ES2314926T3

ES2314926T3 - Hodrofobina como agente de recubrimiento para particulas polimeras termoplasticas, expandibles o expandidas.

Info

Publication number: ES2314926T3
Application number: ES06763606T
Authority: ES
Inventors: Christian Exner; Ulf Baus; Jan Holoch; Claus Bollschweiler; Thomas Subkowski; Marvin Karos; Hans-Georg Lemaire
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2026-06-09
Also published as: DE102005027039A1; WO2006131555A1; CN101189290A; KR20080027826A; MX2007015339A; EP1893675A1; EP1893675B9; DE502006001702D1; CA2611254A1; US20090162659A1; ATE409721T1; JP2008545867A; EP1893675B1

Abstract

Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, con un recubrimiento que contiene hidrofobina.

Description

Hidrofobina como agente de recubrimiento para partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas.

La invención se refiere a partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas con un recubrimiento, que contiene hidrofobina, así como a procedimientos para su obtención.

Con el fin de posibilitar el transporte de poliestireno expandible en ausencia de perturbaciones y para evitar la carga electrostática de las partículas de espuma de poliestireno, sometidas a una transformación previa en forma de espuma, se utiliza, por regla general, un recubrimiento de las partículas de EPS con un antiestático. La abrasión o el arrastre por lavado del agente de recubrimiento desde la superficie de las partículas conducen, frecuentemente, a propiedades antiestáticas no satisfactorias. Por otra parte, el recubrimiento con el antiestático puede conducir al pegado de las partículas y a un mal comportamiento al desparramamiento.

La publicación EP-A 470 455 describe polímeros de estireno expandibles, antiestáticos, en forma de perlas, con un recubrimiento constituido por una sal de amonio cuaternario y por ácido silícico finamente dividido, que se caracterizan por un buen comportamiento al desparramamiento.

Las hidrofobinas son pequeñas proteínas de aproximadamente 100 hasta 150 aminoácidos, que son características de los hongos filamentosos, por ejemplo de Schizophyllum commune. Por regla general éstas presentan 8 unidades de cisteína.

Las hidrofobinas presentan una marcada afinidad con las superficies límite y son adecuadas, por lo tanto, para el recubrimiento de superficies. De este modo, puede revestirse, por ejemplo, el teflón con ayuda de las hidrofobinas obteniéndose una superficie hidrófila.

Las hidrofobinas pueden ser aisladas a partir de fuentes naturales. Nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4 divulga un procedimiento para la obtención de hidrofobinas.

En el estado de la técnica ha sido propuesto el empleo de las hidrofobinas para diversas aplicaciones.

La publicación WO 96/41882 propone el empleo de las hidrofobinas como emulsionantes, espesantes, substancias tensioactivas, para la hidrofilación de superficies hidrófobas, para mejorar la resistencia al agua de los substratos hidrófilos, para la obtención de emulsiones de aceite-en-agua o de emulsiones de agua-en-aceite. Por otra parte, se han propuesto aplicaciones farmacéuticas tal como la obtención de ungüentos o de cremas así como aplicaciones cosméticas tales como la protección de la piel o la fabricación de champúes capilares o de enjuagues capilares.

La publicación WO 01/57528 divulga el recubrimiento de ventanas, de lentes de contacto, de biosensores, de dispositivos medicinales, de recipientes para la realización de ensayos o para el almacenamiento, para cascos de buques, para partículas sólidas o para bastidores o carrocerías de vehículos automóviles con una solución, que contiene hidrofobina, a una temperatura comprendida entre 30 y 80ºC.

La publicación WO 03/53383 divulga el empleo de hidrofobina para el tratamiento de materiales de queratina en aplicaciones cosméticas.

La publicación WO 03/10331 divulga un sensor recubierto con hidrofobina, por ejemplo un electrodo de medición, sobre el cual están enlazadas otras substancias no covalentes, por ejemplo substancias electroactivas, anticuerpos o enzimas.

La tarea de la presente invención consistía, por lo tanto, en paliar los inconvenientes citados y encontrar un agente de recubrimiento antiestático para partículas polímeras termoplásticas expandibles o expandidas, que muestre una menor tendencia al pegado de las partículas durante la transformación previa en forma de espuma o durante la transformación en forma de espuma para dar densidades menores.

Por lo tanto, se encontraron las partículas polímeras termoplásticas expandibles o expandidas, que han sido citadas precedentemente.

De manera preferente, el recubrimiento contiene entre 1 y 5.000 ppm, de manera especial entre 10 y 1.000 ppm de hidrofobina, referido al polímero termoplástico. El recubrimiento puede contener otros antiestáticos y/o otros productos auxiliares para el recubrimiento o puede ser aplicado sobre otros recubrimientos con otros agentes de recubrimiento. Es especialmente preferente un recubrimiento que esté constituido únicamente por hidrofobina o por mezclas de hidrofobinas y que forme una capa monomolecular sobre las partículas polímeras termoplásticas expandibles o expandidas.

Para las partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, se emplean, de manera preferente, polímeros del estireno, tales como el poliestireno (EPS) o las poliolefinas, tales como el polietileno (EPE) o el polipropileno (EPP).

Las partículas polímeras termoplásticas expandibles son aquellas que pueden ser espumadas por ejemplo por medio de aire caliente o de vapor de agua para dar partículas polímeras termoplásticas expandidas. Estas contienen, por regla general, agentes propulsores químicos o físicos en cantidades comprendidas entre un 2 y un 10% en peso, de manera preferente comprendidas entre un 3 y un 7% en peso, referido al polímero termoplástico.

Los agentes propulsores físicos preferentes son los gases, tales como el nitrógeno o el dióxido de carbono o los hidrocarburos alifáticos con 2 hasta 7 átomos de carbono, los alcoholes, las cetonas, los éteres o los hidrocarburos halogenados. De manera especialmente preferente, se emplean el iso-butano, el n-butano, el iso-pentano, el n-pentano, el neo-pentano, el hexano o mezclas de los mismos.

Por otra parte, las partículas polímeras termoplásticas expandibles y expandidas pueden contener productos auxiliares usuales tales como colorantes, pigmentos, materiales de carga, absorbedores de los IR, tales como hollín, aluminio o grafito, estabilizantes, agentes protectores contra la llama tal como el hexabromociclododecano (HBCD), sinérgicos protectores contra la llama, tales como el dicumilo o el peróxido de dicumilo, formadores de gérmenes o agentes lubrificantes en cantidades activas.

Las partículas polímeras termoplásticas, expandibles, de conformidad con la invención, pueden tener una forma esférica o bien pueden presentar una forma de perla o una forma cilíndrica según el procedimiento de obtención y por regla general presentan un diámetro medio de las partículas situado en el intervalo comprendido entre 0,05 y 5 mm, de manera especial comprendido entre 0,3 y 2,5 mm, que pueden ser clasificadas en fracciones individuales en caso dado mediante tamización.

Las partículas polímeras termoplásticas expandidas tienen diámetros medios de las partículas, de conformidad con el grado de expansión, situados en el intervalo comprendido entre 1 y 10 mm, de manera especial comprendido entre 2 y 6 mm y una densidad situada en el intervalo comprendido entre 10 y 200 kg/m^{3}.

Las partículas polímeras termoplásticas expandibles pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante impregnación a presión de las partículas polímeras termoplásticas con agentes propulsores en una cuba, mediante polimerización en suspensión en presencia de agentes propulsores o mediante impregnación en fusión en una extrusora o en un mezclador estático y, a continuación, granulación a presión bajo agua.

Las partículas polímeras termoplásticas expandidas pueden ser obtenidas mediante la transformación en forma de espuma de partículas polímeras termoplásticas expandibles, por ejemplo con aire caliente o con vapor de agua en dispositivos para la transformación previa en forma de espuma, bajo presión, mediante la impregnación a presión de las partículas polímeras termoplásticas con agentes propulsores en una cuba y, a continuación, descompresión o mediante extrusión en fusión de una fusión, que contenga agentes propulsores, con transformación en forma de espuma y subsiguiente granulación.

En el sentido de esta invención se entenderá, a continuación, por el concepto de "hidrofobinas" aquellas proteínas de la fórmula estructural general (I)

X_{n}-C^{1}-X_{1-50}-C^{2}-X_{0-5}-C^{3}-X_{1-100}-C^{4}-X_{1-100}-C^{5}-X_{1-50}-C^{6}-X_{0-5}C^{7}-X_{1-50}-C^{8}-X_{m}\hskip0,8cm (I)

en la que X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). En este caso, X pueden ser respectivamente iguales o diferentes. En esta ocasión, los índices que aparecen en X representan, respectivamente, el número de los aminoácidos, C significa cisteína y los índices n y m significan, de manera independiente entre sí, números naturales comprendidos entre 0 y 500, de manera preferente, comprendidos entre 15 y 300.

Así mismo, los polipéptidos, de conformidad con la fórmula (I), están caracterizados por la propiedad de que provocan, a temperatura ambiente, tras el recubrimiento de una superficie de vidrio, un aumento del ángulo de contacto de una gota de agua de, al menos, 20º, de manera preferente de, al menos, 25º y, de manera especialmente preferente, de 30º, respectivamente en comparación con el ángulo de contacto de una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no recubierta.

Las cisteínas denominadas con C^{1} hasta C^{8} pueden presentarse bien en estado reducido o pueden formar entre sí puentes de disulfuro. Es especialmente preferente la formación intramolecular de puentes C-C, de manera especial la formación con, al menos, 1, de manera preferente con 2, de manera especialmente preferente, con 3 y, de manera muy especialmente preferente, con 4 puentes de disulfuro intramoleculares.

Para la realización de la presente invención se emplean, de manera preferente, las hidrofobinas de la fórmula general (II)

X_{n}-C^{1}-X_{3-25}-C^{2}-X_{0-2}-C^{3}-X_{5-50}-C^{4}-X_{2-35}-C^{5}-X_{2-15}-C^{6}-X_{0-2}C^{7}-X_{3-35}-C^{8}-X_{m}\hskip0,8cm (II)

en la que X, C y los índices que se encuentran en X y en C, tienen el significado precedentemente indicado, sin embargo los índices n y m significan números comprendidos entre 0 y 300, y las proteínas se caracterizan, además, por la modificación del ángulo de contacto que ha sido citada precedentemente.

De manera especialmente preferente, se emplean las hidrofobinas de la fórmula general (III)

(III)X_{n}-C^{1}-X_{5-9}-C^{2}-C^{3}-X_{11-39}-C^{4}-X_{2-23}-C^{5}-X_{5-9}-C^{6}-C^{7}-X_{5-18}-C^{8}-X_{m}

en la que X, C y los índices que se encuentran en X y en C tienen el significado que han sido indicado precedentemente, los índices n y m significan números comprendidos entre 0 y 200, y caracterizándose las proteínas así mismo por la modificación del ángulo de contacto que ha sido citada precedentemente.

Los restos X_{n} y X_{m} pueden estar constituidos por secuencias péptidas, que están enlazadas de manera natural con una hidrofobina. Sin embargo, uno o ambos restos pueden estar constituidos por secuencias péptidas, que no están enlazadas de manera natural con una hidrofobina. Bajo este concepto debe entenderse, también, aquellos restos X_{n} y/o X_{m}, en los cuales está prolongada una secuencia péptida, que se presenta de manera natural en una hidrofobina, por medio de una secuencia péptida, que se presenta de manera no natural en una hidrofobina.

Cuando X_{n} y/o X_{m} estén constituidos por secuencias péptidos, no enlazadas de manera natural con hidrofobinas, tales secuencias tienen una longitud, por regla general, de al menos 20, de manera preferente de, al menos, 35, de manera especialmente preferente de, al menos, 50 y, de manera muy especialmente preferente de, al menos, 100 aminoácidos. Un resto de este tipo que no está enlazado de manera natural con una hidrofobina, se denomina a continuación, también, como participante en la fusión. De este modo, quiere indicarse que las proteínas pueden estar constituidas por, al menos, una parte de hidrofobina y por un participante en la fusión, que no se presentan juntas en la naturaleza en esta forma.

El participante en la fusión puede ser elegido entre una pluralidad de proteínas. Así mismo pueden enlazarse varios participantes en la fusión con una parte de hidrofobina, por ejemplo en el extremo amino (X_{n}) y en el extremo carboxi (X_{m}) de la parte de hidrofobina. Sin embargo también pueden enlazarse, por ejemplo, dos partes de participantes en la fusión con una posición (X_{n} o X_{m}) de la proteína de conformidad con la invención.

Las partes de los participantes en la fusión, especialmente adecuadas, son aquellas proteínas que están presentes en los microorganismos de manera natural, especialmente en E. coli o en Bacillus subtilis. Ejemplos de tales partes de los participantes en la fusión son las secuencias yaad (SEQ ID NO:15 y 16), yaae(SEQ ID NO:17 y 18), y tiorredoxina. Así mismo son perfectamente adecuados los fragmentos o los derivados de estas secuencias citadas, que abarquen únicamente una parte, preferentemente entre un 70 y un 99%, de manera especialmente preferente, entre un 80 y un 98% de las secuencias citadas, o en los cuales estén modificados aminoácidos o bien nucleótidos individuales frente a la secuencia citada, refiriéndose las indicaciones en porcentaje respectivamente al número de los aminoácidos.

Las proteínas, que son empleadas de conformidad con la invención, pueden estar modificadas también en su secuencia polipéptida, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación o incluso mediante reticulación química, por ejemplo con glutarodialdehído.

Una propiedad de las proteínas, que son empleadas de conformidad con la invención, consiste en la modificación de las propiedades superficiales cuando las superficies son recubiertas con las proteínas. La modificación de las propiedades superficiales puede determinarse experimentalmente midiéndose el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después del recubrimiento de la superficie con la proteína y determinándose la diferencia de ambas mediciones.

La realización de las mediciones del ángulo de contacto es conocida en principio por el técnico en la materia. Las mediciones se refieren a la temperatura ambiente así como a las gotas de agua de 5 \Box|. Las condiciones experimentales exactas para un método adecuado, destinado por ejemplo a la medición del ángulo de contacto han sido indicadas en la parte experimental. Bajo las condiciones allí citadas, las proteínas, que se emplean de conformidad con la invención, tienen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto en, al menos, 20º, de manera preferente en, al menos, 25º, de manera especialmente preferente en, al menos, 30º, respectivamente en comparación con el ángulo de contacto de una gota de agua de igual tamaño con la superficie de vidrio no recubierta.

En la parte de hidrofobina, de las hidrofobinas conocidas hasta ahora, están conservadas las posiciones de los aminoácidos polares y no polares, lo cual se pone de manifiesto por medio de una gráfica característica de la hidrofobicidad. Las diferencias en las propiedades biofísicas y en la hidrofobicidad conducen a la clasificación de las hidrofobinas, que son conocidas hasta ahora, en dos clases, I y II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

Las membranas ensambladas, que están constituidas por las hidrofobinas de la clase I, son altamente insolubles (incluso frente al dodecilsulfato de Na (SDS) al 1% a temperatura elevada) y únicamente pueden volverse a disociar por medio de ácido trifluoracético concentrado (TFA) o bien ácido fórmico. Por el contrario, las formas ensambladas de las hidrofobinas de la clase II son menos estables. Éstas pueden disolverse de nuevo ya con etanol al 60% o bien con SDS al 1% (a la temperatura ambiente).

Una comparación entre las secuencias de los aminoácidos muestra que la longitud del intervalo comprendido entre la cisteína C^{3} y C^{4} en las hidrofobinas de la clase II es claramente más corta que en el caso de las hidrofobinas de la clase I. Las hidrofobinas de la clase II presentan así mismo un número mayor de aminoácidos cargados que la clase I.

Las hidrofobinas, especialmente preferentes, para la realización de la presente invención, son las hidrofobinas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, que están estructuralmente caracterizadas en el protocolo de secuencias dado más adelante. Así mismo puede tratarse tan sólo de una parte o de derivados de las mismas. Así mismo pueden estar enlazadas entre sí varias partes de hidrofobina, preferentemente 2 o 3, de estructura idéntica o diferente y pueden estar enlazadas con una secuencia polipéptida adecuada correspondiente, que no esté enlazada de manera natural con una hidrofobina.

Para la realización de la presente invención son especialmente adecuadas, así mismo, las proteínas de fusión con las secuencias polipéptidas representadas en las SEQ ID NO: 20, 22, 24 así como con las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, especialmente las secuencias de conformidad con las SEQ ID NO: 19, 21, 23. Así mismo constituyen formas de realización especialmente preferentes las proteínas que se producen a partir de las secuencias polipéptidas representadas en las SEQ ID NO. 22, 22 o 24 mediante intercambio, inserción o deleción de, al menos, uno, hasta inclusive un 10, de manera preferente un 5, de manera especialmente preferente un 5% de todos los aminoácidos, y que tienen todavía al menos el 50% de la propiedad biológica de las proteínas de partida. En este caso se entenderá por propiedad biológica el aumento, que ya ha sido descrito, del ángulo de contacto en al menos 20º.

Las proteínas, que son empleadas de conformidad con la invención, pueden prepararse químicamente con ayuda de procedimientos conocidos de la síntesis de péptidos, por ejemplo mediante síntesis en fase sólida según Merrifield.

Las hidrofobinas de origen natural pueden aislarse a partir de fuentes naturales con ayuda de métodos adecuados. De manera ejemplificativa, se da referencia a la publicación de Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o a la publicación WO 96/41882.

La obtención de las proteínas de fusión puede llevarse a cabo, de manera preferente, mediante procedimientos de ingeniería genética, según los cuales se combinan un participante en la fusión y una secuencia de ácidos nucleicos, que codifique la parte de la hidrofobina, especialmente la secuencia de ADN, de tal manera, que se genere la proteína deseada en un organismo huésped mediante la expresión génica de la secuencia de ácidos nucleicos combinada. Un procedimiento de obtención de este tipo ha sido divulgado en nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4.

Los organismos huésped adecuados (organismos productores) para el procedimiento de obtención citado pueden ser en este caso procariotas (con inclusión de la Archaea) o eucariotas, de manera especial bacterias con inclusión de halobacterias y de metanococos, hongos, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos, de manera especialmente preferente, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus, megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (y respectivamente las células emparentadas) y similares.

El objeto de la invención está constituido, además, por el empleo de constructos de expresión, que contienen secuencias de ácidos nucleicos reguladoras bajo control genético, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido, empleado de conformidad con la invención, así como vectores que comprenden, al menos, uno de estos constructos de expresión.

De manera preferente, los constructos empleados abarcan un promotor aguas arriba, en el sentido 5', de la correspondiente secuencia codificante y aguas abajo, en el sentido 3', una secuencia terminadora así como, en caso dado, otos elementos reguladores usuales y, concretamente, enlazados respectivamente de manera operativa con la secuencia codificante.

Se entiende por el concepto de "enlace operativo" la disposición secuencial del promotor, de la secuencia codificante, del terminador y, en caso dado, de otros elementos reguladores de tal manera, que cada uno de los elementos reguladores pueda ejercer su función prevista a la hora de la expresión de la secuencia codificante.

Ejemplos de secuencias que pueden ser enlazadas de manera operativa son las secuencias directrices así como los reforzadores, las señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores abarcan los marcadores seleccionables, los señales de amplificación, los orígenes de replicación y similares. Las secuencias reguladoras, adecuadas, están descritas, por ejemplo, en la publicación de Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Además de estas secuencias reguladoras puede estar presente también la regulación natural de estas secuencias por delante de los genes estructurales propiamente dichos y pueden haber sido modificados genéticamente en caso dado de tal manera, que se elimine la regulación natural y se aumente la expresión de los genes.

Un constructo de ácidos nucleicos preferente contiene, de manera ventajosa, también una o varias de las secuencias "reforzadoras" que ya han sido citadas, enlazadas funcionalmente con el promotor, que posibiliten una expresión acrecentada de la secuencia de los ácidos nucleicos. Así mismo pueden insertarse, de manera adicional, secuencias ventajosas en el extremo 3' de las secuencias de ADN, tales como otros elementos reguladores o terminadores.

Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en el constructo en una o en varias copias. Así mismo, en el constructo pueden estar contenidos otros marcadores, tales como genes resistentes a los antibióticos o complementarios de las auxotrofias, en caso dado para selección sobre el constructo.

Las secuencias reguladoras ventajosas para el procedimiento están contenidas, por ejemplo, en los promotores tales como los promotores cos, tac, trp, tet, trp, tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR o el promotor imlambda-P, que encuentran aplicación, de manera ventajosa, en bacterias gram-negativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levadura o en los promotores de fúngicos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Así mismo pueden emplearse promotores artificiales para la regulación.

El constructo de los ácidos nucleicos se inserta, para la expresión, en un organismo huésped, de manera ventajosa en un vector, tal como por ejemplo en un plásmido o en un fago, que posibilite una expresión óptima de los genes en el huésped. Se entenderá por vectores, además de los plásmidos y de los fagos, también todos los otros vectores conocidos por el técnico en la materia, es decir por ejemplo los virus tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposonas, elementos IS, plásmidos, cósmidos y ADN lineal o circular, así como sistemas de agrobacterium.

Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o pueden replicarse de manera cromosómica. Estos vectores representan otra configuración de la invención. Los plásmidos adecuados son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 o pBdCl, en Streptomyces plJ101, pIJ364, pIJ702 o plJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pIL2 o pBB116, en levaduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos citados representan una pequeña selección de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos por el técnico en la materia y pueden tomarse por ejemplo del libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ámsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

De manera ventajosa, el constructo de los ácidos nucleicos contiene además, para la expresión de otros genes contenidos, secuencias reguladoras en el extremo 3' y/o en el extremo 5' para aumentar la expresión, que son elegidas para una expresión óptima de conformidad con el organismo huésped seleccionado y del gen o de los genes.

Estas secuencias reguladoras deben posibilitar la expresión específica de los genes y de la expresión proteica. Esto puede significar por ejemplo, según el organismo huésped, que el gen es expresado o sobreexpresado únicamente tras inducción o que es expresado y/o que es sobreexpresado inmediatamente.

Las secuencias o bien los factores reguladores pueden influenciar, en este caso, positivamente, de manera preferente, la expresión génica de los genes insertados y, de este modo, pueden aumentarla. De este modo, puede producirse un reforzamiento de los elementos reguladores ventajosamente en el plano de la transcripción, mediante el empleo de señales potentes de transcripción tales como promotores y/o "reforzadores". Por otra parte es posible así mismo un reforzamiento de la traducción mejorándose, por ejemplo, la estabilidad del ARN mensajero (mRNA).

En otra forma de realización del vector puede insertarse en los microorganismos el vector, que contiene el constructo de los ácidos nucleicos o que contienen los ácidos nucleicos, también, de manera ventajosa, en forma de un ADN lineal y puede integrarse en el genoma del organismo huésped a través de una recombinación heteróloga o de una recombinación homóloga. Este ADN lineal puede estar constituido por un vector linealizado tal como un plásmido o puede estar constituido únicamente por el constructo de los ácidos nucleicos o por los ácidos nucleicos.

Para una expresión óptima de los genes heterólogos en organismos es ventajoso modificar las secuencias de los ácidos nucleicos de acuerdo con el empleo de codones "codon usage" específico utilizado en el organismo. El empleo de codones "codon usage" puede determinarse fácilmente por medio de evaluaciones con ayuda de ordenador de otros genes conocidos del organismo correspondiente.

La obtención de una caja de expresión se lleva a cabo mediante la fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótidos codificante adecuada así como con una señal de terminador o señal de poliadenilación. Con esta finalidad se utilizan las técnicas usuales de recombinación y de clonación, como las que están descritas en la publicación T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en la publicación de T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en la publicación de Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

El constructo de ácidos nucleicos recombinante o bien el constructo génico se inserta, para la expresión en un organismo huésped adecuado, ventajosamente en un vector específico del huésped, que posibilite una expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son perfectamente conocidos por el técnico en la materia y pueden tomarse, por ejemplo, de la publicación "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Ámsterdam-New York-Oxford, 1985).

Con ayuda de los vectores pueden prepararse microorganismos recombinantes, que estén transformados por ejemplo con al menos un vector y que pueden ser empleados para la producción de las proteínas, que son empleadas de conformidad con la invención. De manera ventajosa, se introducen y se expresan los constructos recombinantes, que han sido descritos precedentemente, en un sistema huésped adecuado. En este caso se emplean, de manera preferente, los métodos de clonación y de transfección usuales, que son conocidos por el técnico en la materia, tales como por ejemplo la coprecipitación, la fusión del protoplastos, la electroporación, la transfección retroviral y similares, con objeto de que los citados ácidos nucleicos sean expresados en el sistema de expresión correspondiente. Los sistemas adecuados han sido descritos, por ejemplo, en la publicación Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, o en la publicación Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

De igual modo, pueden prepararse microorganismos recombinados homólogos. Con esta finalidad se prepara un vector, que contenga al menos un segmento de un gen, a ser empleado de conformidad con la invención, o de una secuencia codificante, habiéndose introducido en caso dado al menos una deleción, una adición o una substitución de aminoácidos con objeto de modificar la secuencia, por ejemplo con objeto de interrumpirla funcionalmente (vector inactivado "Knockout"). La secuencia introducida puede ser por ejemplo, también, un homólogo procedente de un microorganismo emparentado o puede derivarse de una fuente de un mamífero, de una levadura o de un insecto. El vector, empleado para la recombinación homóloga, puede estar configurado alternativamente de tal manera, que el gen endógeno se mute en el momento de la recombinación homóloga o que sea modificado de otro modo pero que, sin embargo, codifique todavía la proteína funcional (por ejemplo puede modificarse la región reguladora situada hacia arriba, en el sentido 5' de tal manera, que se modifique por este motivo la expresión de la proteína endógena). El segmento modificado del gen, empleado de conformidad con la invención, está en el vector de recombinación homólogo. La construcción de los vectores adecuados para la recombinación homóloga está descrita, por ejemplo, en la publicación de Thomas, K. R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Como organismos huésped recombinantes para los ácidos nucleicos empleados de conformidad con la invención o para el constructo de ácidos nucleicos entran en consideración, en principio, todos los organismos procariotas o eucariotas. De manera ventajosa, se emplean como organismos huésped los microorganismos tales como las bacterias, los hongos o las levaduras. De manera ventajosa, se emplean bacterias gram positivas o gram negativas, de manera preferente bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, de manera especialmente preferente, bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus.

Los organismos, que son empleados en el procedimiento de obtención para las proteínas de fusión, se cultivan o se obtienen por selección, de manera conocida por el técnico en la materia, de conformidad con el organismo huésped. Los microorganismos son cultivados, por regla general, en un medio líquido, que contiene una fuente de carbono, en la mayoría de los casos en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, en la mayoría de los casos en forma de una fuente de nitrógeno orgánico tal como extracto de levadura o sales tal como el sulfato de amonio, elementos en trazas tales como sales de hierro, de manganeso o de magnesio así como, en caso dado, vitaminas, a temperaturas comprendidas entre 0 y 100ºC, de manera preferente, comprendidas entre 10 y 60ºC bajo gasificación con oxígeno. En este caso puede mantenerse el valor del pH del líquido nutriente a un valor fijo, es decir que se regula o no durante el cultivo. El cultivo puede llevarse a cabo por "tandas", por "semitandas" o de manera continua. Los nutrientes pueden ser dispuestos inicialmente al comienzo de la fermentación o pueden ser realimentados de manera semicontinua o de manera continua. Los enzimas pueden ser aislados a partir de los organismos según los procedimientos que han sido descritos en los ejemplos o pueden ser empleados como extracto en bruto para la reacción.

De conformidad con la invención, pueden prepararse las proteínas o los fragmentos funcionales, biológicamente activos de las mismas, por medio de un procedimiento recombinante, según el cual se cultiva un microorganismo productor de la proteína, en caso dado se induce la expresión de la proteína y ésta se aísla a partir del cultivo. Las proteínas pueden producirse de este modo, incluso, a escala industrial, cuando esto sea deseado. El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado según procedimientos conocidos. Las bacterias pueden multiplicarse, por ejemplo, en el medio TB o en el medio LB y a una temperatura comprendida entre 20 y 40ºC y a un valor del pH comprendido entre 6 y 9. En particular se han descrito condiciones adecuadas para el cultivo por ejemplo en la publicación de T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Las células son sometidas, a continuación, a una digestión, en caso en que las proteínas, empleadas de conformidad con la invención, no hayan sido troceadas en el medio de cultivo, y el producto se obtiene a partir del lisato según procedimientos conocidos para el aislamiento de proteínas. Las células pueden ser digeridas, a elección, mediante ultrasonidos de alta frecuencia, mediante alta presión, tal como por ejemplo en una célula a presión de French, mediante osmolisis, mediante la acción de detergentes, de enzimas lisadores o disolventes orgánicos, mediante homogeneizadores o mediante la combinación de varios de los procedimientos citados.

Puede conseguirse una purificación de las proteínas, empleadas de conformidad con la invención, con ayuda de procedimientos cromatográficos conocidos, tales como la cromatografía en tamiz molecular (filtración en gel), tal como la cromatografía con Q-Sepharose, la cromatografía con intercambio iónico y la cromatografía hidrófoba, así como con otros procedimientos usuales tales como la ultrafiltración, la cristalización, la precipitación por salificación, la diálisis y la electrofóresis de gel nativa. Los procedimientos adecuados están descritos, por ejemplo, en la publicación de Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York o en la publicación de Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.

Para el aislamiento de la proteína recombinante puede ser ventajoso el empleo de sistemas vectoriales o de oligonucleótidos, que prolonguen al ADNc con un número determinado de secuencias de nucleótidos y que codifiquen, de este modo, proteínas modificadas o proteínas de fusión, que sirven por ejemplo para una purificación más sencilla. Tales modificaciones adecuadas abarcan los denominados marcadores "Tags", que actúan como colas, tal como por ejemplo la modificación conocida como cola de hexa-histidina o los epitopos, que pueden ser reconocidos como antígenos de anticuerpos (descritos por ejemplo en la publicación de Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Otros marcadores adecuados son, por ejemplo HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, esteptavidina-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7, etc. Estas colas pueden servir para el amarre de la proteína sobre un soporte sólido, tal como por ejemplo una matriz polímera, que puede estar cargada por ejemplo en una columna de cromatografía, o pueden ser empleadas sobre una placa de microtitulación o sobre un soporte de otro tipo. Los protocolos de purificación correspondientes pueden ser adquiridos en los suministradores comerciales de Tag de afinidad.

Las proteínas, preparadas como se ha descrito, pueden ser empleadas tanto directamente, a modo de proteínas de fusión, así como, también, tras disociación y separación del participante en la fusión, a modo de hidrofobinas "puras".

Cuando esté prevista una separación del participante en la fusión, es recomendable establecer un punto potencial de rotura (punto de reconocimiento específico por parte de las proteasas) en la proteína de fusión entre la parte de la hidrofobina y la parte del participante en la fusión. Como puntos de rotura son adecuadas, de manera especial, aquellas secuencias péptidas que no estén presentes en otro caso ni en la parte de hidrofobina ni en la parte del participante en la fusión, lo cual puede determinarse fácilmente con herramientas bioinformáticas. Son especialmente adecuadas, por ejemplo, la disociación con BrCN sobre metionina o la disociación, inducida por proteasa, con factor de disociación Xa, de enterocinasa, de trombina, de TEV (proteasa del virus del grabado del tabaco -Tobacco etch virus protease-).

El recubrimiento de las partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas puede llevarse a cabo antes o después de la transformación en forma de espuma, por ejemplo mediante aplicación superficial por rotación de la hidrofobina en un mezclador de paletas (firma Lödige) o mediante la puesta en contacto de la superficie de las partículas polímeras con una solución que contenga la hidrofobina, por ejemplo mediante inmersión o mediante atomización. En un momento de la obtención mediante extrusión de una fusión que contenga agentes propulsores, podrá aportarse la hidrofobina también al circuito cerrado de agua del granulador bajo agua.

De manera preferente, se emplea para el recubrimiento de las partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, una solución acuosa con una concentración comprendida entre 1 y 100 g/l de hidrofobina y con un valor del pH situado en el intervalo comprendido entre 5 y 9. La aplicación de la solución que contiene la hidrofobina se lleva a cabo, por regla general, a una temperatura situada en el intervalo comprendido entre 0 y 140ºC, de manera preferente, situada en el intervalo comprendido entre 30 y 80ºC.

Las partículas polímeras termoplásticas, expandibles y expandidas, de conformidad con la invención, están acabadas de una manera antiestática, presentan una reducida tendencia al pegado en el momento de llevarse a cabo la transformación inicial en forma de espuma, pero, sin embargo, presentan una buena soldadura cuando se lleva a cabo la transformación en forma de espuma para dar piezas moldeadas.

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Ejemplos Ejemplo 1 Trabajos iniciales para la clonación de yaad-His_{6}/yaaE-His_{6}

Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573). Como ADN matriz se utilizó el ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis. El fragmento RCP obtenido contenía la secuencia codificante del gen yaaD/yaaE procedente de Bacillus subtilis, y en los extremos contenía respectivamente un punto de corte por restricción Ncol o bien Bg1II. El fragmento RCP se purificó y se troceó con las endonucleasas de restricción Ncol y BglII. Este fragmento de ADN se empleó como inserto y se clonó en el vector pQE60 de la firma Qiagen que había sido linealizado previamente con las endonucleasas de restricción Ncol y BglII. Los vectores pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5, formados de este modo, pueden ser empleados para la expresión de proteínas constituidas por YAAD::HIS_{6} y respectivamente por YAAE::HIS_{6}.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Ejemplo 2 Clonación de yaad-hidrofobina DewA-His_{6}

Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con ayuda de los oligonucleótidos KaM 416 y KaM 417. Como ADN matriz se empleó ADN genómico del moho Aspergillus nidulans. El fragmento RCP obtenido contenía la secuencia codificante del gen hidrofobina dewA y un punto de corte factor Xa proteinasa N-terminal. El fragmento RCP se purificó y se troceó con la endonucleasa de restricción BamHI. Este fragmento de ADN se empleó como inserto y se clonó en el vector pQE60YAAD#2, que había sido linealizado previamente, con la endonucleasa de restricción BglII.

El vector #508, formado de este modo, puede ser empleado para la expresión de una proteína de fusión constituida por YAAD::Xa::dewA::HiS_{6}.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC

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Ejemplo 3 Clonación de yaad-hidrofobina RodA-His_{6}

La clonación del plásmido #513 se llevó a cabo de manera análoga a la del plásmido #508 mediante el empleo de los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

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Ejemplo 4 Clonación de yaad-hidrofobina BASF1-His_{6}

La clonación del plásmido #507 se llevó a cabo de manera análoga a la del plásmido #508 mediante el empleo de los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418.

Como ADN matriz se empleó una secuencia de ADN sintetizada de manera artificial - hidrofobina BASF1 - (véase el anexo).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

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Ejemplo 5 Clonación de yaad-hidrofobina BASF2-His_{6}

La clonación del plásmido #506 se llevó a cabo de manera análoga a la del plásmido #508 mediante el empleo de los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418.

Como ADN matriz se empleó una secuencia de ADN sintetizada de manera artificial - hidrofobina BASF2 - (véase el anexo).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

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Ejemplo 6 Clonación de yaad-hidrofobina SC3-His_{6}

La clonación del plásmido #526 se llevó a cabo de manera análoga a la del plásmido #508 mediante el empleo de los oligonucleótidos KaM464 y KaM465.

Como ADN matriz se empleó ADNc de Schyzophyllum commune (véase el anexo).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

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Ejemplo 7 Fermentación de la cepa E. coli recombinante yaad-hidrofobina DewA-His_{6}

Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una cepa de E. coli que expresa yaad-hidrofobina DewA-His_{6} en tubitos de Greiner de 15 ml. Incubación durante 8 horas a 37ºC sobre un dispositivo para la aplicación de trepidaciones con 200 revoluciones por minuto. Se inoculan, respectivamente matraces de Erlenmeyer de 21 litros con placas deflectoras y 250 ml de medio LB (+ 100 \mug/ml de ampicilina), respectivamente con 1 ml de cultivo previo y se incubaron durante 9 horas a 37ºC sobre un dispositivo para la aplicación de trepidaciones con 180 revoluciones por minuto.

Se inoculan 13,5 litros de medio LB (+ 100 \mug/ml de ampicilina) en un fermentador de 20 litros con 0,5 litros de cultivo inicial (OD_{600 \ nm} 1:10 medido frente a H_{2}O). Cuando se alcanza un OD_{60 \ nm} de -3,5 se añaden 140 ml de IPTG 100 mM. Se enfría 10ºC al cabo de 3 horas de fermentación y los caldos de fermentación se separan por centrifugación. El pellet celular se emplea para una purificación adicional.

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Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión de hidrofobina recombinante (Purificación de la proteína de fusión de hidrofobina, que tiene un His6-tag C-terminal)

Se completan 100 g de pellet celular (100 - 500 mg de hidrofobina) con tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, hasta un volumen total de 200 ml y se suspenden de nuevo. La suspensión se trata durante 10 minutos con un Ultraturrax de tipo T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) y, a continuación, se incuba durante 1 hora a la temperatura ambiente con 500 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt; número del catálogo 1.01697.0001) para la degradación de los ácidos nucleicos. Como paso previo a la digestión celular, se lleva a cabo una filtración con un cartucho de vidrio (P1). Para la digestión celular y para el troceado del ADN genómico residual se llevan a cabo dos pasadas a través del homogeneizador a 1.500 bares (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). El homogeneizado se centrifuga (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, cubeta de la centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4ºC, 12.000 revoluciones por minuto, 23.000 g), el sobrenadante se dispone sobre hielo y el pellets se vuelve a suspender en 100 ml de tampón de fosfato de sodio, pH 7,5. La centrifugación y la resuspensión se repiten tres veces, conteniendo el tampón de fosfato de sodio un 1% de SDS en la tercera repetición. Tras la resuspensión se agita durante una hora y se lleva a cabo una centrifugación final (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, cubeta de la centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4ºC, 12.000 revoluciones por minuto, 23.000 g). De conformidad con el análisis SDS-PAGE la hidrofobina está contenida en el sobrenadante tras la centrifugación final (figura 1). Los ensayos muestran que la hidrofobina está contenida probablemente en forma de cuerpos de oclusión en las células de E. coli correspondientes. Se aplican 50 ml del sobrenadante, que contiene la hidrofobina, sobre una columna de 50 ml de níquel-Sepharose de alta resolución (Nickel-Sepharose High Performance) 17-5268-02 (Amersham), que se había equilibrado con tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,0. La columna se lavó a continuación con tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,0 y a continuación se eluyó la hidrofobina con tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,0, que contenía imidazol 200 mM. Para la eliminación del imidazol se dializó la solución contra tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,0.

La figura 1 muestra la purificación de la hidrofobina preparada:

1

La hidrofobina de la figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Las bandas más pequeñas representan en parte productos de degradación de la hidrofobina.

Ejemplo 9 Ensayo de aplicación industrial; caracterización de la hidrofobina mediante la modificación del ángulo de contacto de una gota de agua sobre un substrato de vidrio

Vidrio (cristalera para ventana, Süddeutsche Glas, Mannheim):

-: concentración de la hidrofobina: 100 \mug/ml

-: incubación de las plaquetas de vidrio durante la noche (temperatura 80ºC) en acetato de Na 50 mM pH 4 + 0,1% de monolaurato de polioxietilen(20)sorbitán (Tween® 20)

-: a continuación recubrimiento, lavado con agua destilada

-: a continuación incubación durante 10 minutos/80ºC/dodecilsulfato de sodio al 1% (SDS)

-: solución en agua destilada

-: lavado en agua destilada.

Las muestras se secan al aire y se determina el ángulo de contacto (en grado) de una gota de 5 \mul de agua a la temperatura ambiente.

La medida del ángulo de contacto se determinó en un dispositivo Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (noviembre 2002). La medición se llevó a cabo según las indicaciones del fabricante.

Un vidrio no tratado dio un ángulo de contacto de 30 \pm 5º; un recubrimiento con la hidrofobina funcional, de conformidad con el ejemplo 8 (yaad-dewA-his_{6}) dio un ángulo de contacto de 75 \pm 5º.

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Ejemplos 10 y 11

Recubrimiento de perlas de EPS con hidrofobina pQE60 + YaaD + Xa + dewA + HIS6 Agente para el recubrimiento

Solución acuosa de hidrofobina pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6 (SEQ ID NO: 19), que había sido sometida a un tratamiento previo de conformidad con el ejemplo 8 (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,5, concentración de hidrofobina 6,08 g/l).

Las perlas de poliestireno (EPS) expandibles, no recubiertas, preparadas mediante polimerización en suspensión, con un intervalo del tamaño de perla comprendido entre 0,7 y 1,0 mm (Styropor® F 315/N) se secaron y se recubrieron de la manera siguiente:

Se dispusieron mediante pesada por diferencia 50 g de perlas de EPS en un vaso de tapa roscada de 500 ml, se combinaron con 10 ml o respectivamente con 20 ml de la solución de hidrofobina y se agitaron durante 24 horas a la temperatura ambiente sobre una "silla de ruedas". A continuación se dispusieron sobre un papel de filtro las perlas EPS recubiertas con la hidrofobina y se secaron durante 5 horas a la temperatura ambiente.

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Ensayo comparativo V1

Se repitió el ejemplo 10 con la diferencia de que se emplearon 10 ml de agua destilada en lugar de la solución de hidrofobina.

Las perlas de EPS recubiertas de los ejemplos 10 y 11 y del ensayo comparativo se sometieron respectivamente a una transformación inicial en forma de espuma inicial durante 2 minutos a 100ºC en cajas de Rauscher para formar perlas de espuma de poliestireno y se soldaron para dar piezas moldeadas al cabo de 3 días de almacenamiento. Para evaluar la calidad de la soldadura se rompieron en el centro las piezas moldeadas al cabo de 2 días de almacenamiento.

Para la evaluación de las propiedades antiestáticas se midió la resistencia superficial de las perlas de espuma de poliestireno sometidas a una transformación previa en forma de espuma y secadas.

TABLA 1

4

Correlación del nombre de las secuencias con las secuencias de ADN y de polipéptido en el protocolo de secuencias

5

6

Claims

1. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, con un recubrimiento que contiene hidrofobina.

2. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según la reivindicación 1, caracterizadas porque el recubrimiento contiene entre 1 y 5.000 ppm de hidrofobina, referido al polímero termoplástico.

3. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según la reivindicación 1, caracterizadas porque los polímeros termoplásticos están constituidos por poliestireno o por poliolefina.

4. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque presentan un diámetro medio de las partículas situado en el intervalo comprendido entre 0,05 y
5 mm.

5. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque el recubrimiento contiene una hidrofobina de la fórmula general (II)

X_{n}-C^{1}-X_{3-25}-C^{2}-X_{0-2}-C^{3}-X_{5-50}-C^{4}-X_{2-35}-C^{5}-X_{2-15}-C^{6}-X_{0-2}-C^{7}-X_{3-35}-C^{8}-X_{m}\hskip0,8cm (II)

en la que

X significa cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural, n y m significan números comprendidos entre 0 y 500,

C significa cisteína.

6. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según la reivindicación 4, caracterizadas porque el recubrimiento contiene una hidrofobina de la fórmula general (III)

(III).X_{n}-C^{1}-X_{5-9}-C^{2}-C^{3}-X_{11-39}-C^{4}-X_{2-23}-C^{5}-X_{5-9}-C^{6}-C^{7}-X_{6-18}-C^{8}-X_{m}

7. Partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque el recubrimiento contiene una hidrofobina del tipo dewA, rodA, hjypA, hypB, sc3, basf1 o basf2.

8. Procedimiento para el recubrimiento de partículas polímeras termoplásticas, expandibles o expandidas, caracterizado porque se pone en contacto la superficie de las partículas polímeras con una solución que contiene hidrofobina.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se emplea una solución acuosa con una concentración comprendida entre 1 y 100 g/l de hidrofobina y con un valor del pH situado en el intervalo comprendido entre 5 y 9 como solución que contiene hidrofobina.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se pone en contacto la superficie con la solución que contiene hidrofobina a una temperatura situada en el intervalo comprendido entre 0 y 140ºC.