KR20080027826A - 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자용 코팅제로서의하이드로포빈 - Google Patents
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Abstract
본원 발명은 하이드로포빈, 특히, 하기 일반 구조식(II)의 단백질을 포함하는 코팅을 갖는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자, 및 정전기 방지제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I),
상기 식에서, X는 20개의 자연적으로 발생된 아미노산중 임의의 것이고,
n 및 m은 0 내지 500의 수이며,
C는 시스테인이다.
하이드로포빈, 발포성, 열가소성 중합체 입자, 정전기 방지제
Description
본 발명은 하이드로포빈을 포함하는 코팅을 갖는 발포성(expandable) 또는 발포(expanded)의, 열가소성 중합체 입자, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
발포성 폴리스티렌이 문제없이 수송될 수 있도록 하고, 사전발포된 폴리스티렌 발포 입자상의 정전 전하를 감소시키기 위해 EPS 입자는 보통 정전기 방지제로 코팅된다. 입자 표면으로부터 코팅제가 마모되거나 씻겨질 때 불만족스런 정전기 방지제의 성질이 빈번하게 발생한다. 정전기 방지제 코팅은 또한 입자를 케이킹할 수 있고, 유동능을 열악하게 할 수 있다.
EP-A 470 455에는 4급 암모늄 염 및 미분화된 실리카를 포함하는 코팅을 갖는 비드-양 정전기 방지의 발포성 스티렌 중합체가 기재되어 있는데, 이는 유동능이 우수하다는 점에서 뛰어나다.
하이드로포빈은 약 100개 내지 150개 아미노산의 소형 단백질로서, 이는 예 를 들면, 시조필륨 코뮨(Schizophyllum commune)과 같은 사상 진균의 특징이다. 이들 대부분은 보통 8개의 시스테인 단위를 갖는다.
하이드로포빈은 경계면에 대하여 현저한 친화성을 갖는 바, 표면을 코팅하는데 적합하다. 따라서, 예를 들면, 테플론(Teflon)을 하이드로포빈으로 코팅함으로써 친수성 표면을 수득할 수 있다.
하이드로포빈을 천연물로부터 단리시킬 수 있다. 본 발명자의 이전 출원인 DE 102005007480.4에는 하이드로포빈을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
다양한 적용을 위한 하이드로포빈의 용도는 선행 기술에 제안되어 있다.
WO 96/41882에서는 소수성 표면을 친수화하기 위한, 친수성 기재의 방수성을 개선시키기 위한, 수중유 유제 또는 유중수 유제를 제조하기 위한 유화제, 증점제, 계면활성제로서의 하이드로포빈의 용도를 제안하였다. 연고제 또는 크림제의 제조와 같은 약제학적 적용 및 피부 보호 또는 모발용 샴푸 또는 모발용 린스 제조와 같은 화장학적 적용 또한 제안되었다.
WO 01/57528에는 30 내지 80℃의 온도에서 하이드로포빈-함유 용액으로 창문, 콘택트 렌즈, 바이오센서, 의료 장치, 실험용 용기 또는 저장 용기, 선체, 고체 입자, 또는 승객용 차량의 샤시 또는 차체를 코팅하는 것이 개시되어 있다.
WO 03/53383에는 화장학적 적용에 있어서 케라틴 물질을 처리하기 위한 하이드로포빈의 용도가 개시되어 있다.
WO 03/10331에는 추가의 비공유 물질, 예를 들면, 전기활성 물질, 항체 또는 효소가 그에 결합하는 하이드로포빈-코팅된 센서, 예를 들면, 측정 전극이 개시되 어 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 언급된 단점들을 제거하고, 사전발포 또는 발포시 입자의 케이킹 경향은 낮기 때문에 보다 저밀도인, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자용의, 정전기 방지 코팅제를 찾아내는 것이다.
따라서, 상기 언급한 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자가 발견되었다.
코팅은 바람직하게 열가소성 중합체에 기초하여 1 내지 5000 ppm, 특히, 10 내지 1000 ppm의 하이드로포빈을 포함한다. 코팅은 추가로 정전기 방지제 및/또는 코팅 보조제를 포함할 수 있거나, 상이한 코팅제를 함유하는 추가의 코팅에 적용될 수 있다. 하이드로포빈 또는 하이드로포빈 혼합물로만 구성되고, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자상에 단분자 층을 형성하는 코팅이 특히 바람직하다.
발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자, 스티렌 중합체, 예로서, 폴리스티렌 (EPS) 또는 폴리올레핀, 예로서, 폴리에틸렌 (EPE) 또는 폴리프로필렌 (EPP)을 위해 사용하는 것이 바람직하다.
발포성의 열가소성 중합체 입자는 예를 들면, 열기 또는 스트림에 의해 형성되어 발포의, 열가소성 중합체 입자를 제공할 수 있는 것이다. 상기는 보통 열가소성 중합체에 기초하여, 2 내지 10중량%, 바람직하게 3 내지 7중량%의 양으로 화학적 또는 물리적 발포제를 포함한다.
바람직한 물리적 발포제는 기체로서, 예를 들면, 질소, 또는 이산화탄소, 또는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 지방족 탄화수소, 알코올, 케톤, 에테르 또는 할로겐화된 탄화수소이다. 이소부탄, n-부탄, 이소펜탄, n-펜탄, 네오펜탄, 헥산 또는 그의 혼합물을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
발포성 및 발포의, 열가소성 중합체 입자는 추가로 유효량의 통상의 보조제, 예로서, 염료, 색소, 충진제, IR 흡수제, 예로서, 탄소 블랙, 알루미늄 또는 흑연, 안정화제, 내연제, 예로서, 헥사브로모사이클로도데칸 (HBCD), 상승적 내연제, 예로서, 디쿠밀 또는 디쿠밀 퍼옥사이드, 조핵제 또는 활제를 포함할 수 있다.
제조 방법에 따라, 본 발명의 발포성의 열가소성 중합체 입자는 구형, 비드-형 또는 원통형일 수 있고, 보통 평균 입자 직경은 0.05 내지 5 mm, 특히, 0.3 내지 2.5 mm 범위이고, 적절할 경우, 스크리닝에 의해 개별적 분획물로 분할될 수 있다.
발포의, 열가소성 중합체 입자의 평균 입자 직경은 1 내지 10 mm, 특히, 2 내지 6 mm 범위이고, 밀도는 10 내지 200 kg/㎥이며, 이는 발포도에 상응하는 것이다.
발포성의 열가소성 중합체 입자는 예를 들면, 탱크내에서의 열가소성 중합체 입자와 발포제와의 가압 함침에 의해, 발포제 존재하에서의 현탁액 중합화에 의해, 또는 압출기 또는 정적 혼합기에서의 용융 함침에 이은 수중 가압 과립화에 의해 수득할 수 있다.
발포의, 열가소성 중합체 입자는 가압 발포기내에서 예를 들면, 열기 또는 스트림을 사용하여 발포성의 열가소성 중합체 입자를 발포시킴에 의해, 탱크내에서의 열가소성 중합체 입자와 발포제와의 가압 함침에 이은 가압 환원에 의해, 또는 발포제-함유 용융물을 발포시키면서 용융 압출시킴에 이은 과립화에 의해 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "하이드로포빈"은 본원 하기의 일반 구조식(I)의 단백질을 의미한다:
Xn-C1-X1 -50-C2-X0 -5-C3-X1 -100-C4-X1 -100-C5-X1 -50-C6-X0 -5-C7-X1 -50-C8-Xm (I),
상기 식에서, X는 20개의 자연적으로 발생된 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly)중 임의의 것일 수 있다. X는 또한 각 경우에 있어 동일하거나 상이할 수 있다. X 옆의 지수는 각 경우의 아미노산의 갯수를 표시하고, C는 시스테인이며, 지수 n 및 m은 서로 독립적으로, 자연수 0 내지 500, 바람직하게, 15 내지 300이다.
화학식(I)의 폴리펩티드는 게다가, 각 경우에서 유리 표면이 코팅되지 않은, 크기가 동일한 수적(water drop)의 접촉각과 비교할 때, 유리 표면 코팅 후, 실온에서 수적의 접촉각을 적어도 20°, 바람직하게 적어도 25° 및 특히 바람직하게 30°까지 증가시키는 성질을 특징으로 한다.
C1 내지 C8로 표시되는 시스테인은 환원 상태일 수 있거나, 서로서로의 사이에 이황화 브릿지룰 형성할 수 있다. C-C 브릿지를 분자내 형성하는 것, 특히, 적어도 1개, 바람직하게 2개, 특히 바람직하게 3개 및 매우 특히 바람직하게 4개의 분자내 이황화 브릿지를 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 수행을 위해서는 하기 일반식(II)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다:
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)
상기 식에서, X, C 및 X 및 C 옆의 지수는 상기 정의된 바와 같지만, 지수 n 및 m은 수 0 내지 300이고, 상기 단백질은 게다가 상기 언급한 접촉각 변화가 뛰어나다.
하기 일반식(III)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다:
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III),
상기 식에서, X, C 및 X 및 C 옆의 지수는 상기 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 수 0 내지 200이고, 상기 단백질은 게다가 상기 언급한 접촉각 변화가 뛰어나다.
잔기 Xn 및 Xm은 하이드로포빈에 자연적으로 연결되는 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 상기 잔기중 어느 것 또는 양자 모두는 또한 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은 펩티드 서열일 수 있다. 이는 또한 하이드로포빈중 자연적으로 발생된 펩티드 서열이 하이드로포빈중 자연적으로 발생되지 않은 펩티드 서열에 의해 연장된 것인 잔기 Xn 및/또는 Xm을 포함한다.
Xn 및/또는 Xm이 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은 펩티드 서열일 경우, 상기 서열의 길이는 보통 적어도 20개, 바람직하게 적어도 35개, 특히 바람직하게 적어도 50개 및 매우 특히 바람직하게 적어도 100개의 아미노산 길이이다. 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은, 이러한 종류의 잔기는 또한 본원 하기에서 융합 파트너로서 언급될 것이다. 이는 본 단백질은 적어도 하나의 하이드로포빈 파트와 하나의 융합 파트너로 구성될 수 있되, 이러한 형태로는 사실상 함께 존재하지 않는다는 사실을 나타내고자 하는 것이다.
융합 파트너는 각양각색의 단백질로부터 선택될 수 있다. 대다수의 융합 파트너는 하나의 하이드로포빈 파트, 예를 들면, 상기 하이드로포빈 파트의 아미노 말단 (Xn) 및 카복시 말단 (Xm)에 연결될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 2개의 융합 파트너 파트를 본 발명의 단백질중 하나의 위치 (Xn 또는 Xm)에 연결시킬 수 있다.
특히 적합한 융합 파트너 파트는 미생물, 특히, E. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에서 자연발생적으로 존재하는 단백질이다. 그러한 융합 파트너 파트의 일례로는 서열 yaad (서열 번호: 15 및 16), yaae (서열 번호: 17 및 18), 및 티오레독신이다. 상기 서열의 단편 또는 유도체는 상기 서열중의 하나의 파트만을 바람직하게 70-99%, 특히 바람직하게 80-98% 포함하거나, 상기 서열과 비교하여 개개의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변경되어 있는 것으로서, 이 또한 적절하며, 상기 백분율은 각 경우에 있어서의 아미노산 갯수를 언급하는 것이다.
게다가 또한, 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 폴리펩티드 서열은 예를 들면, 당화, 아세틸화 또는 그외 화학적 교차결합, 예를 들면, 글루타르알데히드와의 화학적 교차 결합에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 단백질의 하나의 특징은 표면이 상기 단백질로 코팅되었을 때 표면 성질이 변화한다는 점이다. 실험적으로 상기 단백질로 표면을 코팅하기 이전 및 이후의 수적의 접촉각을 측정하고, 두 측정치의 차이를 측정함으로써 표면 성질의 변화를 측정할 수 있다.
접촉각 측정은 대체로 숙련인에게 공지되어 있다. 측정은 실온 및 5 ℓ의 수적을 기초로 한다. 일례로서 적합한 접촉각 측정 방법에 대한 정확한 실험적 조건은 실시예 섹션에서 설명한다. 하기 언급되는 조건하에서, 본 발명에 따라 사용되는 단백질은 각 경우에서 유리 표면이 코팅되지 않은, 크기가 동일한 수적의 접촉각과 비교할 때, 접촉각을 적어도 20°, 바람직하게 적어도 25°및 특히 바람직하게 30°까지 증가시키는 성질을 갖는다.
현재까지 알려져 있는 하이드로포빈의 하이드로포빈 파트에서 극성 및 비극성 아미노산의 위치는 보존됨으로써 소수성 플롯을 특징으로 한다. 생물리학적 성질 및 소수성에서의 차이로 인하여 현재까지 알려져 있는 하이드로포빈은 I 및 II의 2개 부류로 분류되었다 [Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437].
I군의 하이드로포빈의 조립막은 주로 불용성이고 (승온에서 1% 도데실황산나트륨 (SDS) 까지도), 진한 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 포름산에 의해 다시 오직 해리만이 될 수 있다. 대조적으로, II군의 하이드로포빈의 조립막은 덜 안정적이다. 이는 60% 강도의 에탄올 또는 1% SDS (실온에서)에 의해서도 용해될 수 있다.
아미노산 서열 분석을 통해 시스테인 C3 내지 C4 사이에 있는 부위의 길이는 I군의 하이드로포빈에 있는 것보다 II군의 하이드로포빈에서 뚜렷하게 더욱 짧다는 것이 밝혀졌다. II군의 하이드로포빈은 게다가 I군보다 하전된 아미노산을 더욱 많이 갖는다.
본 발명을 수행하는데 특히 바람직한 하이드로포빈은 구조상 하기 열거하는 서열을 특징으로 하는 dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2 유형의 것이다. 이들은 또한 상기 유형의 유일한 파트이거나 유도체일 수 있다. 여러개의 하이드로포빈 파트, 바람직하게 2 또는 3개의 동일하거나 상이한 구조체를 서로서로에 연결시키고, 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은 상응하는 적합한 폴리펩티드 서열을 연결시킬 수 있다.
게다가, 서열 번호: 20, 22, 24에 나타낸 폴리펩티드 서열과 그를 코딩하는 핵산 서열, 특히, 서열 번호: 19, 21, 23에 따른 서열을 갖는 융합 단백질이 본 발명을 수행하는데 특히 적합하다. 특히 바람직한 실시태양은 또한 서열 번호: 20, 22 또는 24에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 전체의 1% 이상, 10% 이하, 바람직하게, 5% 이하, 특히 바람직하게 5%의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실됨으로써 생성되고, 출발 단백질의 생물학적 성질을 적어도 50%를 여전히 갖고 있는 단백질이다. 본원에서 단백질의 생물학적 성질은 상기-기술된 바와 같이 접촉각을 적어도 20°까지 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 사용되는 단백질은 공지된 펩티드 합성 방법, 예를 들면, 메리필드(Merrifield)에 따른 고체상 합성에 의해 화학적으로 제조될 수 있다.
자연발생적으로 생성된 하이드로포빈은 적합한 방법에 의해 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 일례로 ([Woten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882)을 참조한다.
융합 단백질은 바람직하게 원하는 단백질이 숙주 유기체에서 조합된 핵산 서열의 유전자 발현에 의해 생성되도록 하는 방식으로 융합 파트너를 코딩하는 하나의 핵산 서열, 특히, DNA 서열과 하이드로포빈 파트를 코딩하는 하나가 조합되는, 유전 공학 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 종류의 제조 방법은 본 발명자의 이전 출원인 DE 102005007480.4에 개시되어 있다.
본원에서 언급된 제조 방법에 대하여 적합할 수 있는 숙주 유기체 (생산자 유기체)는 원핵생물 (원시세균 포함) 또는 진핵생물, 특히, 할로박테리아(Halobacteria) 및 메타노코치(Methanococci)를 포함하는 세균, 진균, 곤충 세균, 식물 세균 및 포유동물 세포, 특히 바람직하게, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리지아(Aspergillus oryzea), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스 종(Pseudomonas spec.), 락토바실러스 (lactobacilli), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 트리코데마 리제이(Trichoderma reesei), SF9 (또는 관련 세포) 등이다.
본 발명은 조절 핵산 서열의 유전자 조절하에 본 발명에 따라 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 작제물의 용도, 및 또한 이들 발현 작제물중 적어도 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
사용되는 작제물은 바람직하게 특정 코딩 서열의 5' 상류의 프로모터 및 3' 하류의 종결 서열을 포함하고, 적절한 경우, 추가로는 각 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 통상의 조절 인자를 포함한다.
"작동가능한 연결"은 프로모터, 코딩 서열, 종결자 및, 적절한 경우, 각 조절 인자가 코딩 서열 발현시 필요에 따라 그의 작용을 이행할 수 있는 방식으로 존재하는, 추가의 조절 인자의 연속적인 배열을 의미한다.
작동가능하게 연결될 수 있는 서열의 일례로는 표적 서열 및 또한 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등이다. 다른 조절 인자는 선별가능한 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등을 포함한다. 적합한 조절 서열은 예를 들면 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.
이들 조절 서열 이외에도, 이들 서열의 자연발생적인 조절은 실제 구조 유전자의 상류에 존재할 수 있고, 적절한 경우, 자연발생적인 조절이 스위치 오프되고, 상기 유전자의 발현이 증가되는 방식으로 유전적으로 변경될 수 있다.
바람직한 핵산 작제물은 또한 유리하게는 앞서 언급한 바 있는, 프로모터에 작용가능하게 연결되어 있고, 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있는 인핸서 서열을 하나 이상 포함한다. 추가의 유익한 서열, 예로서, 추가의 조절 인자, 또는 종결자는 또한 DNA 서열의 3' 말단에 삽입될 수 있다.
핵산은 하나 이상의 복사체로 작제물내 존재할 수 있다. 작제물은 또한 상기 작제물을 선별하기 위한 목적으로, 적절하다면, 추가의 마커, 예로서, 항생제 내성 또는 영양요구성-보충 유전자를 포함할 수 있다.
방법에 유익한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 예로서, cos, tac, trp, tet, trp, tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD)SP6, lambda-PR, 또는 람다-P 프로모터에 존재하는데, 상기 프로모터들은 그람-음성 세균에서 유익하게 사용된다. 추가의 유익한 조절 서열은 예를 들면, 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 존재한다.
조절을 위해서는 인공 프로모터 또한 사용될 수 있다.
숙주 유기체에서의 발현 목적을 위해, 핵산 작제물은 유리하게는, 플라스미드 또는 파지, 예를 들면, 유전자가 숙주에서 최적으로 발현될 수 있도록 하는 것인 벡터내로 삽입된다. 플라스미드 및 파지 이외에도, 벡터는 또한 숙련인에게 공지되어 있는 임의의 다른 벡터, 즉, 예를 들면, 바이러스, 예로서, SV40, CMV, 베큘로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포존, IS 인자, 플라스미드, 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA, 및 애그로박테리움(Agrobacterium) 시스템도 포함한다.
이들 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 복제될 수 있거나 염색체적으로 복제될 수 있다. 이들 벡터가 본 발명의 추가의 실시태양을 구성한다. 적합한 플라스미드의 일례는 E. 콜라이에서, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III-B1, tgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서, pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스(Bacillus), pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움(Corynebacterium)에서, pSA77 또는 pAJ667, 진균에서, pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모에서, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23, 또는, 식물에서, pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이다. 상기 플라스미드들은 선별이 가능한 작은 플라스미드이다. 다른 플라스미드들은 숙련인에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 서적 클로닝 벡터(Cloning Vectors)[Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018]에서 찾아볼 수 있다.
존재하는 다른 유전자들을 발현시키기 위한 목적으로, 핵산 작제물은 유리하게 또한 발현을 증가시키기 위해 3' 말단 및/또는 5' 말단 조절 서열을 포함하는데, 이들은 선택된 숙주 유기체 및 유전자 또는 유전자들에 의존하여 최적의 발현을 위해 선택된다.
이들 조절 서열은 유전자 및 단백질 발현이 특이적으로 발현될 수 있도록 하고자 하는 것이다. 숙주 유기체에 따라, 예를 들면, 오직 유도한 후에만 유전자가 발현되거나 과다발현되거나, 또는, 즉시 발현되고/거나 과다발현되는 것을 의미할 수 있다.
이와 관련하여, 조절 서열 또는 인자는 바람직하게 긍정적으로 영향을 미칠 수 있고, 이로써, 도입된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 조절 인자는 유리하게 강력한 전사 신호, 예로서, 프로모터 및/또는 인핸서의 사용에 의해 전사 수준으로 증진될 수 있다. 그러나, 이외에도, 예를 들면, mRNA의 안정성을 개선시킴으로써 번역을 증진시킬 수도 있다.
벡터의 추가적인 실시태양에서, 본 발명의 핵산 작제물 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는 또한 유리하게 선형 DNA 형태로 미생물내로 도입되고, 이종성 또는 상동성 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈내로 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 선형화된 벡터, 예로서, 플라스미드, 또는 핵산 작제물 또는 핵산만으로 구성될 수 있다.
유기체에서 최적으로 이종성 유전자를 발현시키기 위해서는 유기체에서 사용되는 특정 코돈 사용 방식에 따라 핵산 서열을 변경시키는 것이 유리하다. 코돈 사용 방식은 본 유기체의 공지된 다른 유전자의 컴퓨터 분석의 도움을 통해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 프로모터를 적합한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 종결자 신호 또는 폴리아데닐화 신호에 융합시킴으로써 발현 카세트를 제조한다. 예를 들면, ([T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 또한 [T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)])에 기재되어 있는 것과 같은 보편적인 재조합 기법 및 클로닝 기법이 본 목적을 위해 사용된다.
적합한 숙주 유기체에서 발현시키기 위해서는 유전자를 숙주에서 최적으로 발현될 수 있도록 하는 숙주-특이 벡터내로 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물가 삽입되는 것이 유리하다. 벡터는 숙련인에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 클로닝 벡터[Pouwels P.H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985]에서 찾아볼 수 있다.
예를 들면, 적어도 하나의 벡터로 형질전환되고, 본 발명에 따라 사용되는 단백질을 생산하기 위하여 사용될 수 있는 재조합 미생물을 벡터의 도움으로 제조할 수 있다. 유리하게는, 상기-기술한, 본 발명의 재조합 작제물이 적합한 숙수 시스템내로 도입되고 발현된다. 이와 관련하여, 특정의 발현 시스템에서 상기 핵산이 발현될 수 있도록 하기 위해서는 숙련인에게 공지되어 있는 통상의 클로닝 및 형질감염 방법, 예를 들면, 공침전, 원형질체 융합, 전기 천공, 레트로바이러스 형질 감염 등이 사용되는 것이 바람직하다. 적합한 시스템은 예를 들면, ([Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997] 또는 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989])에 기재되어 있다.
상동적으로 재조합된 미생물도 제조할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 적어도 하나의 유전자 절편을 포함하는 벡터, 또는 본 서열을 변형시키기 위해, 예를 들면, 본 서열을 작용과 관련하여 손상시키기 위하여 적절한 경우, 적어도 하나의 아미노산 결실, 아미노산 첨가 또는 아미노산 치환이 도입되어 있는 적어도 하나의 코딩 서열 절편을 포함하는 벡터 (넉아웃 벡터)가 제조된다.
도입된 서열은 예를 들면, 관련 미생물로부터의 동족체일 수도 있거나, 포유동물, 효모 또는 곤충 공급원으로부터 유래될 수 있다. 별법으로, 상동성 재조합을 위해 사용되는 벡터는 상동성 재조합의 경우에서 내인성 유전자가 돌연변이화되거나 다르게는 변경되되, 여전히 작용 단백질을 코딩하도록 하는 방식으로 디자인될 수 있다 (즉, 상류 조절 영역은 내인성 단백질의 발현이 그로 인하여 변경되도록 하는 방식으로 변경될 수 있다). 본 발명에 따라 변경된 유전자 절편은 상동성 재조합 벡터에 존재한다. 상동성 재조합에 적합한 벡터의 작제는 예를 들면, [Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503]에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용되는 핵산 또는 핵산 작제물에 적합한 재조합 숙주 유기체는 대체로 임의의 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체이다. 유리하게는, 미생물, 예로서, 세균, 진균 또는 효모가 숙주 유기체로서 사용된다. 그람-양성 또는 그람-음성, 바람직하게, 엔테로박테리아세에(Enterobacteriaceae) 과, 슈도모나다세에(Pseudomonadaceae) 과, 리조비아세에(Rhizobiaceae) 과, 스트렙토마이세타세에(Streptomycetaceae) 과, 노카르디아세에(Nocardia) 과의 세균, 특히 바람직하게, 에스케리키아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 버홀더리아(Burkholderia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 애그로박테리움 속 또는 로도코코스(Rhodococcus) 속의 세균이 유리하게 사용된다.
융합 단백질 제조 방법에 사용되는 유기체는 숙주 유기체에 따라 숙련인에게 공지된 방식으로 성장되거나 배양된다. 미생물은 0℃ 내지 100℃, 바람직하게, 10℃ 내지 60℃의 온도하에, 산소를 공급받으면서, 보통 당 형태의 탄소 공급원, 유기 질소 공급원 형태의 질소 공급원, 예로서, 효모 추출물, 또는 염, 예로서, 황산암모늄, 미량 원소, 예로서, 철 염, 망간 염 및 마그네슘 염 및, 적절한 경우, 비타민을 포함하는 액체 배지에서 성장된다. 이와 관련하여, 액상 영양소의 pH는 고정값으로 유지될 수 있거나, 유지될 수 없고, 즉, 배양시 조절될 수 있거나 조절될 수 없다. 회분식, 반회분식, 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 영양소는 발효 시작시 초기에 도입될 수 있거나, 반연속적 또는 연속적인 방식으로 순차적으로 공급될 수 있다. 효소는 실시예에 기술된 방법에 의해 유기체로부터 단리될 수 있거나, 반응을 위해 조 추출물로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 단백질, 또는 그의 작용성의, 생물학적으로 활성인 단편은 재조합 방법을 사용하여, 단백질-생산 미생물을 배양하고, 단백질 발현을 유도하고, 적절한 경우, 상기 단백질을 배양물로부터 단리시킴으로써 제조될 수 있다. 단백질은 또한 필요하다면, 산업적 규모로 상기 방식을 통해 생산될 수 있다. 재조합 미생물을 공지 방법에 의해 배양하고, 발효시킬 수 있다. 세균은 예를 들면, TB 배지 또는 LB 배지에서, 20 내지 40℃의 온도하에, pH 6 내지 pH 9에서 번식될 수 있다. 적합한 배양 조건은 예를 들면, [T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용되는 단백질이 배양 배지내로 분비되지 못할 경우에는 세포를 파괴시키고, 공지된 단백질 단리 방법에 의해 산물을 분해물로부터 수득한다. 세포는 원하는 바에 따라, 고주파 초음파에 의해, 예를 들면, 프렌치 압력 셀에서 고압에 의해, 삼투 분해에 의해, 세제, 용균성 효소 또는 유기 용매에 의해, 균질화기에 의해, 또는 열거한 방법중 2개 이상의 조합에 의해 파괴될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 단백질은 공지된 크로마토그래픽 방법, 예로서, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 예를 들면, Q 세파로즈(Sepharose) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 또한, 통상의 다른 방법, 예로서, 한외여과, 결정화, 염석, 투석 및 고유의 전기영동을 사용하여 정제할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들면, [Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.
특정 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA를 연장시키고, 이로써, 예를 들면, 정제를 단순화시키는데 사용되는 변경된 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 또는 벡터 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 단리시키는 것이 유리할 수 있다. 이러한 종류의 적합한 변형에 대한 일례는, 앵커로서 작용하는 "태그" 예로서, 헥사-히스티딘 앵커로서 공지된 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인식될 수 있는 에피토프 (예를 들면, [Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press]에 기재된 것)이다. 다른 적합한 태그는 예를 들면, HA, 칼모듈린-BD, GST, MBD; 키틴-BD, 스트렙트아비딘-BD-avi-태그, Flag-태그, T7 등이다. 이들 앵커는 단백질을 고체 지지체, 예로서, 중합체 매트릭스에 부착시키는데 사용될 수 있으며, 예를 들면, 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼내 패킹될 수 있거나, 미량역가 플레이트 또는 또다른 지지체상에서 사용될 수 있다. 상응하는 정제 프로토콜은 시판되는 친화성 태그 공급처로부터 수득할 수 있다.
기술된 바와 같이 제조되는 단백질은 융합 단백질로서 직접 사용될 수 있거나, 융합 파트너를 절단하고 제거한 후에 "순수한" 하이드로포빈으로서 사용될 수 있다.
융합 파트너를 제거하고자 하는 경우, 잠재적 절단 부위 (프로테아제에 대한 특이 인식 부위)를 하이드로포빈 파트와 융합 파트너 파트 사이의 융합 단백질 내로 혼입시키도록 권고되어 진다. 적합한 절단 부위는 특히, 다르게는 하이드로포빈 파트에도 융합 파트너 파트에도 존재하지 않는 펩티드 서열로서, 이는 생물정보학 도구에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, Xa 인자를 사용하는 메티오닌상의 BrCN 절단 또는 프로테아제-매개 절단, 엔테로키나제 절단, 트로빈, TEV 절단 (담배 식각 바이러스(tobacco etch virus) 프로테아제)이 특히 적합하다.
발포 이전, 또는 이후에 예를 들면, 뢰디게(Lodige) 패들 혼합기를 사용하여 드럼에서 하이드로포빈을 적용시켜, 또는 예를 들면, 침액 또는 분무에 의해 상기 중합체 입자의 표면을 하이드로포빈-함유 용액과 접촉시킴으로써 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자를 코팅시킬 수 있다. 발포제를 함유하는 용융물을 압출시키는 것에 의한 제조법은 또한 하이드로포빈을 수중용 펠릿제조기의 수회로(water circuit)에 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자는 하이드로포빈 농도가 1 내지 100 g/ℓ이고, pH 범위가 5 내지 9인 수용액을 사용하여 코팅되는 것이 바람직하다. 하이드로포빈-함유 용액은 보통 0 내지 140℃ 범위, 바람직하게, 30 내지 80℃ 범위의 온도에서 적용된다.
본 발명에 따른 발포성 및 발포의, 열가소성 중합체 입자는 정전기 방지성이고, 발포시에 낮은 케이킹 경향을 나타내되, 발포시 우수한 융합을 나타냄으로써 성형체를 제공한다.
실시예 1
yaad
-
His
6
/
yaaE
-
His
6
의
클로닝을
위한 예비 작업
올리고뉴클레오티드 Hal570 및 Hal571 (Hal 572/Hal 573)의 도움으로 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 사용된 주형 DNA는 세균 바실러스 섭틸리스의 게놈 DNA였다. 수득된 PCR 단편은 바실러스 섭틸리스 yaaD/yaaE 유전자의 코딩 서열, 및 그의 말단에는 각각의 경우에 각각 NcoI 및 BglII 제한 절단 부위를 포함하였다. PCR 단편을 정제하고, 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 절단하였다. 이러한 DNA 단편을 삽입체로서 사용하고, 사전에 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 선형화된, 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수한 벡터 pQE60 내로 클로닝하였다. 그렇게 수득한 벡터, pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5는 각각 YAAD::HIS6 및 YAAE::HIS6로 구성된 단백질을 발현시키기 위하여 사용할 수 있다.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
실시예 2
yaad
하이드로포빈
DewA
-
His
6
의
클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 416 및 KaM 417을 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 사용된 주형 DNA는 사상균 아스퍼질러스 니듈란스의 게놈 DNA였다. 수득된 PCR 단편은 하이드로포빈 유전자 dewA의 코딩 서열, 및 N-말단 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하였다. PCR 단편을 정제하고, 제한 뉴클레아제 BamHI로 절단하였다. 이러한 DNA 단편을 삽입체로서 사용하고, 사전에 제한 뉴클레아제 BglII로 선형화된, pQE60YAAD#2 벡터 내로 클로닝하였다.
그렇게 수득한 벡터, #508은 YAAD::Xa::dewA::HIS6로 구성된 융합 단백질을 발현시키기 위하여 사용할 수 있다.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
실시예 3
yaad
하이드로포빈
RodA
-
His
6
의
클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 434 및 KaM 435를 사용하여 플라스미드 #513을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
실시예 4
yaad
하이드로포빈
BASF1
-
His
6
의
클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 사용하여 플라스미드 #507을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 사용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열-하이드로포빈 BASF1-(부록 참조)이였다.
KaM417:
CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
실시예 5
yaad
하이드로포빈
BASF2
-
His
6
의
클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 사용하여 플라스미드 #506을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 사용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열-하이드로포빈 BASF2-(부록 참조)였다.
KaM417:
CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
실시예 6
yaad
하이드로포빈
SC3
-
His
6
의
클로닝
올리고뉴클레오티드 KaM464 및 KaM465를 사용하여 플라스미드 #526을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 사용된 주형 DNA는 시조필륨 코뮨 cDNA였다 (부록 참조).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
실시예 7
재조합 E.
콜라이
균주
yaad
하이드로포빈
DewA
-
His
6
의 발효
15 ml의 그라이너(Greiner) 튜브에서 yaad 하이드로포빈 DewA-His6를 발현시키는 E. 콜라이 균주를 3 ml의 LB 액체 배지에 접종하였다. 8시간 동안 37℃에서 200 rpm으로 진탕기상에서 인큐베이션시켰다. 각 경우에서, 배플 및 250 ml의 LB 배지 (+ 100 ㎍/ml 앰피실린)를 포함하는 21ℓ의 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 에 사전배양물을 접종하고, 9시간 동안 37℃에서 180 rpm으로 진탕기상에서 인큐베이션시켰다. 20ℓ의 발효조에서 0.5ℓ의 사전배양물 (H2O에 대하녀 측정된 바 OD600nm 1:10)을 13.5ℓ의 LM 배지 (+100 ㎍/ml 앰피실린)에 접종하였다. 140 ml의 100 mM IPTG를 ~3.5의 OD60nm로 첨가하였다. 3시간 후, 발효조를 10℃까지 냉각시키고, 원심분리하여 발효 브로쓰를 제거하였다. 추가 정제를 위해 세포 펠릿을 사용하였다.
실시예 8
재조합 하이드로포빈 융합 단백질의 정제 (C-말단 His6 태그를 소지하는 하이드로포빈 융합 단백질의 정제)
100 g의 세포 펠릿 (100 - 500 mg의 하이드로포빈)은 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.5)로 보충하여 총 부피가 200 ml가 되도록 하고, 재현탁시켰다. 현탁액을 10분 동안 울트라투락스(Ultraturrax) 타입 T25 (얀케(Janke) 및 컨켈(Kunkel); IKA-라보테크닉(IKA-Labortechnik))로 처리한 후, 연속하여, 핵산을 분해시키기 위한 목적으로 1시간 동안 실온에서 500 단위의 벤조나제 (다름슈타트에 소재하는 머크(Merck); 주문 번호 1.01697.0001)와 함께 인큐베이션시켰다. 세포 파괴에 앞서, 유리 카트리지 (P1)를 사용하여 여과를 수행하였다. 세포를 파괴시키고, 잔류성 게놈 DNA를 전단시키기 위한 목적으로 1500 바에서 2개의 균질화기를 작동시켰다 (마이크로플루이다이저(Microfluidizer) M-110EH; 마이크로플루이딕스 코포레이션(Microfluidics Corp.)). 균질물을 원심분리하고 (소르발(Sorvall) RC-5B, GSA 로타(Rotor), 250 ml 원심분리 비이커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g), 상등액을 얼음 위에 놓고, 펠릿을 100 ml의 인산나트륨 완충액 (pH 7.5)에 재현탁시켰다. 원심분리와 재현탁을 3회에 걸쳐 반복하되, 3번째 반복시에는 인산나트륨 완충액이 1% SDS를 함유하였다. 재현탁시킨 후, 용액을 1시간 동안 교반하고, 이어서, 최종적으로 원심분리하였다(소르발RC-5B, GSA 로타, 250 ml 원심분리 비이커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g). SDS-PAGE 분석에 따라, 최종 원심분리 후, 하이드로포빈은 상등액에 존재하였다 (도 1). 본 실험은 하이드로포빈이 상응하는 E. 콜라이 세포에 가능하게는 봉입체 형태로 존재한다는 것을 나타낸다. 50 ml의 하이드로포빈-함유 상등액을, 50 mM Tris-Cl 완충액 (pH 8.0)로 평형화된 50 ml 니켈-세파로즈 고성능 17-5268-02 칼럼 (아머샴(Amersham))에 적용시켰다. 칼럼을 50 mM Tris-Cl 완충액 (pH 8.0)로 세척하고, 이어서, 하이드로포빈은 200 mM 이미다졸을 포함하는, 50 mM Tris-Cl 완충액으로 용출시켰다. 이미다졸을 제거하기 위한 목적으로 상기 용액을 50 mM Tris-Cl 완충액 (pH 8.0)에 대하여 투석시켰다.
도 1은 제조된 하이드로포빈의 정제를 도시한다:
레인 1: 니켈-세파로즈 칼럼에 적용된 용액 (1:10 희석액)
레인 2: 유동식(flow-through) = 세척 단계의 용출액
레인 3 - 5: 용출액 분획의 OD 280 피크
도 1의 하이드로포빈의 분자량은 대략 53 kD이었다. 일부의 더욱 작은 밴드는 하이드로포빈의 분해 산물을 나타낸다.
실시예 9
성능 시험;
유리상의
수적의
접촉각을
변화시킴에 의한
하이드로포빈의
특징화
기재:
유리 (창문 유리, 독일 만하임에 소재하는 쥐트도이체 글라스(Suddeutsche Glas)):
- 하이드로포빈 농도: 100 ㎍/mL
- 밤새도록 (온도 80℃) 50 mM 아세트산나트륨 (pH 4) + 0.1% 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트 (트윈(Tween)® 20)에서 유리 슬라이드 인큐베이션
- 코팅시킨 후, 증류수로 세척
- 10분/80℃/증류수중 1% 도데실황산나트륨 (SDS) 용액으로 인큐베이션시킨 후,
- 증류수로 세척
샘플을 대기 건조시키고, 5 ㎕의 수적의 접촉각 (°)을 실온에서 측정하였다
접촉각은 데이타픽스 컨택트 시스템(Dataphysics Contact Angle System) OCA 15+ 기기, 소프트웨어 SCA 20.2.0. (2002년 11월)상에서 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
처리하지 않은 유리의 접촉각은 30±5°였고, 실시예 8에 따른 작용성 하이드로포빈 (yaad-dewA-his6)으로 코팅하였을 때 접촉각은 75±5°였다.
실시예 10 및 11
하이드로포빈 pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6을 사용한 EPS 비드 코팅
코팅제:
실시예 8에 따라 사전처리된 (50 mM NaH2PO4 (pH 7.5), 하이드로포빈의 농도: 6.08 g/ℓ) 하이드로포빈 pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6 (서열 번호: 19) 수용액.
현탁액 중합화 (스티로포르(Styropor) ® F 315/N)에 의해 제조된 것으로서, 비드 크기의 범위가 0.7 내지 1.0 mm인, 코팅되지 않은, 발포성 폴리스티렌 (EPS) 비드를 건조시키고, 하기와 같이 코팅시켰다:
50 g의 EPS 비드는 스크류 캡을 갖는 500 ml 유리로 측량하고, 각각 10 ml 및 20 ml의 하이드로포빈 용액과 혼합하고, 24시간 동안 실온에서 로울러 혼합기상에서 교반하였다. 이어서, 하이드로포빈-코팅된 EPS 비드를 여과지에 포설시키고, 5시간 동안 실온에서 건조시켰다.
비교 실험 V1
실시예 10을 반복하되, 단, 하이드로포빈 용액 대신 10 ml의 증류수를 사용한다는 점에서만 차이가 있었다.
실시예 10 및 11의 코팅된 EPS 비드, 및 비교 실험의 것을 각각의 경우에서 2분 동안 100℃하에 사전-발포기에서 사전발포시켜 폴리스티렌 발포 비드를 수득하고, 3일 동안 저장한 후, 성형체로 융합시켰다. 2일 동안 저장한 후, 성형체를 반으로 깨뜨림으로써 융합의 질에 대하여 평가하였다.
사전발포되고, 건조된 폴리스티렌 발포 비드의 표면 내성을 측정하여 정전기 방지 성질을 평가하였다.
표 1
| 실시예 | 하이드로포빈 용액 | 사전발포된 EPS 비드의 케이킹 | 융합 | 정전기 방지성 (표면 내성) |
| 10 | 10 ml | 거의 없음 | 매우 우수 | <1010 ohm |
| 11 | 20 ml | 거의 없음 | 우수 | |
| V1 | 0 ml | 강함 | 열악 | >1014 ohm |
서열 목록의 DNA 및 폴리펩티드 서열에 대한 서열 명칭 지정
| dewA DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 1 |
| dewA 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 2 |
| rodA DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 3 |
| rodA 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 4 |
| hypA DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 5 |
| hypA 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 6 |
| hypB DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 7 |
| hypB 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 8 |
| sc3 DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 9 |
| sc3 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 10 |
| basf1 DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 11 |
| basf1 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 12 |
| basf2 DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 13 |
| basf2 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 14 |
| yaad DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 15 |
| yaad 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 16 |
| yaae DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 17 |
| yaae 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 18 |
| yaad-Xa-dewA-his6 DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 19 |
| yaad-Xa-dewA-his 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 20 |
| yaad-Xa-rodA-his DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 21 |
| yaad-Xa-rodA-his 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 22 |
| yaad-Xa-basf1-his DNA 및 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 23 |
| yaad-Xa-basf1-his 폴리펩티드 서열 | 서열 번호: 24 |
SEQUENCE LISTING
<110> BASF Aktiengesellschaft
<120> Recombinant preparation of hydrophobins
<130> AE 20040837
<160> 24
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 405
<212> DNA
<213> basf-dewA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<223>
<400> 1
atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc 336
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
ggc gct ggt acc aag gct gag 405
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130 135
<210> 2
<211> 135
<212> PRT
<213> basf-dewA
<400> 2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130 135
<210> 3
<211> 471
<212> DNA
<213> basf-rodA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(471)
<223>
<400> 3
atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65 70 75 80
ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100 105 110
gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115 120 125
att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att 432
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130 135 140
ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc 471
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145 150 155
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> basf-rodA
<400> 4
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100 105 110
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115 120 125
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130 135 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145 150 155
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> basf-HypA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223>
<400> 5
atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc 96
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20 25 30
gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35 40 45
acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt 192
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50 55 60
gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65 70 75 80
ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85 90 95
acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc 336
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> basf-HypA
<400> 6
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20 25 30
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35 40 45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50 55 60
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65 70 75 80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100 105 110
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> basf-HypB
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223>
<400> 7
atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65 70 75 80
atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
act ccc att aat gcc aat gtg 357
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> basf-HypB
<400> 8
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65 70 75 80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210> 9
<211> 408
<212> DNA
<213> basf-sc3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(408)
<223>
<400> 9
atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1 5 10 15
ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg 96
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg 144
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
acc atc gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tct tgc tgc 192
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
aac cag gtt caa tcg gcg agc agc agc cct gtt acc gcc ctc ctc ggc 240
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65 70 75 80
ctg ctc ggc att gtc ctc agc gac ctc aac gtt ctc gtt ggc atc agc 288
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
tgc tct ccc ctc act gtc atc ggt gtc gga ggc agc ggc tgt tcg gcg 336
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg atc aac atc 384
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
ggt tgc acc ccc atc aac atc ctc 408
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210> 10
<211> 136
<212> PRT
<213> basf-sc3
<400> 10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1 5 10 15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210> 11
<211> 483
<212> DNA
<213> basf-BASF1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(483)
<223>
<400> 11
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc 240
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65 70 75 80
ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85 90 95
ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc 336
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100 105 110
atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115 120 125
aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc 432
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130 135 140
gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat 480
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145 150 155 160
atg 483
Met
<210> 12
<211> 161
<212> PRT
<213> basf-BASF1
<400> 12
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85 90 95
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100 105 110
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115 120 125
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130 135 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145 150 155 160
Met
<210> 13
<211> 465
<212> DNA
<213> basf-BASF2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(465)
<223>
<400> 13
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
tac gcc ggc gac gtc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc 240
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc 336
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 384
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115 120 125
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145 150 155
<210> 14
<211> 155
<212> PRT
<213> basf-BASF2
<400> 14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115 120 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145 150 155
<210> 15
<211> 882
<212> DNA
<213> basf-yaad
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(882)
<223>
<400> 15
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
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aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
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ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
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gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
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tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
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atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
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Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
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tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
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aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
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tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
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245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
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cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96
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cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144
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gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288
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cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100 105 110
cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384
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cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432
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Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
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165 170 175
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180 185 190
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Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
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210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
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tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
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245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
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260 265 270
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405 410 415
atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
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Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
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20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
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100 105 110
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115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305 310 315 320
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325 330 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340 345 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355 360 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385 390 395 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405 410 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420 425 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435 440 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
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His
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<400> 23
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1 5 10 15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65 70 75 80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
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ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305 310 315 320
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Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
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Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
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65 70 75 80
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85 90 95
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Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
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His His His His His
465
Claims (10)
- 하이드로포빈을 포함하는 코팅을 갖는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.
- 제1항에 있어서, 코팅이 열가소성 중합체에 기초하여, 1 내지 5000 ppm의 하이드로포빈을 포함하는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.
- 제1항에 있어서, 열가소성 중합체가 폴리스티렌 또는 폴리올레핀으로 구성된, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 평균 입자 직경이 0.05 내지 5 mm 범위인, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 코팅이 하기 일반식(II)의 하이드로포빈을 포함하는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)상기 식에서, X는 20개의 자연적으로 발생된 아미노산중 임의의 것이고,n 및 m은 0 내지 500의 수이며,C는 시스테인이다.
- 제4항에 있어서, 코팅이 하기 일반식(III)의 하이드로포빈을 포함하는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.Xn-C1-X5 -9-C2-C3-X11 -39-C4-X2 -23-C5-X5 -9-C6-C7-X6 -18-C8-Xm (III)
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 코팅이 dewA, rodA, hjypA, hypB, sc3, basf1 또는 basf2 유형의 하이드로포빈을 포함하는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자.
- 중합체 입자의 표면을 하이드로포빈-함유 용액과 접촉시키는, 발포성 또는 발포의, 열가소성 중합체 입자를 코팅시키는 방법.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 하이드로포빈-함유 용액은 하이드로포빈 농도가 1 내지 100 g/ℓ이고, pH가 5 내지 9 범위인 수용액인 방법.
- 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 표면을 0 내지 140℃ 범위의 온도에서 하이드로포빈-함유 용액과 접촉시키는 방법.
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