KR20110130440A

KR20110130440A - 케라틴을 통한 국소 약물 전달에 있어서 표면 활성 단백질의 조성물, 용도 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20110130440A
Application number: KR1020117022071A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 부쓰; 안드레아스 하프너; 프란츠 카우프만; 바베테 피들러; 귀도 모이러; 고든 브래들리
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2011-12-05
Also published as: ZA201203028B; CN102333546A; CN102333546B; WO2010097344A1; US8758730B2; EP2400988B1; US20120058199A1; JP2012518669A; CA2784516C; JP5832302B2; EP2400988A1; CA2784516A1

Abstract

본 발명은 국소 적용되는 약학 제제에 있어서, 표면 활성 단백질, 특히 클래스 I 및 클래스 II 하이드로포빈의 용도를 제공한다. 본 발명은 특히, 각종 질병 또는 장애 중 하나 이상을 치료하기 위해, (동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 및/또는 치료학적 유효량의 활성 성분(약물)을 동물체 또는 인체의 손발톱으로 및/또는 이를 통하여 조갑을 경유하여 전달하기 위해 침투를 증진시키기 위한 국소 적용되는 약학 제품에 관한 것이다.

Description

케라틴을 통한 국소 약물 전달에 있어서 표면 활성 단백질의 조성물, 용도 및 사용 방법{COMPOSITIONS, USE AND METHOD FOR THE USE OF SURFACE ACTIVE PROTEINS IN TOPICAL DRUG DELIVERY ACROSS KERATIN}

본 발명은 국소 적용되는 약학 제제에서 (특히 고도의) 표면 활성 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 특히 각종 질병 또는 질환 중 하나 이상을 치료하기 위하여 (동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 및/또는 치료학적 유효량의 활성 성분(약물)을 동물체 또는 인체의 케라틴화된 손발톱 표면으로 또는 이를 통하여 조갑 경유 전달하기 위해 침투를 증진시키기 위한 국소 도포되는 약학 제품에 관한 것이다.

하이드로포빈은 약 100 내지 150 아미노산으로 된 표면 활성 단백질 종류이다. 하이드로포빈의 자기조립은 구조 변화를 동반한다. 단량체 클래스 I 및 II 하이드로포빈은 베타-병풍 구조가 풍부하다. 하이드로포빈은 사상균, 예를 들어 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune) 또는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)의 특징이다. 지금까지, 이들은 특히 (예컨대 재료의, 표면에 활성 성분을 결합시켜, 이를, 예컨대 모발 등에 고정시키는) 부착 매트릭스로서 작용하거나 또는 침투를 억제하는 것으로 예상되는 표면 상에 안정한 층을 형성한다고 개시된 바 있다. 이것은 개시된 적이 있다(예컨대 WO2004/000880 참조). 케라틴, 점막 및 치아를 포함하는 물질을 치료하는 미용 조성물 또한 개시된 바 있지만, 확실한 작용 방식은, 모발, 피부 및 손발톱과 같은 인체의 케라틴 표면에 대한 하이드로포빈의 고 친화도(WO 2006/136607)와, 표면에서 성분의 농도를 증가시키기 위한 임의의 활성 성분 또는 다른 성분에 대한 고정 효과로 인해, 케라틴의 표면 상으로 표적화하고 상기 표면에서 장기간의 지속 효과를 나타내는 것에 관한 것뿐이다. 수분 첨가 및 피부 진정 성질 또는 컬러링이 눈에 띈다. 침투 의존적 약학 효과에 대해서는 개시 또는 시사된 바 없었다. 특히, 활성 증가를 보여준 실시예는 없었으며 - 실제로 결합 향상은, 특히 케라틴층 내부 또는 아래에서의 치료를 원하는 경우에, 필요한 곳에서 이용가능한 유리 활성 성분을 더 적어지게 하기 때문에 이 방법은 반직관적인 것으로 나타났다. 이는 또한 모발에서 하이드로포빈으로 몇몇 샴푸 세척을 견디는 화장료 침전물을 얻을 수 있다고 개시한 US 2003/0217419에 의해 확인된다.

여러 경우에, 환자 신체의 케라틴화 표면, 특히 손발톱으로 및/또는 이를 통한 약물(활성 성분)의 침투를 개선시켜, 필요한 부위에서 약학적으로 유효한 농도를 달성하는 것이 바람직하다.

그런데, 이제 놀랍게도, 실제로 표면 활성 단백질, 예컨대 하이드로포빈을 동물체 또는 인체의 손발톱 표면을 통한 활성 성분의 침투 증진제로서 사용할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 제1 구체예에서 본 발명은 (동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 케라틴화된 손발톱 표면으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유 전달할 수 있는 침투 증진제로서의 표면 활성 단백질의 용도에 관한 것으로서, 상기 표면 활성 단백질을, 하나 이상의 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 제제에 혼합하는 것을 포함한다(바람직하게는 상기 혼합으로 이루어진다).

제2 구체예에서, 본 발명은 활성 성분과 직접 접촉해야 하는 위치에서 환자의 질병을 치료하기 위한 약학 제제의 제조를 위한 표면 활성 단백질의 용도에 관한 것으로서, 상기 표면 활성 단백질은 (동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 손발톱을 포함하는 케라틴화 표면으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유 전달할 수 있는 침투 증진제로서 작용한다.

제3 구체예에서, 본 발명은 (동물 및 인간을 포함하는) 환자, 특히 치료가 필요한 환자에게 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 손발톱을 포함하는 케라틴화 표면으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유 전달할 수 있는 침투 증진제로서 표면 활성 단백질을 사용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 사용은 1종 이상의 활성 성분 및 경우에 따라서 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 성분을 함께 약학 제제에 상기 표면 활성 단백질을 혼합하는 것을 포함한다.

제4 구체예에서, 본 발명은 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 조갑 경유 전달하기 위하여, 환자의 손발톱을 포함하는 케라틴화 표면으로 및/또는 이를 통하여 환자에서의 1종 이상의 활성 성분의 침투를 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 사용은 1종 이상의 활성 성분 및 경우에 따라서 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 성분과 함께 약학 제제에 상기 표면 활성 단백질을 혼합하는 것과 생성되는 약학 제제를 상기 환자에게 국소 투여하는 것을 포함한다.

제5 구체예에서, 본 발명은 1종 이상의 추가의 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 1종 이상의 활성 성분(들)의 손발톱으로의 및/또는 이를 통한 전달을 증가시키는 것을 포함하는, 침투 증진제 없이 치료가능성이 낮거나 또는 없는 환자에게 특별히 사용하기 위한 표면 활성 단백질 형태의 침투 증진제와 1종 이상의 약학적 활성 성분을 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.

상기 언급한 제1 내지 제5 구체예와, 이의 특별한 (예컨대 바람직한) 구체예는 또한 본 발명의 약학 제제, 또는 본 발명에 따라 제조되거나 사용되는 약학 제제, 또는 약학 제제, 이의 용도 또는 이의 제조로서 본원에서 언급된다.

본 발명의 또는 본 발명에 따라 제조되거나 사용되는, 국소 도포용 약학 제제는 특히 (a) 하나 이상의 (약리학적) 활성 성분 및 (b) 비자극성 투과 증진제를 포함한다.

본 발명은 특히 손발톱(또는 발굽)을 포함하는 동물체 또는 인체의 케라틴화 표면을 통해; 추가로 케라틴화 표면 아래의 막, 체강의 막을 통해서, 및 경우에 따라서 상기한 것 중 임의의 것에 근접한 신체의 조직, 장기 및/또는 계로 치료 유효량의 활성 성분의 전달을 증가시키기 위한, 국소 도포된 약학 제제, 이의 용도 또는 이의 제조에 관한 것이다.

하나의 특정 구체예에서, 본 발명은 환자의 발톱 및/또는 손톱에서 유병 또는 감염된 조상(nail bed), 조모(nail matrix) 및/또는 조판(nail plate)으로 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분의 전달을 증가시키기 위한, 국소 도포되는 약학 제제, 이의 제조 또는 이의 용도에 관한 것으로서, 질병 또는 감염은 감염성 질병, 특히 진균병, 더욱 구체적으로 조갑진균증; 또는 염증, 암, 감염 또는 변성이다.

도 1: a, 시험관내 피부 모델을 통한 카페인 투과의 상대적인 증진.
b, 유지 매체에서의 카페인 회수의 절대값
도 2: 손발톱을 통해 침투되는 터비나핀의 누적 평균량(실시예 1a).

일반 용어, 기호 및 표현은 바람직한 구체예에 대한 예인 본 발명의 특정 구체예들(측면들)을 정의하기 위해서 본 개시내용에 사용된 하나, 둘 또는 그 이상 또는 모두의 일반적인 표현을 대체할 수 있는 하기 정의에 제공된 의미를 가지는 것이 바람직하다.

표피로부터 유도된 손발톱은 고도로 이황화 결합된 케라틴으로 주로 이루어지며, 각질층보다 약 100배 두꺼워서, 의약 전달에 대한 더욱 강한 차단막을 제공한다. 그러나, 손발톱의 투습률은 각질층의 약 10배 이상이다. 한편, 손발톱은 피부 각질층보다 함수율이 휠씬 적다.

조갑진균증은 손톱과 발톱의 조판 및 조상의 진균 감염증으로서 손발톱 질환의 최대 50%의 원인이 된다. 조갑진균증의 유병률은 성인 집단에서 약 6∼8%이다. 모든 형태의 조갑진균증에 있어서, 손발톱은 다양하게 모양이 훼손되고 뒤틀린다. 조갑진균증은 3가지 주요 부류의 진균인 피부사상균, 효모 및 비피부사상균성 사상균에 의해 유발되며, 치료가 가장 어려운 진균 감염 중 하나이다. 손발톱이 자라는데 걸리는 시간, 조판의 경도, 및 조상과 조판 사이의 감염 프로세스의 위치가 이들 조직에 영향을 주는 진균제에 의한 근절을 저해하는 주요 인자이다. 조갑진균증의 치료는 일반적으로 국소 항진균제 또는 경구 요법을 사용한다. 경구 요법은 간독성과 같은 부작용이 나타나는 반면에, 국소 요법은 조판의 저 투과도에 의한 제약이 있다. 손발톱에 대한 국소 약물 전달은 연고, 크림, 로션, 겔, 스프레이, 반창고, 패치, 밴드 등을 통해서 이루어질 수 있다.

조갑진균증의 목표 약물 치료는, 감염이 손발톱 내에 매립되어 있고 사람의 손발톱의 매우 구속성인 차단층으로 인해 도달하기가 어렵기 때문에 문제가 된다. 조판은 친수성 겔 막으로서 작용하며 국소 약물 투과에 대한 주요 차단층으로서, 이러한 종류의 치료 효과를 제한한다. 조판으로의 충분한 양의 약물을 전달하기 위해서, 약물에 대한 조판의 투과성을 증진시켜야 한다.

손발톱의 화학 조성과 실험적 증거는 수성 경로가 손발톱으로의 약물 침투에 있어서 주요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 물은 손발톱에 대한 주요 가소제인 것으로 보인다. 수화시, 단단한 조판이 연화되고 더욱 가요성이 된다. 손발톱 수화는 용액 pH 및 특정 화학물질과 같은 여러 인자에 의해 영향을 받는다.

국소 도포된 약학 조성물의 조제에 있어서 심각한 과제는, 도포하고자 하는 조직과의 생체 적합성을 갖도록 하여 조직이 제제에 의해 또는 그 성분들에 의해 손상 또는 자극되지 않게 하는 것이다. 침투 증진제인 것으로 알려진 여러 국소 부형제는 또한 피부 및 막 자극제로서 알려져 있기 때문에 특히 문제가 된다. 일반적으로, 침투 증진제는 2개의 대그룹으로 나눌 수 있다(참조: Current medicinal chemistry ISSN 0929-8673: 2005, vol. 12, no19, pp. 2273-2291):

(i) 소형의 극성 용매, 예컨대 에탄올, 프로필렌 글리콜, 디메틸설폭시드, 및

(ii) 극성 헤드와 소수성 사슬을 포함하는 양친매성 화합물, 예컨대 지방산 및 알콜, 1-도데실아제판-2-온(Azone), 2-노닐-1,3-디옥솔란(SEPA 009), 및 도데실-2-디메틸아미노프로파노에이트(DDAIP). 양친매성 화합물은 케라틴 표면에 흡착하는 것으로도 알려져 있으며 모발 치료에 이용할 수 있다.

에탄올과 같은 저비점 용매는 영향을 받은 손발톱 표면으로부터 빠르게 증발하기 때문에 침투제로서 일시적인 활성만을 가진다. 극성 용매는 자극제일 수 있으며 조판을 손상시킬 수 있다. 그러한 침투 증진제는 하기와 같은 케라틴 조모의 화학 변형제와 함께 사용할 수 있다:

(a) 각질용해제, 예컨대 우레아 및 살리실산은 흔히 조판을 연화시키기 위해서 사용된다.

예로는 살리실산, 우레아 및 구아니딘 염산염 - 케라틴 내 3차 구조, 및 가능하게는 2차 결합(예컨대 수소 결합)을 파괴하여, 손발톱을 통한 침투를 촉진할 수 있는 물질을 포함한다.

(b) 황 함유 화합물, 예컨대 머캅탄 화합물, 아황산염 및 중아황산염으로서, 케라틴 내 이황화 브릿지를 파괴하여 작용하는 화합물;

(c) 주로 음이온 유형의, 계면활성제는 케라틴과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다.

조판의 물리적 내부 환경 또는 화학적 성질을 변화시키는 증진제를 사용한 경우의 단점은 영구적인 손상을 유발할 수 있다는 것이다. 즉, 프로세스가 비가역적일 수 있다는 것이다.

케라틴화된 표면을 또한 포함하는 피부로의 및 피부를 통한 약물의 전달과 관련하여서도 유사한 문제가 존재한다.

본 발명의 범위 내에서, 침투를 증진시키는 청구된 표면 활성 단백질(즉, 침투 증진제로서 활성임)을 포함하는 약학 제제의 국소 전달은 스프레이 또는 패치를 통해서 그리고 연고, 크림, 로션, 겔, 스프레이, 반창고, 밴드 등을 통해서 적용될 수 있다.

본 발명에 의해 포괄되는 특정 구체예는 본 발명에 따라 적용되는 항염증성 약학 제제와 이의 용도 또는 제조이다. 항염증 약물은 진통제, 해열제, 및 더욱 높은 용량에서 항염증 효과를 갖는 약물이며 - 이들은 통증, 발열 및 염증을 감소시킨다. 국소 항염증 약물은 연조직 손상, 염좌, 좌상 및 외상에 의해 유발되는 통증의 경감에 효과적이다. 케토프로펜, 펠비낙, 이부프로펜 및 피록시캄과 하기 언급된 다른 것들은 그 효능이 입증된 예이다.

침투 증진제는 약학 제제에 첨가된 활성제의 경피적 흡수를 촉진하고 피부나 점막 표면의 차단성을 극복하는데 도움이 될 수 있다. 투과 증진제, 수착 촉진제 및 촉진제와 같은 침투 증진제의 별칭이 있다.

피부 모델은 피부 흡수 및/또는 침투뿐 아니라 물질의 피부 자극 효과를 테스트하기 위해서 흔히 이용된다. 상이한 피부 모델과 절개된 인간 및 동물 피부를 비교한 결과(Schmook et al. 2001, Comparison of human skin or epidermis models with human and animal skin in in-vitro percutaneous absorption, Int. J. Pharmaceutics 215, 51-56), 침투 연구에 사용되는 화합물에 따라서 피부 등가물이 침투 증진제에 의한 투과율 및 그 조정을 연구하기에 충분한 침투 차단막을 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.

침투 증진제는 각질층 내의 분자와 상호작용하여 그 투과도를 변형시켜 치료학적으로 유효한 속도로 전달할 수 있다. 그러한 투과 증진제는 약물과 동시에 또는 함께, 또는 전처리에 의해 피부에 도포될 수 있다. 그러나, 침투 증진제의 제품으로의 도입은 피부막의 건강과 관련된 안전성 염려로 인해 줄어들고 있다. 따라서, 케라틴 차단막을 안전하고 효과적인 방식으로 극복하는 것이 경피 및 특히 조갑 경유 국소 요법에 있어서 애로 사항이다.

일부 유용한 투과 증진제는 비이온성 계면활성제를 포함하며, 1종 이상은 글리세릴 모노올레이트, 글리세릴 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 글리세릴 트리올레이트, 및 이소프로필 미리스테이트를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 공지된 침투제의 초기 목록에 대해서는 ("Pharmaceutical Skin Penetration Enhancement", Marcel Dekker, New York 1993, pages 229-24 참조). WO 2006/103638 A2는 터비나핀의 국소 제제에서 부형제로서의 비이온성 계면활성제를 개시하고 있고, US6455592호는 손발톱을 통한 항진균제의 침투를 증진시키기 위한, 친수성 침투제, 즉 디프로필렌 글리콜 디메틸 에테르를 개시하고 있다.

약학 조제물 중에 사용된 물질로서의 침투 증진제는 정성적 기준 세트를 만족해야 한다. 이들은 독성이어서는 안되고; 피부에 대해 자극성, 알러지성 또는 감수성이어서는 안되며; 적당한 투과 작용을 발휘하는데 필요한 농도에서 약리학적으로 비활성이어야 하며; 그 효과는 즉각적이고, 예측가능하며, 가역적이어야 하며; 약학 조제물로 쉽게 도입되어야 한다. 연구된 화학물질 대부분은 인간 피부에 사용시 독성이거나 또는 지나치게 자극적이다.

따라서, 본 발명은 낮은 투과율의 약물과 활성 성분(약물)의 침투를 증진시키는 표면 활성 단백질을 조합 및 동시전달하는 것을 추가로 제공한다.

표면 활성 단백질은 바람직하게는 양친매성 성질을 가지는 단백질, 특히 (특히 소수성 또는 친수성) 표면 상에 층을 형성할 수 있는 단백질이다. 가능한 단백질 중에서, 말의 땀에서 나오는 라테린(예컨대. J. G. Bealey et al., Biochem J. 1986 May 1; 235(3): 645-50), 포스포리파제 C, 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 단백질, 예컨대 아밀로이드-β, β-카제인, 알라산이라고 부르는 액티노박터 라디오레지스턴스(Acinetobacter radioresistens) KA53의 생물유화제, 에스. 콜리콜러(S. coelicolor) A3(2) 및 에스 텐다(S. tendae) 유래의 SapB, 당지질 전달 단백질, 채플린(Claassen et al., Genes Dev. 1714-1726, 2003; Elliot et al., Genes Dev. 17, 1727-1740) 등의 단백질 또는 본 발명의 특정 구체예에서, 하이드로포빈이라고 일반적으로 언급되는 클래스, 특히 하이드로포빈 클래스 1 및/또는 클래스 2의 단백질이 있다.

하이드로포빈은 계면에서 나노규모 구조를 갖는 필름으로 자가조립되는 소형 진균류 표면 활성 단백질이다. 표면 활성 단백질, 바람직하게는 하이드로포빈의, 약물의 국소 적용을 위한 침투 증진제로서의 잠재적 용도는 이전에 개시된 바 없다.

본 발명에 따른 복수의 상이한 하이드로포빈의 혼합물을 사용하는 것도 가능한 것으로 이해된다.

본 발명에 있어서, 이하의 용어 "하이드로포빈"은 특히 하기 화학식 (I)의 폴리펩티드로서 이해된다.

상기 식에서, X는 20개의 자연 발생 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 임의의 아미노산일 수 있다. 여기서 X는 동일하거나 상이할 수 있다. 각 경우에 X 옆의 지수는 아미노산의 수를 나타내고, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌을 나타내고, C로 나타내어지는 아미노산 (C¹-C⁸) 중 4개 이상은 시스테인이며, 지수 n 및 m은 각각 상호 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300의 자연수이다. 이들 물질 및 이의 제법은, 예를 들어 WO 06/103230 또는 WO 2006/136607과 같은 시초에 언급된 문헌에 공지되어 있으며, 이들 문헌은 하이드로포빈 개시에 관해 본원에 특별히 참고로 포함된다.

C¹ 내지 C⁸로 표시되는 아미노산은 바람직하게는 시스테인이지만, 이들은 또한 유사한 입체 구조의 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신에 의해 치환될 수 있다. 어떤 경우에도 C¹ 내지 C⁸의 위치 중 4개 이상, 바람직하게는 5개 이상, 특히 6개 이상, 더욱 구체적으로 7개 이상이 시스테인으로 구성된다. 본 발명에 따른 단백질에 있어서, 시스테인은 환원된 형태로 존재하거나 또는 상호 이황화 가교를 형성할 수 있다. 분자내 가교 형성이 특별히 바람직하며, 특히 1개 이상, 바람직하게는 2개, 특히 바람직하게는 3개, 더욱 특별히 바람직하게는 4개의 분자내 이황화 가교를 가진다. 상기 개시된 바와 같이 시스테인이 유사한 입체 구조의 아미노산에 의해 치환되는 경우, 서로 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 C 위치를 쌍으로 치환하는 것이 유리하다.

X로 표시되는 위치에서 시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이 또한 사용된 경우, 화학식에서 각 C 위치의 번호는 이에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 하기 화학식 (II)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 식에서, X, C 및 X 옆의 지수는 상기 정의된 바와 같으며, 지수 n 및 m은 0∼300의 수이고, 단백질은 상기 언급한 접촉각의 변화에 의해 추가로 구분된다.

화학식 (III)의 하이드로포빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 식에서, X, C 및 X 옆의 지수는 상기 정의된 바와 같으며, 지수 n 및 m은 0∼200의 수이고, 단백질은 상기 언급한 접촉각의 변화에 의해 추가로 구분되며, 또한 C로 표시되는 아미노산 중 6개 이상은 시스테인이다. 모든 아미노산 C가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.

잔기 Xn 및 Xm은 또한 하이드로포빈에 자연적으로 연결되어 있는 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 잔기 중 1개 또는 2개는 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은 펩티드 서열일 수 있다. 이들은 또한 하이드로포빈 중에 자연적으로 발생하는 펩티드 서열이 하이드로포빈 중에 자연적으로 발생하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장된 잔기 Xn 및/또는 Xm을 포함한다.

일례는 H*A(가용성 태그 Yaad에 융합된 His-태그된 하이드로포빈 DewA, BASF 공급; 제조에 대해서는 WO 2006/082251 참조).

본 발명에 따라 사용된 단백질은 또한 폴리펩티드 서열이, 예를 들어 글리코실화, 아실화(예, 아세틸화) 또는 화학적 가교, 예컨대 글루타르 디알데히드에 의해 변형될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질의 성질은 표면이 단백질로 코팅될 때 표면 성질을 변화시킨다. 표면 성질의 변화는, 표면이 단백질로 코팅되기 전 및 후에 수적의 접촉각을 측정하고 2개의 측정값 사이의 차이를 확인하여 실험적으로 결정할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 화학식 (I) 또는 추가의 임의의 하이드로포빈에 따른 폴리펩티드는, 각각 코팅되지 않은 유리 표면을 사용한 경우 동일한 크기의 수적의 접촉각과 비교하여 유리 표면 코팅 후에 실온에서 수적의 접촉각의 증가가 일반적으로 20°이상, 또 다른 본 발명의 구체예에서는 25 °이상, 또 다른 본 발명의 구체예에서는 30° 이상, 또 다른 본 발명의 구체예에서는 35° 이상, 예컨대 35 내지 65°이다. 접촉각 측정 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 테스트하려는 하이드로포빈 1 ml당 100 ㎍의 농도, 수중 0.1% Tween 20과 50 ml 아세트산나트륨 pH 4 중 80℃에서 밤새 유리판을 항온처리하고, 증류수에서 커버링 후에 세척한 다음 증류수 중에서 1% 도데실황산나트륨 용액 중에서 80℃에서 10분간 항온처리한 후에 증류수로 세척하여, 유리(창유리, Sueddeutsche Glas, Mannheim, Germany)에서 접촉각을 측정할 수 있다. 샘플을 공기 중에서 건조하고, 액적 또는 50 ㎕의 접촉각(°)을 측정한다. 접촉각 측정은 제조자의 지시에 따라서 Dataphysics Contact Angle System OA 15+, Software SCA20.2.0 (Nov. 2002)에서 측정한다.

본 발명의 실시에 적당한 하이드로포빈은 예를 들어 하이드로포빈의 개시내용에 관해 참고로 본원에 포함되는 WO 06/103230호 또는 WO 2006/136607호에 개시된 것들이다. 이들은 단지 일부이거나 또는 이의 유도체일 수 있다. 복수의 하이드로포빈, 바람직하게는 2개 또는 3개의 동일하거나 또는 상이한 구조를 서로 연결시키고 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않은 상응하는 적당한 폴리펩티드에 연결시킬 수 있다. 수적의 접촉각의 증가 성질을, 더욱 구체적으로 실시에에 개시된 방법으로 케라틴화 표면을 통해 침투를 증가시키는 성질을 적어도 유지하는 것이 중요하다.

본 발명에 있어서 하이드로포빈을 코딩하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열을 숙주 유기체로 삽입하여 핵산 서열의 유전자 발현에 의해 소정의 단백질을 생산하는 유전 공학 방법(재조합)으로 또한 하이드로포빈을 제조할 수 있다. 이종성 또는 동종성 숙주 균주에서 유전자 발현을 실시할 수 있다. 그러한 방법은 원칙적으로 당업자에게 알려져 있으며 예를 들어 WO　06/082251호에 개시되어 있다.

이에 따라 재조합 하이드로포빈을 제조할 수 있다.

상기 제조 방법을 위해 적절한 숙주 유기체(생산 유기체)는 원핵생물(고세균 포함) 또는 진핵생물, 특히 호염성 박테리아 및 메타노코커스를 포함하는 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포, 특히 바람직하게는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리제아(Aspergillus oryzea), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스 종(Pseudomonas spec.), 락토바실러스(lactobacilli), 한세눌라 폴리모프(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), SF9(및 관련 세포)일 수 있다.

생산된 단백질은 융합 단백질의 형태로 직접 사용될 수 있거나, 또는 스플릿하여 융합 파트너를 제거한 후에 "순수한" 하이드로포빈 형태로 사용될 수 있다.

하이드로포빈은 (예컨대 진핵 기원의) 적절한 숙주계를 사용하여 유전 공학법에 의해 글리코실화 또는 아실화 또는 다른 변형된 형태로 얻을 수 있다.

대안적으로 또는 병행하여, 자연 발생적 하이드로포빈은 적절한 방법으로 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어 문헌[Woesten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882호 참조.

천연 공급원으로부터 단리된 하이드로포빈 중에서, 클래스 1에 속하는 것들, 예컨대 CFTH1, SC4, ABH3, EAS, 또는 (특정 구체예에서) 쉬조필륨 코뮨(Schizophyllum commune) 유래의 SC3 또는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)(신규명: 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina) 유래의 HBF II를 언급할 수 있으며, 클래스 II에 속하는 것들, 예컨대 HFBII, T.레세이(수탁 번호 P79073 [GenBank]); HFBI, T. 레세이(수탁번호 P52754[GenBank]); SRHI, 트리코더마 하르지아늄(Trichoderma harzianum)(수탁번호 Y11841[GenBank]); QID3, 트리코더마 하르지아늄(수탁번호 P52755[GenBank]); TRI1, TRI2, 및 TRI3, TH1 클라비셉스 푸시포미스(Claviceps fusiformis)의 3개 단편(수탁번호 Q9UVI4); CPPHI_1, CPPH1_2, CPPH_3, CPPH_4, 및 CPPH_5, cpph1 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea)의 5개의 단편(수탁번호 AJ418045[GenBank]); CRYPA, 크리파린 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)(수탁번호 P52753[GenBank]); CU, 세라토울민 오피오스토마 울미(Ophiostoma ulmi)(수탁번호 Q06153[GenBank]); MAG, 마그나포린 마그나포시 그리세아(Magnaporthe grisea)(수탁번호 AF126872[GenBank]); HCF5, 클라도스포룸 풀붐(Cladosporium fulvum) AJ133703[GenBank]; HCF6, C. 풀붐(수탁번호 CAC27408[GenBank](예컨대, Woesten, Han A.B.: Hydrophobins: Multipurpose Proteins, Annual Review of Microbiology, Publication Date: 01-JAN-01; Wessels J. G. H. (1994) Annu. Rev. Phytopathol 32:413-437; Woesten H. A. B. (2001) Annu. Rev. Microbiol 55:625-646; 및 각각 그 문헌 내에 언급된 참고 문헌 참조)을 언급할 수 있다. SC3의 단리를 위해서, 예컨대 문헌[Wessels, J. G. H. (1997) Advances in Microbial Physiology 38, 1-45; Woesten, H. A. B., de Vries, O. M. H., and Wessels, J. G. H. (1993) Plant Cell 5, 1567-74; Lugones, L. G., Woesten, H. A. B., and Wessels, J. G. H. (1998) Microbiology 144(Pt 8), 2345-53] 참조. 트리코더마 레세이 하이드로포빈 HFBII에 대해서는 문헌[Nakari-Setaelae T., Aro, N., Ilmen, M., Kalkkinen, N. and Penttilae M. 1997, Differential expression of the vegetative and spore-bound hydrophobins of Tricoderma reesei, Cloning and characterization of the hfb2 (for HFB22) gene. Eur. J. Biochem. 248, pp. 415-423] 참조.

가능한 바람직한 재조합 하이드로포빈은 H*A(가용성 태그 Yaad에 융합된 His-태그된 하이드로포빈 DewA, BASF 공급; 제조에 대해서는 WO 2006/082251호 참조).

"예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 (예를 들어, 경피, 피하, 경막, 근골격, 조갑 경유, 조상경유(transonychial) 및/또는 조상으로(peronychial)) 전달시킬 수 있는 침투 증진제는 특히 표면 활성 단백질의 존재가, 표면 활성 단백질이 없는 다른 동일한 조성물로 실현되는 것보다 시간당 케라틴화 표면을 통해 통과하는 더욱 다량의 활성 성분(들) 및/또는 더 높은 농도의 활성 성분(들)을 초래할 수 있다는 것을 의미한다. 이것은, 예를 들어 하기 실시예에 개시된 방법으로 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 "유효한"은 예방학적으로 및/또는 치료학적으로, 바람직하게는 치료학적으로 활성임을 의미한다.

예방학적으로 유효하다는 것은 특히, 1종 이상의 활성 성분이 상기 1종 이상의 활성 성분이 존재하지 않는 상황과 비교하여 질병 또는 장애 형성을 예방하거나 지연시킨다는 것을 의미한다.

치료학적으로 유효하다는 것은, 특히 1종 이상의 활성 성분이 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 모든 증상을 감소시키거나, 또는 심지어 부분적으로 또는 완전히 치유하는 것을 의미한다.

환자는 동물, 예컨대 파충류 또는 조류, 또는 특히 포유동물, 예컨대 인간일 수 있다.

"케라틴화 표면"으로서는, 특히 손발톱과 인접 피부를, 더욱 바람직하게는 손발톱을 의미할 수 있다. "손발톱"은 수의용 예방 및 치료에 있어서 발굽(hoof)도 포함한다.

1종 이상의 활성 성분은, 예를 들어 항생제, 예컨대 항박테리아제(예, 아미노글리코시드 항생제, 예컨대 스트렙토마이신, 프라마세틴, 카나마이신 또는 파로마이신, 세팔로스포린, 예컨대 카팔로리딘, 세포디짐, 세폭시틴 또는 세파클로르, 클로람페니콜, 예컨대 포스포마이신, 린코마이신 항생제, 예컨대 클린다마이신, 마크롤리드 항생제, 예컨대 에리트로마이신, 페니실린 항생제, 예컨대 아목시실린 또는 앰피실린, 폴리펩티드 항생제, 예컨대 암포믹신, 박시트라신 또는 티로트리신, 글리코펩티드 항생제, 예컨대 반코마이신, 테트라사이클린, 예컨대 클로르테트라사이클린 또는 독시사이클린, 스테로이드 항생제, 예컨대 푸시드산, 또는 뉴클레오시드 항대사물질), 항바이러스제(예, 인터페론, 환형 아민, 예컨대 아만티딘, 티오세미카르바존, 예컨대 메티사존, 비구아니드, 예컨대 모록시딘, 또는 뉴클레오시드 항대사물질, 예컨대 이독수리딘 또는 지도부딘), 또는 (특히, 손발톱 치료의 경우에는) 항진균제(항진균약), 예컨대 앰포테리신 B, 니스타틴, 그리세오풀빈, 에코나졸, 미코나졸, 케토코나졸, 클로트리마졸, 플루코나졸, 톨나프타트, 톨시클라트, 아모롤핀, 크로코나졸, 펜티코나졸, 오모코나졸, 세르타코나졸, 나프티핀, 터비나핀, 또한 운데실렌산(예, Zn 염으로서), 살리실산, 시안화칼륨, 페놀, 알데히드, 트리페닐 메탄 염료, 술풀, 황), 예컨대 손발톱의 조갑진균증에 대한 활성제; 소염제(예컨대, 비스테로이드성 소염제 또는 글리코코르티코이드 등), 항류마티스제(예컨대 대증적 항류마티스제 또는 기본 치료제), 진통제(특히, 피부 또는 피부를 통한 치료의 경우에, 예컨대 말초 진통제, 예컨대 아닐린 유도체, 예컨대 파라세타몰, 안트라닐산 유도체, 예컨대 플루펜아미닌산, 메페나민산 또는 니플루미닌산, 페닐알킬산 유도체, 예컨대 아세메타신, 인도메타신, 이부프로펜, 펠비낙, 케토프로펜 또는 나프록센, 옥시캄, 예컨대 테녹시캄 또는 피록시캄, 피라졸 유도체, 예컨대 페나졸 또는 메타미졸, 살리실산 유도체, 예컨대 살리실 아미드, 아세틸 살리실산 또는 디플루니살), 해열제 및, 특히 고용량에서, 통증, 발열 및/또는 염증을 감소시키는 항염증제 성분; 연조직 손상, 염좌, 좌상 및 외상에 의해 유발되는 통증의 경감에 효과적인 국소 항염증 약물; 항건선제, 예컨대 글루코코르티코이드, 예컨대 플루티카손 또는 모메타손, 각질용해제, 예컨대 살리실산, 비타민 D 유사체, 예컨대 칼시포트리올 또는 타칼시톨, 메토트렉세이트, 레티노이드 또는 시클로스포린 A, 항증식제, 예컨대 항흑색종제, 예컨대 각각 화학치료제 또는 항체, 여드름에 대한 치료제 또는 예방제, 예컨대 레티노이드, 예컨대 알리트레티노인, 이소트레티노인 또는 트레티노인, 에리트로마이신, 클린다마이신 또는 아젤라산, 테트라사이클린, 항지루약, 예컨대 항안드로겐, 예를 들어 시프로테론 아세테이트 또는 에스트로겐, 예컨대 메스트라놀, 내인성 또는 외인성 습진, 예컨대 아토피성 또는 국소 습진에 대한 제제, 예컨대 항히스타민제, 글루코코르티코이드, 벤조디아제핀, 항알러지제 등, 또는 특히 안구의 경우 백내장이나 특히 결막염에 대한 제제, 예컨대 항알러지제로부터 선택될 수 있다.

활성 성분과의 직접 접촉이 필요한 위치는, 환자의 예를 들어 손발톱의 경우 손발톱 자체이거나 또는 바로 주변부, 예컨대 발톱 및/또는 손톱의 조상, 조모 및/또는 조판, 또는 동물의 경우에는 발톱 또는 발굽일 수 있다.

"치료가 필요한" (용어 치료가 예방학적 또는 (바람직한) 치료학적 처리를 모두 포함하는 경우)이란 특히, 환자가 예방학적으로(예컨대 질병 또는 장애의 발생에 대한 예상되거나 또는 알려진 감수성 관점에서) 또는 치료학적으로(질병 또는 장애의 개시, 예컨대 하나 이상의 증상의 발현 후에) 그 건강 상태를 유지하거나 개선하기 위해서 치료를 필요로 하는 것을 의미한다.

본 발명에 따라 이용 또는 제조되거나 본 발명의 구체예로서의 약학 제제는 특히 국소 제제, 예컨대 연고, 팅크제, 크림(O/W 에멀션), 리치 크림(W/O 에멀션), 로션, 포옴, 겔, 예컨대 하이드로겔 또는 리포겔, 페이스트, 스프레이, 고형 에어로졸, 샴푸, 비누, 반창고, 패치, 밴드, 용액, 에멀션, 현탁제 등의 형태이며, 필요에 따라서 경피계 적용품, 예컨대 마스크, 습포, 패드를 포함한다. 실제로, 국소 적용할 수 있는 임의의 통상적인 조성물을 본 발명에 이용할 수 있다.

상기 개시된 국소 조제물을 제조하는데 있어서, 국소 조제물의 약학 혼합 분야에서 통상적인 추가의 첨가제, 예컨대 보존제, 증점제, 착향제 등을 비롯한 부형제 및/또는 담체 물질을 사용할 수 있다. 또한, 통상적인 항산화제 또는 통상적인 항산화제의 혼합물을 상기 활성제를 함유하는 국소 조제물로 도입할 수 있다. 이들 조제물에 이용할 수 있는 통상적인 항산화제로는, N-메틸-α-토코페롤아민, 토코페롤, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 에톡시퀸 등이 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 활성제를 함유하는 크림계 약학 제제는 지방산 알콜, 반고형 석유계 탄화수소, 에틸렌 글리콜 및 유화제를 함유하는 수성 에멀션으로 이루어진다.

본 발명에 따른 표면 활성 단백질 및 1종 이상의 활성제를 포함하는 연고 제제는, 예를 들어 활성 물질의 용매 분산물과 반고형 석유계 탄화수소의 혼합물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 활성 성분을 함유하는 크림 조성물은 바람직하게는 보습제, 점도 안정화제 및 물의 수성상, 지방산 알콜, 반고형 석유계 탄화수소 및 유화제의 유성상 및 수성 안정화제-완충액에 분산된 활성제를 포함하는 상으로부터 형성된 에멀션을 포함한다. 안정화제를 국소 조제물에 첨가할 수 있다. 임의의 통상적인 안정화제를 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 이들 지방산 알콜은 안정화제로서 기능한다. 이들 지방산 알콜 성분은 14개 이상의 탄소 원자를 함유하는 장쇄 포화 지방산의 환원으로부터 유도된다. 또한, 모발용 국소 제제에 일반적으로 이용되는 통상적인 향료 및 로션을 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 종래의 유화제를 본 발명의 국소 제제에 이용할 수 있다. 대안적으로, 표준 겔 캐리어를 이용한 겔을 사용할 수 있다.

크림은 물 50% 이상을 포함하는 수중유 에멀션이다. 오일 베이스로서 특히 지방 알콜, 예컨대 라우릴, 세틸 또는 스테아릴 알콜, 지방산, 예컨대 팔미트산 또는 스테아르산, 액체 내지 고체 왁스, 예컨대 이소프로필 미리스테이트, 양모랍 또는 밀랍, 및/또는 탄화수소, 예컨대 바셀린^®(페트로라텀) 또는 파라핀유가 사용된다. 적절한 유화제는 주로 친수성 성질을 가지는 표면 활성 물질, 예컨대 비이온성 유화제, 예를 들어 다가알콜의 지방산 에스테르 또는 이의 산화에틸렌 부가물, 예컨대 폴리글리세르산 지방산 에스테르 또는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 지방산 알콜 에테르 또는 지방산 에스테르, 또는 상응하는 이온성 유화제, 예컨대 지방 알콜 황산염의 알칼리 금속염, 예컨대 라우릴황산나트륨, 세틸황산나트륨 또는 스테아릴황산나트륨이며, 이는 일반적으로 지방 알콜, 예컨대 세틸 알콜 또는 스테아릴 알콜의 존재 하에 사용된다. 수성상에의 첨가제는 특히 크림이 건조해지는 것을 줄이는 제제, 예를 들어 폴리알콜, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과, 보존제 및 향료이다.

페이스트는 그 목적이 존재하는 임의의 수분 또는 분비물에 결합하기 위한 것인, 분비물 흡수 파우더 구성성분, 예컨대 금속 산화물, 예를 들어 산화티탄 또는 산화아연과, 활석 및/또는 규산알루미늄을 가지는 크림 및 연고이다.

포옴은 가압 용기로부터 나오고 에어로졸 형태의 액상 수중유 에멀션으로서, 할로겐화 탄화수소, 예컨대 클로로플루오로-저급 알칸, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄 및 디클로로테트라플루오로에탄, 또는 바람직하게는 비할로겐화된 기상 탄화수소, 에어, N₂O 또는 이산화탄소가 추진체로서 사용된다. 유성상으로서는, 언급된 첨가제와 같이, 특히 연고 및 크림에서 상기 이용된 유상을 이용한다.

팅크제 및 용액은 일반적으로 수성-에탄올 베이스를 가지며, 여기에 필요에 따라 특히 폴리알콜, 예컨대 글리세롤, 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 증발 감소 보습제로서 첨가하고, 지방 복원 물질 , 예컨대 저 분자량 폴리에틸렌 글리콜과의 지방산 에스테르, 즉 수성 혼합물에 용해되는 친지성 물질을 에탄올에 의해 피부로부터 제거되는 지방 물질 대용으로서 첨가하고, 그리고 필요에 따라 다른 부형제 및 첨가제를 첨가한다.

보습제, 예컨대 다가 알콜, 특히 디올 또는 트리올, 예컨대 펜타디올, 예를 들어 1,2-펜탄디올이 존재할 수 있다.

예를 들어, pH를 20∼25℃에서 바람직하게는 4.5∼6.0, 더욱 바람직하게는 4.8∼5.5로 유지하기 위한, pH-조절제도 가능하다.

본 발명에 따른 국소 투여용 약학 조제물은 그러한 조제물 중에 통상적으로 사용되는 비독성의 치료학적으로 비활성인 고체 또는 액체 담체와 상기 활성 성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 이들 조제물은 바람직하게는 조성물의 총 중량을 기준으로 활성 성분(들)을 0.1∼30 중량%, 특히 0.1∼10.0 중량%, 바람직하게는 0.3∼8.0 중량% 포함한다.

표면 활성 단백질은 바람직하게는 본 발명에 따라 약학 제제의 0.001∼5 중량%, 예를 들어 각각 0.01∼2 중량%, 예컨대 0.02∼1 중량% 또는 1∼5 중량%의 양으로 일반적으로 사용(첨가)/존재한다. 매우 소량이 충분할 수 있으며, 이는 본 발명에 따라 사용되는/존재하는 표면 활성 단백질의 고 침투 증진 활성을 나타내는 것이다.

나머지는 담체 물질(들) 및/또는 추가의 첨가제를 포함하는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 상기 개시된 바와 같은 것들 일 수 있다.

도포되는 용량은 치료하고자 하는 위치 및 질병 또는 장애에 따라 달라지며 - 예를 들어, 접촉 면적 1 cm²당 0.1∼50 mg의 양을 1회 또는 수회, 예컨대 1일 최대 3회 도포할 수 있다. 도포되는 용량은 또한 치료하고자 하는 환자의 종, 크기, 성별, 체중 및 다른 구체적인 특징에 따라서 달라질 수 있다.

국소 약학 제제의 조제(제조)는 국소 제제를 얻기 위한 표준 방법, 예를 들어 성분들을 혼합하는 방법을 포함한다. 1종 이상의 표면 활성 단백질 및 1종 이상의 활성 성분을 혼합물에 첨가하거나 또는 혼합하며, 이는 추가의 약학 담체 또는 부형제가 반드시 존재해야 하는 것은 아님을 의미하며, 1종 이상의 담체 물질 또는 부형제를 첨가하여 최종 생성물을 얻을 수 있다. 성분의 첨가 순서가 일반적으로 중요하지만, 유리한 순서는 당업자가 알거나 또는 쉽게 도출할 수 있다.

국소 투여는, 예컨대 손발톱에의 투여이다.

약어:

w/w 중량부당 중량으로 제공되는 백분율 또는 양

v/v 부피에 의한 백분율 또는 양

w/v 부피당 중량의 백분율 또는 양(액상 밀도가 1 g/ml인 경우 w/w와 동일함)

하기 실시예는 그 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시한다.

하이드로포빈의 제조

일반 절차**

하이드로포빈의 제조_/^**

쉬조필륨 코뮨(Schizophyllum commune) 유래의 클래스 I 하이드로포빈(SC3) 및 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei) 유래의 클래스 II 하이드로포빈(HFBII)을 본 발명을 위해 사용하였다. 상기 하이드로포빈을 위한 단백질 서열을 NCBI/진뱅크로부터 얻었다: SC3: 수탁번호 P16933 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=1710860);

HFB II: 수탁번호 CAA72636 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1903325).

아미노산 서열을 핵산 서열로 번역하였다. E. 콜라이에 대하여 코돈 사용을 최적화 후에, cDNA를 합성하였다(Sloning BioTechnology, Pucheim, Germany). 하이드로포빈 핵산 서열을 T7-RNA-폴리머라제를 포함하는 pET 벡터로 클로닝하고 당업계에 공지된 방법으로 발현 숙주 E. 콜라이 BL21로 형질전환하였다(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.).

최적화된 하이드로포빈 cDNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 E. 콜라이 BL21(DE3)의 발효를, 각각 100 ㎍/ml 앰피실린 또는 25 ㎍/ml 카나마이신의 존재 하에 ZYM-5052 배지(25 mM Na₂HPO₄ , 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄Cl, 5 mM Na₂SO₄, 20 mM MgSO₄, 5 g/l 글리세롤, 0.5 g/l 글루코스, 2 g/l 알파-락토스 일수화물, 5 g/l 효모 추출물, 및 10 g/l NZ-아민(Sigma에서 구입))를 사용하여 16 시간 동안 10 리터 규모에서 실시하였다. 바이오매스의 수확 후에, 침강 세포를 액상 배지에서 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 초음파 처리에 의해 침강된 세포의 해동 분액을 처리한 후에, 방출된 봉입체를 30초 동안 세포 균질물을 비등시키고 20℃에서 600 rpm으로 2 시간 동안 교반하여 용해시켰다.

10분 동안 원심분리로 세포 파편을 침강시키고 단백질 함유 상청액을 0.22 μm 필터를 통해 통과시켰다. 니켈 세파로스(GE Healthcare) 상에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 여과물을 분리하고, 용리된 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 하이드로포빈 함유 분획을 축적한 후 하이드로포빈 함유 용액을 물에 대해 10 kDa 컷오프 막(16 시간 동안 물 3 리터 중 30 ml 용리물)을 갖는 Slide-A-Lyzer(Pierce)에서 투석하여 탈염시켰다.

BCA 분석(Pierce)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 하이드로포빈 용액은 액체 질소 중에서 급속 동결시키고 동결건조시켰다.

실시예 1 - 손발톱을 이용한 투과성 연구

제제 및 완충액의 제조

1종 증진제 트리코더마 레세이 하이드로포빈 HFBII(분리 Nakari-Setaelae, T., Aro, N., Ilmen, M., Kalkkinen, N. and Penttilae, M. 1997, Differential expression of the vegetative and spore-bound hydrophobins of Tricoderma reesei, Cloning and characterization of the hfb2 gene. Eur. J.Biochem. 248, pp. 415-423 참조) 또는 H*A (용해성 태그 Yaad에 융합된 His-태그된 하이드로포빈 DewA, BASF 공급; 제조에 대해서는 WO 2006/082251호 참조), 및 모델 활성 성분으로서 카페인 및 물을 포함하는 제제를 순수한 물 대신에 수중 20%(v/v) 에탄올을 함유하는 유사한 제제와 비교하여 평가하였다. 에탄올은 물에 잘 녹지 않는 물질에 대한 유효 용매이고 미생물 생장을 억제할 수 있기 때문에, 더욱 양호한 또는 비슷한 투과성이 바람직하다. 투과성 실험을 위해서, 각 증진제를 용매로서 물을 함유하는 조제물, 또는 용매로서 수중 20% (w/w) 에탄올을 함유하는 조제물 중에 사용하였다. 증진제의 농도는 5%(w/v 또는 v/v)였고, 단 도큐세이트 나트륨염은 1% (w/v)이고 각각 하이드로포빈은 0.02 및 0.1%였다. 모든 제제는 2% (w/w)의 농도의 카페인을 모델 활성 성분으로서 포함하였다. 이 카페인 농도를 이용하여 용액을 거의 포화시켰다. 이것은 가능한 최대 농도 구배에 따른 더욱 신속한 정상 상태를 실현하려는 것이었다. 인산염 완충 염수(PBS)를 pH 7.4로 조제하였다. PBS의 pH 및 삼투압은 Franz 확산 세포 억셉터 챔버에서 생리적 혈액 조건(전신 완충계)을 모의하였다. 제제 및 PBS에 사용되는 물은 새로 제조되고, 이중 증류되고 여과되었다.

투과 연구

투과 실험을 위한 건강한 손발톱은 Institute of Anatomy of the University of Basel 및 Institute of Anatomy of the University of Freiburg, Germany에서 입수하였다. 확산 면적이 0.785 cm²인 Franz 확산 셀(SES GmbH - Analysesysteme, Bechenheim, Germany)을 이용하였다. 손발톱을 1 시간 동안 PBS 중에 침지하여 완전히 수화시키고 금속 펀칭기로 절단하였으며, 직경은 16 mm였다. 이어서, 이를 적절한 방식으로 확산 세포에 설치하였다. 손발톱 아래의 억셉터 챔버를 5 ml PBS로 충전하였다. 제제(400 ㎕)를 손발톱에 적용하였다. 계의 온도를 일정하게 유지하기 위해서, 32℃에서 유지되는 워터 잭킷으로 글래스 셀을 조절하였다. 억셉터 챔버를 400 rpm에서 자기 교반기로 교반하였다. 제제용 개구와 샘플 채취 연장부를 파라필름(파라핀 왁스 및 폴리에텐을 포함하는 필름; American National Can Company, USA)으로 덮었다. 400 ㎕의 샘플을 각 셀로부터 1일 2회 채취하고 32℃로 가온된 동량의 PBS로 교체하였다. 6일 후에, 실험을 정지시켰다. 샘플 농도를 UV-분광기로 측정하였다. 플럭스 및 투과 계수를 48 시간 후의 값으로 계산하였는데, 이 시간이 정상 상태가 얻어지는 시점이기 때문이다.

증진 인자는 수중 20% 에탄올 또는 순수한 물을 이용한 대조군과 비교하여 고정된 손발톱 판을 통한 카페인의 침투 촉진을 나타낸다.

실시예 1a - 손발톱을 이용한 투과성 연구

또 다른 침투 연구는 실시예 1에서와 동일한 실험 설정에 따라 이루어졌으나 단 터비나핀을 활성제로서 사용하고 상기 추가로 개시된 바와 같은 클래스 I 하이드로포빈(하이드로포빈 C)을 사용하였다.

제제: 60%(v/v) 에탄올/물 용액 중 0.1%(w/v) 하이드로포빈 + 10%(w/v) 터비나핀; 기준은 60%(v/v) 에탄올/물 중 10% (w/v) 터비나핀 용액이다. 각 테스트에 대해 3개의 샘플 처리를 평균하였다. 결과(도 2에 제시됨)는 처리 2∼10일 후에 하이드로포빈에 의한 명백한 증진을 나타낸다(10일 후 누적량: 약 83 mg/cm², 및 기준 용액만을 사용한 경우 약 12 mg/cm²).

실시예 2(비교예): 피부를 이용한 투과성 연구

피부를 통한 카페인의 침투는 인간 표피 피부 모델(EST-1000, Cell Systems, St. Katharinen, Germany)을 사용하여 측정하였다. 인간 피부에 대한 시험관내 모델은 14일 동안 배양시키고 피부 유사 성질을 가지는 견고한 다층 3차원 세포 배양물로 이루어진다. EST-1000의 세포 구조물은 자연 표피와 유사하여, 기저막, 증식성 각질세포 및 온전한 차단막 기능을 갖는 각질층을 나타낸다.

0.63 cm²표면적 및 0.4 ㎛ 기공 크기를 가지는 폴리카르보네이트 막을 갖는 세포 배양물 삽입체에 조직을 제공하였다. 막은 세포로 완전히 덮었으며, 완전한 분화 후에 무광택의 백색 건조한 표면을 나타내었다. 멸균 핀셋을 사용하여 삽입체를 쉽게 취급하였다. 전달시, 각 삽입체를 유지 배지(Cell Systems가 제공) 1 ml를 함유하는 6-웰 세포 배양 접시의 웰에 넣어 피부 삽입체를 평형화시켰다. 평형 4-12 시간 후에, 시험 물질을 건조한 피부 모델 표면에 놓았다. 피부 모델을 통해 피부 배양물의 표면에 놓인 물질의 침투는, 삽입체를 둘러싸는 배지를 샘플링하고 테스트 물질, 여기서는 카페인의 농도를 검측하여 측정하였다.

피부를 통해 카페인의 투과성을 증진시키는 하이드로포빈의 능력을 시험하기 위해서, 하기 실험 계획을 선택하였다. 카페인을 시그마로부터 구입하고 10 mg/ml(1% w/v)의 농도로 적용하였다. SC3은 쉬조필륨 코뮨, ATCC 44200으로부터 유래한 112 아미노산의 하이드로포빈이고 HBF II(도면에서 HB F2라고 명명함)는 트리코더마 레세이(신규명: 하이포크레아 제코리나) ATCC 90557로부터 유래한 86 아미노산의 하이드로포빈이다.

실험 계획

대조군: 50% EtOH/PBS 중 1% 카페인 50 ㎕의 미처리 피부 모델에의 도포

프리코팅: 60분 동안 각각 100 ㎍/ml SC3 또는 HBF II 50 ㎕로 피부 배양물의 전처리 후 남은 하이드로포빈 용액 제거 및 50% EtOH/PBS 중의 1% 카페인 50 ㎕ 도포.

혼합물: 각각 100 ㎍/ml SC3 또는 HBF II, 및 50% EtOH/PBS 중 1% 카페인의 혼합물 도포 및 피부 모델에의 상기 혼합물 50 ㎕ 도포.

37℃ 및 5% CO₂의 세포 배양 인큐베이터에서 항온처리 48 시간 내에, 100 ㎕ 배지를 (표 2 및 도 1에 제시된 바와 같은) 상이한 시간 간격을 두고 각 웰로부터 샘플링하였으며, HPLC 검출로 카페인 농도를 측정하였다. 각 샘플링시 제거된 배지를 100 ㎕ 새로운 배지로 교체하였다. 표 2에 제시된 바와 같이 유지 배지 중의 카페인 농도는 각각 2회 독립적인 피부 배양의 평균값이다.

피부 배양물에 대한 시험 샘플의 세포독성은 피부 모델 제공자의 지시에 따라서 MTT 분석으로 결정하였다. 피부 모델에서의 세포 생존율은 PBS만으로 처리한 배양물과 비교하여 용매(50% 에탄올, 0.002% SDS)에 의해 영향을 받지 않았다. 1% 카페인 또는 1% 카페인/10 ㎍ 하이드로포빈(각각 SC3 또는 HFB II)을 피부 배양물에 도포하였을 때 대조군 배양물의 약 50%의 생존율이 관찰되었는데, 이는 하이드로포빈 자체가 200 ㎍/ml의 농도에서 세포독성이 아님을 보여준다. 피부 모델의 차단막 기능은 세포의 생존율 감소에 의해 완전히 영향을 받지 않는 것 같은데, 그 이유는 상층 각질세포가 비생세포를 포함하기 때문이다. 또한, 1% 카페인으로 처리한 피부 배양물 및 1% 카페인 및 10 ㎍ 하이드로포빈으로 처리한 배양물의 비교로 투과 증진을 측정하였으며, 이는 48 시간 후의 실험 말미에 결정되는 것과 동일한 생존률을 나타내었다.

그 결과는, SC3 및 HFB II가 둘다 시험관내 인간 피부 모델을 통한 카페인(1% w/v)의 침투를 최대 21.5% 증진시킨다는 것을 보여준다(표 2). 하이드로포빈과 카페인의 혼합물은 하이드로포빈의 도포 1 시간 후에 카피인의 도포 및 하이드로포빈의 프리코팅보다 우수한 침투 증진 효과를 가지며, 이는 투과 증진제로서의 하이드로포빈과 피부 효과적 약물이 혼합된 유효 조제물에 유리하다. 클래스 II 하이드로포빈 HFB II는 클래스 I 하이드로포빈 SC3보다 투과 증진 측면에서 약간 더 효과적이다.

더욱 상세한 내용에 대해서는 또한 도 1a 및 1b 참조.

Claims

(동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 손발톱으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유(transungual) 전달할 수 있는 침투 증진제로서의 표면 활성 단백질의 용도로서, 상기 표면 활성 단백질을, 하나 이상의 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 제제에 혼합하는 것을 포함하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 표면 활성 단백질은 라테린(latherin), 포스포리파제 C, 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 단백질, 알라산(alasan), SapB, 당지질 전달 단백질, 채플린(chapline) 또는 하이드로포빈 클래스, 특히 하이드로포빈 클래스 1 및/또는 클래스 2로부터 선택되는 단백질 또는 단백질 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표면 활성 단백질은 비변형되거나 또는 글리코실화, 아실화 또는 가교결합될 수 있는 천연 또는 재조합 하이드로포빈으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질인 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표면 활성 단백질은 하기 화학식 (I)의 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상의 단백질인 용도:

상기 식에서, X는 20개의 자연 발생 아미노산인 Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly 중 임의의 아미노산일 수 있고, X는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각 경우에 X 옆의 지수는 아미노산의 수를 나타내고, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이고, C로 나타내어지는 아미노산 (C¹-C⁸) 중 4개 이상은 시스테인이며, 지수 n 및 m은 각각 상호 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300, 더욱 바람직하게는 15∼200의 자연수이다.
제4항에 있어서, C¹-C⁸로 나타내어지는 아미노산은 시스테인인 용도.
제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하이드로포빈(들)은 클래스 I에 속하는 것들, 특히 CFTH1, SC4, ABH3, EAS, 또는 쉬조필륨 코뮨(Schizophyllum commune) 유래의 SC3, 또는 클래스 II에 속하는 것들, 특히 HFBII, HFBI, SRHI, QID3, TRI1, TRI2, TRI3, TH1의 3개 단편, CPPHI_1, CPPH1_2, CPPH_3, CPPH_4, CPPH_5, cpph1의 5개 단편, CRYPA, CU, MAG, HCF5, HCF6로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1종 이상의 활성 성분은 항생제, 특히 항박테리아제, 항바이러스제, 또는 특히 항진균제, 예컨대 앰포테리신(amphotericin) B, 니스타틴(nystatin), 그리세오풀빈(griseofulvin), 에코나졸(econazol), 미코나졸(miconazol), 케토코나졸(ketoconazol), 클로트리마졸(clotrimazol), 플루코나졸(fluconazol), 톨나프타트(tolnaftat), 톨시클라트(tolciclat), 아모롤핀(amorolfin), 크로코나졸(croconazol), 펜티코나졸(fenticonazol), 오모코나졸(omoconazol), 세르타코나졸(sertaconazol), 나프티핀(naftifin), 터비나핀(terbinafin)과, 운데실렌산(예, Zn 염으로서), 살리실산, 시안화칼륨, 페놀, 알데히드, 트리페닐 메탄 염료, 술풀, 황), 예컨대 손발톱의 조갑진균증에 대한 활성제; 소염제, 항류마티스제, 진통제, 해열제, 항염증제 성분, 각질용해제, 항증식제, 여드름에 대한 치료제 또는 예방제, 내인성 또는 외인성 습진에 대한 제제로 이루어진 군으로부터의 1종 이상에서 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 손발톱 치료용 조성물에서의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표면 활성 단백질은 약학 제제의 중량의 0.001∼5%의 양으로 조성물에 첨가되는 것인 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표면 활성 단백질은 실온에서, 유리 표면 코팅 후에 수적의 접촉각을, 각각 코팅되지 않은 유리 표면을 이용한 경우 동일한 크기의 수적의 접촉각과 비교하여 일반적으로 20°이상, 예컨대 25 °이상, 예컨대 30° 이상, 예컨대 35° 이상, 예컨대 35 내지 65 °증가시키는 성질을 갖는 것인 용도.
환자, 특히 조갑 경유 전달 치료가 필요한 환자에게 예방학적 또는 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 손발톱으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유 전달하기 위한 침투 증진제로서의 표면 활성 단백질의 사용 방법으로서, 상기 사용은 1종 이상의 활성 성분 및 경우에 따라 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 성분과 함께 약학 제제에 상기 표면 활성 단백질을 혼합하는 것을 포함하고, 상기 방법은 바람직하게는 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 용도를 포함하는 것인 사용 방법.
예방학적 또는 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 조갑 경유 전달하기 위해서, 환자의 손발톱으로 및/또는 이를 통하여 상기 환자로의 1종 이상의 활성 성분의 침투를 증진시키는 방법으로서, 사용은, 바람직하게는 제11항에 따라서, 1종 이상의 활성 성분 및 경우에 따라 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 성분과 함께 약학 제제에 표면 활성 단백질을 혼합하는 것과, 생성되는 약학 제제를 상기 환자에게 국소 투여하는 것을 포함하는 증진 방법.
손발톱 표면으로 및/또는 이를 통해 활성 성분(들)의 전달을 증가시키는 것을 포함하는, 특히 침투 증진제 없이 치료가능성이 낮거나 또는 치료할 수 없는 환자에게 사용하기 위한, 약학 제제의 중량을 기준으로 0.001∼5%의 표면 활성 단백질 형태의 침투 증진제 및 1종 이상의 약학적 활성 성분을, 1종 이상의 추가의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 제제로서, 상기 활성 성분 및/또는 표면 활성 단백질은 바람직하게는 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 것인 약학 제제.
손발톱 표면으로 및/또는 이를 통하여 1종 이상의 약학적 활성 성분(들)의 조갑 경유 전달에 사용하기 위한, 특히 침투 증진제 없이 치료가능성이 낮거나 또는 치료할 수 없는 환자에게 사용하기 위한, 표면 활성 단백질 형태의 침투 증진제를, 1종 이상의 추가의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 제제로서, 상기 활성 성분 및/또는 표면 활성 단백질은 바람직하게는 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 것인 약학 제제.
(동물 및 인간을 포함하는) 환자에게 예방학적 또는 (특히) 치료학적 유효량의 1종 이상의 활성 성분을 상기 환자의 손발톱으로 및/또는 이를 통하여 조갑 경유 전달할 수 있는 침투 증진제로서의 약학 제제의 제조를 위한 표면 활성 단백질의 용도로서, 1종 이상의 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 제제에 상기 표면 활성 단백질을 혼합하는 것을 포함하고, 상기 활성 성분(들) 및/또는 표면 활성 단백질은 바람직하게는 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 것인 용도.