CN101080637A - 由二乙炔材料构成的比色传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测分析物的比色传感器。本发明还公开了使用比色传感器和试剂盒来比色检测分析物的方法。

Description

由二乙炔材料构成的比色传感器
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年12月17日提交的美国临时专利申请系列号60/636,993的优先权，该申请被全文引入本文以供参考。
发明背景
目前用于检测微生物、尤其是耐抗生素细菌的技术通常是耗时的，典型地涉及培育纯形式的细菌。主要关注的一种所述微生物是金黄色葡萄球菌(“S.aureus”)，它是引起广谱感染的病原，这些感染包括：浅表损伤如皮肤小脓肿和创伤感染；全身和致命的病症，如心内膜炎、肺炎和败血症；以及毒素病，如食物中毒和中毒性休克综合征。金黄色葡萄球菌耐受除少数选择性抗生素以外的所有抗生素。
已经尝试使用各种各样的常规技术分析微生物。例如，方法包括使用荧光免疫色谱法(例如，美国专利第5,753,517号中所述的快速分析测量程序)、ELISA(例如比色ELISA)、和其它比色技术。美国专利5,622,872和公开WO 02/00920；美国专利6,395,561 B1；6,306,598 B1；6,277,652；6,183,722；和6,080,423中描述了包括聚二乙炔(PDA)材料的比色传感器。
二乙炔作为溶液中的单体通常是无色的，经加热或光化学辐射可发生加成聚合。当聚合时，这些化合物发生对比色变化，变成蓝或紫色。当经受外部刺激时，如加热、物理压力、或者溶剂或相反电荷离子变化时，聚二乙炔因平面骨架构象的变形表现出进一步的颜色变化。例如，已知随着温度升高或pH变化，由于共扼骨架中的构象变化，聚二乙炔组装体颜色从蓝变到红色，如Mino等人，Langmuir，Vol.8，p.594，1992；Chance等人，化学物理杂志(Journal of Chemistry and Physics)，Vol.71，206，1979；Shibutag，固体薄膜(Thin Solid Films)，Vol.179，p.433，1989；Kaneko等人，固体薄膜(Thin Solid Films)，Vol.210，548，1992；和美国专利5,672,465中所述。
尽管本领域已经描述了检测金黄色葡萄球菌以及其它微生物的方法，但改进检测方法将是有益的。
发明概述
本发明提供了一种比色传感器，其通过光谱变化(颜色变化可用裸眼或比色计观察)来检测分析物的存在，所述光谱变化是由分析物通过引起聚二乙炔组装体构象变化的方式发生相互作用而引起的。聚二乙炔组装体以简单但高度灵敏的方式指示分析物的存在。
本发明提供了用于检测分析物的比色体系，该体系包括：包括受体的比色传感器；包括至少一种二乙炔化合物的聚合组合物(这意味着由所述二乙炔化合物的聚合而形成所述聚合组合物)；其中所述受体被掺入到所述聚合组合物中以形成转导物；和介导所述分析物与所述转导物之间相互作用的缓冲组合物，其中所述缓冲组合物优选包括两种或多种不同的缓冲剂；其中所述转导物在与分析物接触时表现出颜色变化。
在一个实施方案中，所述缓冲组合物是具有较高离子强度的缓冲剂与具有较低离子强度的缓冲剂的组合。在优选实施方案中，所述缓冲组合物选自：HEPES缓冲剂、咪唑缓冲剂、PBS缓冲剂、及其组合。在一个实施方案中，所述缓冲剂通过与所述转导物的离子相互作用来介导分析物的相互作用。在另一个实施方案中，所述缓冲组合物通过增强与所述转导物的疏水相互作用来介导分析物的相互作用。转导物可以被分散在水溶液中或涂覆在基底上。
在另一个实施方案中，所述比色体系还包括探针。在优选实施方案中，所述探针选自：纤维蛋白原、链霉亲和素、IgG、及其组合。
在另一个实施方案中，所述比色体系还包括表面活性剂。在优选实施方案中，所述表面活性剂包括非离子型表面活性剂。
在示例性实施方案中，比色体系的转导物是脂质体和/或在与缓冲组合物接触时表现出颜色变化。
在示例性实施方案中，所述二乙炔化合物(即用于聚二乙炔材料的原材料)具有下式：
Figure A20058004342900111
其中R1包括
C1-C20烷基、
Figure A20058004342900112
Figure A20058004342900113
R2包括
Figure A20058004342900114
Figure A20058004342900121
其中R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33独立地为C1-C20烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32独立地为C1-C14亚烷基；R6、R15、R18和R26独立地为C1-C14亚烷基、C2-C8亚烯基、或C6-C13亚芳基；R9为C1-C14亚烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29独立地为C1-C14亚烷基或(C1-C14亚烷基)-(C2-C8亚芳基)；R11和R28独立地为C2-C30炔基；R17为酯活化基团；R23为C6-C13亚芳基；R30为C1-C14亚烷基或-NR36-；R34和R36为C1-C4烷基；p为1-5(本文中，“二乙炔”用于包括具有二至十个C-C三键的化合物)；n为1-20；其中R1和R2不相同。
在一个实施方案中，比色体系的受体包括磷脂，所述磷脂选自：磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、及其组合。
本发明还提供了用于检测分析物的方法。所述方法包括：形成包括受体和含二乙炔的聚合组合物(即所述聚合组合物源自二乙炔的聚合)的比色传感器，其中所述受体被掺入到聚合组合物中以形成能够表现颜色变化的转导物；使传感器与探针接触；在缓冲组合物(优选包括两种或多种不同的缓冲剂)存在的情况下，使传感器与怀疑包含靶分析物的样品接触；如果分析物存在，则观察颜色变化。
在另一个实施方案中，提供了用于检测分析物的方法，该方法包括：形成包括受体和含二乙炔的聚合组合物的比色传感器，其中所述受体被掺入到聚合组合物中以形成转导物，该转导物在探针存在时能够表现颜色变化；在缓冲组合物(优选包括两种或多种不同的缓冲剂)存在的情况下，使转导物与怀疑包含靶分析物的样品、和对靶分析物和受体两者都具有亲和力的探针接触；如果分析物存在，则基本上观察不到颜色变化。优选地，可以在接触转导物前，将所述探针和怀疑包括靶分析物的样品组合以形成混合物。
在示例性实施方案中，所述分析物选自：金黄色葡萄球菌、蛋白A、PBP2′、大肠杆菌(E.coli)、和铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)。在大多数实施方案中，在转导物与分析物接触60分钟以内，比色体系表现出可观察到的颜色变化。
定义
对于下面所定义的术语，除了在权利要求书和本说明书其它地方有不同的定义，应使用这些定义：
本文中，术语“烷基”指具有特定碳原子数的直链或支链或环状的单价烃基。烷基包括具有一至二十个碳原子的烷基。本文中“烷基”的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丁基和异丙基等。应该理解，当想要表示环状部分时，在所述烷基中必须存在至少三个碳原子。这种环状部分包括：环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
本文中，术语“亚烷基”指具有特定碳原子数的直链或支链或环状的二价烃基。亚烷基包括具有一至十四个碳原子的亚烷基。本文中“亚烷基”的例子包括但不限于：亚甲基、亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基等。应该理解，当想要表示环状部分时，在所述亚烷基中必须存在至少三个碳原子。这种环状部分包括：环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚庚基。
本文中，术语“亚烯基”指具有特定碳原子数和一个或多个碳-碳双键的直链或支链或环状的二价烃基。亚烯基包括具有二至八个碳原子的亚烯基。本文中“亚烯基”的例子包括但不限于1，2-亚乙烯基、1，3-亚丙烯基等。
本文中，术语“亚芳基”指二价不饱和芳族羧基，具有单环的亚芳基为例如亚苯基，或具有多个稠环的亚芳基为例如萘或蒽。亚芳基包括具有六至十三个碳原子的亚芳基。本文中“亚芳基”的例子包括但不限于1，2-亚苯基、1，3-亚苯基、1，4-亚苯基、1，8-亚萘基等。
本文中，术语“亚烷基-亚芳基”指上述亚芳基部分与上述亚烷基部分键合。本文中“亚烷基-亚芳基”的例子包括但不限于：-CH2-亚苯基、-CH2CH2-亚苯基、和-CH2CH2CH2-亚苯基。
本文中，术语“炔基”指具有二至三十个碳原子和至少一个碳-碳三键的直链或支链或环状的单价烃基。本文中“炔基”的例子包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
本文中，术语“分析物”指能够通过本发明的传感器检测的任何材料。这种材料包括但不限于：小分子、致病和非致病有机体、毒素、膜受体和片段、挥发性有机化合物、酶和酶底物、抗体、抗原、蛋白质、肽、核酸、和肽核酸。“靶分析物”指传感器体系检测的材料目标。
本文中，术语“细菌”指被认为是细菌的所有微生物形式，包括球菌、杆菌、螺旋菌、原生质球状体(sheroplasts)、原生质体等。
本文中，术语“受体”指对于靶分析物和/或探针具有亲和力的任何分子或分子组装体。受体包括但不限于天然或合成受体，如脂质体、表面膜蛋白、酶、血凝素、抗体、重组蛋白、合成蛋白、核酸、c-糖苷、碳水化合物、神经节苷脂、及鳌合剂。
本文中，术语“组装”或“自组装”指在聚合前二乙炔分子和磷脂的任何自排序。参见J.Israelachvili，分子间的力和表面力(Intermolecular and Surface Forces)(2nd Ed.)，Academic Press，New York(1992)，pp.321-427。
本文中，术语“自组装单层”(SAM)指通过自发自排序，在给定基底上形成的任何有序的超薄有机薄膜。A.Ulman，超薄有机薄膜入门(An Introduction to Ultrathin Organic Films)，Academic Press，NewYork(1991)，pp.237-301。
本文中，术语“转导物”指能够将分子水平的识别事件如共价键合或非共价相互作用(例如静电相互作用、极性相互作用、范德华力)转化成可观察信号的材料。
“探针”指能够与靶分析物和/或受体发生相互作用的成分。因此，探针是一类“可检测的结合试剂”，即该试剂能特异性地识别并与分析物(即靶分析物)和/或受体发生相互作用或结合，其中探针的性质允许在结合时检测。“特异性相互作用”意味着可检测的结合试剂与靶分析物或受体发生物理相互作用，基本上排除样品中还存在的其它分析物。可用于本发明的可检测结合试剂的结合具有允许测量所述结合的稳定性。
当术语“包括”及其变化在说明书和权利要求书中出现时，这些术语没有限制意义。
措辞“优选的”和“优选地”指在某些环境下，本发明的实施方案可能具有某些益处。但是，在相同环境或其它环境下，其它实施方案也可以是优选的。此外，列举一种或多种优选实施方案并非暗示其它实施方案不可用，并非意欲将其它实施方案排除在本发明的范围以外。
本文中，“一个”、“所述”、“至少一个”和“一种或多种”是互换使用的。
本文中所有的数值被认为可由术语“约”修饰。通过端点表示的数值范围包括此范围内的所有数值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)。
上面的发明概述并非意欲描述本发明公开的每个实施方案或的每个实施。下面的描述更具体地示范了说明性实施方案。在本申请的几个地方，通过列举实施例提供了指导，这些例子能够用于各种组合。在每种情况中，所引用的列举仅仅作为代表组，不应认为是排它性列举。
附图简述
图1显示了本发明的比色传感器的示意图。
图2显示了本发明的比色传感器阵列的示意图。
具体实施方案
本发明提供了用于检测分析物的比色传感器体系。所述比色体系包括：包括受体和聚合二乙炔材料(聚二乙炔组装体，它指可以(但不必须)包括其它成分的有组织聚二乙炔结构)的比色传感器，其中所述受体被掺入到聚二乙炔中以形成转导物，该转导物在与探针和/或分析物结合时能提供颜色变化。所述比色传感器能够在溶液中起作用或涂覆在基底上。
聚二乙炔组装体
本发明的二乙炔化合物能够在溶液中自组装以形成有序的组装体，所述组装体能够使用任何光化学辐射，如在UV或可见光范围内的电磁谱中的电磁辐射，以聚合该组装体。所述二乙炔化合物的聚合产生聚合反应产物，该产物在小于570纳米(nm)、570nm至600nm(包括端点)、或大于600nm的可见光谱中具有颜色，这取决于它们的构象和所面临的外部因素。通常，本文公开的二乙炔化合物的聚合导致包括聚二乙炔骨架的亚稳定蓝相聚合物网络。举例而言，在经受外部因素如加热、溶剂或相反电荷的变化、或者如果有物理压力时，这些亚稳定的蓝相聚合物网络发生从蓝到红-橙色的颜色变化。
本文公开的二乙炔化合物及其聚合产物能够在暴露于物理压力时经历可见的颜色变化的能力，使得它们成为制造传感装置来检测分析物的候选物。由所公开的二乙炔化合物形成的聚二乙炔组装体能够在生物传感应用中作为转导物起作用。
对于给定的传感应用，二乙炔分子的结构要求典型地是应用特异性的。特征如总链长、溶解性、极性、结晶性、和用于进一步修饰分子而存在的官能团一起，共同确定二乙炔分子作为有用的传感材料的能力。例如，在生物检测水性介质中的分析物的情况下，二乙炔化合物的结构应该能够在水中形成稳定的分散体，有效地聚合成有色的材料，能够掺入恰当的受体化学物质以结合分析物，并能够通过颜色变化转导所述的结合相互作用。这些能力取决于二乙炔化合物的结构特征。
本发明的二乙炔化合物具有上述能力，易于有效地聚合成聚二乙炔组装体，从而发生所需的颜色变化。而且，所述二乙炔化合物允许掺入大大过量的不可聚合的材料，如下述受体，同时仍然形成稳定可聚合的溶液。
能够以快速高收率的方式，包括高产量的合成方法，合成所公开的二乙炔化合物(原材料)。二乙炔化合物(原材料)骨架中存在官能度如杂原子，这样能够为满足给定传感应用的要求而进行容易的结构加工。通过将二乙炔添加到合适的溶剂如水中，将混合物超声，然后用波长通常为254nm的紫外光照射所述溶液，能够将二乙炔化合物聚合成包含所需聚二乙炔骨架的网络。在聚合后，所述溶液的颜色变成蓝紫色。
可用于本发明的二乙炔(原材料)典型包含至少为8的平均碳链长度，具有至少一个官能团如羧基、伯胺基或叔胺基、羧基的甲酯等。合适的二乙炔包括美国专利5,491,097(Ribi等人)、PCT公开WO02/00920、美国专利6,306,598、和PCT公开WO 01/71317中所述的那些。
在优选的实施方案中，聚二乙炔组装体包括由下式二乙炔获得的聚合化合物：
其中R1为：
烷基、
Figure A20058004342900182
Figure A20058004342900183
R2为：
Figure A20058004342900184
Figure A20058004342900191
R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33独立地为烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32独立地为亚烷基；R6、R15、R18和R26独立地为亚烷基、亚烯基、或亚芳基；R9为亚烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29独立地为亚烷基或亚烷基-亚芳基；R11和R28独立地为炔基；R17为酯活化基团；R23为亚芳基；R30为亚烷基或-NR36-；R34和R36独立地为H或C1-C4烷基；p为1-5；n为1-20；其中R1和R2不相同。
示例性化合物还描述于美国公开2005/0101794-A1以及美国公开2004/0126897-A1和2004/0132217-A1中。
在优选实施方案中，R1为
Figure A20058004342900192
其中R7为亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、或1，9-亚壬基，R6为亚乙基、1，3-亚丙基、亚乙烯基、或亚苯基；和
其中R2为
其中R20为亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、或1，9-亚壬基，其中R21为十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基；和其中p为1。
本发明包括本文所述的化合物，包括异构体如结构异构体和几何异构体、盐、溶剂化物、多晶型物等。
式XXIII的二乙炔能够按照流程1所示制备，其中n典型地为1至4，m典型为10至14。
                         流程1
在合适的溶剂如DMF中，通过与合适的氧化剂反应，可经过氧化由式XXII的化合物制备式XXIII的化合物。合适的氧化剂包括例如琼斯试剂和重铬酸吡啶盐。前述反应典型在0℃至40℃、通常为0℃至25℃进行，反应时间为1小时至48小时，通常为8小时。
通过与合适的酰基氯反应，可由式XXI的化合物制备式XXII的化合物。合适的酰基氯包括可提供所需产物的任何酰基氯，如月桂酰氯、1-十二烷酰氯、1-十四烷酰氯、1-十六烷酰氯和1-十八烷酰氯。合适的溶剂例如包括醚、四氢呋喃、二氯甲烷、和氯仿。前述反应典型地在碱如三烷基胺或吡啶碱的存在下，在0℃至40℃、通常为0℃至25℃的温度下进行，反应时间为1小时至24小时，通常为3小时。
式XXI的化合物可以是购买的(例如当n为1-4)，或者按照例如流程1所示和Abrams，Suzanne R.；Shaw，Angela C.“三键异构化：2-至9-癸炔-1-醇”(Triple-bond isomerizations：2-to 9-decyn-l-ol)，Org.Synth.(1988)，66，127-31和Brandsma，L.制备性炔化学”(PreparativeAcetylenic Chemistry)(Elsevier Pub.Co.，New York，1971)所公开的，通过化合物XIX和XX，从式XVIII的化合物制备。
也可以在合适的溶剂如甲苯存在的情况下，通过式XXII的化合物与酸酐如琥珀酸酐、戊二酸酐或邻苯二甲酸酐反应来制备本文公开的二乙炔化合物。前述反应典型地在50℃至125℃、通常为100℃至125℃的温度下进行，反应时间为1小时至24小时，通常为15小时。
包括聚合二乙炔的比色传感器能够作为比色检测分子识别事件的基础。通过在聚合前或聚合后，将受体添加到二乙炔单体中，能够制备所述传感器。受体能够通过各种方式，包括物理混合、共价键合、和非共价相互作用(例如静电相互作用、极性相互作用等)，将聚二乙炔组装体功能化。
在聚合时或聚合后，受体被有效地掺入聚合物网络，从而由于共轭烯-炔聚合物骨架的动摇，使受体与分析物相互作用，导致可见的颜色变化。
受体与聚二乙炔组装体的掺合所提供的结构形状能够变形以响应与探针和/或分析物的相互作用或结合。特别有用的受体是具有典型杆状分子构造的两性分子组装体，可通过定义为v/(a0lc)的包装参数来描述其特征(Israelachvili，J.N.等人，Q.Rev.Biophys.；13，121，1980)：其中v是分子的烃成分(例如磷脂或脂肪酸的烃链)所占的体积，a0为极性首基(例如磷脂的磷酸盐首基或脂肪酸的羧酸首基)所占的有效面积，lc是所谓临界长度，它通常描述分子在其环境温度下的长度。对于受体，优选两性分子的包装参数v/(a0lc)值为1/3至1。
有用的受体例子包括但不限于：脂质、表面膜蛋白、酶、血凝素、抗体、重组蛋白、合成蛋白、核酸、c-糖苷、碳水化合物、神经节苷脂、及鳌合剂。在大多数实施方案中，受体是磷脂。合适的磷脂包括：磷酸胆碱(例如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱)、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、和磷脂酰甘油，如Silver，Brian L.，膜物理化学(The Physical Chemistry of Membranes)，第1章，pp 1-24(1985)中所述的那些。
在一个实施方案中，受体物理混合并分散在聚二乙炔中，以形成结构，其中所述结构本身对所关注的探针和/或分析物具有结合亲和力。所述结构包括但不限于脂质体、胶束、和薄片。在优选实施方案中，所述结构为脂质体。尽管不受理论的约束，但相信当聚二乙炔组装体将脂质体发生的物理化学变化翻译为可见颜色变化时，磷脂可模拟细胞膜。所制备的脂质体具有充分限定的形态学、大小分布、和其它物理性质如充分限定的表面电位。
脂质体中受体与二乙炔化合物(原材料)的比率能够基于材料的选择和所需的比色响应而变化。在大多数实施方案中，磷脂与二乙炔化合物(原材料)的比率将为至少25∶75，更优选至少40∶60。在优选实施方案中，脂质体由二乙炔化合物HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3[琥珀酸单-(12-四癸酰氧基-十二-5，7-二炔基)酯]、和两性离子的磷脂1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱[DMPC]以6∶4的比率混合组成。
在本文中，对PDA体系的讨论涉及脂质体在受体组装体中的用途；然而，该讨论也应用于其它受体组装体，包括例如其它平面构造。
通过将悬浮在缓冲溶液中的材料混合物进行探针超声来制备脂质体，该缓冲溶液被称为制备缓冲剂。例如，制备缓冲剂可能是低离子强度(5mM)的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸[HEPES]缓冲剂(pH＝7.2)。另一个有用的制备缓冲剂是低离子强度(2mM)的三羟甲基氨基乙烷[TRIS]缓冲剂(pH＝8.5)。
设计本发明的比色体系以开发出如下途径，即探针能够与包含受体如磷脂、和聚合二乙炔两者的脂质体相互作用。脂质体能够用作与探针如蛋白质相互作用的生物膜模型，如Oellerich，S.等人；J.Phys.Chem B；2004，108，3871-3878；和Zuckermann，M.J.；Heimburg T.；Biophysi.J.；2001，81，2458-2472中所述。通常，在脂质体与蛋白质的高浓度比率下，蛋白质将主要通过静电相互作用吸附至脂质体表面。
随着蛋白质浓度增加，脂质体与蛋白质浓度比率降低，蛋白质继续静电吸附至脂质体表面，直至蛋白质完全饱和或包裹住脂质体。在这个过程进行时，脂质体和蛋白质两者都能够发生形态学和构象变化，直至覆盖脂质体表面的蛋白质疏水片段能够开始与脂质体结构的疏水内部发生相互作用。此时，蛋白质能够变得疏水结合并渗透脂质体结构，导致脂质体结构的基本形态学变化，同时脂质体的尺寸和渗透性发生急剧改变。最终，蛋白质层能够导致损失悬浮稳定性、絮凝、和最终沉淀。
这些静电相互作用的存在不仅高度依赖于存在的蛋白质和脂质体类型，而且还高度依赖于它们的环境。尽管不希望受理论的约束，但相信给定缓冲体系的离子强度将有助于建立脂质体和带电蛋白质两者的表面电位，从而使它们能够发生显著的静电相互作用。
例如，在具有低离子强度(2-5mM)的中性pH缓冲体系中(例如HEPES、TRIS)，带电探针能够静电吸附至聚二乙炔脂质体。尽管起始吸附可能不是本身引发脂质体尺寸和形态学的基本变化，并因此引发最初很小或可忽略的比色响应，但如果探针相对于脂质体过量存在，则可能探针最终将与脂质体疏水结合并渗透到其膜结构的内部。此时，期望通过将探针掺入脂质体结构所提供的巨大机械压力会显著改变聚二乙炔构象，从而导致易于观察的伴随比色响应。
或者，如果探针在中性pH中带负电荷，则它与聚二乙炔脂质体静电相互作用的能力会严重受阻，由于探针和包含受体的聚二乙炔脂质体的疏水相互作用而引起比色响应的能力可能受到损害。在这种情况下，在中性pH(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、咪唑缓冲剂)下使用高离子强度的缓冲剂(＞100mM)，将提供减少脂质体的表面电位(通过屏蔽脂质体的表面电荷)、促进未带电探针与脂质体的直接疏水相互作用、并导致将该蛋白质掺入脂质体结构中的手段。因此，在这种情况下，缓冲体系协助发生充分的比色响应，否则将不能发生这种响应。尽管缓冲剂具有较高的离子强度，但由于其对脂质体表面电位的影响，在不存在探针的情况下，它也能够引导明显的比色响应，已经确定当探针存在时，由于蛋白质-脂质体的疏水相互作用，比色响应明显增加。这个结果具有非常有用的实践效果：能够明显缩短给定检测限内的检测时间，或者相反，对于给定的检测时间，能够明显降低检测限。
基于这种现象，能够基于其与给定分析物靶和聚二乙炔脂质体两者发生特异性相互作用以引发比色响应的能力来选择探针。在直接分析的那些情况下，包含聚二乙炔的脂质体的比色响应与探针的浓度或探针-分析物络合物的浓度直接成比例。
对于给定的应用，探针的选择将部分取决于探针的尺寸、形状、电荷、疏水性、和与分子的亲和力。探针可以是带正电的、带负电的、或根据环境的pH是两性的。在低于探针等电点的pH时，探针带正电，高于该点时它带负电。用于本文时，术语“等电点”指探针净电荷为零时的pH。
为了用聚二乙炔/磷脂体系设计生化测定，已知受体(或探针)的等电点将影响缓冲剂组合的选择。具有较低等电点的探针可能需要较高离子强度的缓冲剂来获得脂质体形态学的变化。较高等电点的蛋白质能够用于低离子强度的缓冲剂如HEPES缓冲剂以产生颜色变化。
在这种常规机理下，重要的是限定检测分析不仅要考虑聚二乙炔脂质体组成(例如选择所使用的磷脂和磷脂与二乙炔的比率)、及所使用的探针(例如多粘菌素、纤维蛋白原、抗体)，还要考虑缓冲体系的选择所确定的水性环境。
本发明的缓冲组合物所提供的体系能够抵抗其它成分存在时的pH变化，该组合物由共轭的酸-碱对组成，其中质子接受体与质子供体的比率接近一致。而且，本发明的缓冲体系能介导分析物与比色传感器成分之间的物理或化学相互作用。例如，在一个实施方案中，缓冲组合物抑制分析物与受体的相互作用。在另一个实施方案中，缓冲组合物促进分析物与受体的相互作用。特别有用的缓冲组合物包括HEPES缓冲剂、咪唑缓冲剂、和PBS缓冲剂。
在优选实施方案中，对于给定的应用，基于对探针和/或要检测的靶分析物的选择，使用缓冲剂的组合(即不同缓冲剂)来调整适当的离子强度。
将两种或多种不同缓冲剂组合是调适缓冲体系的物理性质的方便手段，从而获得脂质体-蛋白质探针相互作用中静电组分和疏水组分的适当平衡。
例如，在仅包含HEPES缓冲剂的体系中，其pH为7.2，多粘菌素(其等电点为7.7)具有正电荷，易于粘着至磷脂的负电荷极性首基，能够诱导比色传感器颜色从蓝变为红。纤维蛋白原的等电点是5.3，在相同的HEPES缓冲组合物中带负电，这阻止了与磷脂极性首基的吸附或任何静电相互作用。
或者，在具有较高离子强度的缓冲剂如咪唑或PBS存在的情况下，离子强度可改变脂质体(或其它转导物结构)的形态学，以暴露疏水部分。在包含较高离子强度缓冲组合物的比色体系中，纤维蛋白原结构中包含疏水部分，该部分可与磷脂发生相互作用以引起颜色变化。
在脂质体-蛋白质相互作用中，一种获得静电组分和疏水组分的最佳平衡的方便方法是使用两种或多种不同缓冲剂的混合物。例如，将低离子强度的有机缓冲剂(HEPES、Tris)与具有不同离子强度的无机缓冲剂(PBS)混合，这样可超越由单一缓冲剂提供的缓冲剂性质范围。因此，能够将混合缓冲体系设计成提供最优化的脂质体-蛋白质相互作用。
混合缓冲体系还将提供调适方式，来调节缓冲体系相对于无相互作用缓冲剂，作为相互作用缓冲剂的程度。例如，能够用无相互作用的缓冲剂(HEPES)“稀释”相互作用的缓冲剂(PBS、咪唑)，以调适其对脂质体形态学的影响。当然，通过使用混合缓冲体系也能获得相反的效果(无相互作用缓冲剂变得更具相互作用性)。
最后，通过类似的手段，能够将表面活性剂组分引入缓冲组合物中，来帮助探针与比色传感器的疏水相互作用。在本发明中特别有用的表面活性剂包括非离子型表面活性剂。聚烷氧基化、尤其是聚乙氧基化的非离子型表面活性剂能够在溶液中良好稳定本发明的组分。
可能有用的非离子型表面活性剂包括：
1.聚氧化乙烯延伸的山梨聚糖单烷基酯(即聚山梨醇酯类)。尤其是，作为NIKKOL TL-10出售的聚山梨醇酯20(来自Barret Products)是非常有效的。
2.聚烷氧基化的烷醇。已经证明表面活性剂如来自ICI SpecialtyChemicals，Wilmington，DE、以商品名BRIJ出售、HLB为至少约14的那些表面活性剂是有用的。尤其是，已经证明BRIJ 78和BRIJ 700是非常有用的，它们分别是分别具有20和100摩尔聚氧化乙烯的硬脂醇乙氧化物。还有用的是ceteareth 55，它来自BASF Corp.，PerformanceChemicals Div.，Mt.Olive，NJ，以商品名PLURAFAC A-39出售。
3.聚烷氧基化的烷基酚。这类有用的表面活性剂包括聚乙氧基化的辛基或壬基酚，其HLB值为至少约14，分别来自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ和Union Carbide Corp.，Danbury，CT，以商品名ICONOL和TRITON出售。例子包括TRITONX100(包含15摩尔氧化乙烯的辛基酚，来自Union Carbide Corp.，Danbury，CT)以及ICONOL NP70和NP40(分别包含40和70摩尔氧化乙烯单位的壬基酚，来自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ)。这些表面活性剂的硫酸化和磷酸化衍生物也是有用的。这些衍生物的例子包括壬苯醇醚-4-硫酸铵，它来自Rhodia，Dayton，NJ，以商品名RHODAPEX CO-436出售。
4.泊洛沙姆。已经显示基于氧化乙烯(EO)和氧化丙烯(PO)嵌段共聚物的表面活性剂可有效地稳定本发明的成膜聚合物并提供良好的润湿。预期EO-PO-EO嵌段和PO-EO-PO嵌段两者都运用良好，只要HLB为至少约14，优选至少约16。这些表面活性剂以商品名PLURONIC和TETRONIC出售，来自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ。要注意，来自BASF的PLURONIC表面活性剂的报告HLB值是按照与上述不同的方式计算的。在这种情况下，应使用由BASF报告的HLB值。例如，优选的PLURONIC表面活性剂为L-64和F-127，其HLB分别为15和22。尽管PLURONIC表面活性剂在稳定本发明组合物方面特别有效，并且在碘作为活性剂时特别有效，但它们可能减少使用聚维酮-碘作为活性剂的组合物的抗菌活性。
5.聚烷氧基化的酯。聚烷氧基化的二醇如乙二醇、丙二醇、甘油等可以被部分或完全酯化，即可以用(C8-C22)烷基羧酸将一个或多个醇酯化。这些聚乙氧基化的酯的HLB为至少约14，优选至少约16，它们适用于本发明的组合物。
烷基聚糖苷。烷基聚糖苷如美国专利5,951,993(Scholz等人)从第9栏第44行开始描述的那些与本发明的成膜聚合物相容，有助于聚合物稳定性。例子包括glucopon 425，其(C8-C16)烷基链长，平均链长为10.3个碳和1-4个葡萄糖单位。
最终，基于本发明比色材料的检测体系取决于下列因素中的一种或多种：二乙炔化合物的分子构造；使用的受体部分的类型；脂质体的形态学(尺寸和结构)或二乙炔和受体分子的其它潜在聚集结构；所用的蛋白质探针；和用于运行测定的缓冲体系。
检测方法
本发明提供了用于分析分析物的方法，该方法包括将上述比色传感器与溶液样品或包含分析物的表面接触，利用吸光度测量或用裸眼视觉观察来检测比色传感器的颜色变化。
在替代实施方案中，本发明通过选择对掺入聚乙二炔组装体的受体和分析物两者具有亲和力的探针，提供用于间接检测分析物的方法。所选择的探针将显示与分析物的竞争亲和力。当相关的分析物存在时，探针将与分析物而不是与聚乙二炔骨架上的受体结合，从而导致与分析物浓度成反比的颜色变化。如果分析物不存在，则探针将与掺入聚乙二炔骨架的受体结合，从而导致颜色从蓝变为红。探针能够在分析物接触传感器后接触传感器，或者能够在混合物接触传感器之前与分析物混合。
在相反的检测测定中，使探针和靶分析物在缓冲剂中发生相互作用，随后使该缓冲溶液与传感器接触。缓冲剂中游离探针的浓度取决于所存在的靶分析物数量：分析物浓度越高，剩余探针的浓度越低。由于传感器的比色响应与可利用的游离探针量成比例，所以比色响应与分析物浓度成反比。
在一些情况下，探针能够与分析物形成络合物，该络合物与传感器直接发生相互作用，从而获得直接测定，其中比色响应与分析物浓度直接成比例。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在缓冲组合物中提供包括分析物的测试样品；在缓冲组合物中提供探针；将测试样品与探针组合，其中探针对分析物的亲和力高于对受体的亲和力；以及用生物传感器检测变化。
还重要的是认识到在一些分析中，通过将靶分析物分段或以其它方式裂解，可原位产生探针，如下面的进一步讨论。探针还可能被认为是存在于有机体细胞壁外的蛋白质或蛋白质片段，它们可用于与传感器发生直接相互作用。探针和分析物之间的相互作用能够用于排除与脂质体的相互作用。或者探针可以与分析物发生相互作用，以形成络合物，使所得络合物与脂质体发生相互作用。
探针能够与传感器在溶液中接触，或者被涂覆在基底上。探针将是与靶分析物和受体两者都具有亲和力的任何分子。用于本发明的可能探针包括膜中断肽如丙甲菌素、蛙皮素、短杆菌肽、硫酸多粘菌素B、和蜂毒素；纤维蛋白原；链霉亲和素；抗体；血凝素；及其组合。
在一些实施方案中，使用抗体作探针。“抗体”指免疫球蛋白，其能够特异性结合至包括其抗原结合片段的给定抗原。术语“抗体”用于包括任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体，及其也可以与脊椎动物(例如哺乳动物)蛋白质特异性结合的片段。可以使用常规技术将抗体分段，将片段筛选以按照与完整抗体相同的方式利用。因此，该术语包括抗体分子的蛋白水解裂解或重组制备部分的片段，它们能够选择性地与某些蛋白质反应。这些蛋白水解和/或重组片段的非限制性例子包括：F(ab′)、F(ab)2、Fv、和包含被肽接头结合的VL和/或VH区域的单链抗体(scFv)。scFv能够共价或非共价连接以形成具有两个或多个结合位置的抗体。能够用本领域技术人员已知的任何可检测部分标记抗体。
各种抗体在本领域中是已知的。例如金黄色葡萄球菌抗体可从Sigma和Accurate Chemical购得。所用的抗体浓度优选为至少2纳克/毫升(ng/ml)。抗体浓度通常为至少100ng/ml。例如，可能使用100微克/ml的浓度。通常使用不超过约500微克/ml的浓度。
在其它实施方案中，使用纤维蛋白原作为探针。不受理论的约束，相信分析物上面/内部表达或存在的纤维蛋白原结合蛋白会与纤维蛋白原反应。例如，金黄色葡萄球菌可表达通常被称为聚集因子的纤维蛋白原结合蛋白质，该聚集因子在与纤维蛋白原接触时会发生反应。
产生该反应的纤维蛋白原浓度典型地为至少0.0001wt-％，通常不超过5wt-％。人血浆和动物(例如兔)血浆是合适的含纤维蛋白原介质。市售的血浆产品通常包括抗凝结剂如EDTA、柠檬酸盐、肝素等。源自人的纤维蛋白原可从Sigma Aldrich，St.Louis，MO购得。
使用间接检测方法，基于所用的探针浓度，提供低检测水平的高灵敏度是可能的。为进行检测，可选择探针浓度以对应检测所需的浓度水平。对于特定应用中所需的灵敏度，使用探针的间接检测方法将围绕探针类型和浓度设计体系。这使得转导物可通用于多种相关分析物。例如，根据探针对分析物的亲和力改变探针与转导物的接触，单一转导物(聚二乙炔/受体组合)可用于检测多个分析物。
特别关注的检测分析物是微生物(即微小生物)如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物、支原体、酵母、病毒、和甚至脂质包封的病毒。特别相关的有机体包括肠杆菌(Enterobacteriaceae)科成员，或者葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、假单孢菌属(Pseudomonas spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希菌属(Esherichia spp.)、杆菌属(Bacillus spp.)、利斯特菌属(Listeria spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、以及肝炎病毒、曲霉菌属(Aspergillus spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、和假丝酵母属(Candida spp.)。特别剧毒的有机体包括金黄色葡萄球菌(包括耐药菌株如耐甲烯土霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、无乳链球菌(S.agalatiae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐受万古霉素的肠球菌(VancomycinResistant Enterococcus，VRE)、耐受万古霉素的金黄色葡萄球菌(Vancomycin Resistant Staphyulococcus aureus，VRSA)、万古霉素中介度耐受金黄色葡萄球菌(Vancomycin intermediate Staphyulococcus aureus，VISA)、碳疽杆菌(Bacillus anthracis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟熏曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A clavatus)、腐皮镰刀霉(Fusariumsolani)、尖镰孢霉(F.oxysporum)、厚垣镰孢(F.chlamydosporum)、单核细胞增生性李斯物菌(Listeria monocytogenes)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、和耐受多种药物的革兰氏阴性杆菌(MDR)。
特别关注的是革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌。通常，通过检测细菌的特征性细胞壁成分如细胞壁蛋白质的存在，可检测这些微生物。而且，特别关注的是耐受抗生素的微生物，包括MRSA、VRSA、VISA、VRE、和MDR。通常，通过额外检测内部细胞组分如膜蛋白的存在，可检测这些微生物。
能够在测试样品中分析这些微生物或其它相关的种类，测试样品可源自任何来源，例如生理液体如血液、唾液、眼晶体液、滑膜液体、脑脊液、脓液、汗液、排泄物、尿液、粘液、乳汁等。而且，测试样品可以源自身体部位，例如创伤、皮肤、鼻孔、头皮、指甲等。在用于本文时，“测试样品”指包含靶分析物的样品。优选地，样品为液体或气体，更优选液体。
本领域描述了用于检测金黄色葡萄球菌的各种患者采样技术。这些采样技术也适用于本发明的方法。通过擦拭患者的鼻孔来获得样品很常见。特别优选的采样技术包括用无菌人造纤维拭子擦拭对象(如患者)的前鼻孔。一个拭子可用于采集一个对象的样品，即一个药签用于两个鼻孔。通过将干燥或预先用合适溶液润湿的拭子(购自Puritan，EastGrinstead，UK，商品名为“Pure-Wraps”)插入对象鼻孔的前顶端，将拭子沿着鼻孔粘膜表面完整地旋转两周，来进行采样。然后将药签直接培育，或者用合适的溶液提取，该溶液典型地包括任选地组合有缓冲剂和至少一种表面活性剂的水。
除了生理液体外，其它测试样品可以包括其它液体以及溶于液体介质中的固体。关注的样品可以包括工艺物料流、水、土壤、种植物或其它植物、空气、表面(例如被污染的表面)等。
可以对测试样品(例如液体)进行预处理，例如稀释粘性液体。在注入样品口前，可以对测试样品(例如液体)进行其它的处理方法，例如浓缩(通过过滤、蒸馏、透析等)、稀释、过滤、天然组分的失活、添加试剂、化学处理等。
可增强靶分析物检测信号的一种处理方法涉及将细胞裂解以形成细胞壁片段，然后分析该细胞壁片段，如美国专利公开2005/0153370中所述。尤其是，这些方法可用于检测微生物、尤其是金黄色葡萄球菌特征性细胞壁的一种或多种组分。该方法包括：提供包括未培养细胞的测试样品；将未培养细胞裂解以形成包括细胞壁片段的裂解产物；分析细胞壁片段的分析物特征性细胞壁组分；其中相对于未裂解细胞中的相同组分，分析物特征性的细胞壁组分可增强信号。
细胞壁组分包括例如细胞壁蛋白如蛋白A，和微生物表面组分识别粘着基质分子(MSCRAMM)如纤维蛋白原结合蛋白(例如聚集因子)、纤连蛋白结合蛋白、胶原结合蛋白、肝素/肝素相关的多糖结合蛋白等。在用于检测金黄色葡萄球菌存在的方法中，蛋白A和聚集因子如纤维蛋白原结合因子和聚集因子A、B、和Efb也特别有用。其它细胞壁组分包括荚膜多糖和细胞壁碳水化合物(例如磷壁酸和脂磷壁酸质)。
裂解可能包括使细胞与裂解剂接触或物理裂解细胞。裂解可以在常规条件进行，举例，约5℃至约37℃的温度、优选约15℃至约25℃的温度下。重要的是，能够使用未培养的细胞即直接测试样品进行裂解，尽管也可能使用经培育的细胞。
裂解细胞的结果是形成细胞壁片段和产生细胞壁组分信号增强，能够评价具有相对低浓度的关注的样品种类。例如，对于某些实施方案，测试样品可以包括相对低浓度的微生物，尤其是金黄色葡萄球菌。这些相对低的浓度包括例如：小于约5×104菌落形成单位(“cfu”)/毫升(cfu/ml)的微生物、小于约5×103cfu/ml、小于约1000cfu/ml、甚至低至约500cfu/ml。也能够在高水平下检测微生物如金黄色葡萄球菌，例如其范围高至5×107cfu/ml。
合适的裂解剂包括例如酶，例如溶葡萄球菌素、溶菌素、肽链内切酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙胺酸酰胺酶、内-β-N-乙酰基葡糖胺酶、和ALE-1。如果需要，可以使用酶的各种组合。在检测金黄色葡萄球菌存在的方法中，溶葡萄球菌素是特别有用的。
其它裂解剂包括盐(例如离液序列高的盐)、增溶剂(例如清洁剂)、还原剂(例如DTT、DTE、半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸)、酸(例如HCl)、碱(例如NaOH)。如果需要，可能使用这些裂解剂的组合。
一个例子是如果金黄色葡萄球菌存在，则能够分析检测样品中裂解细胞的蛋白A，它是金黄色葡萄球菌特有的，能够用固定在生物传感器表面的蛋白A特异性抗体来检测。此外，裂解的细胞如金黄色葡萄球菌可从细胞内部部分(与细胞的细胞壁部分相反)中释放蛋白质标记物。能够通过探针如抗体检测这些蛋白质标记物。
可以以各种合适的手段结合测试样品和探针。在一方面，向传感器提供探针，向比色传感器提供测试样品，成为分开的部分，或者以任何顺序。例如，可以用包含纤维蛋白原的溶液涂覆表面并任选干燥。在另一方面，将测试样品和探针组合作为混合物，向比色传感器提供该混合物。在优选实施方案中，在接触比色传感器之前，使探针与包含分析物的测试样品发生相互作用。
有益地，本发明的方法具有改进的灵敏度。如下面实施例中的进一步描述，可以在5×104菌落形成单位(“cfu”)/毫升、5×103cfu/ml、和5×102cfu/ml的浓度检测到金黄色葡萄球菌。因此，本领域普通技术人员会理解，本发明的方法能够用于检测浓度低至5×102cfu/ml的靶分析物(例如，所示浓度以10cfu/ml递增之间的任何具体浓度)。也能够在高水平检测靶分析物，例如其范围高至5×107cfu/ml。
作为替代或者附加，本发明的方法还有益地导致改进的检测速率。本文所用的设备能够在相对短暂的时间段内检测分析物。例如，可以在小于120分钟内(例如90分钟、60分钟、30分钟、10分钟)检测上述任何浓度的金黄色葡萄球菌。
应用
由所公开的二乙炔化合物形成的本发明比色传感器可用于实验室外要求成本有效、稳定、精确、一致和快速诊断的各种用途。应用包括医疗点测试、家庭测试诊断、空气或水源病原体和VOC的军用和工业用检测、及食物处理。
在一个实施方案中，比色传感器可用于检测生物体液中的革兰氏阴性菌，以诊断感染的存在。例如，在尿中存在革兰氏阴性菌是尿路感染的指示。通过溶液中或作为基底涂层的颜色变化，包括本发明聚二乙炔组装体的比色传感器可以指示生物体液中革兰氏阴性菌如金黄色葡萄球菌的存在。
在某些实施方案中，本发明的比色传感器可与其他已知诊断方法配合使用，以对细菌或其他分析物的存在提供多项(multi-prong)检测。
在一个实施方案中，本发明的比色传感器可与创伤敷料结合使用，以检测感染的存在。传感器可与敷料整合成一层，直接或间接与创伤接触。在使用时，传感器也可插入敷料中。或者，可以构思如下敷料结构，其中通过如美国专利6,420,622 B1所述的微流体通道，创伤分泌液可从创伤导向一部分没有接触创口的敷料，其中放置着传感器。通过分析从创伤药签提取的分析物，传感器也可在创伤评定中用于独立诊断。
可以得到包括聚二乙炔组装体的传感器，而不需要在将其转移到合适的支撑物上之前，通过常规LB(Langmuir-Blodgett)方法形成薄膜。或者，可使用如A.Ulman，超薄有机薄膜入门(An Introduction toUltrathin Organic Films)，Academic Press，New York(1991)，pp.101-219中所述的已知LB方法，在基底上形成聚二乙炔组装体。
本发明能够在一次性粘着产品中提供生物传感能力。这种传感器是独立的，不需要额外仪器来传输测量结果。或者，可能与其他分析仪器一起使用以进一步增强灵敏度，如具有在检测分析物之后显现出荧光“红”相的荧光。当需要检测特定分析物的存在阈时，传感器用于提供快速筛选装置，即小于30分钟，优选小于15分钟。此外，本发明的传感器是一次性的，相对廉价。
在本发明的一个实施方案中，比色传感器包括将受体掺入聚二乙炔组装体溶液中而形成的转导物。溶液可以在简单的小瓶系统中提供，分析物可直接添加到含有溶液的小瓶中，溶液具有对关注的分析物特异的转导物。或者，比色传感器可包括试剂盒中的多个小瓶，每个小瓶含有包括聚二乙炔组装体的转导物，所述转导物具有特别针对不同分析物掺入的受体。对于分析物不能直接添加到聚二乙炔转导物中的那些应用，可以使用两部分小瓶系统。小瓶的一个分隔间可以包含用于制备分析物样品的试剂，其与第二分隔间物理分离，该第二分隔间包含从聚二乙炔组装体形成的转导物。一旦完成样品制备，就移除分离两个分隔间的物理障碍物，以使分析物与转导物混合而进行检测。
然后通过向基底上点样并使水蒸发，或者通过具有适当孔径大小的膜挤出悬浮液、俘获聚二乙炔组装体并得到经涂覆的膜，将所制备的比色传感器涂覆到固体基底上，然后使其干燥。合适的膜通常是孔径大小为200nm或更小的那些膜，包括材料如聚碳酸酯、尼龙、PTFE、聚乙烯(可能列举其它种类)。可以用二乙炔组装体的聚合悬浮液涂覆这些基底，或者悬浮液可以以未聚合的形式涂覆，随后在经涂覆的状态下聚合。
在本发明的另一个实施方案中，比色传感器是带状或标签形式的快速指示器，如图1所示。图1表示用压敏粘合剂20涂覆的带子或标签10和涂覆在基底40上的转导物30。如美国公开申请2004-0132217-A1所述，使用milli-Q(Millipore)水和二碘甲烷(Aldrich)，通过接触角测量可描绘用于本发明的合适基底的特征。
基底40可以包括在非常平坦的基底，例如在原子级平坦硅(111)晶片上的蒸发金、原子级平坦硅(111)晶片、或浮法玻璃，它们是裸露的，并且被自组装单层(SAM)修饰以按系统方式改变其表面能；或者基底具有高度网纹形状，包括：纸质基底、聚合油墨吸收涂层、结构聚合物薄膜、微孔薄膜、及膜材料。
在经干燥仍保持聚二乙炔组装体的原始“蓝”相的本发明实施方案中，基底40对于二碘甲烷的前进接触角低于50°。这种条件对应于如下特征的基底：其分散组分的表面能大于40达因/cm。在替代实施方案中，具有这些性质、且其与水的前进接触角小于90°的基底导致包含蓝相和红相混合物的干燥涂料。这种条件将对应如下表面，其中分散表面能组分可能小于40达因/cm，但极性表面能组分大于至少10达因/cm。
再次参考图1，压敏粘合剂20可将带子或标签10固定到表面上，以直接检测分析物。压敏粘合剂20与包含聚二乙炔组装体的转导物30分离，以潜在地使不利影响最小化。在图1中，压敏粘合剂20包围位于带子或标签10中心的转导物30。在替代实施方案(未显示)中，压敏粘合剂和转导物组合在一起。
任选地，在带子或标签10的侧面，带子或标签10将包含不含压敏粘合剂20的透明窗口。窗口可以集中在转导物30的下面，以允许使用者观察颜色变化，而不用从含有分析物的表面上除去带子或标签10。
在图2中，带子或标签110表示为由多个转导物112、113、114、115和116构成的阵列111。转导物112、113、114、115和116中的每一个可由相同或不同的聚二乙炔组装体形成，而每个聚二乙炔组装体掺有相同或不同的受体。通过改变转导物112、113、114、115和116，阵列111可被设计成检测各种浓度水平的多个分析物。或者，可用替代诊断测试代替转导物112、113、114、115中的任一个。本发明考虑的其它实施方案提供于美国专利系列号10/738,573中。
对于那些需要制备分析物样品的应用，在接触涂覆在二维基底上的比色传感器之前，试剂盒可以包含用于保存试剂和混合分析物的小瓶。在一个实施方案中，试剂盒可以包括用于保存试剂及制备分析物的小瓶，其盖子装置包含涂覆在基底上的本发明转导物。
实施例
本发明不应被认为限于下述特定实施例，而应理解为包括如所附权利要求清楚描述的本发明所有方面。在阅读本说明书之后，本发明可应用的各种修改、等价过程、以及多种结构对本发明指导的本领域技术人员将是显而易见的。在说明书的实施例和其余部分中，除非另有说明，所有的份数、百分数、比例等都按摩尔计。没有列出供应商的所有溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical；Milwaukee，WI。水通过使用U-V Milli-Q水纯化器来纯化，其电阻为18.2兆欧/cm(Millipore，Bedford MA)。
使用由数字相机采集的图片确定比色响应(CR)。用来自AdobeSystems Incorporated(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，SanJose，CA)的软件扫描图片，以获得各聚二乙炔传感器测试的RGB(红、绿、蓝)通道值。红色和蓝色通道值由等式CR＝((PR初始-PR样品)/PR初始)给出，其中PR＝样品的红色值百分比，它由等式PR＝R值/(R值+B值)*100给出，其中R值和B值分别对应聚二乙炔传感器的红色通道值和蓝色通道值。
简写表
简写或商品名 说明
ATCC 美国典型培养物保藏中心
DMPC 1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱(DMPC，式量(F.W.)678，来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO
HEPES N-2-羟乙基哌嗪N’-2-乙磺酸，来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO
咪唑缓冲溶液 30mM咪唑，125mM氯化钠，0.1％(w/v)叠氮化钠水溶液，pH＝7.3，购自Sigma Diagnostics，cat.No 12900
PBS缓冲剂 磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，通过将购自EMD Biosciences，SanDiego CA的10×PBS液体浓缩物稀释十倍而制备
PBS L64缓冲剂 通过取PBS缓冲溶液并添加0.2％(w/v)PLURONIC L64而制备
PLURONIC L64 表面活性剂的商品名，来自BASF Corporation，Mount Olive，NJ
制备例1-二乙炔脂质体悬浮液的制备
按照美国专利申请公开2004/0132217的实施例6，制备二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3。基本程序包括使5，7-十二炔-1，12-二醇(HO(CH2)4C-≡C-C≡C(CH2)4OH)与豆蔻酰氯反应，然后使该产物与琥珀酸酐反应以获得二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3，为白色固体。
将二乙炔化合物HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3(琥珀酸单-(12-四癸酰氧基-十二-5，7-二炔基)酯)、和两性磷脂1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱(DMPC，式量(F.W.)678，来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的(6∶4)混合物称重到玻璃瓶中，悬浮在N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)缓冲剂(5mM，pH 7.2)中，以制备1nM溶液。然后使用Misonix XL202探针超声仪(购自Misonix Inc.，Farmington，NY)将该溶液探针超声2分钟，在4℃的冷藏室中放置约20小时。该过程导致形成稳定的脂质体悬浮液。
制备例2-二乙炔脂质体悬浮液的聚合
将制备例1中制备的悬浮液通过1.2μm的针筒过滤器过滤，通过以3cm的距离在254nm UV灯(购自VWR Scientific Products；WestChester，PA)下将样品照射10分钟，使之聚合，从而生成可观察到的蓝色。
制备例3-二乙炔脂质体悬浮液的涂覆样品的制备
将制备例1中制备的悬浮液涂覆到直径为25(mm)、具有200(nm)直径小孔的多孔聚碳酸酯膜(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)上，以制备比色传感器样品。使用下述手持挤压过程涂覆膜。将要涂覆的聚碳酸酯膜放置到手持挤压器(商品名为LIPOFAST，来自Avestin，Inc.(Ottawa，Canada))的不锈钢室中。膜覆盖了特氟隆(TEFLON)为基本成分的底部O-型环。注意避免将膜弯曲和/或弄皱。将顶部TEFLON O-型环塞放置到膜顶部的不锈钢室内。然后用手上紧不锈钢帽来密封膜。用二乙炔脂质体悬浮液填充气密注射器(Hamilton 500-微升(μl))，将注射器连接到基底，将第二注射器连接到其它帽上。用恒定的压力将第一注射器的脂质体缓慢推动通过室。
膜的表面捕获脂质体，从而使得清澈的缓冲剂缓慢流过并进入第二注射器。将该作用看作1道涂布。在该实施例中用作检测器的膜样品使用2道涂布。通过将第二个0.5毫升(ml)脂质体部分应用到已经涂覆的膜上，与第一道涂料类似地实施第二道涂料。除去包含经过滤缓冲剂的第二注射器，弃去内容物。拧开不锈钢端帽，除去TEFLON O-型环塞。取出湿膜，将涂覆侧向上放置在玻璃载片上，在5℃的冰箱中放置至少3小时。然后在包含CaSO4的干燥器中将样品干燥30分钟，暴露至254纳米(nm)UV光下30-90秒。
将PDA涂布的基片(25毫米(mm)的圆形)切成四个正方形。每个正方形样品被用作实验样品。
制备例4-磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲溶液)的制备
通过将10×PBS液体浓缩物(购自EMD Biosciences，SanDiego CA)稀释十倍，来制备磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。这样得到具有如下盐组成的PBS缓冲溶液：10mM磷酸钠、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾。该PBS缓冲溶液在25℃的pH为7.5。
制备例5-用PLURONIC L64制备磷酸盐缓冲盐水(PBS L64缓冲溶液)
取出按制备例4制备的PBS缓冲溶液并添加0.2％(w/v)PLURONIC L64表面活性剂(来自BASF Corporation，Mount Olive，NJ)，来制备PBS L64缓冲溶液。该PBS L64缓冲溶液在25℃的pH为7.5。
制备例6-金黄色葡萄球菌悬浮液的制备
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC25923”获得金黄色葡萄球菌。使细菌在肉汤培育基中生长过夜(37℃，17-22小时)，肉汤培养基通过用细菌接种5-10毫升制备好的无菌胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)来制备。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm 15分钟，Eppendorf型号504R离心机(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，将其悬浮到PBS L64缓冲剂中，并用该溶液再离心3个循环来洗涤。
制备例7-表皮葡萄球菌悬浮液的制备
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC12228”获得表皮葡萄球菌。使细菌在肉汤培育基中生长过夜(37℃，17-22小时)，该肉汤培养基通过用细菌接种5-10毫升制备无菌胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)来制备。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm 15分钟，Eppendorf型号504R离心机(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，将其悬浮到PBS L64缓冲溶液中，并用该溶液再离心3个循环来洗涤。
制备例8-大肠杆菌悬浮液的制备
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC25922”获得大肠杆菌。使细菌在肉汤培育基中生长过夜(37℃，17-22小时)，该肉汤培养基通过用细菌接种5-10毫升制备无菌胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)来制备。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm 15分钟，Eppendorf型号504R离心机(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，将其悬浮到HEPES缓冲剂中，并用该溶液再离心3个循环来洗涤。
实施例1-纤维蛋白原蛋白质探针的溶液相检测
将来自人血浆的纤维蛋白原(来自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No FR4129)溶于咪唑缓冲剂中，成0.5％(w/v)的浓度。将纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液(100μl)与100μl按制备例2制备的蓝色聚二乙炔脂质体溶液混合。还制备了对照样品，其中包含100μl不含纤维蛋白原的咪唑缓冲剂、和100μl按制备例2制备的蓝色聚二乙炔脂质体溶液。尽管两个样品在最初20分钟内都从蓝色变为红色，但是在总计30分钟内，包含纤维蛋白原的悬浮液样品发生絮凝并随后沉淀。对照样品的悬浮液在全部观察时间内保持稳定。
实施例2-兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针的溶液相检测
将兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体(来自AccurateChemical andScientific Corporation，Westbury，NY，cat.No.YVS6881)溶于咪唑缓冲剂中，浓度为100μg/ml。将抗体的咪唑缓冲溶液(100μl)与100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液(在制备例2中制备)混合。还制备了对照样品，其中包含100μl不含抗体的咪唑缓冲剂、和100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液(在制备例2中制备)。尽管两个样品在最初30分钟内都从蓝色变为红色，但是在24小时后，包含抗体的悬浮液样品发生絮凝并随后沉淀。对照样品的悬浮液在全部观察时间内保持稳定。
实施例3-在金黄色葡萄球菌和PBS L64缓冲溶液存在的情况下，纤维蛋白原蛋白质探针的溶液相检测
将按实施例1制备的纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液(100μl)与100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液(在制备例2中制备)和100μl按制备例6制备、包含106cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液混合。通过将100μl纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液、100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液、和100μl不含金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液混合，还制备了对照样品。两个样品在最初30分钟内都从蓝色变为红色，但是与实施例1相反，两个样品的悬浮液在24小时的观察期内都保持稳定。
实施例4-在金黄色葡萄球菌和PBS L64缓冲溶液存在的情况下，兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针的溶液相检测
使用三种不同的组合，将按制备例2制备的蓝色聚二乙炔脂质体溶液与按实施例2制备的抗体的咪唑缓冲溶液和按制备例6制备的包含金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液混合：
样品4A-100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液+100μl抗体的咪唑缓冲溶液+100μl包含107cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液。
样品4B-100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液+100μl抗体的咪唑缓冲溶液+100μl不含细菌的PBS缓冲溶液。
样品4C-100μl蓝色聚二乙炔脂质体溶液+100μl不含抗体的咪唑缓冲剂+100μl不含细菌的PBS缓冲溶液。
下面表1中记录了45分钟后样品的颜色。
             表1
    样品     45分钟时的颜色
    4A     紫色
    4B     浅红色
    4C     红色
实施例5-使用聚二乙炔的涂覆样品，检测纤维蛋白原蛋白质探针
将按制备例3制备的三个聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板(购自Corning Incorporated，Corning NY，cat.No 3524，商品名为COSTAR)的孔底部，随后添加下列溶液：
样品5A-250μl按实施例1制备的纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液+250μl PBS L64缓冲溶液。
样品5B-250μl纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液+250μl按制备例6制备、包含107cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品5C-250μl纤维蛋白原的咪唑缓冲剂+250μl按制备例7制备、包含107cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
下面表2记录了各样品从蓝色变为红色所需的时间。
          表2
    样品   变为红色的时间(分钟)
    5A   2
    5B   15
    5C   5
实施例6-使用纤维蛋白原蛋白质探针的咪唑缓冲溶液，在PBSL64缓冲溶液中检测不同浓度的金黄色葡萄球菌
将按制备例3制备的六个聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分开的孔底部。将按实施例1制备的纤维蛋白原的咪唑缓冲溶液(250μl)与250μl按制备例6制备、包含金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液混合，获得包含不同细菌浓度的一系列样品混合物。细菌浓度列于下面表3中。将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的各孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在6分钟时，使用数码相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件扫描图片。如上所述确定比色响应(CR)。下面表3的数据将比色响应报告为细菌浓度的函数。
                          表3
 样品  金黄色葡萄球菌浓度(cfu/ml)  比色响应(红色份数)
 6A  0  2.4
 6B  100  2.4
 6C  1000  2.4
 6D  10000  1.8
 6E  100000  1.6
 6F  1000000  1.4
实施例7-使用抗体-链霉亲和素共轭的蛋白质探针和聚二乙炔的涂覆样品，在PBS L64缓冲溶液中检测金黄色葡萄球菌
将按制备例3制备的两个聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分开的孔底部。按照下列方式制备链霉亲和素共轭的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针。将链霉亲和素共轭的抗体溶于咪唑缓冲剂中，浓度为100μg/ml。
然后制备下列样品溶液：
样品7A-250μl链霉亲和素共轭抗体的咪唑缓冲溶液+250μl按制备例4制备的PBS缓冲溶液。
样品7B-250μl链霉亲和素共轭抗体的咪唑缓冲溶液+250μl PBS缓冲溶液，所述缓冲剂包含按制备例6制备的106cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液。
在混合后，将溶液涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔传感器的各孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，AnnArbor，MI)上搅动微量滴定板。下面表4记录了各传感器从蓝色变为红色所需的时间。
            表4
  样品   变为红色的时间(分钟)
  7A   9
  7B   20
实施例8-使用抗体-生物素共轭的蛋白质探针，使用聚二乙炔的涂覆样品检测链霉亲和素
将按制备例3制备的四个聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分开的孔底部。以100μg/ml的浓度，将生物素共轭的鼠抗蛋白AIgG单克隆抗体(购自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No 13-3150)蛋白质探针溶于PBS缓冲溶液中。将链霉亲和素(购自Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，Cat.No 016-050-084)溶于PBS缓冲溶液中，浓度为100μg/ml。
然后制备下列样品溶液：
样品8A-300μl咪唑缓冲剂。
样品8B-150μl咪唑缓冲剂+150μl链霉亲和素的PBS缓冲溶液。
样品8C-100μl咪唑缓冲剂+100μl链霉亲和素的PBS缓冲溶液+100μl生物素共轭抗体的PBS缓冲溶液。
样品8D-150μl咪唑缓冲剂+150μl生物素共轭抗体的PBS缓冲溶液。
在混合后，将溶液涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔传感器的分开的孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。下面表5记录了各传感器从蓝色变为红色所需的时间。
           表5
    样品   变为红色的时间(分钟)
    8A   13
    8B   9
    8C   6
    8D   13
实施例9-使用纤维蛋白原蛋白质探针的PBS L64缓冲溶液，检测PBS L64缓冲溶液中不同浓度的金黄色葡萄球菌
将按制备例3制备的六个聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分开的孔底部。将纤维蛋白原溶于PBS L64缓冲溶液中，浓度为0.5％(w/v)。类似地，还将纤维蛋白原溶于PBS L64缓冲溶液中，浓度为0.05％(w/v)。
制备下列样品溶液：
样品9A-250μl 0.5％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl不含细菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9B-250μl 0.5％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl按照制备例6制备、包含103cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9C-250μl 0.5％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl按照制备例6制备、包含105cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9D-250μl 0.05％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl不含细菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9E-250μl 0.05％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl包含103cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品15F-250μl 0.05％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl包含105cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
为了比较，还制备两种其它样品：
样品9G-250μl 0.5％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl按制备例7制备、包含105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9H-250μl 0.05％浓度的纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液+250μl包含105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分开的孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在30分钟时，使用数码相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表6的数据报告了这些样品的比色响应(CR)。
                                          表6
  样品   纤维蛋白原浓度(％w/v PBS L64缓冲溶液)     细菌种类   细菌浓度(cfu/ml)     比色响应(红色分数)
  9A   0.5     无   0     2.3
  9B   0.5     金黄色葡萄球菌   1000     2.1
  9C   0.5     金黄色葡萄球菌   100000     0.9
  9D   0.05     无   0     3.3
  9E   0.05     金黄色葡萄球菌   1000     2.7
  9F   0.05     金黄色葡萄球菌   100000     1.6
  9G   0.5     表皮葡萄球菌   100000     3.1
  9H   0.05     表皮葡萄球菌   100000     3.2
实施例10-使用纤维蛋白原蛋白质探针的PBS L64缓冲溶液，检测临床样品中的完整金黄色葡萄球菌
收集来自6名患者的鼻孔拭子样品，从每位患者收集两个拭子，共计12个样品。通过用无菌人造纤维拭子(购自Puritan，East Grinstead，UK，商品名“Pure-Wraps”)擦拭患者的前鼻孔获得鼻孔拭子样品。通过将人造纤维拭子插入对象的鼻孔的前端，将拭子沿着鼻孔粘膜表面完整地旋转两周，来进行采样。使用1ml PBS L64缓冲溶液洗脱各拭子样品。使用按制备例3制备的涂覆聚二乙炔传感器分析分别来自6位患者的一个样品。使用1ml PBS L64缓冲溶液洗脱来自相同患者的第二个样品并培养，以获得下面表7报告的用于比较的细菌计数。用于这些样品的培养程序依照“人类疾病中的葡萄球菌”(TheStaphylococci in Human Disease)；Crossley，K.B.和Archer，G.L.editors，Churchill Livingston，NY，1997，pp.233-252中的一般性描述。通过将250μl以0.5％(w/v)的浓度溶于PBS L64缓冲溶液的纤维蛋白原与250μl从各患者拭子洗脱的溶液混合，制备要用聚二乙炔传感器分析的样品。将样品溶液涡旋并放置5分钟，然后放置在聚二乙炔涂覆的传感器上，该传感器已经被放置在24-孔微量滴定板的分开的孔底部。在EberbachModel 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在45分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表7的数据将比色响应报告为细菌浓度的函数。
                     表7
    拭子样品 培养基细菌计数(cfu)   比色响应(红色分数)
    10A 0   1.3
    10B 25   1.2
    10C 631   0.9
    10D 1995   0.9
    10E 39811   0.7
    10F 125892   0.7
实施例11-使用纤维蛋白原蛋白质探针的PBS L64缓冲溶液，检测临床样品中的裂解金黄色葡萄球菌
收集5名患者的鼻孔拭子样品，从每位患者收集两个擦拭物，共计10个样品。按照实施例10获得样品。使用按制备例3制备的涂覆聚二乙炔传感器分析分别来自5位患者的一个样品。使用1ml PBS L64缓冲溶液洗脱来自相同患者的第二个样品并培养，以获得如实施例10所述的细菌计数。如下制备要用聚二乙炔传感器分析的样品。首先，通过与等体积的裂解缓冲剂混合，将1ml洗脱的拭子样品中所含的金黄色葡萄球菌裂解，裂解缓冲剂由浓度为3μg/ml的溶葡萄球菌素(目录号L-4402，Sigma-Aldrich)的PBS L64缓冲溶液组成。第二，将250μl裂解溶液与250μl以0.5％(w/v)的浓度溶于PBS L64缓冲溶液的纤维蛋白原混合。将样品溶液涡旋并放置5分钟，然后放置在聚二乙炔涂覆的传感器上，该传感器已经被放置在24-孔微量滴定板的分开的孔底部。在Eberbach Model 6000
摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在42分钟时，使用数字相机采集图片。使用来自Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表8的数据将比色响应报告为细菌浓度的函数。
                  表8
    拭子样品 培养基细菌计数(cfu)   比色响应(红色份数)
    11A 0   1.0
    11B 63   0.9
    11C 160   1.2
    11D 7940   1.4
    11E 40000   2.0
实施例12-使用兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针的PBSL64缓冲溶液，检测临床样品中的裂解金黄色葡萄球菌
收集6名患者的鼻孔擦拭样品，从每位患者收集两个擦拭物，共计12个样品。按照实施例10所述获得样品。使用按制备例3制备的涂覆聚二乙炔传感器分析分别来自6位患者的一个样品。使用1ml PBSL64缓冲溶液洗脱来自相同患者的第二个样品并培养，以获得下面表9报告的用于比较的细菌计数。按实施例10所述进行培养程序。如下制备要用聚二乙炔传感器分析的样品。首先，通过与等体积的裂解缓冲剂混合，将1ml洗脱擦拭样品中所含的金黄色葡萄球菌裂解，裂解缓冲剂由浓度为3μg/ml的溶葡萄球菌素(目录号L-4402，Sigma-Aldrich)的PBS L64缓冲溶液组成。第二，将250μl裂解溶液与250μl以100μg/ml的浓度溶于PBS L64缓冲溶液的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体(从Accurate Chemicals获得)混合。将样品溶液涡旋并放置5分钟，然后放置在聚二乙炔涂覆的传感器上，该传感器已经被放置在24-孔微量滴定板的分开的孔底部。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，AnnArbor，MI)上搅动微量滴定板。在20分钟时，使用数字相机采集图片。使用来自Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表9的数据将比色响应报告为细菌浓度的函数。
                 表9
    拭子样品 培养基细菌计数(cfu)   比色响应(红色份数)
    12A 0   1.3
    12B 954   1.4
    12C 724   1.4
    12D 2089   1.2
    12E 6918   1.0
    12F 47863   1.0
实施例13-使用兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针的PBSL64缓冲溶液，比较聚二乙炔涂覆的传感器对裂解金黄色葡萄球菌相对于完整金黄色葡萄球菌的检测效率
将制备例1中制备的二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4G≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3与1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱(DMPC)的(60/40)制剂涂覆到直径为25mm、具有200nm直径小孔的多孔聚碳酸酯膜(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)上，以制备比色检测器样品。按照制备例3制备检测器样品。
将聚二乙炔涂覆的基片(25毫米(mm)圆形)剪切成四个正方形。每个正方形样品被用作实验样品。将基片放置到24-孔微量滴定板的分开的孔中。通过将250μl包含完整金黄色葡萄球菌ATCC 25923的PBSL64缓冲溶液与250μl抗体溶液混合，制备完整细菌样品溶液。抗体溶液包含浓度为100μg/ml兔抗金黄色葡萄球菌(目录号YVS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)的PBS L64缓冲溶液。使用裂解缓冲剂制备包含裂解金黄色葡萄球菌ATCC 25923的PBS L64缓冲溶液，裂解缓冲剂由浓度为3微克/毫升的溶葡萄球菌素(购自Sigma-Aldrich，目录号L-4402)的PBS L64缓冲溶液组成。裂解细菌样品溶液由250μl裂解金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的PBS L64缓冲溶液与250μl按上述制备的抗体溶液混合组成。测试样品所用的细菌浓度在0至105cfu/ml之间变化，如下面表10所报告的。将细菌与抗体溶液的混合物放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的24-孔板上。还制备了对照样品用于比较。对照样品不包含细菌，仅由250μlPBS-L64缓冲剂与250μl按上述制备的抗体溶液混合组成。
使用数字相机，每5分钟采集图片。使用Adobe SystemsIncorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表10的数据报告了在15分钟测量时，对照样品与含菌样品(完整的或裂解的)之间比色响应的差别。
                  表10
    细菌浓度(cfu/ml)   完整细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)   裂解细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)
    0   0   0
    100   0.05   0.17
    1,000   0.05   0.58
    10,000   0.05   0.52
    100,000   0.04   0.64
实施例14-使用兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探针和涂覆聚二乙炔传感器，缓冲剂组成对检测裂解金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响
将按制备例3制备的三十二个聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分开孔底部。
制备下列样品溶液：
样品14A-500μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
样品14B-400μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+100μl HEPES缓冲剂。
样品14C-350μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+150μl HEPES缓冲剂。
样品14D-300μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+200μl HEPES缓冲剂。
样品14E-250μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+250μl HEPES缓冲剂。
样品14F-200μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+300μl HEPES缓冲剂。
样品14G-150μl按实施例2制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+350μl HEPES缓冲剂。
样品14H-500μl HEPES缓冲剂，其中兔抗金黄色葡萄球菌(目录号YYS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)的浓度为100μg/ml，并包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
还制备了一系列对照样品，它们的组成与样品14A-14H相同，除了它们不含完整或裂解的细菌。
将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分开的孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在40分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表11的数据显示了在15分钟测量时，对照样品和含菌样品(完整的或裂解的)之间的比色响应差异。
                                    表11
  样品溶液   PBS缓冲溶液体积(μl)   HEPES缓冲剂体积(μl)     有效缓冲离子强度(mM)   103cfu/ml完整细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)   103cfu/ml裂解细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)
  14A   500   0     150   0.2   0.6
  14B   400   150     121   0.3   0.8
  14C   350   200     106.5   0.6   1.1
  14D   300   300     92   2.0   2.0
  14E   250   250     77.5   2.1   1.2
  14F   200   200     63   0.6   0.9
  14G   150   150     48.5   0.7   1.0
  14H   0   500     5   0   0
实施例15-使用高浓度的纤维蛋白原蛋白质探针和涂覆聚二乙炔传感器，缓冲剂组成对检测裂解金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响
将按制备例3制备的三十二个聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分开的孔底部。
制备下列样品溶液：
样品15A-500μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
样品15B-400μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+100μl HEPES缓冲剂。
样品15C-350μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+150μl HEPES缓冲剂。
样品15D-300μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+200μl HEPES缓冲剂。
样品15E-250μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+250μl HEPES缓冲剂。
样品15F-200μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+300μl HEPES缓冲剂。
样品15G-150μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+350μl HEPES缓冲剂。
样品15H-500μl HEPES缓冲溶液，其中纤维蛋白原(来自Sigma，cat.No FR4129，Lot# 083K7604)的浓度为0.5％(w/v)，包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
在所有样品溶液15A-15H中，将纤维蛋白原溶于缓冲剂中，浓度为0.5％(w/v)。还制备了一系列对照样品溶液，它们的组成与样品15A-15H相同，除了它们不含完整或裂解的细菌。
将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分开的孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在40分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。测定比色响应(CR)。下面表12的数据显示了在15分钟测量时，对照样品和含菌样品(完整的或裂解的)之间的比色响应差异。
                                 表12
  样品溶液   PBS缓冲溶液体积(μl)   HEPES缓冲剂体积(μl)     有效缓冲离子强度(mM)   103cfu/ml完整细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)   103cfu/ml裂解细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)
  15A   500   0     150   -1.2   NA
  15B   400   150     121   -0.3   0.3
  15C   350   200     106.5   1.0   0.5
  15D   300   300     92   1.4   0.8
  15E   250   250     77.5   0.4   0.7
  15F   200   200     63   0.9   0.4
  15G   150   150     48.5   0.2   0.4
  15H   0   500     5   0   0
实施例16-使用低浓度的纤维蛋白原蛋白质探针和涂覆聚二乙炔传感器，缓冲剂组成对检测裂解金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响
将按制备例3制备的三十二个聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分开的孔底部。制备下列样品溶液：
样品16A-500μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
样品16B-400μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+100μl HEPES缓冲剂。
样品16C-350μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+150μl HEPES缓冲剂。
样品15D-300μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+200μl HEPES缓冲剂。
样品16E-250μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+250μl HEPES缓冲剂。
样品16F-200μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+300μl HEPES缓冲剂。
样品16G-150μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，其中包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌+350μl HEPES缓冲剂。
样品16H-500μl HEPES缓冲溶液，纤维蛋白原(来自Sigma，cat.NoFR4129，Lot#083K7604)的浓度为0.05％(w/v)，包含103cfu/ml完整金黄色葡萄球菌或按实施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黄色葡萄球菌。
在所有样品溶液16A-16H中，将纤维蛋白原溶于缓冲剂中，浓度为0.05％(w/v)。还制备了一系列对照样品，它们的组成与样品15A-15H相同，除了它们不含完整或裂解的细菌。
将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分开的孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在40分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表13的数据显示了在15分钟测量时，对照样品和含菌样品(完整的或裂解的)之间的比色响应差异。
                                        表13
  样品溶液   PBS缓冲溶液体积(μl)   HEPES缓冲剂体积(μl)     有效缓冲离子强度(mM)   103cfu/ml完整细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)   103cfu/ml裂解细菌与对照的比色响应差异(Δ红色分数)
  16A   500   0     150   -1.2   NA
  16B   400   150     121   -0.6   0.3
  16C   350   200     106.5   0.5   0.5
  16D   300   300     92   1.5   0.8
  16E   250   250     77.5   1.4   1.1
  16F   200   200     63   1.2   0.8
  16G   150   150     48.5   0.5   0.7
  16H   0   500     5   0   0
实施例17-使用与蛋白A预反应的单克隆抗体和涂覆聚二乙炔的传感器，检测耐受甲烯土霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)
使抗MRSA的PBP2′的单克隆IgG1K抗体与蛋白A交叉反应。该抗体与蛋白A预反应，然后暴露于裂解的MRSA(3M Culture collection#360)。用于裂解MRSA的程序按照实施例11进行。按实施例13所述，在PBS L64中制备裂解的MRSA。本实施例中裂解和使用的细菌浓度为105和103cfu/ml。使用不含细菌而仅含裂解剂的PBS L64作为对照样品。在HEPES缓冲剂中制备抗PBP2′的单克隆抗体，浓度为100μg/ml。还在HEPES缓冲剂中制备蛋白A(Zymed，San Fransisco，CA，目录号10-1006)，浓度为200μg/ml。按下面所述，使用细菌溶液与包含抗体和蛋白A的HEPES缓冲剂的两种不同组合。
样品17A-将150μl抗PBP2′单克隆抗体的HEPES缓冲溶液与100μl蛋白A的HEPES缓冲溶液混合。将小瓶涡旋并放置五分钟。
然后将样品17A与250μl包含103或105cfu/ml细菌的PBS L64溶液或不含细菌的对照样品混合。将小瓶涡旋并放置5分钟。将制备例3所述的三个涂覆PDA的聚碳酸酯膜样品放置在24孔板的底部。将具有不同细菌水平的溶液吸移到各孔中。下面表14跟随并报告了从蓝色的颜色变化。
                 表14
    样品溶液   细菌浓度cfu/ml   2小时的颜色
    17A   0   蓝色
    17A   103   紫色
    17A   105   浅红色
样品17B-将150μl抗PBP2′单克隆抗体的HEPES缓冲溶液与50μl蛋白A的HEPES缓冲溶液混合。将小瓶涡旋并放置五分钟。
然后将样品17B与300μl包含103或105cfu/ml细菌的PBS L64溶液或不含细菌的对照样品混合。将小瓶涡旋并放置5分钟。将如制备例3所述的三个涂覆PDA的聚碳酸酯膜样品放置在24孔板的底部。将具有不同细菌水平的溶液吸移到各孔中。下面表15跟随并报告了从蓝色的颜色变化。
               表15
  样品溶液   细菌浓度cfu/ml   20分钟的颜色
  17B   0   红色
  17B   103   浅红色
  17B   105   蓝色
实施例18-使用单克隆抗体作为蛋白质探针和涂覆聚二乙炔的传感器，检测耐受甲烯土霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)
裂解MRSA的程序按照实施例11进行。按实施例13所述，在PBSL64中制备裂解的MRSA。本实施例中裂解和使用的细菌浓度为105和103cfu/ml。使用不含细菌而仅包含裂解剂的PBS L64作为对照样品。在HEPES缓冲剂中制备抗PBP2′的单克隆IgG1K抗体，浓度为100μg/ml。
然后制备下列样品溶液：
样品18A-将250μl抗PBP2′单克隆抗体的PBS L64缓冲溶液与250μl不含细菌的PBS L64缓冲溶液混合。将小瓶涡旋并放置5分钟。
样品18B-将250μl抗PBP2′单克隆抗体的PBS L64缓冲溶液与250μl包含103cfu/ml裂解MRSA的PBS L64缓冲溶液混合。将小瓶涡旋并放置5分钟。
样品18C-将250μl抗PBP2′单克隆抗体的PBS L64缓冲溶液与250μl包含105cfu/ml裂解MRSA的PBS L64缓冲溶液混合。将小瓶涡旋并放置5分钟。
将如制备例3所述的三个涂覆PDA的聚碳酸酯膜样品放置在24孔板的底部。将具有不同细菌水平的溶液吸移到各孔中，在EberbachModel 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在45分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。下面表16的数据报告了各样品的比色响应。
                     表16
  样品溶液   裂解细菌浓度cfu/ml   比色响应(红色分数)
  18A   0   2.1
  18B   103   2.3
  18C   105   3.2
实施例19-使用多粘菌素蛋白质探针的HEPES缓冲溶液，检测不同浓度的大肠杆菌的HEPES缓冲溶液
将按制备例3制备的五个聚二乙炔涂覆基底放置在24孔微量滴定板的各孔底部。，将硫酸多粘霉菌B(购自Aldrich)溶于HEPES缓冲剂中，浓度为26纳摩尔/ml。
制备下列样品溶液：
样品19A-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES缓冲溶液，不含细菌。
样品19B-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES缓冲溶液，包含按制备例8制备的103cfu/ml大肠杆菌。
样品19C-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES缓冲溶液，包含按制备例8制备的105cfu/ml大肠杆菌。
样品19D-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES缓冲溶液，包含按制备例8制备的107cfu/ml大肠杆菌。
样品19E-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES缓冲溶液，包含按制备例8制备的109cfu/ml大肠杆菌。
将不同的样品混合物涡旋，放置5分钟，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的各孔中。在Eberbach Model 6000摇床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上搅动微量滴定板。在30分钟时，使用数字相机采集图片。使用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描图片。测定比色响应(CR)。下面表17的数据将比色响应报告为细菌浓度的函数。
                  表17
  样品   大肠杆菌浓度(cfu/ml)   比色响应(红色分数)
  19A   0   2.2
  19B   1000   1.8
  19C   100000   1.2
  19D   10000000   0.8
  19E   1000000000   0.0
在不背离本发明范围和实质的情况下，对本发明的各种修改和替代对本领域技术人员将是显而易见的。应该理解本发明将不受本文所述说明性实施方案的不适当限制，这些实施方案仅仅作为例子出现，本发明的范围将仅将权利要求书限定。

Claims (20)

1.一种用于检测分析物的比色体系，包括：
比色传感器，其包括：
受体；
聚合组合物，其包括至少一种二乙炔化合物；
其中所述受体被掺入到所述聚合组合物中以形成转导物；和
缓冲组合物，其介导分析物与转导物之间的相互作用；
其中所述转导物在与分析物接触时表现出颜色变化；并且其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式：
Figure A2005800434290002C1
其中R1包括：
C1-C20烷基、
Figure A2005800434290002C2
Figure A2005800434290002C3
R2包括：
Figure A2005800434290002C4
Figure A2005800434290003C1
R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33独立地为C1-C20烷基；
R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32独立地为C1-C14亚烷基；
R6、R15、R18和R26独立地为C1-C14亚烷基、C2-C8亚烯基、或C6-C13亚芳基；
R9为C1-C14亚烷基或-NR34-；
R10、R12、R27和R29独立地为C1-C14亚烷基或(C1-C14亚烷基)-(C2-C8亚芳基)；
R11和R28独立地为C2-C30炔基；
R17为酯活化基团；
R23为C6-C13亚芳基；
R30为C1-C14亚烷基或-NR36-；
R34和R36为C1-C4烷基；
p为1-5；和
n为1-20；
其中R1和R2不相同。
2.如权利要求1所述的比色体系，其中所述缓冲组合物选自：HEPES缓冲剂、咪唑缓冲剂、PBS缓冲剂及其组合。
3.如权利要求1所述的比色体系，还包括探针。
4.如权利要求1所述的比色体系，其中所述探针选自：纤维蛋白原、链霉亲和素、IgG、及其组合。
5.如权利要求1所述的比色体系，还包括表面活性剂。
6.如权利要求1所述的比色体系，其中所述转导物为脂质体。
7.如权利要求1所述的比色体系，其中所述转导物在与所述缓冲组合物接触时表现出颜色变化。
8.如权利要求1所述的比色体系，其中所述缓冲剂通过与转导物的离子相互作用来介导分析物的相互作用。
9.如权利要求1所述的比色体系，其中所述缓冲组合物通过增强与转导物的疏水相互作用来介导分析物的相互作用。
10.如权利要求1所述的比色体系，其中R1为：
Figure A2005800434290004C1
其中R7为：亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、或1，9-亚壬基，R6为亚乙基、1，3-亚丙基、亚乙烯基、或亚苯基；和
其中R2为
Figure A2005800434290004C2
其中R20为亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、或1，9-亚壬基，其中R21为十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基；和
其中p为1。
11.如权利要求10所述的比色体系，其中R1为：
Figure A2005800434290004C3
R7为亚乙基；和
R2为
Figure A2005800434290005C1
R20为1，4-亚丁基，其中R21为十三烷基；和
p为1。
12.如权利要求1所述的比色体系，其中所述受体包括磷脂。
13.如权利要求12所述的比色体系，其中所述磷脂选自：磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、及其组合。
14.如权利要求1所述的比色体系，其中所述缓冲组合物包括两种或多种不同的缓冲剂。
15.一种用于检测分析物的方法，包括：
形成比色传感器，该传感器包括受体和含二乙炔的聚合组合物，其中所述受体被掺入到聚合组合物中以形成转导物，该转导物能够表现出颜色变化；
使传感器与探针接触；
在缓冲组合物存在的情况下，还使传感器与怀疑包含靶分析物的样品接触；和
如果分析物存在，则观察颜色变化；
其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式：
其中R1包括：
C1-C20烷基、
Figure A2005800434290005C3
Figure A2005800434290006C1
R2包括：
Figure A2005800434290006C2
R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33独立地为C1-C20烷基；
R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32独立地为C1-C14亚烷基；
R6、R15、R18和R26独立地为C1-C14亚烷基、C2-C8亚烯基、或C6-C13亚芳基；
R9为C1-C14亚烷基或-NR34-；
R10、R12、R27和R29独立地为C1-C14亚烷基或(C1-C14亚烷基)-(C2-C8亚芳基)；
R11和R28独立地为C2-C30炔基；
R17为酯活化基团；
R23为C6-C13亚芳基；
R30为C1-C14亚烷基或-NR36-；
R34和R36为C1-C4烷基；
p为1-5；和
n为1-20；
其中R1和R2不相同。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述缓冲组合物包括两种或多种不同的缓冲剂。
17.一种用于检测分析物的方法，包括：
形成比色传感器，该传感器包括受体和含二乙炔的聚合组合物，其中所述受体被掺入到聚合组合物中以形成转导物，该转导物能够在探针存在的情况下表现出颜色变化；
在缓冲组合物存在的情况下，使转导物与怀疑包含靶分析物的样品、和对靶分析物和受体两者都有亲和力的探针接触；和
如果分析物存在，则基本观察不到颜色变化；
其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式：
Figure A2005800434290007C1
其中R1包括：
C1-C20烷基、
Figure A2005800434290007C2
Figure A2005800434290007C3
R2包括：
Figure A2005800434290007C4
Figure A2005800434290008C1
R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33独立地为C1-C20烷基；
R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32独立地为C1-C14亚烷基；
R6、R15、R18和R26独立地为C1-C14亚烷基、C2-C8亚烯基、或C6-C13亚芳基；
R9为C1-C14亚烷基或-NR34-；
R10、R12、R27和R29独立地为C1-C14亚烷基或(C1-C14亚烷基)-(C2-C8亚芳基)；
R11和R28独立地为C2-C30炔基；
R17为酯活化基团；
R23为C6-C13亚芳基；
R30为C1-C14亚烷基或-NR36-；
R34和R36为C1-C4烷基；
p为1-5；和
n为1-20；
其中R1和R2不相同。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述靶分析物选自：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、蛋白A、PBP2′、大肠杆菌(E.coli)、和铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)。
19.如权利要求17所述的方法，其中在转导物与怀疑包含靶分析物的样品接触60分钟内，发生可观察到的颜色变化。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述缓冲组合物包括两种或多种不同的缓冲剂。
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