MX2007015339A - Hidrofobina como un agente de recubrimiento para paticulas de polimero termoplastico expandibles o expandidas. - Google Patents

Abstract

Particulas de polimero termoplastico expandibles o expandidas con un recubrimiento que comprende hidrofobina, en particular proteinas de la formula estructural general (1) Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-50-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50- C8-Xm (I) en donde X es cualquiera de los 20 aminoacidos de presencia natural, n y m son numeros entre 0 y 500, C es cisteina y su uso como antiestaticos.

Description

HIDROFOBINA COMO UN AGENTE DE RECUBI IIENTO PARA PARTÍCULAS DE POLÍMERO TERMOPLASTICO EXPAND1BLES O EXPANDIDAS Descripción La invención se refiere a partículas de polímero expandióles o expandidas con un recubrimiento que comprende hidrofobma y a los proceso para la preparación de las mismas A fin de permitir que el pohestireno expandible sea transportado sin problemas y para reducir la carga electrostática en las partículas de espuma de pohestireno pre-espumadas, las partículas EPS son recubiertas de manera usual con un antiestético Las propiedades antiestéticas no satisfactorias son ocasionadas de manera frecuente por el agente de recubrimiento que es desgastado por rozamiento o deslavado desde la superficie de las partículas El recubrimiento antiestético puede resultar también en aglutinamiento de las partículas y escaso rendimiento de flujo EP-A 470 455 describe polímeros de estireno expandibles antiestéticos similares a lecho con un recubrimiento que comprende una sal de amonio cuaternario y sílice finamente dividida, los cuales se distinguen por su buen rendimiento de flujo Las hidrofobinas son pequeñas proteínas desde aproximadamente 100 hasta 150 aminoácidos, las cuales son características de los hongos filamentosos, por ejemplo Schizophyllum commune. De la manera más usual tienen 8 unidades de cisteína. Las hidrofobinas tienen una marcada afinidad para las interfases y por lo tanto son adecuadas para recubrir superficies. Por lo tanto es posible recubrir, por ejemplo, Teflon por medio de hidrofobinas para obtener una superficie hidrofílíca. Las hidrofobinas pueden ser aisladas a partir de sustancias naturales. La solicitud previa, DE 102005007480.4, describe un proceso para preparar hidrofobinas. Se ha propuesto el uso de hidrofobinas para varias aplicaciones en la técnica anterior. WO 96/41882 propone el uso de las hidrofobinas como emulsificantes, espesantes, agentes tensioactivos, para hidrofilizar superficies hidrofóbicas, para mejorar la resistencia al agua de los sustratos hidrofílicos, para preparar emulsiones aceite-en-agua o emulsiones agua-en-aceite. Se proponen también las aplicaciones farmacéuticas tales como la preparación de ungüentos o cremas y también aplicaciones cosméticas tales como la protección de la piel o la preparación de champús para el cabello o enjuagues para el cabello. WO 01/57528 describe el recubrimiento de ventanas, lentes de contacto, biodetectores, aparatos médicos, recipientes para transportar experimentos o para almacenamiento, cascos de embarcaciones, partículas sólidas o el chasis o carrocería de vehículos de pasajeros con una solución que contiene hidrofobina a una temperatura desde 30 hasta 80°C. WO 03/53383 describe el uso de hídrofobina para tratar materiales de queratina en aplicaciones cosméticas. WO 03/10331 describe un sensor recubierto con hidrofobina, por ejemplo un electrodo de medición, al cual, se han unido sustancias no covalentes adicionales, por ejemplo sustancias electroactivas, anticuerpos o enzimas. Por lo tanto es un objeto de la invención eliminar las desventajas mencionadas y encontrar un agente de recubrimiento antiestático para partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas, las cuales tienen una tendencia reducida de aglutinamiento de partículas durante el pre-espumado o el espumado para proporcionar densidades menores. En consecuencia, se encontraron las partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas antes mencionadas. El recubrimiento comprende de manera preferible desde 1 hasta 5000 ppm, en particular 10 hasta 1000 ppm, de hidrofobina, en base al polímero termoplástico. El recubrimiento puede comprender antiestáticos adicionales y/o auxiliares de recubrimiento o puede ser aplicado a recubrimientos adicionales que contienen diferentes agentes de recubrimiento. Se da particular preferencia a un recubrimiento que consiste solamente de hidrofobina o mezclas de hidrofobina y forma una capa monomolecular en las partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas.

Se a preferencia al uso de los polímeros de estireno de partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas tales como poliestireno (EPS) o poliolefinas tales como pohetileno (EPE) o polipropileno (EPP) Las partículas de polímero termoplástico expansible son aquellas que pueden ser espumadas, por ejemplo por medio de aire caliente o vapor, para proporcionar las partículas de polímero termoplástico expandidas De manera normal comprenden agentes de soplado físicos o químicos en cantidades desde 2 hasta 10% en peso, de preferencia 3 hasta 7% en peso, en base al polímero termoplástico Los agentes de soplado físicos preferidos son gases tales como nitrógeno o dióxido de carbono o hidrocarburos a I if áticos que tienen desde 2 hasta 7 átomos de carbono, alcoholes, cetonas, éteres o hidrocarburos halogenados Se da particular preferencia al empleo de isobutano, n-butano, isopentano, n-pentano, neopentano, hexano o mezclas de los mismos Las partículas de polímero termoplástico expandibles y expandidas pueden comprender además cantidades efectivas de auxiliares comunes tales como tintes, pigmentos, rellenos, absorbedores IR tales como negro de carbono, aluminio o grafito, estabilizadores, retardantes de flama tales como hexabromociclododecano (HBCD), retardantes de flama sinergísticos tales como dicumilo o peróxido de dicumilo, agentes de nucleación o deslizantes Dependiendo del proceso de manufactura, las partículas de polímero termoplástico expandibles de acuerdo con la invención pueden ser esféricas, en forma de lecho o cilindricas y de manera normal tienen un diámetro de partícula promedio en el rango de 0 05 hasta 5 mm, en particular 0 3 hasta 2 5 mm y, si es apropiado, pueden ser divididas en fracciones individuales mediante tamizado Las partículas de polímero termoplástico expandidas tienen diámetros de partícula promedio en el rango desde 1 hasta 10 mm, en particular de 2 hasta 6 mm, y una densidad en el rango de 10 hasta 200 kg/m3, que corresponde al grado de expansión Las partículas de polímero termoplástico expandibles se pueden obtener, por ejemplo, mediante impregnación por presión de las partículas de polímero termoplástico con agentes de soplado en un tanque, mediante polimerización de suspensión en presencia de agentes de soplado o por medio de impregnación de fusión en un extrusor o mezclador estático y la subsecuente presión bajo agua Las partículas de polímero termoplástico expandidas se pueden obtener mediante espumado de partículas de polímero termoplástico expandibles, utilizando, por ejemplo, aire caliente o vapor en pre-espumadores de presión, mediante impregnación por presión de las partículas de polímero termoplástico con agentes de soplado en un tanque y la subsecuente reducción de presión, o por medio de extrusión de fusión de un agente de soplado que contiene fusión con espumado y la subsecuente granulación El término "hidrofobinas" de acuerdo con la presente invención representa en lo sucesivo a proteínas de la fórmula estructural general (I) Xn-C -X?_5o-C -X0-5-C -X?.?oo"C -X1-50-C -X1.50-C -X0.5-C -X1.50-C -Xr (I) en donde X puede ser cualquiera de los aminoácidos de presencia natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), X puede ser también en cada caso idéntico o diferente. Los índices junto a X indican en cada caso el número de aminoácidos, C es cisteína y los índices n y m son de manera independiente de números naturales desde 0 hasta 500, de preferencia desde 15 hasta 300. Los polipéptidos de acuerdo con la fórmula (II) están caracterizados además por la propiedad de su crecimiento, a temperatura ambiente, después del recubrimiento de una superficie de vidrio, el ángulo de contacto de una caída de agua en por lo menos 20°, de preferencia de por lo menos 25° y de muy particular preferencia de 30°, en cada caso en comparación al ángulo de contacto de una caída de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no recubierta. Las cisteínas denotadas C1 a C8 pueden encontrarse en un estado reducido o pueden formar puentes disulfuro entre sí. Se da particular preferencia a la formación intramolecular de puentes C-C, en particular aquel con por lo menos uno, de preferencia 2, de particular preferencia 3 y de forma muy particular 4, puentes disulfuro intramoleculares.

Se da preferencia al empleo de hidrofobinas de la fórmula general (II) Xn-C -X3-25-C -X0-2-C -X5-50-C -X2-35-C -X2_15-C -X0.2-C -X3.35-C -Xr (ll) para llevar a la práctica la presente invención, en donde X, C y los índices junto a X y C son como se definieron con anterioridad, los índices n y m son, sin embargo números entre 0 y 300 y las proteínas se distinguen además por el cambio del ángulo de contacto. Se da particular preferencia al empleo de hidrofobinas de la fórmula (lll) Xn-C -X5-9-C -C -X1 1-39" C -X2-33"C -X5.9-C -C -X c8-xr (lll) en donde X, C y los índices junto a X y C son como se definieron con anterioridad, los índices n y m son números entre 0 y 200 y las proteínas se distinguen además por el cambio del ángulo de contacto antes mencionado. Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que son enlazadas de manera natural a una hidrofobina. Sin embargo, cualquiera o ambos residuos pueden ser también secuencias de péptido que no son enlazadas de manera natural a una hidrofobina.

Esto también incluye a aquellos residuos Xn y/o Xm en los cuales una secuencia de péptido de ocurrencia natural en una hidrofobina se ha extendido por medio de una secuencia de peptido que no ocurre de manera natural en una hidrofobina Si Xn y/o Xm son secuencias de péptido que no son enlazadas de manera natural a hidrofobinas, dichas secuencias son usualmente de por lo menos 20, de preferencia de por lo menos 35, de particular preferencia de por lo menos 50 y de muy particular preferencia de por lo menos 100, aminoácidos de longitud Un residuo de esta clase que no es enlazado de manera natural a una hidrofobina también será referido a continuación como asociado de fusión Se pretende que éste exprese el hecho de que las proteínas pueden constar de por lo menos una parte de hidrofobina y un asociado de fusión que por naturaleza no se presentan juntos en esta forma El asociado de fusión puede seleccionarse a partir de una multiplicidad de proteínas También es posible que una pluralidad de asociados de fusión sea enlazada a una parte de hidrofobina, por ejemplo para el término amino (Xn) y al término carboxilo (Xm) de la parte de hidrofobina Sin embargo, también es posible enlazar, por ejemplo, dos partes de asociado de fusión a una posición (Xn o Xm) de la proteína de esta invención Las partes de asociado de fusión particularmente adecuadas son proteínas que se presentan de manera natural en microorganismos, en particular en E coh o Bacillus subtilis Los ejemplos de dichas partes de asociado de fusión son las secuencias yaad (ID SEC NO 15 y 16) yaae (IS SEC NO 17 y 18), y tioredoxina Los fragmentos o derivados de dichas secuencias, que comprenden solamente una parte, de preferencia 70-99%, de particular preferencia 80-98%, de dicha secuencia o en los cuales se han alterado los aminoácidos o nucleótidos en comparación con la secuencia mencionada, también son muy adecuadas, con los porcentajes que se refieren en cada caso al número de aminoácidos Además también es posible que la secuencia de po 11 pépt id o de las proteínas usadas de acuerdo con la invención haya sido modificadas, por ejemplo mediante ghcosilación, acetilación o mediante entrelazamiento químico, por ejemplo con glutaraldehído Una característica de las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención es el cambio en las propiedades de superficie cuando las superficies son recubiertas con las proteínas El cambio en las propiedades de superficie se puede determinar de manera experimental a través de la medición del ángulo de contacto de una caída de agua antes y después del recubrimiento de la superficie con la proteína y que determina la diferencia de las dos mediciones La medición de los ángulos de contacto es conocida en principio por el trabajador con experiencia Las mediciones se basan en la temperatura ambiente y los goteos de 5 I de agua Las condiciones experimentales precisas para un método de medición del ángulo de contacto, que es adecuado a manera de ejemplo, se ilustran en la sección experimental Bajo las condiciones allí mencionadas, las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención tienen la propiedad de incrementar el ángulo de contacto en por lo menos 20°, de preferencia en por lo menos 25°, de particular preferencia en por lo menos 30J en cada caso en comparación con el ángulo de contacto de una caída de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio sin recubrir Las posiciones de los aminoácidos polares y no polares en la parte de hidrofobina de las hidrofobmas conocidas hasta la fecha se conservan, dando como resultado una gráfica de hidrofobicidad característica Las diferencias en las propiedades biofísicas y la hidrofobicidad resultaron en la clasificación de las hidrofobinas conocidas hasta ahora en dos clases, I y II (Wessels et al 1994, Ann Rev Phytopathof , 32, 413-437) Las membranas ensambladas de hidrofobinas clase I son en un mayor grado insolubles (incluso para sulfato de dodecilo sódico al 1% (SDS) a una temperatura elevada) y solamente pueden ser disociadas de nuevo por medio de ácido tpfluoroacético concentrado (TFA) o ácido fórmico En contraste, las formas ensambladas de hidrofobinas clase II son menos estables Pueden ser disueltas de nuevo incluso por etanol al 60% de resistencia i SDS 1% (a temperatura ambiente) La comparación de las secuencias de aminoácido revela que la longitud de la región entre la cisteína C3 y C4 es distintivamente más corta en las hidrofobinas clase II que en las hidroíobinas clase I las hidrofobinas clase II tienen ademas aminoácidos más cargados que las hidrofobinas clase I Las hidrofobmas que son particularmente preferidas para llevar a cabo la presente invención son aquellas de los tipos dewA, rodA, hypA, hypB, sc3 basfl, basf2 que están estructuralmente caracterizadas en el listado de secuencia siguiente Pueden ser también sólo partes o derivados de dichos tipos También es posible enlazar una pluralidad de partes de hidrofobina, de preferencia 2 o 3, de la misma o una estructura diferente a otra y a una secuencia de pol ipéptido adecuada que no está conectada de forma natural a una hidrofobina Además son particularmente adecuadas para ejecutar la presente invención las proteínas de fusión que tienen las secuencias de pohpéptido indicadas en ID SEC NO 20 22, 24 y también las secuencias de ácido nucleico que codifican para las mismas, en particular las secuencias de acuerdo con ID SEC NO 19, 21, 23 Las modalidades particularmente preferidas también son proteinas que, inician a partir de las secuencias de polipéptido indicadas en ID SEC NO 22, 23 o 24, que resultan a partir de la sustitución, inserción o eliminación de por lo menos uno, hasta 10, de preferencia 5, de particular preferencia 5% de todos, los aminoácidos y que tiene aún por lo menos 50% de la propiedad biológica de las proteínas de partida La propiedad biológica de las proteínas aquí representan el incremento antes descrito en el ángulo de contacto en por lo menos 20°.

Las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención pueden ser preparadas de manera química a través de procesos conocidos de síntesis de péptido, por ejemplo de síntesis de fase sólida de acuerdo con Merrifield. Las hidrofobinas de ocurrencia natural pueden ser aisladas a través de métodos adecuados. A manera de ejemplo, se hace referencia a Wósten et. aL, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas de modo preferible a través de procesos de ingeniería genética en los cuales una secuencia de ácido nucleico, en particular secuencia de ADN, que codifica para el asociado de fusión y una codificación para la parte de hidrofobina se combinan de tal manera que se genera la proteína deseada mediante expresión de gen de la secuencia de ácido nucleico combinada en un organismo huésped. Un proceso de preparación de esta clase se describe en la solicitud previa DE 102005007480.4. Los organismos huésped (organismos productores) que pueden ser adecuados aquí para el proceso de preparación mencionado son los procariotos (incluyendo Archaea) o eucariotos, en particular bacterias que incluyen halobacterias y metanococos, hongos, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos, de manera particularmente preferible Escherichia coli, Baciilus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobaciilen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (o células relacionadas), y otras.

La invención se refiere además al uso de construcciones de expresión que comprenden, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico regulador, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipeptido utilizado de acuerdo con la invención y también a vectores que comprenden por lo menos una de esas construcciones de expresión Las construcciones utilizadas comprenden un promotor 5' corriente arriba de la secuencia de codificación particular y una secuencia terminadora 3' corriente abajo y, si es apropiado, elementos reguladores comunes adicionales, en cada caso enlazados de manera operativa a la secuencia de codificación Un "enlace operativo" representa la disposición secuencial del promotor, la secuencia de codificación, el terminador y, si es apropiado, elementos reguladores adicionales de tal manera que cada uno de los elementos reguladores es capaz de cumplir con su función según se requiere para expresar la secuencia de codificación Los ejemplos de secuencias operativamente enlazables son secuencias de etiquetado y también mejoradores, señales de poliadenilación y similares Otros elementos reguladores comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de reproducción y similares Las secuencias reguladoras adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddet, Gene Expression Technology Methode in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) Además de esas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias puede estar presente aún corriente arriba de los genes estructurales reales y, si. es adecuado, puede haber sido genéticamente alterada de tal manera que la regulación natural ha sido cambiada y la expresión de los genes se ha incrementado. Una construcción de ácido nucleico preferida también comprende de forma ventajosa una o más de las secuencias mejoradoras mencionadas con anterioridad que son funcionalmente enlazadas al promotor y que permiten que se incremente la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Las secuencias ventajosas adicionales tales como los elementos reguladores adicionales o terminadores pueden ser insertados en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en la construcción en una o más copias. La construcción puede comprender también marcadores adicionales tales como resistencias antibióticas i genes auxotrópicos-complementarios, si es apropiado con el propósito de seleccionar dicha construcción. Las secuencias reguladoras que son ventajosas para el proceso están presentes, por ejemplo, en los promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAo) SP6-, promotor lambda-PR- o lambda-P, cuyos promotores son utilizados de manera ventajosa en bacterias Gram-negativas. Las secuencias reguladoras ventajosas adicionales están presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en promotores de levadura o fúngales ADCI, MFalpha, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH. También es posible utilizar promotores artificiales para la regulación. Para el propósito de la expresión en un organismo huésped, la construcción de ácido nucleico es insertada de manera ventajosa en un vector tal como un plásmido o un fago, por ejemplo, lo que permite que los genes sean expresados de forma óptima en el huésped. Los vectores representan, además de los plásmidos y fagos, cualesquiera otros vectores conocidos también por el trabajador experimentado, es decir, por ejemplo, virus tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposons, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular, y también el sistema Agrobacterium. Estos vectores pueden ser reproducidos de manera autónoma en el organismo huésped o reproducidos de forma cromosómica. Estos vectores constituyen una modalidad adicional de la ¡nvención. Ejemplos de plásmidos adecuados son, E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2f pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pU R290, pIN-l I l"3-B1 , tgt 11 o pBdCI, en Streptomyces pl J 101 , plJ364, plJ702 o pl J361 , en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en Pilzen pALS1, plL2 o pBB116, en levaduras 2alfa, pAG-1, YEpß, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas, pLGV23, pGHfac + , pBIN19, pAK2004 o pDH51. Dichos plásmidos son una pequeña selección de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son bien conocidos por el trabajador experimentado y se pueden encontrar, por ejemplo en el libro Cloning Vectors (Eds. Pou els P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Para el propósito de expresar los otros genes que están presentes, la construcción de ácido nucleico comprende también de manera ventajosa secuencias reguladoras 3'-terminal y/o 5'-terminal para incrementar la expresión, las cuales son seleccionadas para expresión óptima en dependencia del organismo huésped y el gen o genes seleccionados. Se pretende que estas secuencias reguladoras permitan que los genes y la expresión de proteína sean expresados de manera específica. Dependiendo del organismo huésped, esto pude representar, por ejemplo, que el gen es expresado o sobreexpresado solamente después de la inducción o que es expresado y/o sobreexpresado de inmediato. A este respecto, las secuencias reguladoras o factores pueden influir positivamente de manera preferible y de este modo incrementan la expresión de los genes que han sido introducidos. Por lo tanto, los elementos reguladores pueden ser mejorados de forma ventajosa en el nivel de transcripción al utilizar señales de transcripción tales como promotores y/o mejoradores. Sin embargo, además de esto, también es posible mejorar la traslación al mejorar la estabilidad del ARNm, por ejemplo. En una modalidad adicional del vector, el vector que comprende la construcción de ácido nucleico de la ¡nvención o el ácido nucleico de la invención también puede ser introducido de manera ventajosa dentro de los microorganismos en la forma de un ADN lineal y ser integrado dentro del genoma del organismo huésped por medio de recombinación heteróloga u homologa. El ADN lineal pude constar de un vector linearizado tal como un plásmido o solamente de la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico. A fin de expresar los genes heterólogos de manera óptima en los organismos, es ventajoso alterar las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con el uso de codón específico empleado en el organismo. El uso de codón puede ser determinado de forma sencilla con ayuda de análisis de computadora de otros genes conocidos del organismo en cuestión. Se preparó un cartucho de expresión mediante la fusión de un promotor adecuado para una secuencia de nucleótido de codificación adecuado y para una señal de terminador o señal de poliadenilación. Para este propósito, se utilizan las técnicas de recombinación y clonación comunes, según se describen, por ejemplo, en T, Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y también en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987). Para lograr la expresión en un organismo huésped adecuado, la construcción de ácido nucleico recombinante o construcción de gen es insertada de manera ventajosa dentro de un vector específico de huésped que permite que los genes sean expresados de forma óptima en el huésped Los vectores son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica y se pueden encontrar por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P H et al , Eds , Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) Es posible preparar, con la ayuda de los vectores, microorganismos recombinantes que son, por ejemplo, transformados con por lo menos un vector y que pueden ser utilizados para producir las proteínas empleadas de acuerdo con la invención De manera ventajosa, las construcciones recombinantes descritas de la invención son introducidas dentro de un sistema huésped adecuado A este respecto, los métodos de clonación y transfección comunes conocidos por el trabajador experimentado, como por ejemplo, coprecipitacion, fusión de protoplasto, electroporación transfección retroviral y similares, son utilizados de manera preferible a fin de ocasionar que los ácidos nucleicos sean expresados en el sistema de expresión particular Los sistemas apropiados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F Ausubel et al , Eds , Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al Molecular Cloning A Laboratory Manual 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Coíd Spring Harbor, NY, 1989 También es posible preparar microorganismos recombinados de modo homólogo Para este propósito, se prepara un vector que comprende por lo menos una sección de un gen para ser utilizada de acuerdo con la invención o de una secuencia de codificación en la cual, si es apropiado, por lo menos una eliminación de aminoácido, adición de aminoácido o sustitución de aminoácido ha sido introducida a fin de modificar, por ejemplo, la funcionalidad, alterar la secuencia (vector de eliminación) La secuencia introducida puede, por ejemplo, ser también una homologa a partir de un microorganismo relacionado o ser derivada a partir de un mamífero, una levadura o un insecto De manera alternativa, el vector utilizado para la recombinación homologa puede ser diseñado de tal manera que el gen endógeno es, en el caso de la recombinación homologa, mutado o de otra manera alterado aunque codifica aún la proteína funcional (por ejemplo la región reguladora corriente arriba puede haber sido alterada de manera que la expresión de la proteína endógena es alterada de este modo) La sección alterada del gen utilizado de acuerdo con la invención está en el vector de recombinación homologa La construcción de vectores que es adecuada para la recombinacion homologa se describe, por ejemplo, en Thomas K R y Capecchi, M R (1987) Cell 51 503 Los organismos huéspedes recombinantes adecuados para el ácido nucleico usado de acuerdo con la invención o la construcción de ácido nucleico son en principio cualesquiera organismos procarióticos o eucarióticos De manera ventajosa, los organismos tales como bacterias, hongos o levaduras son empleados como organismos huéspedes. Las bacterias Gram-positivas o Gramnegativas, de preferencia las bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, bacterias particularmente preferibles de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus son utilizadas de manera ventajosa. Los organismos usados en el proceso de preparación de proteínas de fusión son, dependiendo del organismo huésped, desarrollados o cultivados de una manera conocida para el trabajador experimentado. Los microorganismos son desarrollados de forma usual en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, usualmente en la forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en la forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, elementos de traza como por ejemplo sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas entre 0°C y 100°C, de preferencia entre 10°C y 60°C, en tanto que es suministrada con oxígeno. A este respecto, el pH del líquido nutriente puede o no mantenerse en un valor fijo, es decir, puede o no ser regulado durante el cultivo. El cultivo se puede llevar a cabo por lotes, semi-lote o de forma continua. Los nutrientes pueden ser introducidos inicialmente al inicio de la fermentación o ser alimentados de modo subsecuente de una manera semi-continua o continua. Las enzimas pueden ser aisladas a partir de los organismos a través del proceso descrito en los ejemplos o ser utilizado para la reacción como un extracto crudo Las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención o fragmentos biológicamente activos, funcionales de las mismas se pueden preparar utilizando un proceso recombinante, con un microorganismo productor de proteína que es cultivado, la expresión de esas proteínas que es inducida si es apropiado y las proteínas que son aisladas a partir del cultivo Las proteínas también pueden ser producidas de esta manera en una escala industrial si así se desea El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado a través de métodos conocidos Las bacterias pueden, por ejemplo, ser propagadas en el medio TB o medio LB y a una temperatura desde 20 hasta 40°C y un pH desde 6 hasta 9 Las condiciones de cultivo adecuadas se describen en detalle, por ejemplo, en T Maniatis, E F Fritsch and J Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) Si las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención no son secretadas dentro del medio de cultivo, las células son alteradas entonces y se obtiene el producto a partir del hsado a través de procesos de aislamiento de proteína conocidos Las células pueden ser alteradas, según se desee, por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por medio de alta presión, como por ejemplo, en una celda de presión French, por medio de osmólisis, mediante la acción de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, por medio de homogenizadores o por medio de una combinación de dos o más de los procesos listados Las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención pueden ser purificadas empleando métodos cromatográficos conocidos tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración de gel), por ejemplo cromatografía de Q Sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica y también, utilizando otros métodos conocidos tales como u Itraf iltración, cristalización, salificación, diálisis y electroforesis de gel nativo Los procesos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, F G , Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes R , Protein Pupf ication , Sppnger Verlag, New York, Heidelberg, Berlín Puede ser ventajoso aislar la proteína recombinante a través del uso de sistemas de vector u oligonucléotidos que extienden al cADN a través de secuencias de nucleótido particulares y codifican de esta manera las proteínas alteradas o las proteínas de fusión que son utilizadas, por ejemplo, para simplificar la purificación Los ejemplos de modificaciones apropiadas de esta clase son las "etiquetas" que actúan como anclajes, tales como la modificación conocida como anclaje de hexa-histidina, o epítopes que pueden ser reconocidos como antígenos mediante anticuerpos (descritos, por ejemplo, en Harlow, E and Lañe, D , 1988, Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (N Y ) Press) Otras etiquetas adecuadas son, por ejemplo, HA, Calrnoduhn-BD, GST, MBD, Chitin- BD, Steptavidin-BD-Aví- Tag, Flag-Tag, T7 etc Estos anclajes pueden ser utilizados para unir las proteínas a un soporte sólido tal como una matriz de polímero, por ejemplo, que puede estar empacada en una columna de cromatografía, o puede ser utilizada en una placa de microtitulación o un soporte de anclaje Los protocolos de purificación correspondientes se pueden obtener a partir de proveedores de etiqueta de afinidad comerciales Las proteínas preparadas como se describen pueden ser utilizadas ya sea de forma directa como proteínas de fusión o, después de la separación y remoción del asociado de fusión, como hidrofobinas "puras" Si el asociado de fusión está destinado a ser removido, se recomienda incorporar un sitio de separación potencial (sitio de reconocimiento específico para proteasas) dentro de la proteína de fusión entre la parte de hidrofobina y la parte del asociado de fusión Los sitios de separación adecuados son en particular aquellas secuencias de péptido que de otra manera no se presentan en la parte de hidrofobina ni en la parte del asociado de fusión, lo cual se puede determinar con facilidad por medio de herramientas de bioinformática Son particularmente adecuadas, por ejemplo, la separación BrCN en metionina o la separación mediada por proteasa con factor Xa, separación de enteroquinasa, trombina, separación TEV (proteasa de virus del tabaco) Las partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas pueden ser recubiertas antes o después del espumado, por ejemplo mediante la aplicación de hidrofobina en un tambor, utilizando un mezclador de paletas Lodige, o al poner en contacto la superficie de dichas partículas de polímero con una solución que contiene hidrofobina, por ejemplo mediante inmersión o aspersión. La preparación a manera de extrusión de una fusión que contiene agentes de soplado puede involucrar también la adición de hidrofobina al circuito de agua del granulador subacuático. Las partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas son recubiertas de manera preferible utilizando una solución acuosa con una concentración desde 1 hasta 100 g/l de hidrofobina y un pH en el rango de 5 hasta 9. La solución que contiene hidrofobina es aplicada normalmente a una temperatura en la escala de 0 hasta 140°C, de preferencia en el rango de 30 hasta 80°C. Las partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas de acuerdo con la invención son antiestáticas, exhiben una baja tendencia al aglutinamiento durante el espumado, aunque buena fusión cuando se espuman para proporcionar moldes.

Ejemplos: Ejemplo 1 Trabajo preliminar para la clonación de vaad-HiSg/vaaE-HiSR Se llevó a cabo una reacción de cadena de polimerasa con la ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/ Hal 573). La plantilla ADN utilizada fue ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis El fragmento PCR obtenido comprendió la secuencia de codificación del gen Bacillus subtilis yaaD/yaaE y, en sus terminales, en cada caso un Ncol y, respectivamente sitio de separación de restricción Bglll El fragmento PCR fue purificado y cortado con las endonucleasas de restricción Ncol y Nglll Este fragmento ADN fue utilizado como inserto y clonado dentro del vector pQE60 a partir de Qiagen, el cual había sido lineapzado de forma previa con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll Los vectores así obtenidos, pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 pueden ser utilizados para expresar proteínas que constan de YAAD HIS6 y YAAE HIS6, respectivamente Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Ha I571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Ejemplo 2 Clonación de hidrofobina yaad DewA-HiSs Se llevo a cabo una reacción de cadena de polimerasa con el ollgonucleótido KaM 416 y KaM 417 La plantilla ADN utilizada fue ADN genómico del molde Aspergillus nidulants El fragmento PCR obtenido comprendió la secuencia de codificación del gen de hidrofobina dewA y un sitio de separación de proteinasa factor Xa N-terminal El fragmento PCR fue purificado y cortado con la endonucleasa de restricción BamHl. Este fragmento ADN fue utilizado como inserto y clonado dentro del vector pQE60YAAD#2 linearizado de forma previa con la endonucleasa de restricción Bglll. El vector así obtenido #508, puede ser utilizado para expresar una proteína de fusión que consta de YAAD Xa- dewA.:HIS6.

KaM 16- GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC Ejemplo 3 Clonación de yaad hidrofobina RodA-His^ El plásmido #513 fue clonado de manera análoga al plásmido #508, utilizando los ollgonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM434-GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Ejemplo 4 Clonación de vaad hidrofobina BASF1-H¡Sñ El plásmido #507 fue clonado de manera análoga al plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. La plantilla ADN utilizada fue una secuencia de ADN sintetizada de manera artificial - hidrofobina BASF1 - (ver anexo).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 5 Clonación de vaad hidrofobina BASF2-HÍSR El plásmido #506 fue clonado de manera análoga al plásmido #508, utilizando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. La plantilla ADN utilizada fue una secuencia de ADN sintetizada de manera artificial - hidrofobina BASF2 - (ver anexo).

Ka M417:CCCGTAGCTAGTGG ATCC ATTG AAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 6 Clonación de yaad hidrofobina SC3-H¡SR El plásmido #526 fue clonado de manera análoga al plásmido #508, utilizando los ollgonucleótidos KaM 464 y KaM 465 La plantilla ADN utilizada fue Schyzophyllum commune cADN (ver anexo) KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465 GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Ejemplo 7 Fermentación de la cepa recombinante E coli vaad hidrofobina DewA- H?s6 Incubación de 3 ml de medio líquido con una cepa E coli que expresa yaad hidrofobina DewA-H?s6 en tubos Grener de 15 ml incubación a 37°C en un agitador a 200 rpm a 37°C En cada caso durante 8 horas En cada caso3 matraces Erlenmeyer de 11 con desviadores y 250 ml de medio LB (+ 100 µg/ml son inoculados con 1 ml de precultivo e incubados en un agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 horas Inocular 13 5 I de medio LM (+ 100 µg/ml de ampici na) con 0 5 I de precultivo (OD60onm 1 10 medido contra H2O) en un fermentador de 20 I, adición de 140ml de 100mM IPTG a un ODeoonm -3 5 Después de 3 h, el fermentador frío a 10°C y remover el caldo de fermentación mediante centrifugación Usar la pella de celda para purificación adicional Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión de hidrofobina recombinante (purificación de proteínas de fusión de hidrofobina que poseen una etiqueta C-terminal H?s6) Se elaboran 100 g de pella de celda (100 - 500 mg de hidrofobina) con 50 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 7 5, para un volumen total de 200 ml y son suspendidos nuevamente La suspensión es tratada con un Tipo Ultraturrax T25 (Janke und Kunkel, IKA-Labortechnik) durante 10 minutos y de forma subsecuente, para los propósitos de degradación de los ácidos nucleicos, incubada con 500 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt, No de orden 1,01697 0001) a temperatura ambiente durante 1 hora Antes de la alteración de la célula, se lleva a cabo una filtración utilizando un cartucho de vidrio (P1) Para los propósitos de alteración de las células y para compartir el ADN genómico restante se ejecutan dos operaciones de homogenizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp ) El homogenato es centrifugado (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml vaso de precipitados con centrifugado, 60 minutos, 4°C, 12 000 rpm, 23000 g), el sobrenadante es colocado sobre hielo y las pellas son suspendidas nuevamente en 10 ml de regulador de fosfato de sodio, pH 7 5 La centrifugación y la resuspensión se repiten tres veces, el regulador de fosfato de sodio que contiene 1% SDS en la tercera repetición Después de la resuspension la solución es agitada durante una hora, seguida por un centrifugado final (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml vaso de precipitados con centrifugado, 60 minutos, 4°C, 12 000 rpm, 23 000 g) De acuerdo con los análisis SDS-PAGE, la hidrofobina está presente en el sobrenadante después de la centrifugación final (Figura 1) Los experimentos demuestran que la hidrofobma esta presente en las células E coh correspondientes probablemente en la forma de cuerpos de inclusión 50 ml de sobrenadante que contiene hidrofobina son aplicados a una columna de 50 ml niquel-Sefarosa de alto rendimiento 17-5268-02 (Amersham) equilibrada con regulador 50 mM Tps-CI, pH 8 0 la columna es lavada con regulador 50 mM Tps-CI, pH 8 0 y la hidrofobina es eluida de manera subsecuente con regulador 50 mM Tps-CI, pH 80, que comprende 20 mM de imidazol Para el propósito de remover el imidazol, la solución es dializada contra 50 mM Tps-Cl, pH 8 0 La figura 1 ilustra la purificación de la hidrofobina preparada Línea 1 solución aplicada a columna de níquel-Sefarosa (1 10 dilución) Línea 2 flujo pasante = eluato de etapa de lavado Líneas 3-5 picos OD 280 de fracciones de elución La hidrofobina de la figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD Algunas de las bandas más pequeñas representan la degradación de los productos de hidrofobina Ejemplo 9 Prueba de rendimiento caracterización de la hidrofobina mediante cambio del ángulo de contacto de una caída de aqua en vidrio Sustrato Vidrio (vidrio de ventana, Suddeutsche Glas, Mannheim) - Concentración de hidrofobina 100 µg/mL - Incubación de portaobjetos de vidrio durante la noche (temperatura 80°C) en 50 mM de acetato de sodio pH 4 + 0 1% polioxietileno (20) monolaurato de sorbitan (Tween® 20) - seguida por recubrimiento, lavado en agua destilada - seguido por incubación 10 minutos / 80°C / 1% solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) en agua destilada - lavado en agua destilada Las muestras son secadas al aire y el ángulo de contacto (en grados) de una caída de 5 µl de agua se determina a temperatura ambiente El ángulo de contacto fue medido en un instrumento Dataphysics Contact Angle System OCA 15 + , Software SCA 20 2 0 (noviembre 2002) La medición se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante El vidrio no tratado dio como resultado un ángulo de contacto de 30 ± 5°, un recubrimiento con la hidrofobina funcional de acuerdo con el ejemplo 8 (yaad-dewA-h?s6) que dio como resultado ángulos de contacto 75 ± 5° Ejemplos 10 y 11 Recubrimiento de lechos EPS con hidrofobina pQE60+YaaD+dewA+HIS6 Agente de recubrimiento Solución acuosa de hidrofobina pQE60 + YaaD + Xa + dewA + HIS6 (ID SEC NO 19), pretratada de acuerdo con el ejemplo 8 (50 mM NaH2PO4, pH 7 5, concentración de hidrofobina 6 08 g/l) Los lechos de pohestireno (EPS) expandibles, no recubiertos con un tamaño de lecho en el rango de 0 7 hasta 1.0 mm, preparados por medio de polimerización de suspensión (Styropor ® F 315/N), fueron secados y recubiertos como sigue 50 g de lechos EPS fueron pesados en vidrio de 500 ml con tapa de rosca, mezclados con 10 ml y 20 ml, respectivamente, de la solución de hidrofobina y agitados en un mezclador de rodillo a temperatura ambiente durante 24 horas Los lechos EPS recubiertos de hidrofobina fueron tendidos después sobre papel filtro y secados a temperatura ambiente durante 5 horas Ejemplo comparativo V1 Se repitió el ejemplo 10, aunque con la diferencia de que se usaron 10 ml de agua destilada en vez de la solución de hidrógeno Los lechos EPS recubiertos de los ejemplos 10 y 11 y del experimento comparativo fueron pre-espumados en cada caso en un pre-expansor (Rauscher) a 100°C durante 2 minutos para dar los lechos de espuma de poliestireno y fusionados para moldes después de 3 días de almacenamiento. Los móldeos fueron evaluados para la calidad de la fusión al separarlos a la mitad después de 2 días de almacenamiento. Las propiedades antiestáticas fueron evaluadas a través de la medición de la resistencia de superficie de los lechos de espuma de poliestireno pre-espumados y secados.

Cuadro 1 Asignación de nombres de secuencia para secuencias de ADN y polipéptido en el listado de secuencia

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 Una partícula de polímero termoplástico expandible o expandida con un recubrimiento que comprende hidrofobina 2 La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende desde 1 hasta 5000 ppm de hidrofobina, en base al polímero termoplástico 3 La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero termoplástico consiste en po estireno o poliolefina 4 La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque tiene un diámetro de partícula promedio en el rango de 0 05 hasta 5 mm 5 La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el recubrimiento comprende una hidrofobina de la fórmula general (II) Xn-C -X3 25-C -Xo 2-C -X5 50-C -X2 35-C -X2 15-C -Xo 2-C -X3 35-C -Xr (ll) en donde X es cualquiera de los 20 aminoácidos de presencia natural, n y m son números entre 0 y 500, C es cisteína. 6. La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el recubrimiento comprende una hidrofobina de la fórmula general (lll) Xn-C -X5-9-C -C -X11.39-C -X2-33-C -X5.9-C -C -X6-18-C -Xr (lll) 7. La partícula de polímero termoplástico expandible o expandida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el recubrimiento comprende una hidrofobina tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2. 8. Un proceso para recubrir partículas de polímero termoplástico expandibles o expandidas, en donde la superficie de las partículas de polímero es puesta en contacto con una solución que contiene hidrofobina. 9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la solución que contiene hidrofobina utilizada es una solución acuosa con una concentración de hidrofobina desde 1 hasta 100 g/l y un pH en el rango de 5 hasta 9. 10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la superficie es puesta en contacto con la solución que contiene hidrofobina a una temperatura en el rango de 0 hasta 140°C.