OD 280 das frações de eluição

A hidrofobina de Figura 1 possui um peso molecular de cerca

de 53 kD. Algumas das bandas menores representam produtos de degradação da hidrofobina.

FvprrlpIn Q: Teste de desempenho: caracterização da hidrofobina através da mnHança de ângulo de contato de uma pota de água sobre vidro

- substrato: vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas,

Mannheim):

- concentração de hidrofobina: 100 μg/mL

- incubação de placas de vidro durante a noite (temperatura80°C) em acetato de Na 50 mM de pH 4 + monolaurato de polioxietileno(20)sorbitano (Tween® 20) 0,1% - após revestimento, lavar em água destilada

- então incubação 10 min / 80°C / solução de dodecil-sulfato

de sódio (SDS) 1% em água destilada

- lavar em água destilada

As amostras são secas em ar a 20°C e o ângulo de contato (em

graus) de uma gota de 5 μΐ de água é determinado na temperatura ambiente.

A medição de ângulo de contato foi determinada usando um Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, software SCA 20.2.0. (Novembro 2002). A medição foi realizada de acordo com as instruções do

fabricante.

Vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o; revestimento com a hidrofobina funcional de acordo com o Exemplo 8 (yaad- dewA-hiSô) deu ângulos de contato de 75 ± 5o. Parte Ώ: Emulsão compreendendo hidrofobina Kxemplo 10: Preparação e investigação de uma emulsão de estireno em água

Água deionizada foi usada. Para a preparação da emulsão de acordo com a invenção, uma solução de hidrofobina (proteína de fusão) yaad- Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) preparada como em Exemplo 8 em água foi usada. A concentração da hidrofobina na solução foi 100 mg/l (0,02% em

peso).

O emulsificador de Pickering usado foi pirofosfato de magnésio (MPP) como suspensão aquosa, que foi preparada como segue: a20°C, 93,18 g de pirofosfato de sódio (Na4P2O7) foram dissolvidos em 3.200 ml de água. Com agitação, uma solução de 172,8 g de sulfato de magnésio (MgSO4 · 7 H2O) em 800 ml de água foi adicionada nesta solução e a mistura

foi agitada por mais 5 min.

Uma garrafa de boca larga de 50 ml foi usada a qual estava

proporcionada com um agitador magnético e compreendia um bastão de

agitação revestido com Teflon®. A 20°C e sem agitação, 0,3 a 1,2 g da solução de hidrofobina foram inicialmente introduzidos, e 1,5 a 2,5 g da suspensão de MPP recém-preparada e 15 a 20 g de água foram adicionados. Esta mistura foi agitada por 30 s a 700 rpm. 30 g de estireno foram então adicionados. As quantidades precisas de solução de hidrofobina, suspensão de MPP e água foram escolhidas de modo que a razão em volume de fases de estireno: água na mistura resultante fosse 1.3 e o conteúdo de MPP fosse 780 ppmp. O conteúdo de hidrofobina da mistura é dado na tabela abaixo.

A mistura resultante foi agitada por 17 horas a 20°C e 700 ipm. A mistura foi então deixada repousar por 2 horas sem agitação e a

mistura resultante foi fotografada.

A estabilidade da mistura e da emulsão foi investigada por

diluição com estireno ou água. Para isto, 0,1 ml de estireno ou 0,1 ml de água

foi adicionado em uma amostra de 0,1 ml da mistura a 20°C e foi observado

se misturação era possível. Além disso, em referência às fotos, o tamanho

aproximado das gotículas de estireno foi determinado.

A tabela sumariza os resultados.

Tabela: Resultados (C significa para comparação, nd não determinado)

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Designação dos nomes de seqüência para as seqüências de polipeptídeo e de DNA no protocolo de seqüência

<table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table> τ TQTAreM TlF seqüência

^ ^uLaefSg::^:foarquosas contendo hidrofobina.

<130> AE 20050377

<160> 24

<170> PatentIn versÃO 3.1

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> basf-dewA <220>

<221> CDS <222> (1)..(405) <223>

<400> ntr tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48

Met αΓ9 £ tl S« Su Leu La Phe Thr Μ. Ala Ma Tf Ala

acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96

?hr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser

9 Π ^ ^ 1 A Λ

E K K K S 2 K K S S S S K Κ Κ 2

40 4b -Q-

ate act tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192

Ue Ma Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu

55

E SS 2 S S E K 2 S K S £ K E 2 S 2'°

κ ε κ s κ 2 K K s s κ a 2 κ 2 s 2,3

K 2 K C K S SS K K S K S s IS SS 336

act tac tgc Crt gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384

Ifa Cys C?s Pro Ilu G?y Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala

115 "O 125 405

ggc gct ggt acc aàg gct gag Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130

135

<210> 2 <21l> 135 <212> PRT <213> basf-dewA

Met0Arg2Phe Ue Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser

20 ^ ^ Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser

40 45

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu

55

ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr

70

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85

Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Prc Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 Ala Cvs Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135

<210> 3 <211> 471 <212> DNA <213> basf-rodA <220>

<221> CDS

<222> (1)..(471) <223>

atg°aag3ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48

Het Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10

gcg gcc etc cct cct gcc. cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt

96

192

Iia Ala Leu Pro Pro Ala· His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val

20 25

ggc aac aag ggc aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144

Glv Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val

35 40 45

acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tet

Thr ?al Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser

50 ^

toe tqc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240

Cys Cys Asn Lys La Thl Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75

aat ctt ctg tet ggt gcc ctc age ggc ctc ate ggc gcc ggg tet ggt 288

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ue Gly Ala Gly Ser Gly

85 95

gcc gaa ggt ctt ggt etc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala

100 105 H°

gtc ctc att ggc ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac

?al Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn

115 120 125

att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc age gcg gat ggc aac ctt att

He Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile

130 135 140

ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc ate ctc Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155

<210> 4 <211> 157 <212> PRT <213> basf-rodA

M^t0Lys4Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 1° 15

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val

20 25 30

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val

35 40 45

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser

50 55 60

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly AsP Thr Thr Thr Val Asp Glu

65 70 75

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly

85 90 95

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala

100 105 HO

Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn

336

384

432

471 115 120 125

Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile

130 135 140

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155

<210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> basf-HypA <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> <400> 5

atg ate tet cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15

gtt act gea act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc age agt cag tgc 96

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

acc age gcc gcc gcg tet ggt ttg ctt ggt gtt ccc ate aac ctt ggt 192

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80

ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

acc gea ttg att aac gct ctt gac tgc tet cct gtc aat gtc aac ctc Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 HO

<210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> basf-HypA <4 00> 6

Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110

<210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> basf-HypB <220> <221> CDS <222> (1) .. (357) <223> <400> 7 atg gtc age acg ttc ate act gtc gea aag acc ctt ctc gtc gcg ctc Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 15 10 15

ctc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aag Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys

20 25 30

cat tgt age acc ggt cct ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tet His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser

35 40 45

aag age cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu

50 55 60

ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc age cct 240

Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80

ate acg gea att ggt att ggc tcc ggc age caa tgc tet ggc cag acc 288

Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr

85 90 95

gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336

Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys

100 105 HO

act ccc att aat gcc aat gtg 357

Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115

<210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> basf-HypB <400> 8

Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 15 10 15

Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys

20 25 30

His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser

35 40 45

Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80

Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr

85 90 95

Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys

100 105 HO

Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115

<210> 9 <211> 408 <212> DNA <213> basf-sc3 <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <223> <4 00> 9

atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe 15 10 15

ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr

20 25 30

ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr 35 40 45 acc ate gcc gcc ggt ggc acg tgt act acç ggg tcg ctc tet tgc tgc 192 Thr lie Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys 50 55 60

aac cag gtt caa tcg gcg age age age ccr gtt acc gcc ctc ctc 240 Asn Gln Vai Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Vai Thr Ala Leu Leu Gly 70 75 80

ctg ctc ggc att gtc ctc age gac ctc aac gtt ctc gtt ggc ate age 288 Leu Leu Gly lie Vai Leu Ser Asp Leu Asr. Vai Leu Vai Gly Ile Ser 85 90 95

tgc tct ccc ctc act gtc ate ggt gtc gga cgc age ggc tgt tcg gcg 336 Cys Ser Pro Leu Thr Vai lie Gly Vai Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala 100 105 110

cag acc gtc tgc tgc gaa eac acc caa ttc aac ggg ctg ate aac ate 384 Gln Thr Vai Cys Cys Glu Asn Thr Gln ?he Asn Gly Leu lie Asn lie 115 120 125

ggt tgc acc cco ate aac ate ctc 408 Gly Cys Thr Pro lie Asn lie Leu 130 135

<210> 10 <2L1> 136 <212> PRT <213> basf-sc3 <400> 10

Me- Phc Ala Arg leu Pro Vai Vai Phe Leu Tyr Ala Phe Vai Ala Phe 1 5 10 15

Gly Ala Leu Vai Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr 20 25 30

Pro Pro Vai Thr Thr Thr Vai Thr Vai Thr Thr Prc Pro Ser Thr Thr 35 40 45

Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys 50 55 60

Asn Gln Vai Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro val Thr Leu Gly 65 70 75 80

Leu Leu Gly He Vai Leu Ser Asp Leu Asn Vai Leu Vai Gly lie Ser 85 90 95

Cys Ser Pro Leu Thr Vai lie Gly Vai Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala 100 105 110

Gln Thr Vai Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly leu Ile Asn 115 120 125 Gly Cys Thr Ptc lie Asn He Leu 130 135

<210> 11 <211> 483 <212> DKA <213> basf-BASF1 <220> <221> CDS <222> (1)..{483} <223> <400> 11

a-g aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc t~c gcc gcc tcc gtc 48 Mct Lys Phe Ser Vai Ser Ala Ala Vai Leu Ala Phe Ala Ala Ser Vai 1 5 10 15

gcc gcc ctc cet cag cac gac tcc gcc gcc gcc aac ggc aac ggc g-c Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asr Gly Vai 20 25 30

gçc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc ac Gly Asn Lys Phe Pro Vai Pro Asp Asp Vai Thr Vai Lys Gln Ala Th 35 40 45

gac aag tgc age gac cag gcc cag ctc tcc iyu oay y^ Asp Lys Cvs Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60

tac gcc ggc gac ctc ctc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc gcc 240 Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly 65 70 75 80

Ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288 Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95

ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc 336 Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly 100 105 110

atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384 Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln 115 120 125

aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc 432 Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140

gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat 480 Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His 145 150 155 160

atg 483 Met

<210> 12 <211> 166 <212> PRT <213> basf-BASF1 <400> 12

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Lou Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asr Lys Ala Thr 50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly 65 70 75 80

Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95

Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln ILe Ser Val Ile Gly 100 105 110

Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys LYs Gln 115 120 125

Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140

Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His 145 150 155

Met

<210> 13

<211> 465

<212> DNA

<213> basf-BASF2

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(465)

<223>

<400> 13

atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48 Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15

gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96 Ala Ala Leu Pro Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30

ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45

gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60

tac gcc ggc gac gtc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc 240 Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu 65 7O 75

ctc aag aac ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288 Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95

ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate 336 Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile 100 105 110

cct ate cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 384 Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 115 120 125

tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432 Cvs Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly

130 135 140

aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465 Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155

<210> 14 <211> 155 <212> PRT <213> basf-BASF2 <400> 14

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30

Glv Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80

Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95

Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile 100 105 110

Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 115 120 125

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 140

Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155

<210> 15 <211> 882 <212> DNA <213> basf-yaad <220> <221> CDS <222> (1) . . (882) <223> <400> 15

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gea gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45

cca gea gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gea gta tet ate ccg gta atg gea 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lvs Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gea aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gea act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gea att gtg gaa gea aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270

act gea atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg 882 Met Gln Glu Arg Gly Trp

290 <210> 16 <211> 294 <212> PRT <213> basf-yaad <400> 16

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 HO

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp

290 <210> 17 <211> 591 <212> DNA <213> basf-yaae <220> <221> CDS <222> (1)..(591) <223> <400> 17

atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48 Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu 1 5 10 15

cac ate cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96 His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys 20 25 30

cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144 Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45

gag age acg acg atg cgc cgt ttg ate gat acg tat caa ttc atg gag 192 Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu 50 55 60

ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80

gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288 Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 95

cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 100 105 11O

cag gtt gac age ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384 Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu cct ttt act ggg gta ttc ate cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt Pro Phe Thr Gly Val Phe Ue Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg 480

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala

aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa Lys Gln Ily Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

aat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag Asp Ss Arg U Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

caa aag gea ctt gta Gln Lys Ala Leu Val

<210> 18 <211> 197 <212> PRT <213> basf-yaae

Met0Gly1Leu Thr Xle Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu

1 5 10 15 His Ile His Ala Ue Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys

20 25 30

Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly

35 40 45

Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu

50 55 60

' Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys

70 75

Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu He Ala Gly Ser Asp Asn Pro

85 90 95

His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg

100 105 110

Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala AsP Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu

115 120 125

Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

130 I35 140

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala

145 150 155 u t,

LyS Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

165 I70 110 T

Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

180 185 I90

Gln Lys Ala Leu Val

195 <210> 19 <211> 1329 <212> DNA

<213> basf-yaad-Xa-dewA-his

<220>

<221> CDS

<222> (1)·· (1329)

<223>

^g0SCt1Caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gea gaa atg

Met Ala Gln ^ G^ ihr Glu A^g Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met

1 5 10 -l^

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45

cca qca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gea gta tet ate ccg gta atg gea 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75

aaa acg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Itl Hl He Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95

ggt gtt gae tat att gat gaa agt gaa gtt etg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110

aaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gea aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175

ata aat gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Syr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205

ttt acc net ggc ggc gta gea act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Sn Phe íll Itl Hy Gly ?al Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220

ata caa ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235

tca gae aac cct gct aaa ttt gcg aaa gea att gtg gaa gea aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255

eac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Xle Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270

act gea atg aaa ggg att gaa ate tea aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg aga tcc att gaa ggc cgc atg cgc ttc ate 912 Me? Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ue Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile 290 295 300

ate tet ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg 960 Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320

acc tet gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc 1008 Ala Ser Ma Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala 325 330 335

aaa cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg ate gct tgc tgc 1056 Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys 340 345 350

aae tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg age ggt ctg ctc 1104 Asn Ser Pro Ua Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 355 360 365

ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc age gcc tgc 1152 <formula>formula see original document page 48</formula> Asn Ser Pro Ala GXu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser GXy Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr GXy Ser Ala Cys Ala L7ys Ala Ser Leu XXe a!P Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp ãfs Thr GXU GXU GXy Pro VaX Cys Lys Asn IXe Val Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala GXy Thr Lys Ala GXu Gly Ser His His His His His His

<210> 21

<211> 1395

<212> DNA

<213> basf-yaad-Xa-rodA-his <220>

<221> CDS

<222> d).· (1395) <223>

<400> 21 <formula>formula see original document page 49</formula> <formula>formula see original document page 50</formula> <formula>formula see original document page 51</formula> Gln Lys Gly Gly Vai Ile Met Aso Val lie Asn -oxu 20 25 30

atc gct gaa gct gtc gta atg gcg ata gaa cgt gtg 144 ILe Ala Glu Ala VAl Ala VAl Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45

oca gca gat a,t cgc gcg gc, gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca tct atc ccg gta atg gca 240 Th- He Vai Glu Glu Vai Met Asn Ala Vai ser Ile Pro Val Met Ala 85 90 95 ggt gtt gac tat Gly Vai Asp Tyr 100 gaa ttt cat tta Glu Phe Kis Leu 115 tgc cçt gat ctt Cys Arg Asp Leu

att gat gaa agt Xle Asp Glu Ser aat aaa aat gaa Asn Lvs Asn Glu 120 ggt gaa gca aca Gly Glu Ala Thr 135 gaa gtt ctg acg Glu Vai Leu Thr 105 tac aca gtt cct Tyr Thr Vai Pro cgc cgt att gcg Arg Arg He Ala 140 Pro Ala Asp Glu 110 ttt gtc tgt ggc Phe Vai Cys Gly 325 gaa ggt gct tct Glu Gly Ala Ser tgc cçt gat ctt Cys Arg Asp Leu 130 atg ctt cgc aca Met Leu Arg Thr 145 gtt cgc cat atg Vai Arg H.is Het ggt gaa gca aca Gly Glu Ala Thr 135 aaa ggt gag cct Lys Gly Glu Pro 150 cgt aaa gtt aac Arg Lys Vai Asr. 165 cgc cgt att gcg Arg Arg He Ala 140 gga aca ggt aat Gly Thr Gly Asn 155 gct caa gtg cgc Ala Gln Vai Arg 170 gaa ggt Glu Gly Ala Ser att gtt gag gct lie Vai Glu Ala 160 aaa gta gtt gcg Lys Vai Vai Ala 175 Ala nct act cct atg agt gag gat Met Ser Glu Asp 180 tac gag ctt ctt Tyr Glu Leu Leu 195 aac ttt gcc gct Asn Fhe Ala Ala gag cta atg aca Glu Leu Met Thr ctt caa att oaa Leu Gln lie Lys 200 ggc ggc gta gca Gly Gly Vai Ala gaa gcg aaa aac Glu Ala Lys Asn 185 aaa gac ggc aag Lys Asp Gly Lys act cca gct gat Thr Pro Ala Asp cta ggt Leu Gly Ala Pro 190 ctt cct gtc gtt Leu Pro Vai Vai 205 gct gct ctc atg Ala Ala Leu Met aac ttt gcc gct ggc ggc gta g Asn Phe Ala Ala Gly Gly Vai Ala 210 215 atg cag ctt ggt gct gac gga gta Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Vai Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 220 ttt att ggt tet ggt att ttt aaa Phe Vai Gly. Ser Gly He Phe Lys 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca a ^ ^ Thr Ser Asp Asn ?ro Ala Lys Pne Ala Lys A_a ,_e ^ ill tta atc act gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 cac ttt act gat tac aaa tta atc gc. g y - His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu lie Ala Glu .eu Ser Ly oiu

atg caa gaa cgc ggc tfet Gin Glu Arg Gly 290 gtc tcc gcc gcc gtc Vai Ser Ala Ala Vai taa aga tct att gaa ggc Trp Arg Ser lie Glu Gly 295 etc gcc ttc gcc gcc. tcc Leu Ala Phe Ala Ala Ser a 315 cgc atg a<iy Arg Met Lys Phe Ser 300 gtc gcc gcc ctc cct Vai Ala Ala Leu Pro 320

Gly Asn Cl, Vai Gly Asn Lys P,e cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc «56 Pro Vai. Pro Asp Asp Vai Tr.r Vai Lys Gln Ala Tr.r Asp -Gly 34c 11 AA çac cag gcc íag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc 1104 Asp Gln Ala 355

gtc ctc acc Val Leu Thr

370 etc ate ggc Leu Xle Gly 385

tgc gtc aag Cys Val Lys

gac ctc ctc Asp Leu Leu

Gln Leu Ser Cys

gac ate Asp Ile

ggc ggc Gly Gly

ctc Leu

aac Asn 420 tcc Ser

gac Asp 405 cag Gln

gac gag Asp Glu 375 tcc ggc Ser Gly 390

ctc cag Leu Gln

gtc aac Val Asn

Cys Asn Lys Ala

360

ggc ate ctc gcc Gly Ile Leu Ala

cet Pro

tgc cag aac Cys Gln Asn 435

ctc ggc aac cct tgc Leu Gly Asn Pro Cys 450

cac cat cac cat cac His His His His His

465

<210> 24 <211> 469 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa- <400> 24 Met Ala Gln 1

Gln Lys Gly

tcc gac Ser Asp

ate cct Ile Pro 455

tcc gag Ser Glu

ate tcc Ile Ser

aag cag Lys Gln 425 gcc acc Ala Thr 440

gtc tcc Val Ser

ggc ctc Gly Leu 395 gtc ate Val He 410

tgc aag Cys Lys

ggc tcc Gly Ser

etc ctc Leu Leu

Thr Tyr 365 ggc CtC Gly Leu

380

ggc ctc Gly Leu

ggc ate Gly He

cag aac Gln Asn

ctc gtc Leu Val 445 cat atg His Met 460 .

Ala Gly Asp

ctc aag aac Leu Lys Asn

ttc gac cag Phe Asp Gln 400

cct ate cag Pro Ile Gln

415 ate gcc tgc Ile Ala Cys 430

aac ctc ggc Asn Leu Gly

gga tet cat Gly Ser His

Ile Ala Glu 35

Pro Ala Asp

50

Thr Ile Val

65

Lys Ala Arg

Gly Val Asp

Glu Phe His 115

Cys Arg Asp

130 Met Leu Arg

145

Val Arg His

Met Ser Glu

Tyr Glu Leu 195

Asn Phe Ala 210 Met Gln Leu 225

Ser Asp Asn His Phe Thr Thr Ala Met

Thr Gly 5

Gly Val 20

Glu Ala

Ile Arg Glu Glu

BASFl-his

Thr Glu Arg

Ile Met Asp

Gly Ala Val 40

Ala Ala Gly 55

Val Met Asn

70

His Ile Val

Ile Gly 85

Tyr Ile Asp Glu Ser

100

Leu Asn

Leu Gly

Thr Lys

Met Arg 165 Asp Glu 180

Leu Leu Ala Gly Gly Ala

Pro Ala 245 Asp Tyr 260

Lys Gly

Lys Asn Glu 120

Glu Ala Thr

135 Gly Glu Pro

150

Lys Val Asn

Leu Met Thr

Gln Ile Lys 200

Gly Val Ala

215 Asp Gly Val

230

Lys Phe Ala

Val Lys

10

Val Ile 25

Ala Val

Gly Val

Ala Val

Glu Ala

90 Glu Val 105

Tyr Thr

Arg Gly

Asn Ala

Met Ala

Ala Arg 60

Ser Ile

75

Arg Val Leu Thr Val Pro

Lys Leu Ile Ile Glu Ile

Arg Arg

Gly Thr

Ala Gln 170 Glu Ala 185

Lys Asp Thr Pro

Phe Val

Lys Ala 250 Ala Glu

265

Ser Asn

Ile Ala 140 Gly Asn

155

Val Arg

Lys Asn

Gly Lys

Ala Asp 220 Gly Ser 235

Ile Val Leu Ser Leu Leu

Met Ala

Glu Gln 30

Leu Glu

45

Met Ala

Pro Val

Leu Glu

Pro Ala 110

Phe Val 125

Glu Gly

Glu Met

15

Ala Lys

Arg Val

Asp Pro

Met Ala 80 Ala Met

95

Asp Glu Cys Gly Ala Ser

Ile Val

Lys Val

Leu Gly 190 Leu Pro 205

Ala Ala

Gly He

Glu Ala

Lys Glu 270 Pro Glu

Glu Ala 160 Val Ala

175

Ala Pro

Val Val

Leu Met

Phe Lys 240 Thr Thr

255

Leu Gly Gln Arg

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1407 Met Gln 290 Val Ser

305

Gln His

Pro Val

Asp Gln

Val Leu 370 Leu Ile

385

Cys Val

Asp Leu

Cys Gln

Leu Gly 450 His His 465

275

Glu Arg

Ala Ala

Asp Ser

Pro Asp 340 Ala Gln 355

Thr Asp Gly Gly Lys Leu

Leu Asn 420 Asn Ser

435

Asn Pro

Gly Trp

Val Leu 310 Ala Ala 325

Asp Val Leu Ser

Ile Asp

Gly Ser 390 Asp Leu 405

Gln Val

280 Arg Ser 295

Ala Phe

Gly Asn

Thr Val

Cys Cys 360 Glu Gly 375

Gly Ser Gln Ile Asn Lys

Pro Ser Cys Ile His His His

Asp Ala 440 Pro Val 455

Ile Glu Gly

Ala Ala Ser 315

Gly Asn Gly

330 Lys Gln Ala

345

Asn Lys Ala

Ile Leu Ala

Glu Gly Leu 395

Ser Val Ile

410 Gln Cys Lys

425

Thr Gly Ser

Ser Leu Leu

285 Arg Met 300

Val Ala

Val Gly

Thr Asp

Thr Tyr 365 Gly Leu

380

Gly Leu

Gly He

Gln Asn

Leu Val 445 His Met 460

Lys Phe Ser

Ala Leu Pro 320

Asn Lys Phe

335 Lys Cys Gly

350

Ala Gly Asp

Leu Lys Asn

Phe Asp Gln 400

Pro Ile Gln

415 Ile Ala Cys

430

Asn Leu Gly Gly Ser His

Claims (16)

1. Emulsões de monômeros hidrofóbicos em água, caracterizadas pelo fato de compreenderem partículas inorgânicas como emulsificadores de Pickering, e hidrofobina.

2. Emulsões de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o monômero é estireno, onde podem ser co-usados comonomeros que são escolhidos de α-metil-estireno, estirenos de anel halogenado, estirenos de anel alquilado, acrilonitxila, ésteres de ácido acrílico ou de ácido metacrílico de Q.g-alcoóis, N-vinil-compostos, butadieno, divinil- benzeno ou diacrilato de butanodiol.

3. Emulsões de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizadas pelo fato de que as partículas inorgânicas são escolhidas de partículas compreendendo pirofosfato de magnésio, sulfato de bário, óxido de zinco e fosfato de cálcio.

4. Emulsões de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a hidrofobina possui a fórmula geral (I) Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I) onde X é qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leuj Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro5 His, Gln, Arg, lie, Met, Thr5 Asn, Lys5 Vai, Ala, Asp, Glu, Gly) e o X pode em cada caso ser idêntico ou diferente, os índices ao lado de X são o número de aminoácidos, C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, onde pelo menos quatro dos radicais nomeados como C são cisteína,os índices η e m, independentemente um do outro, são números naturais de 0 a 500.

5. Emulsões de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizadas pelo fato de que a hidrofobina possui a fórmula geral (II) Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II) onde X, C e os índices ao lado de X possuem o significado dado na reivindicação 4, e os índices nem, independentemente um do outro, são números naturais de 0 a 300.

6. EmulsÕes de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que a hidrofobina é escolhida dos tipos dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl e bas£2.

7. Emulsões de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizadas pelo fato de que o monômero é estireno, as partículas inorgânicas compreendem pirofosfato de magnésio e a hidrofobina é aquela descrita na descrição em SEQID NO: 19.

8. EmulsÕes de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de não compreenderem tensoativos ou emulsificadores orgânicos.

9. Processo para a preparação de emulsões como definidas nas reivindicações 1 a 8, em que os monômeros estão dispersados em água na presença de partículas inorgânicas que atuam como emulsificador Pickering, caracterizado pelo fato de que hidrofobina é co-usada.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a emulsão possui pelo menos uma das características das reivindicações 1 a 8.

11. Uso de hidrofobina, caracterizado pelo fato de ser na preparação de emulsões de monômeros hidrofóbicos em água.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a emulsão possui pelo menos uma das características das reivindicações 1 a 8.

13. Processo para a polimerização em suspensão de monômeros hidrofóbicos em água com co-uso de partículas inorgânicas como emulsificadores de Pickering, caracterizado pelo fato de que hidrofobina é co- usada.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que uma emulsão como definida nas reivindicações 1 a 8 é usada como material de alimentação.

15. Uso das emulsões como definidas nas reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser como material de alimentação em uma polimerização em suspensão.

16. Processo para a preparação de partículas de polímero termoplástico expandidas ou expansíveis com co-uso de um propelente, caracterizado pelo fato de que as partículas de polímero são preparadas usando o processo como definido na reivindicação 13.