CN101107523A - 由联乙炔材料构成的比色传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测分析物的比色传感器。同样公开了利用该比色传感器和试剂盒用于比色检测分析物的方法。

Description

由联乙炔材料构成的比色传感器
相关申请的交叉引用
本申请要求于2004年12月17日提交的序列号为No.60/639,993的美国临时专利申请的优先权，其在此通过全文引入作为参考。
背景技术
目前的微生物检测技术(尤其是细菌对抗生素的耐药性)通常是耗时且通常涉及处于纯的形式的细菌培养。一种引起极大兴趣的这类微生物是金黄色葡萄球菌(“S.aureus”)，其是一种引起光谱感染的病原体，所述感染包括：表面损伤如小的皮肤脓肿和伤口感染；系统的和危及生命的疾病如心内膜炎，肺炎和败血病；以及toxinoses如食物中毒和中毒性休克综合症。金黄色葡萄球菌对于几乎对于所有的选择性的抗生素具有耐药性。
已经利用许多不同的常规方法尝试进行微生物的分析。例如，这些方法包括使用荧光免疫层析法(例如，快速分析测量方法如在美国专利5,753,517中指出的)，ELISA(例如，比色法ELISA)，和其他比色方法。在美国专利5,622,872和专利公开WO02/00920；美国专利6,395,561B1；6,306,598B1；6,277,652；6,183,722；和6,080,423中记载了包括聚联乙炔(PDA)材料的比色传感器。
联乙炔通常是溶液中的无色单体，并通过热或光化辐射进行加成聚合。随聚合进行，这些化合物发生对照性的颜色变化，变为蓝色或紫色。当暴露于外界刺激如热、物理应力或溶剂或反离子的变化时，聚联乙炔表现出由平面主链构象变形而产生的进一步的颜色变化。例如，如在Mino等人的Langmuir，第8卷594页，1992；Chance等人的Journal of Chemistry and Physics，第71，206卷，1979；Shibutag，ThinSolid Films，第179卷，433页，1989；Kaneko等人，Thin Solid Films，第210，548卷，1992；和美国专利5,672,465。
尽管本领域已经对检测金黄色葡萄球以及其他微生物的方法有记载，但是改进的检测方法仍是有利的。
概述
本发明提供了一种用于通过光谱变化(肉眼可见或色度计可测量的颜色变化)来检测分析物存在的比色传感器，所述光谱变化是由于分析物以引起聚联乙炔组装构象变化的方式相互作用而发生的。所述聚联乙炔组装表明分析物是以简单但高度敏感的方式存在的。本发明提供了一种检测分析物的比色系统，包括含有受体(receptor)的比色传感器；含至少一种联乙炔化合物的聚合组合物(聚合组合物由所述联乙炔化合物的聚合形成)；其中受体被引入聚合组合物以形成转导物(transducer)；和调节分析物和转导物之间的相互作用的缓冲组合物，其中缓冲体系包括两种或更多种不同的缓冲液；其中转导物在与分析物接触时表现出颜色变化。
在一个实施方式中，所述缓冲组合物是更高离子强度的缓冲液与较低离子强度缓冲液的组合。在优选的实施方式中，所述缓冲组合物选自HEPES缓冲液，咪唑缓冲液，PBS缓冲液及其组合。在一个实施方式中，所述缓冲液通过与转导物的离子相互作用调节与分析物之间的作用。在另一个实施方式中，所述缓冲组合物通过增强与转导物之间的疏水相互作用调节分析物的相互作用。所述转导物可分散在水溶液中或涂覆在基材上。
在另一个实施方式中，该比色系统进一步包括探测物(probe)。在一个优选的实施方式中，所述探测物选自纤维蛋白原、链霉亲和素、IgG、及其组合。
在另一个实施方式中，该比色系统进一步包括表面活性剂。在一个优选的实施方式中，所述表面活性剂包括非离子表面活性剂。
在一个示例性实施方式中，所述比色系统的转导物为脂质体和/或当与缓冲组合物接触时表现出颜色变化。
在一个示例性实施方式中，所述的联乙炔化合物(即聚联乙炔材料的起始材料)为以下通式
Figure A20058004353800061
其中，R1包括
或者
Figure A20058004353800071
R2包括
Figure A20058004353800072
或者
Figure A20058004353800073
其中R3，R8，R13，R21，R24，R31，和R33独立地为C1-C20烷基；R4，R5，R7，R14，R16，R19，R20，R22，R25和R32独立地为C1-C14亚烷基；R6，R15，R18和R26独立地为C1-C14亚烷基，C2-C8亚烯基，或C6-C13亚芳基；R9为C1-C14亚烷基或-NR34-；R10，R12，R27和R29独立地为C1-C14亚烷基或(C1-C14亚烷基)-(C2-C8亚芳基)；R11和R28独立地为C2-C30炔基；R17为酯活化的基团；R23为C6-C13亚芳基；R30为C1-C14亚烷基或-NR36-；R34和R36为C1-C4烷基；p为1～5(这里，“联乙炔”包括具有2～10个C-C叁键的化合物)；n为1～20；其中R1和R2不同。
在一个实施方式中，在比色体系中的受体包括选自以下的磷脂：胆碱磷酸，磷酸乙醇胺，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，及其组合。
本发明还提供了一种检测分析物的方法。该方法包括形成包括受体和聚合组合物的比色传感器，其中的聚合组合物包括联乙炔(即该聚合组合物衍生自联乙炔的聚合)，其中的受体被引入到聚合组合物中以形成能够表现出颜色变化的转导物；使传感器与探测物接触；在含有两种或更多种不同缓冲液的缓冲组合物存在下，使传感器与怀疑含有目标分析物的样品接触；如果存在分析物，观察到颜色变化。
在另一个实施方式中，提供了一种检测分析物的方法，该方法包括形成比色传感器，所述传感器包括受体和含联乙炔的聚合组合物，其中的受体被引入到聚合组合物中以形成在探测物存在下能够表现出颜色变化的转导物；在包括两种或更多种不同缓冲液的缓冲组合物存在下，使所述转导物与怀疑含有目标分析物的样品和对目标分析物和受体均具有亲和力的探测物接触；如果存在分析物，观察到基本无颜色变化。优选可将探测物和怀疑含有目标分析物的样品混合以在与转导物接触之前形成混合物。
在一个示例性实施方式中，所述分析物选自金黄色葡萄球菌，蛋白质A，PBP2’，埃西氏大肠杆菌，和绿脓杆菌。在大多数实施方式中，该比色体系在使转导物与分析物接触60分钟内表现出可观察到的颜色变化。
定义
除非在权利要求或说明书其他部分给出不同定义，对于下面限定的术语使用这些定义。
此处，术语“烷基”指具有特定数目碳原子的直链或支链或环状单价烃基。烷基基团包括具有1～20个碳原子的那些。此处使用的“烷基”的例子包括但不限于，甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，异丁基，和异丙基等。应理解为在环状部分中，在所述烷基中必须至少存在3个碳原子。这种环状部分包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环庚基。
此处，术语“亚烷基”指具有特定数目碳原子的直链或支链或环状二价烃基。亚烷基基团包括具有1～14个碳原子的那些。此处使用的“亚烷基”的例子包括但不限于，亚甲基，亚乙基，三亚甲基，四亚甲基等。应理解为在环状部分中，在所述亚烷基中必须至少存在3个碳原子。这种环状部分包括环丙烯，环丁烯，亚环戊基，亚环己基和亚环庚基。
此处，术语“亚烯基”指具有特定数目碳原子和一个或多个碳碳双键的直链或支链或环状二价烃基。亚烯基基团包括具有2～8个碳原子的那些。此处使用的“亚烯基”的例子包括但不限于乙烯-1，2-二基，丙烯-1，3-二基等。
此处，术语“亚芳基”指具有单环如亚苯基或多个稠环如亚萘基或亚蒽基的二价不饱和芳族羧基。亚芳基包括具有6～13个碳原子的那些。此处“亚芳基”的例子包括但不限于，苯-1，2-二基，苯-1，3-二基，苯-1，4-二基，萘-1，8-二基等。
此处，“亚烷基-亚芳基”指如上定义的亚烷基部分结合到如上定义的亚芳基部分。此处所用的“亚烷基-亚芳基”的例子包括但不限于，-CH2-亚苯基，-CH2CH2-亚苯基，和-CH2CH2CH2-亚苯基。
此处，术语“炔基”指具有2～30个碳原子和至少一个碳碳叁键的直链或支链或环状单价烃基。此处使用的“炔基”的例子包括但不限于乙炔，丙炔和丁炔等。
此处，术语“分析物”指可通过本发明传感器体系检测到的任何材料。这种材料包括但不限于小分子，病原和非病原有机体，毒素，膜受体和片段，挥发性有机化合物，酶和酶底物，抗体，抗原，蛋白质，肽，核酸和肽核酸。“目标分析物”指传感器系统检测的目标物质。
此处，术语“细菌”指所有认为是细菌的微生物，包括球菌，杆状菌，螺旋体，原生质球，原生质体等。
此处，术语“受体”指如何对目标分析物和/或探测物具有亲和性的分子或分子组装。受体包括但不限于天然或合成受体如脂质，表膜蛋白，酶，外源凝集素，抗体，重组蛋白，合成蛋白，核酸，c-配糖体，碳水化合物，神经节苷脂，和螯合剂。
此处，术语“组装”或“自组装”指任何聚合前自动排序的联乙炔分子和磷脂。参见J.Israelachvili，Intermolecular and Surface Forces(2<nd>Ed.)，Academic Press，New York(1992)，pp.321-427。
此处，术语“自组装单层”(SAMs)指通过自发的自动排序在给定基材上形成的任何有序超薄有机膜。A.Ulman，An Introduction toUltrathin Organic Films，Academic Press，New York(1991)，pp.237-301。
此处，术语“转导物”指一种能够将分子水平的识别事件如共价键或非共价相互作用(例如静电作用，极性作用，范德华力)转化成可观察到的信号的材料。
“探测物”指能够与目标分析物和/或受体相互作用的物质。相应的，所述探测物是一种“可检测的结合试剂”即一种特定识别并与分析物(即目标分析物)和/或受体相互作用或结合的试剂，其中该探测物在结合时具有可检测的性质。  “特定相互作用”指可检测到的结合试剂与目标分析物或受体物理性相互作用，以基本上排除其他也存在于样品中的分析物。根据本发明有用的可检测结合试剂的结合的稳定性允许结合的测量。
术语“包括”和其变体形式在其出现在说明书和权利要求中时不具有限制性含义。
“优选”和“优选地”是指本发明的实施方式在某些情况下可提供特定的优点。然而，其他上述方式在相同或其他情况下，也可能是优选的。此外，引述一种或多种优选的实施方式并非意味着其他实施方式不可用，且并非意欲将其他实施方式排除在本发明范围之外。
此处，“一个(a)”，“一个(an)”，“该(the)”，“至少一个(种)”，和“一个或多个”可互换使用。
本文的所有数值均认为以“约”修饰。通过端值表示的数值范围包括包含在该范围内的所有数值(例如，1～5包括1，1.5，2，2.75，3，3.80，4，和5)。
本发明的上述概述不意欲说明每一公开的实施方式或本发明的每一实现方式。下面的说明书更具体地举例说明了例示性的实施方式。在本申请全文的几个地方中通过实施例列表提供了指导，其实施例可用于各种组合。在各情况下，所引用的列表仅作为代表性的一组，并不应解释为排除性的列表。
示例性实施方式概述
图1表示本发明比色传感器的示意图
图2表示本发明比色传感器阵列的示意图
示例性实施方式详述
本发明提供了一种用于检测分析物的比色系统。所述比色系统包括比色传感器，比色传感器包括受体和聚联乙炔材料(聚联乙炔组装，其指可(但非必要)包括其他组分的有序聚联乙炔结构)，其中的受体被引入到聚联乙炔内，以形成能够在与探测物和/或分析物结合时提供颜色变化的转导物。所述比色传感器可在溶液中或涂覆到基材上而起作用。
聚联乙炔组装
本发明的联乙炔化合物可在溶液中自组装，以形成可利用任何光化辐射聚合的有序组装，所述光化辐射如电磁光谱的UV或可见光范围的电磁辐射。联乙炔化合物的聚合产生聚合反应产物，所述聚合反应产物取决与它们的构象和暴露于外界因素的情况，在小于570纳米(nm)，570nm和600nm之间(包括端值)，或大于600nm的可见光光谱内具有颜色。通常，本文公开的联乙炔化合物的聚合产生包括聚联乙炔主链的亚稳态蓝相聚合物网络。在暴露到外界因素如热、溶剂或反离子变化、或者可能的物理压力的情况下，这些亚稳态蓝相聚合物网络产生从带蓝色向带红色-橙色的颜色变化。
本文公开的联乙炔化合物和它们的聚合产物在暴露于物理压力下能够发生可见的颜色变化的能力使得它们成为制备用于检测分析物的传感器的备选物质。由所公开的联乙炔化合物形成的聚联乙炔组装可用作生物传感应用中的转导物。
用于给定传感应用中的联乙炔分子的结构要求通常根据具体应用有具体要求。特征如整个链的长度、溶解性、极性、结晶度和用于进一步分子改性的官能团的存在均共同确定了联乙炔分子用作有用的传感材料的能力。例如，在水性介质中分析物的生物检测的情况下，联乙炔类化合物的结构应能够形成水中的稳定分散体，有效聚合成有色材料，引入适当化学受体用于结合分析物，并通过颜色变化转导结合相互作用。这些能力取决于所述联乙炔化合物的结构特征。
本发明的联乙炔化合物具备上述能力，并能容易和有效地聚合成产生所需的颜色变化的聚联乙炔组装。此外，该联乙炔化合物允许引入大大过量的不可聚合材料，如下文所述受体，而仍形成稳定、可聚合的溶液。
所公开的联乙炔化合物(原料)可以快速高产率方式合成，包括高产出合成方法。在联乙炔化合物(原料)主链中存在的官能度如杂原子提供了容易结构精制的可能性，所述结构精制的目的在于满足给定传感应用的要求。通过向适当溶剂如水中加入联乙炔，经声波处理该混合物，然后用紫外光(通常在254nm波长下)照射该溶液，所述联乙炔化合物可被聚合成含所需的聚联乙炔主链的网络。经聚合该溶液发生颜色变化成蓝紫色。
本发明中使用的联乙炔(原料)通常含有至少8个碳的平均碳链长度和至少一个官能团如羧基、伯胺或叔胺基，羧基甲酯等。适当的联乙炔包括在美国专利5,491,097(Ribi等人)，PCT公开WO 02/00920，美国专利6,306,598，和PCT公开WO 01/71317。
在一个优选的实施方案中，所述的聚联乙炔组装包括由以下通式的联乙炔聚合产生的化合物：
Figure A20058004353800131
其中R1是
烷基，
或者，
Figure A20058004353800142
R2是
Figure A20058004353800143
其中R3，R8，R13，R21，R24，R31，和R33独立地为烷基；R4，R5，R7，R14，R16，R19，R20，R22，R25和R32独立地为亚烷基；R6，R15，R18和R26独立地为亚烷基，亚烯基，或亚芳基；R9为亚烷基或-NR34-；R10，R12，R27和R29独立地为亚烷基或亚烷基-亚芳基；R11和R28独立地为炔基；R17为酯活化的基团；R23为亚芳基；R30为亚烷基或-NR36-；R34和R36独立地为H或C1-C4烷基；p为1～5；n为1～20；其中R1和R2不同。
在美国公开号为2005/0101794-A1和美国公开号为2004/0126897-A1及2004/0132217-A1中进一步描述了示例性的化合物。
在一个优选的实施方式中，R1是
Figure A20058004353800151
其中R7是亚乙基，三亚甲基，四亚甲基，五亚甲基，六亚甲基，七亚甲基，八亚甲基，或九亚甲基，R6为亚乙基，三亚甲基，亚乙烯基或亚苯基；和其中R2是
Figure A20058004353800152
其中，R20是亚乙基，三亚甲基，四亚甲基，五亚甲基，六亚甲基，七亚甲基，八亚甲基，或九亚甲基，和其中R21为十一烷基，十三烷基，十五烷基，十七烷基；和其中p是1。
本发明包括本文所述化合物的异构体，如结构异构体和几何异构体，盐，溶剂化物，多晶型物等。
可如在路线1中概括的制备通式XXIII的联乙炔，其中n通常为1～4，m通常为10～14。
路线1
可以通过在适当溶剂如DMF中，通过通式XXII的化合物与适当的氧化剂的氧化反应制备通式XXIII的化合物。适当的氧化剂例如包括Jones试剂和重铬酸吡啶盐。实施的反应通常在0℃～40℃的温度下，通常为0℃～25℃的温度下，进行1～48小时，通常为8小时的时间周期。
可通过由通式XXI的化合物与适当的酰氯反应制备通式XXII的化合物。适当的酰氯包括任何提供所需产物如月桂酰氯，1-十二烷酰氯，1-十四烷酰氯，1-十六烷酰氯，和1-十八烷酰氯的酰氯。适当的溶剂包括例如醚，四氢呋喃，二氯甲烷和氯仿。上述反应在0℃～40℃的温度下，通常为0℃～25℃的温度下，在碱如三烷基胺或吡啶碱的存在下，通常进行1～24小时，经常进行3小时。
通式XXI的化合物或者可以市售购得(例如n为1～4的情况)，或者可以由通式XVIII的化合物通过化合物XIX和XX如路线1中概括的那样和例如在Abrams，Suzanne R.；Shaw，Angela C.″Triple-bondisomerizations：2-to 9-decyn-l-ol，″Org.Synth.(1988)，66，127-31和Brandsma，L.″Preparative Acetylenic Chemistry，″(Elsevier Pub.Co.，New York，1971)中公开的那样而制备。
还可以通过在适当的溶剂如甲苯存在下，使通式XXII的化合物与酸酐如琥珀酸，戊二酸或邻苯二甲酸的酸酐反应而制备本文公开的联乙炔化合物。上述的反应在50℃～125℃的温度下，通常在100℃～125℃的温度下，通常进行1～24小时，经常进行15小时。
包括聚合联乙炔的比色传感器可用作分子识别事件的比色检测基础。可通过或者在聚合之前，或者在聚合之后，将受体加入到联乙炔单体而制备所述传感器。该受体通过各种方式包括物理混合，共价键合，和非共价相互作用(如静电作用，极性相互作用等)功能化所述的聚联乙炔组装。
聚合时或其后，受体被有效与聚合物网络混合，这样由于共轭烯-炔聚合物主链的扰动，受体和分析物的相互作用产生可见的颜色变化。
受体与聚联乙炔组装的混合提供了能够相应于与探测物和/或分析物的相互作用或结合而变形的结构形状。特别有用的受体为两性分子与通常为棒状的分子结构体系的组装，所述棒状分子结构体系的特征在于下列文献中限定的堆积参数：v/(aolc)(Israelachvili，J.N.等人；Q.Rev.Biophys.；13，121，1980)，其中v为烃组分分子所占的体积(例如，磷脂或脂肪酸的烃链)，a0是极性头基所占的有效面积(例如磷脂的磷酸盐头基或者脂肪酸的羧酸头基)，lc是所谓的临界长度，并通常在其环境温度下描述分子长度。优选的受体两性分子是堆积参数v/(aolc)在1/3～1之间的那些。
有用的受体包括但不限于，脂质，表膜蛋白，酶，外源凝集素，抗体，重组蛋白，合成蛋白，核酸，c-配糖体，碳水化合物，神经节苷脂，和螯合剂。在大多数实施方式中，所述受体为磷脂。适当的磷脂包括磷酯酰胆碱(例如1，2-二豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酯酰胆碱)，磷乙醇胺，和磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，如在Silver，Brian L.，The Physical Chemistry of Membranes，Chapter 1，pp 1-24(1985)中描述的那些。
在一个实施方案中，将所述受体与聚联乙炔物理混合并分散在聚联乙炔中，形成其中的结构自身对于研究的探测物和/或分析物具有亲和性的结构。该结构包括但不限于，脂质体，胶束，和薄层。在一个优选的实施方式中，该结构为脂质体。尽管不希望受限于理论，认为所述的磷脂拟态细胞膜，而聚联乙炔组装允许脂质体发生的物理化学变化被转译成可见的颜色变化。所制备的脂质体具备清楚定义(welldefinded)的形态、尺寸分布和其他物理性质如清楚定义的表面电势。
脂质体中的受体与联乙炔化合物(原料)的比例可基于材料选择和所需的比色响应而变。在大多数实施方式中，磷脂与联乙炔化合物(原料)的比例至少将为25∶75，更优选至少为40∶60。在一个优选的实施方式中，脂质由以下的联乙炔化合物：HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3[琥珀酸单(12-十四烷酰氧-十二-5，7-二炔基)酯]，和两性离子磷脂1，2-二豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酯酰胆碱[DMPC]以6∶4比例混合而构成。
此处，PDA体系的讨论涉及脂质体在受体组装中的用途；然而，该讨论也可应用于其他受体组装，包括例如其他的平面构象。
通过悬浮在称作制备缓冲液的缓冲溶液中的材料混合物的探测物(超)声波降解法而制备该脂质体。例如，制备缓冲液可为低离子强度的(5mM)N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸[HEPES]缓冲液(pH＝7.2)。另一种有用的制备缓冲液是低离子强度的(2mM)三羟甲基氨基乙烷[TRIS]缓冲液(pH＝8.5)。
本发明的比色系统设计用于开发一种探测物可与含有受体如磷脂和聚联乙炔的脂质体相互作用的方式。所述脂质体可用作与探测物相互作用的生物膜模型，如在Oellerich，S.等人；J.Phys.Chem B；2004，108，3871-3878；和Zuckermann，M.J.；Heimburg T.；Biophysi.J.；2001，81，2458-2472中描述的蛋白质。通常，在高的脂质与蛋白质浓度比下，蛋白质将主要通过静电相互作用吸附到脂质体的表面。
随蛋白质浓度的增大，和脂质与蛋白质浓度比的降低，蛋白质继续静电吸附到脂质体的表面，直至它们完全饱和或包住脂质体。随该过程的进行，脂质体和蛋白质均发生了形态和构象的变化，直到覆盖脂质体表面的蛋白质疏水片段开始与脂质体结构的疏水内部相互作用。此时，蛋白质可变为疏水结合并穿入脂质体结构中，脂质体的大小和渗透性变化极大。最后，蛋白质层可产生悬浮稳定性降低，絮凝，并最终沉淀。
这些静电相互作用的存在不仅高度依赖于存在的蛋白质和脂质的类型，而且也依赖于它们的环境。尽管不希望受限于理论，认为给定缓冲体系的离子强度将有助于建立脂质体和带电蛋白质的表面电势，并从而有助于它们显著静电作用的能力。
例如，在低离子强度(2-5mM)的缓冲体系中，在中性pH(例如HEPES，TRIS)下，带电的探测物可静电吸附到聚联乙炔脂质体上。尽管初始吸附自身可能不会引起脂质体大小和形态的根本变化，从而初始小的或可忽略的比色响应，如果探测物相对于脂质过量存在的话，则很可能探测物将最终变为疏水吸附到脂质体上并穿透其内部膜结构。此时，可预期通过在脂质体结构内引入探测物而产生的大的机械应力将显著改变聚联乙炔的构象，产生伴生的容易观察到的比色响应。
或者，如果探测物在中性pH下带负电，它与聚联乙炔脂质体相互静电作用的能力受到严重阻碍，并由于探测物和含受体聚联乙炔脂质体之间的疏水相互作用产生比色响应的能力可能受到损害。在此情况下，使用中性pH下的高离子强度的缓冲液(＞100mM)(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，咪唑缓冲液)将提供降低脂质体表面电势的方法(通过屏蔽脂质体的表面电荷)，有利于不带电探测物和脂质体之间的直接疏水相互作用，并在脂质体的结构内导致蛋白质的混入。从而，在此情况下，该缓冲体系有助于产生实质上的比色响应，否则其将不会发生。由于它对脂质体的表面电势影响，尽管更高离子强度的缓冲液在无探测物时可引入明显的比色响应，已经确定当存在探测物时，由于蛋白质-脂质体的疏水相互作用，显著增强了比色响应。该结果具有非常有用的实践结果：对于给定检测限度，可明显缩短检测时间，或相反，对于固定的检验时间，可明显降低检测限度。
基于该现象，可基于其与给定目标分析物和聚联乙炔脂质体特定相互作用以引发比色响应的能力而选择探测物。在直接分析情况下，含聚联乙炔脂质体的比色响应直接与探测物或探测物-分析物复合物的浓度成正比。
对于特定应用，探测物的选择将部分取决于探测物的尺寸，形状，电荷，疏水性，和对分子的亲和性。取决于环境的pH值，探测物可带有正电，负电或为两性离子。在低于探测物等电点的pH下，探测物带正电，高于该值则探测物带负电。此处，术语“等电点”指探测物净电荷为零的pH值。
为设计具有聚联乙炔/磷脂体系的生化检测，知道受体(或探测物)的等电点将影响缓冲混合物的选择。具有较低等电点的探测物可能需要较高离子强度的缓冲液，以获得脂质体形态的变化。具有较高等电点的蛋白质可用于低离子强度的缓冲液如HEPES缓冲液，以产生颜色变化。
在此给定的一般机理下，不仅要考虑聚联乙炔脂质体组合物(例如所使用的磷脂和磷脂与联乙炔的比例的选择)和使用的探测物(例如多粘菌素，纤维蛋白原，抗体)，还要考虑通过选择缓冲体系建立的水性环境。
本发明的缓冲组合物提供了一种在其他组分存在下能够抵抗pH值变化的体系，该体系由共轭酸碱对组成，其中质子受体与质子给体的比例接近整数。此外，本发明的缓冲组合物调节分析物和比色传感器组分之间的物理或化学相互作用。例如，在一个实施方式中，该缓冲组合物抑制分析物和受体的相互作用。在另一个实施方式中，缓冲组合物促进分析物和受体的相互作用。尤其有用的缓冲组合物可包括HEPES缓冲液，咪唑缓冲液和PBS缓冲液。
在一个优选的实施方式中，基于探测物和/或待检测的目标分析物的选择，使用缓冲液的组合(即不同的缓冲液)调节给定应用的适当离子强度。
将两种或多种不同缓冲液混合是调节缓冲体系的物理性质以获得脂质体-蛋白质探测物相互作用中的静电和疏水组分适当平衡的便捷途径。
例如，在仅含有HEPES缓冲液的体系中，其中pH为7.2，多粘菌素(等电点为7.7)带正电并容易附着到磷脂带负电的极性头基上，并可引发比色传感器中的蓝色到红色的颜色变化。等电点为5.3的纤维蛋白原在相同的HEPES缓冲组合物中带负电，其防止吸附或与磷脂的进行头基的任何静电相互作用。
或者，在具有较高离子强度的缓冲液存在下，如咪唑或PBS，离子强度改变了脂质体(或其他转导物结构)的形态，暴露出疏水的部分。在含有较高离子强度缓冲组合物的比色体系中，纤维蛋白原在结构中含有与磷脂相互作用的疏水部分，引起颜色变化。
一种获得脂质体-蛋白质相互作用的静电和亲水组分的最优平衡的方法是使用磷脂或多种不同缓冲液的混合物。例如，将低离子强度的缓冲液(HEPES，Tris)与不同离子强度的无机缓冲液(PBS)混合可允许扩大单一缓冲液情况下缓冲性能的等级范围。因而，可设计混合缓冲体系以提供优化的脂质体-蛋白质相互作用。
混合的缓冲液体系还将提供相对于非相互作用的缓冲液，调节缓冲体系相互作用到何种程度的一种途径。例如，可使用非相互作用的缓冲液(HEPES)“稀释”相互作用的缓冲液(PBS，咪唑)以调节其对脂质体形态的影响。当然，也可通过使用混合的缓冲体系获得相反的效果(非相互作用的缓冲液变得更多地相互作用)。
最后，可以类似方式将表面活性剂组分引入到缓冲组合物中，所述表面活性剂组分有助于探测物和比色传感器的疏水相互作用。本发明中特别有用的表面活性剂可包括非离子表面活性剂。聚烷氧基化的，特别是聚乙氧基化的非离子表面活性剂尤其可在溶液中很好地稳定本发明的组分。
可使用的非离子类型的表面活性剂包括：
1.聚环氧乙烷延长的山梨糖椁单烷基酸酯(即聚山梨醇酯)。特别是市售的NIKKOL TL-IO(得自Barret Products)聚山梨醇酯20非常有效。
2.聚烷氧基化烷醇
如以商品名BRIJ得自ICI Specialty Chemicals，Wilmington，DE的那些可商购的表面活性剂，HLB至少约14，证明是有用的。特别是BRIJ78和BRIJ 700，其分别为具有20和100摩尔聚环氧乙烷的硬脂醇乙氧基化物，证明非常有用。鲸蜡硬脂醇醚55也是有用的，其可以商品名PLURAFAC A-39从BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ商购得到。
3.聚烷氧基化烷基酚
这类有用的表面活性剂包括HLB值至少约为14的聚乙氧基化辛基酚或聚乙氧基化壬基酚，其可以商品名ICONOL和TRITON分别从BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ和Union CarbideCorp.，Danbury，CT商购得到。例子包括TRITON XlOO(具有15摩尔环氧乙烷的辛基酚，可得自Union Carbide Corp.，Danbury，CT)，和ICONOL NP70和NP40(分别具有40和70摩尔环氧乙烷单元的壬基酚，可购自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ)。也可使用这些表面活性剂的硫酸酯化和磷酸化的衍生物。这种衍生物的例子包括壬苯醇醚(nonoxynol)-4-硫酸铵，其可以商品名RHODAPEX CO-436从Rhodia，Dayton，NJ商购得到。
4.Polaxamers.
基于环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物的表面活性剂在稳定本发明的成膜聚合物和提供良好润湿性方面表现为有效。只要HLB至少约14，并优选至少约16，EO-PO-EO blocks和PO-EO-PO嵌段预期均能良好使用。这种表面活性剂可以商品名PLURONIC和TETRONIC从BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ.商购得到。注意到BASF的PLURONIC报告的计算HLB值与上述的不同。在此情况下，应使用BASF报告的HLB值。例如，优选PLURONIC表面活性剂为L-64和F-127，其分别具有15和22的HLB值。尽管PLURONIC表面活性剂在稳定本发明的组合物方面非常有效，并以碘作为活化剂非常有效，它们可能降低使用吡咯烷酮-碘作为活化剂的组合物的抗菌剂活性。
5.聚烷氧基化酯
聚烷氧基化二醇如乙二醇，丙二醇等可部分或完全被酯化，即可用(C8～C22)烷基羧酸酯化一种或多种醇。HLB至少为约14，优选至少约为16的这种聚乙氧基化酯适用于本发明的组合物。
烷基聚葡萄糖苷
如在美国专利5,951,993(Scholz等人)从第9栏44行开始中记载的那些烷基聚葡萄糖苷可与本发明成膜聚合物相容，并可有助于聚合物稳定性。例子包括glucopon 425，其具有平均10.3个碳的平均链长的(C8-C16)烷基链长和1～4个葡萄糖单元。
最后，基于本发明比色材料的检测体系取决于一个或多个以下因素：联乙炔化合物的分子构造；使用的受体部分的类型；脂质体或联乙炔和受体分子的其他电势聚集结构的形态(大小和结构)；使用的蛋白质探测物；和用于所述检测的缓冲系统。
检测方法
本发明提供了一种用于分析物的分析方法，其包括使上述的比色传感器与溶液样品或含表面的分析物接触，并利用吸附材料或肉眼观察测定比色传感器中的颜色变化。
在选择性的一个实施方式中，本发明提供了一种通过选择对混入聚联乙炔组装中的受体和分析物均具有结合亲和性的探测物间接检测分析物的方法。所选择的探测物将显示与分析物的有竞争力的亲和性。当存在感兴趣的分析物时，探测物将结合到分析物上而不是聚联乙炔主链上的受体上，产生与分析物浓度成反比的颜色变化。若不存在分析物，则探测物将结合到引入聚联乙炔主链上的受体上，产生从蓝色到红色的颜色变化。可在分析物接触传感器之后，使探测物与传感器接触，或可在混合物接触传感器之前与分析物混合。
在一个相反的检测分析中，允许探测物和目标分析物在缓冲溶液中相互作用，其随后与传感器接触。缓冲液中游离探测物的浓度取决于存在的目标分析物的量：分析物浓度越高，探测物残留浓度越低。由于传感器的比色响应与存在的游离探测物量成正比，则比色响应与分析物浓度成反比。
在一些情况下，探测物可与能直接与传感器相互作用的分析物形成复合物，直接得到鉴定，其中比色响应直接与分析物的浓度成正比。
在一个实施方式中，本发明的方法包括提供在缓冲组合物中包括分析物的测试试样，提供在缓冲组合物中的探测物，将测试试样和探测物混合，其中该探测物对分析物表现出比受体更大的结合亲和性，并用生物传感器检测变化。
同样重要的是认识到在某些检测中可如在下文进一步讨论的那样，通过分段或否则裂解目标分析物而原位产生探测物。所述探测物还可认为是存在于可直接与传感器相互作用的有机体细胞壁外部上的蛋白质或蛋白质片段。可进行探测物和分析物之间的相互作用，以排除与脂质体之间的相互作用。或者所述探测物可与分析物相互作用，以形成具有可与脂质体相互作用的复合物的复合物。
探测物可与溶液中或涂覆在基材上的传感器接触。探测物可以是对目标分析物和受体均具有亲和性的任何分子。可用于本发明的探测物包括破膜肽如阿拉霉素，magainin，短杆菌肽，多粘菌素B硫酸盐，和蜂毒肽；纤维蛋白原；streptavridin；抗体；外源凝集素；及其组合。
在一些实施方式中，使用抗体作为探测物。“抗体”指能够特定结合给定抗原包括其抗原结合片段的免疫球蛋白。术语“抗体”包括任何同种型(IgG，IgA，IgM，IgE，等)的整个抗体，和也与脊椎动物(例如哺乳动物)蛋白质特定反应的其片段。可利用常规方法被分成片段，并筛选片段以作为整个抗体的相同方式使用。从而，该术语包括那个选择性与特定蛋白质反应的抗体分子的蛋白水解或重组制备部分的片段。这种蛋白水解和/或重组片段的非限制性例子包括F(ab′)，F(ab)2，Fv，和含有通过肽连接结合的VL和/或VH区域的单链抗体(scFv)。所述scFv′s可被共价或非共价连接以形成具有两个或多个结合位的抗体。可用如何本领域技术人员已知的可检测的部分标记抗体。
各种抗体在本领域是已知的。例如，金黄色葡萄球菌抗体可从Sigma和Accurate Chemical商购得到。优选使用的抗体浓度至少为每毫升2纳克(ng/ml)。通常抗体的浓度至少为100纳克/毫升。例如可使用100微克/毫升的浓度。通常使用不大于约500微克/毫升的浓度。
在另外的实施方式中，使用纤维蛋白原作为探测物。不希望受限于理论，认为结合纤维蛋白原的蛋白质表达或存在于与纤维蛋白原反应的分析物上/内。例如，金黄色葡萄球菌表达结合纤维蛋白原的蛋白质通常称作与在接触时与纤维蛋白原反应的聚集因子。
产生该反应的纤维蛋白原浓度通常至少为0.0001wt-％，并通常不高于5wt-％。人血浆和动物(例如兔)血浆适用作含纤维蛋白原的培养基。市售可得的血浆产品通常包括抗凝血剂如EDTA，柠檬酸盐，肝素等。衍生自人体的纤维蛋白原可从Sigma Aldrich，St.Louis，MO商购得到。
利用间接检测方法，基于使用的探测物浓度得到提供低检测程度的高敏感性是可能的。对于检测策略，可对应于所需的检测浓度水平选择探测物浓度。对于给定应用所需灵敏度，利用探测物的间接检测方法允许围绕探测物的浓度和类型设计系统。这允许转导物对于多种分析物是统一的。例如根据探测物对分析物的亲和性，通过改变与转导物接触的探测物即可使用单一的转导物(聚联乙炔/受体组合)用于检测多种分析物。
特别感兴趣的待检测分析物是微生物(即微小生物体)如革兰氏(染色)阳性细菌，革兰氏(染色)阴性细菌，真菌，原生动物，支原体，酵母菌，病毒，和甚至脂包膜病毒.特别相关的有机体包括肠杆菌科，或者葡萄球菌属链球菌属，假单胞菌属，肠球菌属，Esherichia spp.，芽孢杆菌属，李斯特氏菌属，弧菌属，以及疱疹病毒，曲霉属，镰刀菌属，和假丝酵母属。特别是病毒性有机体包括金黄色葡萄球菌(包括耐药性菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))，表皮葡萄球菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，化脓性链球菌，粪肠球菌，耐万古霉素肠球菌(VRE)，耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)，中度耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VISA)，炭疽芽孢杆菌，绿脓杆菌，埃西氏大肠杆菌，黑曲霉菌，烟曲霉，棒曲霉菌，茄病镰刀菌，尖孢镰刀菌，F.chlamydosporum，单核细胞增多性李斯特菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，猪霍乱沙氏杆菌，伤寒沙门菌，鼠伤寒沙门菌，白色念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，和多药耐药革兰氏阴性杆菌(MDR)。
特别感兴趣的是革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌。通常这些可通过检测细菌的细胞壁组分特征的存在而检测，例如细胞壁蛋白质。同样，特别感兴趣的是抗药性微生物包括MRSA，VRSA，VISA，VRE，和MDR。通常，这些可通过另外检测细胞内部组分的存在而检测，如膜蛋白。
这类微生物或其他感兴趣的物种可在测试样品中被分析，所述测试样品可衍生自任何来源，如生理体液，例如血液，唾液，接目镜液，滑液，脑脊髓液，脓液，汗液，渗出液，尿液，粘液，泌乳等。此外，该测试样品可衍生自身体部位如伤口、皮肤、鼻腔，头皮，指甲等。这里“测试样品”指含有目标分析物的样品。优选，该样品为液态或气态，更优选为液态。
现有技术记载了多种用于金黄色葡萄球菌检测的患者取样方法。这类取样方法同样适用于本发明的方法。通常通过患者的鼻咽擦拭而得到样品。一种特别优选的取样方法包括用无菌人造纤维拭子擦拭取样对象(例如患者)的前鼻腔。每个取样对象使用一支拭子，即两个鼻孔均用一支拭子。通过将人造纤维拭子(可以商品名″Pure-Wraps″商购自Puritan，East Grinstead，UK)干燥或用适当溶液在取样对象鼻孔前端预先润湿，并沿鼻孔的粘膜表面旋转该拭子两个完整的一周进行取样。然后直接或用适当溶液提取培养该拭子，所述溶液通常包括水，任选与缓冲液和至少一种表面活性剂结合。
除生理体液外，其他的测试样品可包括其他液体以及溶于液体介质中的固体。感兴趣的样品可包括加工气流，水，土壤，作物或其他植物，空气，表面(如污染表面)等。
测试样品(例如液体)可进行预先处理，如粘性流体的稀释。在注入样品孔之前，可以其他处理方法处理测试样品，如浓缩(通过过滤，蒸馏，渗析等)，稀释，过滤，天然组分的灭活，加入试剂，化学处理等。
一种可增强目标分析物的信号检测的处理方法包括溶解细胞以形成细胞壁片段并分析所述细胞壁片段，如在美国专利公开2005/0153370中记载。该方法特别可用于检测一种或多种微生物，尤其是金黄色葡萄球菌特征的细胞壁组分。该方法包括：通过包括未培养细胞的测试样品；溶解该未培养的细胞以形成包括细胞壁片段的溶菌产物；分析该细胞壁片段用于分析物的细胞壁组分表征；其中所述分析物的细胞壁组分表征相对于未溶解细胞中的相同组分表现出增强的信号。
细胞壁组分包括，如细胞壁蛋白质如蛋白质A和微生物表面组分识别粘附基质分子(MSCRAMMs)如纤维蛋白原结合蛋白质(例如，聚集因子)，fibronectin-结合蛋白质，胶原质-结合蛋白质，肝素/肝素相关的多糖结合蛋白质等。蛋白质A和聚集因子，如纤维蛋白原结合因子和聚集因子A，B和Efb也可特别用于存在金黄色葡萄球菌的检测方法中。其他的细胞壁组分包括胶囊状多糖和细胞壁碳水化合物(例如，磷壁酸和脂磷壁酸)
细胞溶解可包括使细胞与溶解剂接触，或物理分解细胞。细胞溶解可在常规调节下进行，例如，在约5℃～约37℃的温度下，优选在约15℃～25℃的温度下。值得注意的是，该细胞溶解可利用未培养的细胞，即直接测试样品进行，尽管也可使用培养的细胞。
作为溶解细胞形成细胞壁片段并得到细胞壁组分的信号增强的结果，可对具有相对低浓度的感兴趣物种样品进行测评。例如，对于某些实施方式，测试样品可包括相对低浓度的微生物，特别是金黄色葡萄球菌。这种相对低的浓度包括，例如，小于约每毫升微生物5×104菌落形成单位(“cfu”)  (cfu/ml)，小于约5×103cfu/ml，小于约1000cfu/ml，甚至低至约500cfu/ml。如金黄色葡萄球菌的微生物也可在高水平下被检测，例如高达5×107cfu/ml的范围。
适当的溶解剂包括，例如酶如溶葡萄球菌素，溶解酵素，肽键内切酶，N-乙酰胞壁酰-L-丙胺酸酰胺酶，endo-β-N-acethylglucosaminidase，和ALE-I。如果需要，可使用各种酶的组合。溶葡萄球菌素在检测金黄色葡萄球菌存在的方法中特别有用。
其他溶解剂包括盐(例如chaotrophic盐)，增溶剂(如洗涤剂)，还原剂(如DTT，DTE，半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)，酸(如HCl)，碱(如，NaOH)。如果需要，可使用这些溶解剂的不同组合。
一个例子是，如果存在金黄色葡萄球菌，则可分析测试样品中溶菌细胞蛋白质A，其是金黄色葡萄球菌的表征，并可用固定在生物传感器表面上的蛋白质A特定抗体检测。此外，溶菌细胞，如金黄色葡萄球菌从细胞内部部分(相对于细胞的细胞壁部分)释放出蛋白质标记物。这种蛋白质标记物可通过探测物如抗体检测到。
该测试样品和探测物可以各种适当的方式结合。在一个方面，以任何顺序将探测物提供到传感器上，测试样品作为分离部分提供到比色传感器上。例如，表面可用含有纤维蛋白原的溶液涂覆，并任选进行干燥。在另一个方面，将测试样品和探测物混合成混合物，并将该混合物提供到比色传感器上。在一个优选实施方式中，在与比色传感器接触之前，探测物与含测试样品的分析物相互作用。
本发明的方法有利地具有改进的敏感性。如在下面实施例中进一步描述的，可以每毫升5×104菌落形成单位(“cfu”)，5×103cfu/ml，5×102cfu/ml的浓度检测金黄色葡萄球菌。因而，本领域普通技术人员可知本发明的方法可用于在低至5×102cfu/ml的浓度下(例如任何增量为10cfu/ml的在上述浓度范围内的具体浓度)检测目标分析物。也同样可在高水平下检测目标分析物，范围高达5×107cfu/ml。
或者，作为其补充，本发明的方法还可有利地产生改进的检测速率。本文使用的装置能在相对短的时间内检测分析物。例如，可在小于120分钟(例如90分钟，60分钟，30分钟，10分钟)内检测上述任何浓度的金黄色葡萄球菌。
应用
本发明由公开的联乙炔混合物形成的比色传感器可用于各种需要成本经济、稳定、精确、一致和快速判断的实验室外设定应用。应用包括床边检验(point-of-care testing)，室内检验诊断，空气或水携带的病原体和VOC的军用和工业检测，和食品加工。
在一个实施方式中，比色传感器可用于检测生理体液中的革兰氏阴性细菌，以诊断感染的存在。例如，在尿液中存在革兰氏阴性细菌是尿路感染的标志。通过溶液或基材上涂层的颜色变化，包括本发明的聚联乙炔组装的比色传感器可指示生理体液中革兰氏阴性细菌如金黄色葡萄球菌的存在。
在某些实施方式中，本发明的比色传感器可与其他已知的诊断方法配合，以提供细菌或其他分析物存在的多重(multi-prong)确定。
在一个实施方式中，本发明的比色传感器可与伤口敷料协同使用，以检测感染的存在。该传感器可结合到敷料中作为层，直接或间接与伤口接触。还可将传感器在使用过程中插入到敷料中。或者，可设想一种敷料结构，其中通过如在美国专利6,420,622B1中记载的那些微流体通道，可将伤口渗出物从伤口引至敷料不与伤口接触的设置有传感器的部分。该传感器还可通过分析从伤口拭子提取的分析物而在伤口评定中用于独立诊断。
在转移到适当的载体上之前，可不用通过常规LB(Langmuir-Blodgett)法成膜而得到包括聚联乙炔组装的传感器。或者可利用如在A.Ulman，An Introduction to Ultrathin Organic Films，Academic Press，New York(1991)，pp.101-219中记载的已知LB方法在基材上形成聚联乙炔组装。
本发明可在一次性粘合剂产品中提供生物传感能力。该传感器自含，不需要使用另外的仪器传送可测量的结果。或者，使用其他分析仪器可进一步增强灵敏度，如在分析物检测后形成荧光“红”相的荧光。当希望检测特定分析物的开始存在时，传感器作用在于提供快速的筛选装置，即小于30分钟，并优选小于15分钟。此外，本发明的传感器是一次性的并相对便宜。
在本发明的一个实施方式中，所述比色传感器包括溶液中由引入聚联乙炔组装内的受体形成的转导物。该溶液可在样品瓶体系中提供，分析物直接加入含溶液的瓶中，该溶液具有感兴趣的分析物的特定转导物。或者，所述比色传感器可包括试剂盒中的多个小瓶，各小瓶含有包括转导物的聚联乙炔组装，其中的聚联乙炔具有对不同分析物引入的特定受体。对于其中分析物不能直接加入聚联乙炔转导物的应用，可使用两部分的小瓶系统。小瓶的一个隔室可含有用于分析物样品制备的试剂，第二隔室含有由聚联乙炔组装形成的转导物，第一和第二隔室物理分隔开。一旦完成样品制备，可除去分隔隔室的物理屏障，使分析物与转导物混合用于检测。
然后可将制备的比色传感器涂覆到固体基材上，或者通过点涂基材并使水蒸发，或者通过适当孔径的膜将悬浮液挤出，截留聚联乙炔组装和在涂覆的膜上得到，其随后进行干燥。适当的膜通常具有的孔径为200nm或更小，包括材料如聚碳酸酯，尼龙，PTFE，聚乙烯(可列出其他的)。或者可用联乙炔组装的聚合悬浮液涂覆这些基材，或者可将悬浮液以未聚合形式涂覆在这些基材上并随后在涂覆状态下聚合。
在本发明的另一个实施方式中，比色传感器是如图1所示的带或标签形式的快速指示器。图1给出了涂覆有压敏粘合剂20的带或标签10和涂覆在基材40上的转导物30。本发明适用的基材其特征可在于如美国申请公开2004-0132217-A1记载的那样通过利用millli-Q(微孔)水和二碘甲烷(Aldrich)的接触角测量。
基材40可包括高平基材，例如在原子级平整硅(111)晶片，原子级平整硅(111)晶片，或浮法玻璃上的蒸发的金，其是裸露的并用自组装单分子层(SAMs)改性以系统方式改变它们的表面能；或具有高织构外观的基材，其包括纸基材，聚合吸墨涂层，结构化的聚合膜，微孔膜和膜材料。
在本发明的一个在干燥时保持聚联乙炔组装的原始“蓝”相的实施方式中，用二碘甲烷基材40表现出低于50°的前进接触角。该情况对应于特征在于表面能大于40dynes/cm的色散组分的基材。在一个选择性实施方式中，具有与水的前进接触角小于90°的这些性能的基材产生含有蓝相和红相混合物的干燥涂层。该情况对应于其中表面能色散组分可小于40dynes/cm但表面能极性组分至少大于10dynes/cm的表面。
再次参考图1，可将压敏粘合剂20附着到带或标签10用于直接检测分析物的表面上。压敏粘合剂20与含聚联乙炔组装的转导物30隔离，以潜在地最小化负面影响。在图1中，压敏粘合剂20包围位于带或标签10中心部位的转导物30。在一个选择性的实施方式中(未给出)，将压敏粘合剂和转导物结合。
任选地，在带或标签10不含压敏粘合剂20的侧面上，带或标签10将含有转导物窗。该窗将在转导物30下居中，以允许使用者不必从含分析物的表面移开带或标签10即可观察颜色变化。
在图2中，带或标签10以排列111给出，排列111由多个转导物112，113，114，115，和116组成。转导物112，113，114，115，和116由相同或不同的聚联乙炔组装形成，其中各聚联乙炔组装引入相同或不同的受体。通过改变转导物112，113，114，115，和116，可将排列111设计用于检测不同浓度水平下的多种分析物。或者，转导物112，113，114，115的任一个可用选择性的诊断测试替代。本发明预期的其他实施方式在序列号为10/738,573的美国专利中提供。
对于需要分析物样品制备的应用，试剂盒可包括在与涂覆在二维基材上的比色传感器接触前，用于试剂贮存和分析物混合的小瓶。在一个实施方式中，该试剂盒可包括用于试剂贮存和分析物制备的小瓶，该小瓶具有含涂覆在基材上的本发明转导物的帽系统。
实施例
不应认为本发明受限于下面的特定实施例，而应理解所附的权利要求清楚限定并覆盖了本发明的所有方面。对于本发明本说明书面向的本领域技术人员，本发明的各种改变，等同方法以及可应用的多种结构是显而易见的。除非另外指明，在实施例和说明书其他部分中的所有份数、百分比、比例等单位为摩尔。所有未指明供应者的溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical；Milwaukee，WI。通过使用U-V Milli-Q净水器以18.2兆欧/厘米的电阻率(Millipore，Bedford MA)净化水。
利用数字相机拍摄的图片确定比色响应(CR)。利用Adobe SystemsIncorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，SanJose，CA)扫描图片，得到各个聚联乙炔传感器测试的RGB(红，绿，蓝)信道值。通过方程CR＝((PR初始-PR样品)/PR初始)得到红和蓝信道值，其中PR＝样品红色值的百分数，并通过方程PR＝R值/(R值+B值)*100得到，其中R值和B值分别对应于聚联乙炔传感器的红色和蓝色信道值。
缩略表
   缩写或商品名   说明
   ATCC   American Type Culture Collection
DMPC   1，2-二豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酯酰胆碱(DMPC，分子量(F.W.)678，可得自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)
HEPES   N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，可得自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO
咪唑缓冲溶液   30mM咪唑，125mM氯化钠，0.1％(w/v)水中的叠氮化钠，可购自SigmaDiagnostics，cat.No I2900
PBS缓冲液   磷酸缓冲盐(PBS)溶液，通过10倍稀释10xPBS浓缩液(得自EMD Biosciences，SanDiego CA)制备
PBS L64缓冲液   通过使用PBS缓冲溶液并加入0.2％(w/v)的PLURONIC L64制备
PLURONIC L64   可得自BASF Corporation，Mount Olive，NJ的表面活性剂的商品名
   双炔廿三酸(Tricosadiynoic acid) 可得自GFS Chemicals(Powell，OH)
制备实施例1-联乙炔脂质体悬浮液的制备
如在美国专利申请公开2004/0132217的实施例6中那样，制备联乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3。基本步骤包括使5，7-十二烷二炔-1，12-二醇(HO(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4OH)与肉豆蔻酰氯反应，并使其产物随后与琥珀酐反应得到联乙炔，
HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3，为白色固体。
联乙炔化合物
HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3
(琥珀酸单(12-十四烷酰氧-十二-5，7-二炔基)酯)和两性离子磷脂1，2-二豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酯酰胆碱(DMPC，分子量(F.W.)678，可得自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的(6∶4)混合物称重加入玻璃小瓶中并悬浮在N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液(5mM，pH7.2)中，以制得1mM溶液。然后利用Misonix XL202探针近距离声波定位器(可商购自Misonix Inc.，Farmington，NY)探针超声波处理该溶液2分钟，并置于4℃冰箱内约20小时。该方法导致形成稳定的脂质体悬浮液。
制备实施例2-联乙炔脂质体悬浮液的聚合
在制备实施例1中制备的悬浮液通过1.2μm针筒滤膜过滤，并通过在254nm的UV灯(可商购自VWR Scientific Products；West Chester，PA)下在3cm距离处照射样品10分钟而聚合，导致观察到形成蓝色。
制备实施例3-联乙炔脂质体悬浮液涂覆样品的制备
将制备实施例1中制得的悬浮液涂覆在具有200(nm)孔径的25(mm)直径的多孔聚碳酸酯膜(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)上，以制备比色检测器样品。利用如下的手持挤出方法涂覆膜。将待涂覆的聚碳酸酯膜置于手持挤出系统的不锈钢室内，商品名为LIPOFAST，可得自Avestin，Inc.(Ottawa，Canada)。该膜覆盖TEFLON基底的底部O环。小心避免使膜出现弯曲和/或褶皱。将TEFLON O环块的顶部置于膜顶上的不锈钢罩内。然后通过用手盖紧不锈钢帽而密封该室。将联乙炔脂质体悬浮液注入气密式注射器((Hamilton 500-微升(μl))中，并连到基底上，并将第二注射器连接到另一个帽上。用恒定的均匀压力迫使第一注射器的脂质体缓慢通过该室。
捕获表面上的脂质体的膜允许清澈的缓冲液缓慢流过并流入第二注射器。该操作认为是1遍涂覆。在该实施例中用作检测器的膜样品采用2遍涂覆。第二遍与第一遍类似，通过施加第二个0.5毫升(ml)部分的脂质体到已经涂覆的膜上。将含有过滤的缓冲液的第二注射器除去，弃去内容物。卸掉不锈钢端帽并除去TEFLON O环块。取出湿膜并将涂覆侧向上置于载玻片上，并置于5℃冰箱内至少3小时。然后在含有CaSO4的干燥器中干燥30分钟，并暴露于254纳米(nm)的UV光下30～90秒。
将PDA涂覆的基材(25毫米(mm)环)切成四等分。各个四分之一样品用作实验样品。
制备实施例4-磷酸缓冲盐(PBS缓冲溶液)的制备
通过10倍稀释10x的PBS浓缩液(可商购自EMD Biosciences，SanDiego CA)而制备磷酸缓冲盐(PBS)溶液。这使得PBS缓冲溶液具有以下的盐组成，10mM磷酸钠，137mM氯化钠，2.7mM氯化钾。25℃下PBS缓冲溶液的pH为7.5。
制备实施例5-用PLURONIC L64(PBS L64缓冲溶液)制备磷酸缓冲盐
通过利用如在制备实施例4中制备的PBS缓冲溶液并加入0.2％(w/v)的PLURONIC L64表面活性剂(可得自BASF Corporation，MountOlive，NJ)而制备PBS L64缓冲溶液。PBS L64缓冲溶液在25℃下的pH为7.5。
制备实施例6-金黄色葡萄球菌悬浮液的制备
从The American Type Culture Collection(Rockville，MD)以商品名″ATCC 25923.″得到金黄色葡萄球菌。使通过将细菌接种在5-10毫升配制好的无菌胰蛋白酶大豆琼脂(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)而制备的过夜(37℃下17-22小时)肉汤培养基中使细菌生长。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm下15分钟，在Eppendorf型数字5804R离心机(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中)，并再悬浮到PBS L64缓冲液中并用该溶液离心洗涤另外3个循环。
制备实施例7-表皮葡萄球菌悬浮液的制备
从The American Type Culture Collection(Rockville，MD)以商品名″ATCC 12228.″得到表皮葡萄球菌。使通过将细菌接种在5-10毫升配制好的无菌胰蛋白酶大豆琼脂(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)而制备的过夜(37℃下17-22小时)肉汤培养基中使细菌生长。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm下15分钟，在Eppendorf型数字5804R离心机(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中)，并再悬浮到PBS L缓冲液中并用该溶液离心洗涤另外3个循环。
制备实施例8-埃西氏大肠杆菌悬浮液的制备
从The American Type Culture Collection(Rockville，MD)以商品名″ATCC 25922.″得到埃西氏大肠杆菌。使通过将细菌接种在5-10毫升配制好的无菌胰蛋白酶大豆琼脂(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)而制备的过夜(37℃下17-22小时)肉汤培养基中使细菌生长。离心洗涤培养基(8,000-10,000rpm下15分钟，在Eppendorf型数字5804R离心机(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中)，并再悬浮到HEPES缓冲液中并用该溶液离心洗涤另外3个循环。
实施例1-纤维蛋白原蛋白质探测物的溶液相检测
将来自人血浆的纤维蛋白原(得自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No FR4129)溶于浓度为0.5％(w/v)的咪唑缓冲液中。将咪唑缓冲溶液(100μl)中的纤维蛋白原与100μl按照制备实施例2制得的蓝色聚联乙炔脂质体溶液混合。同样制备包括不含纤维蛋白原的100μl咪唑缓冲溶液和100μl按照制备实施例2制得的蓝色聚联乙炔脂质体溶液的对比样品。尽管在最初的20分钟内两个样品均从蓝色变为红色，而含有纤维蛋白原的悬浮液样品在总的30分钟内继续絮凝并随后沉淀。在整个观察时间内对比样品的悬浮保持稳定。
实施例2-兔子抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物的溶液相检测
将兔子抗金黄色葡萄球菌IgG抗体(得自Accurate Chemical andScientific Corporation，Westbury，NY，cat.No.YVS6881)溶于100μg/ml浓度的咪唑缓冲溶液中。将在缓冲溶液(100μl)中的抗体与100μl的蓝色聚联乙炔脂质体溶液(按照制备实施例2制备)混合。同样制备包括不含抗体的100μl咪唑缓冲溶液和100μl蓝色聚联乙炔脂质体溶液(按照制备实施例2制备)的对比样品。尽管在最初的30分钟内两个样品均从蓝色变为红色，而含有抗体的悬浮液样品在24小时后继续絮凝并随后沉淀。在整个观察时间内对比样品的悬浮保持稳定。
实施例3-在金黄色葡萄球菌和PBS L64缓冲溶液的存在下纤维蛋白原蛋白质探测物的溶液相检测
将如实施例1制备的咪唑缓冲溶液(100μl)中的纤维蛋白原与100μl的蓝色聚联乙炔脂质体溶液(按照制备实施例2制备)，和100μl按照制备实施例6制备的含有106cfu/ml的金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液混合。同样通过混合100μl咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原，100μl的蓝色聚联乙炔脂质体溶液，和100μl不含金黄色葡萄球菌的PBSL64缓冲溶液而制备对比样品。在30分钟内两个样品均从蓝色变为红色，但与实施例1相反的是两个样品在24小时的观察期内均保持稳定。
实施例4-在金黄色葡萄球菌和PBS L64缓冲溶液存在下兔子抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物的溶液相检测
将按照制备实施例2制备的蓝色聚联乙炔脂质体溶液与按照实施例2制备的在咪唑缓冲溶液中的抗体和按照制备实施例6制备的含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液混合，使用三种不同的组合：
样品4A-100μl蓝色聚联乙炔脂质体溶液+100μl在咪唑缓冲溶液中的抗体+100μl含有107cfu/ml的金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液。
样品4B-100μl蓝色聚联乙炔脂质体溶液+100μl在咪唑缓冲溶液中的抗体+100μl不含细菌的PBS缓冲溶液。
样品4C-100μl蓝色聚联乙炔脂质体溶液+100μl不含抗体的咪唑缓冲溶液+100μl不含细菌的PBS缓冲溶液。
下表1中记录了45分钟后样品的颜色
表1
    样品     45分钟时的颜色
    4A     紫色
    4B     淡红
    4C     红色
实施例5-利用聚联乙炔涂覆样品的纤维蛋白原蛋白质探测物检测
按照制备实施例3制备的三个聚联乙炔涂覆基材置于24孔微滴板的孔底(可商购自Corning Incorporated，Corning NY，cat.No 3524，商品名COSTAR)，加入下列溶液：
样品5A-250μl按照实施例1制备的在咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl PBS L64缓冲溶液。
样品5B-250μl在咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl按照制备实施例6制备的含有107cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品5C-250μl在咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl按照制备实施例7制备的含有107cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
各样品从蓝色变到红色所需的时间记录在下面表2中。
表2
    样品     变红的时间(分钟)
    5A     2
    5B     15
    5C     5
实施例6-利用在咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原蛋白质探测物在不同浓度下PBS L64缓冲溶液中的金黄色葡萄球菌的检测
将6个按照制备实施例3制备的聚联乙炔涂覆基材置于24孔微滴板中分离孔的底部。按照实施例1制备的在咪唑缓冲溶液中的纤维蛋白原(250μl)与250μl按照制备实施例6制备的含有金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液混合，得到含有各种浓度细菌的系列样品混合物。细菌浓度在下面表3中列出。涡旋搅拌不同的样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔中。在Eberbach Model6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在6分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件扫描照片。如上述确定比色响应(CR)。下面表3中的数据记录了作为细菌浓度函数的比色响应。
表3
样品     金黄色葡萄球菌浓度(cfu/ml)     比色响应(红色部分)
    6A     0     2.4
    6B     100     2.4
    6C     1000     2.4
    6D     10000     1.8
    6E     100000     1.6
    6F     1000000     1.4
实施例7-利用抗体-链霉亲和素缀合蛋白质探测物和聚联乙炔的涂覆样品测定PBS L64缓冲溶液中的金黄色葡萄球菌
将2个按照制备实施例3制备的聚联乙炔涂覆基材置于24孔微滴板中分离孔的底部。按照以下方式制备链霉亲和素缀合的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物。将链霉亲和素缀合抗体溶解在咪唑缓冲溶液中，浓度为100μg/ml。
然后制备以下样品溶液：
样品7A-250μl在咪唑缓冲溶液中的链霉亲和素缀合抗体+按照制备实施例4制备的250μl PBS缓冲溶液。
样品7B-250μl在咪唑缓冲溶液中的链霉亲和素缀合抗体+250μl按照制备实施例6制备的在PBS缓冲溶液含有106cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS缓冲溶液。
涡旋搅拌溶液并在混合后使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔传感器的分离孔中。在Eberbach Model 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。下面表4记录各个传感器从蓝色变为红色所需的时间。
表4
    样品     变红的时间(分钟)
    7A     9
    7B     20
实施例8-利用抗体-生物素缀合蛋白质探测物利用聚联乙炔的涂覆样品检测链霉亲和素
将4个按照制备实施例3制备的聚联乙炔涂覆基材置于24孔微滴板中分离孔的底部。将生物素缀合的鼠抗蛋白A IgG单克隆抗体(可商购自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No 13-3150)蛋白质探测物溶于PBS缓冲溶液中，浓度为100μg/ml。将链霉亲和素(可商购自JacksonImmuno Research，West Grove，PA，Cat.No 016-050-084)溶解在PBS缓冲溶液中，浓度为100μg/ml
然后制备以下样品溶液：
样品8A-300μl咪唑缓冲溶液
样品8B-150μl咪唑缓冲溶液+150μl在PBS缓冲溶液中的链霉亲和素。
样品8C-100μl咪唑缓冲溶液+100μl在PBS缓冲溶液中的链霉亲和素+100μl在PBS缓冲溶液中的生物素缀合的抗体。
样品8D-150μl咪唑缓冲溶液+150μl在PBS缓冲溶液中的生物素缀合的抗体。
涡旋搅拌溶液并在混合后使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔传感器的分离孔中。在Eberbach Model 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。下面表5记录各个传感器从蓝色变为红色所需的时间。
表5
    样品     变红的时间(分钟)
    8A     13
    8B     9
    8C     6
    8D     13
实施例9-利用PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原蛋白质探测物检测PBS L64缓冲溶液中不同浓度的金黄色葡萄球菌
将6个按照制备实施例3制备的聚联乙炔涂覆基材置于24孔微滴板中分离孔的底部。以0.5％(w/v)的浓度将纤维蛋白原溶于PBS L64缓冲溶液中。类似的，还以0.05％(w/v)的浓度将纤维蛋白原溶于PBSL64缓冲溶液中。
制备以下样品溶液：
样品9A-250μl浓度为0.5％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl不含细菌的PBS L64缓冲溶液
样品9B-250μl浓度为0.5％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl按照制备实施例6制备的含有103cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9C-250μl浓度为0.5％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl含有105cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9D-250μl浓度为0.05％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl不含细菌的PBS L64缓冲溶液。
样品9E-250μl浓度为0.05％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl含有103cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
样品15F-250μl浓度为0.05％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl含有105cfu/ml金黄色葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
为比较目的，还制备两个另外的样品：
样品9G-250μl浓度为0.5％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl按照制备实施例7制备的含有105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBSL64缓冲溶液。
样品9H-250μl浓度为0.05％的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原+250μl含有105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64缓冲溶液。
涡旋搅拌不同样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔中。在Eberbach Model 6000振荡器(EberbachCorp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在30分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表6记录了这些样品的比色响应(CR)。
表6
样品 纤维蛋白原浓度(％w/v在PBSL64缓冲溶液中) 细菌类型 细菌浓度(cfu/ml) 比色响应(红色部分)
    9A     0.5 无     0     2.3
    9B     0.5 金黄色葡萄球菌     1000     2.1
    9C     0.5 金黄色葡萄球菌     100000     0.9
    9D     0.05 无     0     3.3
    9E     0.05 金黄色葡萄球菌     1000     2.7
    9F     0.05 金黄色葡萄球菌     100000     1.6
    9G     0.5 表皮葡萄球菌     100000     3.1
    9H     0.05 表皮葡萄球菌     100000     3.2
实施例10-利用PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原蛋白质探测物检测临床样品中的整个金黄色葡萄球菌
收集6个患者的鼻咽拭子样品，从每个患者收集2个拭子共12个样品。通过用无菌人造纤维拭子(可以商品名″Pure-Wraps″商购自Puritan，East Grinstead，UK)擦拭患者的前鼻腔而得到鼻咽拭子样品。通过将人造纤维拭子插入取样对象鼻腔的前端，并沿鼻孔的粘膜表面旋转该拭子两个完整的一周进行取样。用1mlPBS L64缓冲溶液洗提各个拭子样品。利用按照制备实施例3制备的涂覆的聚联乙炔传感器分析6个患者各自的一个样品。用1ml PBS L64缓冲溶液洗提同一患者的第二样品并培养，以得到在下面表7中记录的用于比较的菌落计数。这些样品的培养步骤遵循在The Staphylococci in Human Disease；Crossley，K.B.and Archer，G.L.editors，Churchill Livingston，NY，1997，pp.233-252.中概括记载的方法。通过混合250μl浓度为0.5％(w/v)的在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原和250μl由各个患者拭子洗提的溶液而制备待用聚联乙炔传感器分析的样品。涡旋搅拌样品溶液并使其静置5分钟，然后置于聚联乙炔涂覆的传感器上，其置于24孔微滴板中分离孔的底部。在Eberbach Model 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在45分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表7记录了作为细菌浓度函数的比色响应。
表7
拭子样品     培养菌落计数(cfu)     比色响应(红色部分)
    10A     0     1.3
    10B     25     1.2
    10C     631     0.9
    10D     1995     0.9
    10E     39811     0.7
    10F     125892     0.7
实施例11-利用PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原蛋白质探测物检测临床样品中的细胞溶解金黄色葡萄球菌
收集5个患者的鼻咽拭子样品，从每个患者收集2个拭子共10个样品。如实施例10得到样品。利用按照制备实施例3制备的涂覆聚联乙炔传感器分析5个患者各自的一个样品。用1ml PBS L64缓冲溶液洗提同一患者的第二样品并培养，以得到如实施例10所述的菌落计数。用如下制备的聚联乙炔传感器分析样品。首先，通过混合等体积的浓度为3μg/ml的由PBS L64缓冲溶液中的溶葡萄球菌素(目录号L-4402，Sigma-Aldrich)组成的细胞溶解缓冲溶液而溶解在1ml洗提的拭子样品中存在的金黄色葡萄球菌。其次，将250μl的溶解溶液与浓度为0.5％(w/v)的溶解在PBS L64缓冲溶液中的纤维蛋白原混合。涡旋搅拌样品溶液并使其静置5分钟，然后置于聚联乙炔涂覆的传感器上，其置于24孔微滴板中分离孔的底部。在Eberbach Model 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在42分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表8记录了作为细菌浓度函数的比色响应。
表8
拭子样品     培养菌落计数(cfu)     比色响应(红色部分)
    11A     0     1.0
    11b     63     0.9
    11C     160     1.2
    11D     7940     1.4
    11E     40000     2.0
实施例12-利用PBS L64缓冲溶液中的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物检测临床样品中的细胞溶解金黄色葡萄球菌
收集6个患者的鼻咽拭子样品，从每个患者收集2个拭子共12个样品。如实施例10进行取样。利用按照制备实施例3制备的涂覆聚联乙炔传感器分析6个患者各自的一个样品。用1ml PBS L64缓冲溶液稀释同一患者的第二样品并培养，以得到如下表9记录的用于比较的菌落计数。用如在实施例10中所述进行培养步骤。如下制备待用聚联乙炔传感器分析的样品。首先，通过混合等体积的浓度为3μg/ml的由PBSL64缓冲溶液中的溶葡萄球菌素(目录号L-4402，Sigma-Aldrich)组成的细胞溶解缓冲溶液而溶解在1ml稀释的拭子样品中存在的金黄色葡萄球菌。其次，将250μl的溶解溶液与250μl浓度为100μg/ml的溶解在PBS L64缓冲溶液中的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体(得自AccurateChemicals)混合。涡旋搅拌样品溶液并使其静置5分钟，然后置于聚联乙炔涂覆的传感器上，其置于24孔微滴板中分离孔的底部。在EberbachModel 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在20分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表9记录了作为细菌浓度函数的比色响应。
表9
拭子样品     培养菌落计数(cfu)     比色响应(红色部分)
    12A     0     1.3
    12B     954     1.4
    12C     724     1.4
    12D     2089     1.2
    12E     6918     1.0
    12F     47863     1.0
实施例13-利用PBS L64缓冲溶液中的兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物在用于细胞溶解金黄色葡萄球菌与整个金黄色葡萄球菌比较的聚联乙炔涂层传感器的检测效率对比
将在制备实施例1中制备的(60/40)联乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3和1，2-二豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酯酰胆碱(DMPC)制剂涂覆在具有200nm孔径的25mm直径的多孔聚碳酸酯膜上(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)以制备比色检测器样品。如制备实施例3所述制备检测器样品。
将聚联乙炔涂层基材(25毫米(mm)环)切成4等份。每一四分之一样品用作实验样品。将基材置于24孔微滴板的分离孔中。通过混合含有完整金黄色葡萄球菌ATCC 25923的250μl PBS L64缓冲溶液和250μl的抗体溶液而制备完整细菌的样品溶液。抗体溶液含在PBS L64缓冲溶液中浓度为100μg/ml的兔抗金黄色葡萄球菌(目录号YVS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)。利用PBS L64缓冲溶液中的浓度为3微克/毫升的溶葡萄球菌素(可商购自Sigma-Aldrich，目录号L-4402)组成的溶菌缓冲溶液制备含有在PBS L64缓冲溶液中溶解的金黄色葡萄球菌ATCC 25923样品。
溶解的细菌样品溶液由250μl在PBS L64中的溶解金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和250μl如上述制备的抗体溶液混合组成。如下表10中记录的那样，测试样品中使用的细菌浓度在0～105cfu/ml之间变化。允许细菌和抗体溶液的混合物静置5分钟，然后加到含有聚联乙炔涂覆基材的24孔板之上。同样制备对照样品用于比较。如上述制备不含细菌且仅由250μl PBS L64缓冲液和250μl抗体溶液混合组成的对照样品。
利用数字相机每5分钟拍照。利用Adobe Systems Incorporated(SanJose，CA)的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0)扫描照片。下面表10中的数据表示在15分钟时测得的对照样品和含细菌样品(或者是完整的或者是溶解的)之间的比色响应间的不同。
表10
  细菌浓度(cfu/ml)   完整细菌的对照比色响应差(△红色部分) 溶解细菌的对照比色响应差(△红色部分)
    0     0     0
    1 00     0.05     0.17
    1,000     0.05     0.58
    10,000     0.05     0.52
    100,000     0.04     0.64
实施例14-缓冲溶液组成对利用兔抗金黄色葡萄球菌IgG抗体蛋白质探测物和涂覆的聚联乙炔传感器检测溶解的金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响。
将如制备实施例3所述制备的32个聚联乙炔涂覆的基材置于24孔微滴板分离孔的底部。
制备以下的样品溶液：
样品14A-500μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
样品14B-400μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+100μl的HEPES缓冲溶液。
样品14C-350μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+150μl的HEPES缓冲溶液。
样品14D-300μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+200μl的HEPES缓冲溶液。
样品14E-250μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+250μl的HEPES缓冲溶液。
样品14F-200μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+300μl的HEPES缓冲溶液。
样品14G-150μl如实施例2所述制备的抗体的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+350μl的HEPES缓冲溶液。
样品14H-具有浓度为100μg/ml的兔抗金黄色葡萄球菌(目录编号YVS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)的500μl HEPES溶液，且该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
同样还制备系列的对照样品溶液，所述样品溶液除不含完整或溶解的细菌外，与样品14A-14H的组成相同。
涡旋搅拌不同的样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔内。在Eberbach Model 6000振荡器(EberbachCorp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在40分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表11中的数据表示在15分钟测得的对照样品和含细菌(完整或溶解的)样品之间的比色响应的差。
表11
样品溶液 PBS缓冲溶液的体积(μl) HEPES缓冲溶液的体积(μl) 有效的缓冲液离子强度(mM)   在103cfu/ml完整细菌的对照比色响应差(△红色部分) 在103cfu/ml溶解细菌的对照比色响应差(△红色部分)
  14A     500     0     150     0.2     0.6
  14B     400     150     121     0.3     0.8
  14C     350     200     106.5     0.6     1.1
  14D     300     300     92     2.0     2.0
  14E     250     250     77.5     2.1     1.2
  14F     200     200     63     0.6     0.9
  14G     150     150     48.5     0.7     1.0
  14H     0     500     5     0     0
实施例15-缓冲溶液组成对利用高浓度的纤维蛋白原蛋白质探测物和涂覆的聚联乙炔传感器检测溶解的金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响。
将如制备实施例3所述制备的32个聚联乙炔涂覆的基材置于24孔微滴板分离孔的底部。
制备以下的样品溶液：
样品15A-500μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
样品15B-400μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+100μl的HEPES缓冲溶液。
样品15C-350μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+150μl的HEPES缓冲溶液。
样品15D-300μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+200μl的HEPES缓冲溶液。
样品15E-250μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+250μl的HEPES缓冲溶液。
样品15F-200μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+300μl的HEPES缓冲溶液。
样品15G-150μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+350μl的HEPES缓冲溶液。
样品15H-具有浓度为0.5％(w/v)的纤维蛋白原(可得自Sigma，cat.No FR4129，Lot#083K7604)的500μl HEPES缓冲溶液，且该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
在所有15-15H的样品溶液中，以0.5％(w/v)的浓度将纤维蛋白原溶于缓冲溶液中。同样还制备系列的对照样品溶液，所述样品溶液除不含完整或溶解的细菌外，与样品15A-15H的组成相同。
涡旋搅拌不同的样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔内。在Eberbach Model 6000振荡器(EberbachCorp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在40分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。确定比色响应(CR)。下面表12中的数据表示在15分钟测得的对照样品和含细菌(或者是完整或者是溶解的)样品之间的比色响应的差。
表12
样品溶液 PBS缓冲溶液的体积(μl) HEPES缓冲溶液的体积(μl) 有效的缓冲液离子强度(mM) 在103cfu/ml完整细菌的对照比色响应差(△红色部分) 在103cfu/ml溶解细菌的对照比色响应差(△红色部分)
  15A     500     0     150     -1.2     NA
  15B     400     150     121     -0.3     0.3
  15C     350     200     106.5     1.0     0.5
  15D     300     300     92     1.4     0.8
  15E     250     250     77.5     0.4     0.7
  15F     200     200     63     0.9     0.4
  15G     150     150     48.5     0.2     0.4
  15H     0     500     5     0     0
实施例16-缓冲溶液组成对利用低浓度的纤维蛋白原蛋白质探测物和涂覆的聚联乙炔传感器检测溶解的金黄色葡萄球菌和完整金黄色葡萄球菌的影响。
将如制备实施例3所述制备的32个聚联乙炔涂覆的基材置于24孔微滴板分离孔的底部。
制备以下的样品溶液：
样品16A-500μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
样品16B-400μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+100μl的HEPES缓冲溶液。
样品16C-350μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+150μl的HEPES缓冲溶液。
样品16D-300μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+200μl的HEPES缓冲溶液。
样品16E-250μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+250μl的HEPES缓冲溶液。
样品16F-200μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+300μl的HEPES缓冲溶液。
样品16G-150μl纤维蛋白原的PBS L64缓冲溶液，该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌+350μl的HEPES缓冲溶液。
样品16H-具有浓度为0.05％(w/v)的纤维蛋白原(可得自Sigma，cat.No FR4129，Lot#083K7604)的500μl HEPES缓冲溶液，且该溶液或者含有103cfu/ml完整的金黄色葡萄球菌或者含有103cfu/ml通过按照实施例11给出的溶解步骤得到的溶解金黄色葡萄球菌。
在所有16A-16H的样品溶液中，以0.05％(w/v)的浓度将纤维蛋白原溶于缓冲溶液中。同样还制备系列的对照样品溶液，所述样品溶液除不含完整或溶解的细菌外，与样品16A-16H的组成相同。
涡旋搅拌不同的样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔内。在Eberbach Model 6000振荡器(EberbachCorp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在40分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。下面表13中的数据表示在15分钟测得的对照样品和含细菌(或者是完整或者是溶解的)样品之间的比色响应的差。
表13
样品溶液 PBS缓冲溶液的体积(μl) HEPES缓冲溶液的体积(μl) 有效的缓冲液离子强度(mM)   在103cfu/ml完整细菌的对照比色响应差(△红色部分)   在103cfu/ml溶解细菌的对照比色响应差(△红色部分)
  16A     500     0     150     -1.2     NA
  16B     400     150     121     -0.6     0.3
  16C     350     200     106.5     0.5     0.5
  16D     300     300     92     1.5     0.8
  16E     250     250     77.5     1.4     1.1
  16F     200     200     63     1.2     0.8
  16G     150     150     48.5     0.5     0.7
  16H     0     500     5     0     0
实施例17-利用与蛋白质A和涂覆的聚联乙炔传感器预反应的单克隆抗体检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)
MRSA中对抗PBP2′的单克隆IgG1κ抗体与蛋白质A交叉反应。该抗体与蛋白质A预先反应，然后暴露于溶解的MRSA(3M Culturecollection#360)中。按照实施例11进行MRSA的溶解。如实施例13所述在PBS L64中制备溶解的MRSA。在本实施例中使用的溶解细菌的浓度为105和103cfu/ml。使用仅含PBS L64中的溶菌剂而不含细菌对照样品。在HEPES缓冲液中制备浓度为100μg/ml的对抗PBP2′单克隆抗体。同样在HEPES缓冲液中制备浓度为200μg/ml的蛋白质A(Zymed，SanFransisco，CA，catalog#10-1006)。如下面所述使用细菌溶液和含有抗体和蛋白质A的HEPES缓冲液的两种不同组合。
样品17A-对抗PBP2′的单克隆抗体在HEPES缓冲液中的150μl溶液与100μl蛋白质A的HEPES缓冲液混合。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。
然后将样品17A与250μl PBS L64溶液混合，所述PBS L64溶液含有103或105cfu/ml细菌，或是不含细菌的对照样品。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。将如制备实施例3所述涂覆在聚联乙炔膜上的三个PDA样品置于24孔板的底部。用移液管将具有不同浓度细菌的溶液转移到分离孔中。之后追踪蓝色的颜色变化并记录在下面的表14中。
表4
样品溶液     细菌浓度(cfu/ml) 2小时时的颜色
    17A     0     蓝色
    17A     103     紫色
    17A     105     淡红
样品17B-对抗PBP2′的单克隆抗体在HEPES缓冲液中的150μl溶液与50μl蛋白质A的HEPES缓冲液混合。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。
然后将样品17B与300μl PBS L64溶液混合，所述PBS L64溶液含有103或105cfu/ml细菌，或是不含细菌的对照样品。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。将如制备实施例3所述涂覆在聚联乙炔膜上的三个PDA样品置于24孔板的底部。用移液管将具有不同浓度细菌的溶液转移到分离孔中。之后追踪蓝色的颜色变化并记录在下面的表15中。
表15
样品溶液     细菌浓度(cfu/ml) 2小时时的颜色
    17B     0     红色
    17B     103     淡红
    17B     105     蓝色
实施例18-利用单克隆抗体作为蛋白质探测物和涂覆的聚联乙炔传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)
按照实施例11进行MRSA的溶解步骤。如实施例13所述在PBSL64中制备溶解的MRSA。在本实施例中使用的溶解细菌的浓度为105和103cfu/ml。使用仅含PBS L64中的溶菌剂而不含细菌的对照样品。在HEPES缓冲液中制备浓度为100μg/ml的对抗PBP2′单克隆IgGκ抗体。
然后制备以下的样品溶液：
样品18A-对抗PBP2′的单克隆抗体在PBS L64缓冲溶液中的250μl溶液与不含细菌的250μl PBS L64缓冲溶液混合。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。
样品18B-对抗PBP2′的单克隆抗体在PBS L64缓冲溶液中的250μl溶液与含103cfu/ml溶解的MRSA的250μl PBS L64缓冲溶液混合。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。
样品18C-对抗PBP2′的单克隆抗体在PBS L64缓冲溶液中的250μl溶液与含105cfu/ml溶解的MRSA的250μl PBS L64缓冲溶液混合。涡旋搅拌小瓶并使其静置5分钟。
将如制备实施例3所述涂覆在聚联乙炔膜上的三个PDA样品置于24孔板的底部。用移液管将具有不同浓度细菌的溶液转移到分离孔中，并在Eberbach Model 6000振荡器(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在45分钟时用数字相机拍照。利用Adobe SystemsIncorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)扫描照片。在下面表16中记录各个样品的比色响应。
表16
样品溶液     溶解的细菌浓度(cfu/ml)     比色响应(红色部分)
    18A     0     2.1
    18B     103     2.3
    18C     105     3.2
实施例19-利用HEPES缓冲溶液中的多粘菌素蛋白质探测物检测HEPES缓冲溶液中的各种浓度的埃西氏大肠杆菌
将如制备实施例3所述制备的5个聚联乙炔涂覆的基材置于24孔微滴板分离孔的底部。将多粘菌素B硫酸盐(可商购自Aldrich)以26纳摩尔/毫升的浓度溶于HEPES缓冲溶液中。
制备以下的样品溶液：
样品19A-500μl不含细菌的多粘菌素B硫酸盐的HEPES缓冲溶液。
样品19B-500μl如制备实施例8所述制备的含103cfu/ml埃西氏大肠杆菌的多粘菌素B硫酸盐的HEPES缓冲溶液。
样品19C-500μl如制备实施例8所述制备的含105cfu/ml埃西氏大肠杆菌的多粘菌素B硫酸盐的HEPES缓冲溶液。
样品19D-500μl如制备实施例8所述制备的含107cfu/ml埃西氏大肠杆菌的多粘菌素B硫酸盐的HEPES缓冲溶液。
样品19E-500μl如制备实施例8所述制备的含109cfu/ml埃西氏大肠杆菌的多粘菌素B硫酸盐的HEPES缓冲溶液。
涡旋搅拌不同的样品混合物并使其静置5分钟，然后加入含有聚联乙炔涂覆基材的分离孔内。在Eberbach Model 6000振荡器(EberbachCorp.，Ann Arbor，MI)上振摇微滴板。在30分钟时用数字相机拍照。利用Adobe Systems Incorporated的软件(商品名ADOBE PHOTOSHOPversion 5.0，San Jose，CA)扫描照片。确定比色响应(CR)。下面表17中的数据记录了作为细菌浓度函数的比色响应。
表17
样品     埃西氏大肠杆菌的浓度(cfu/ml)     比色响应(红色部分)
    19A     0     2.2
    19B     1000     1.8
    19C     100000     1.2
    19D     10000000     0.8
    19E     1000000000     0.0
实施例20.具有双炔二十三酸的脂质体作为联乙炔
采用制备实施例1的步骤制备具有双炔二十三酸的脂质体。制备(60/40)10，12-双炔二十三酸/1，2-DMPC在5毫摩尔7.2pH的HEPES缓冲液中的样品，以得到10ml溶液用于超声处理和脂质体的形成，该溶液中联乙炔为1mM。在二氯甲烷中分别制备10，12-双炔二十三酸和1，2-DMPC的原液，以使得当将1ml的各溶液蒸发至干燥并在10ml体积的缓冲液中再水合时得到(60/40)10，12-双炔二十三酸/1，2-DMPC复合物，该复合物中的联乙炔为1mM。将该二氯甲烷溶液置于6打兰的小瓶中然后减压在25～30℃温度下旋转蒸发，直至除去有机溶剂。进一步在高真空下(200mTorr)干燥残留物10分钟以除去最后的痕量溶剂。利用10ml的HEPES缓冲液再水合样品。
然后利用Misonix XL202超声波振荡器(可商购自Misonix Inc.，Farmington，NY)对该溶液进行超声波振荡。在系列的超声波功率水平下对这些10ml样品进行振荡。该范围包括3，4，5和6的功率水平，其中功率水平3进行10～20分钟，功率水平4进行2.5～7.5分钟，功率水平5进行1～3分钟，功率水平6进行1～2分钟的长度。对溶液进行超声处理并将它们的外观与McFarland浊度标准比较其混浊程度。0.5级基本是清澈的，4.0是混浊的。将溶液超声处理至1.0～2.0之间的浊度等级。在超声处理后将所有样品冷却至室温(在覆盖状态下)并置于5℃冰箱中20小时以形成囊泡。
在20小时后几个样品形成了可接受的囊泡，其与制备实施例1中的脂质体大小看似类似。然后将这些样品用于进一步的研究。
如制备实施例3涂覆形成灰相脂质体(grey liposome phase)的样品。将所述灰相脂质体涂覆在200nm聚碳酸酯膜上。以每次500μl将每个膜涂覆2，3和4次的厚度。然后在冰箱里干燥它们8小时，然后置于干燥器中过夜。
在254纳米波长的灯下UV曝光所述样品，直至肉眼观察它们变为与制备实施例2中制得的那些样品类似的蓝色(约0.630％蓝色)。对于这些批次发现蓝色的最大％，约0.644％，发生在UV曝光的5-7秒后。这比制备实施例2(在30秒曝光后达到类似的颜色)中的联乙炔要快得多。
将聚合样品切成四片。将样品片置于24孔微滴板的孔底部。按照实施例18的步骤产生样品溶液20A，20B和20C，所述样品溶液含有抗体和0，1000cfu/ml，100,000cfu/ml的细菌水平。将这些溶液暴露到聚合的PDA涂覆样品2次。将滴板置于振摇器上，振摇速度设定为60周/分钟。
监测样品颜色随时间的变化。没有样品变成红色。即使暴露过夜所有的样品也保持蓝色。
认为通过调整缓冲体系和使用两种用于脂质体形成的缓冲体系，可调整响应以用该PDA体系得到变为红色的颜色变化。目前的体系是配制用于用制备实施例1的PDA检测。实施例20的PDA结构的不同足以影响囊泡的表面特性和它们与探测物的相互作用，并要求不同的缓冲体系以得到比色响应。
对于本领域技术人员，不偏离本发明的范围和精神对本发明作出各种改变和变动将是显而易见的。应理解本发明不意欲不当地受限于本文给出的例示性实施方式，这些实施方式仅为举例说明目的，本发明的范围仅由权利要求限定。

Claims (15)

1.一种检测分析物的比色系统，包括：
比色传感器；所述比色传感器包括：
受体；
含至少一种联乙炔化合物的聚合组合物；
其中受体被引入聚合组合物以形成转导物；和
调节分析物和转导物之间的相互作用的缓冲组合物，其中缓冲体系包括两种或更多种不同的缓冲液；
其中转导物在与分析物接触时表现出颜色变化。
2.权利要求1的比色系统，其中的缓冲组合物包括两种或更多种选自HEPES缓冲液，咪唑缓冲液，PBS缓冲液及其组合的缓冲液。
3.权利要求1的比色系统，进一步包括探测物。
4.权利要求1的比色系统，其中探测物选自纤维蛋白原、链霉亲和素，IgG，及其组合。
5.权利要求1的比色系统，进一步包括表面活性剂。
6.权利要求1的比色系统，其中转导物为脂质体。
7.权利要求1的比色系统，其中转导物在与缓冲组合物接触时表现出颜色变化。
8.权利要求1的比色系统，其中缓冲液通过与转导物的离子相互作用而调节分析物的相互作用。
9.权利要求1的比色系统，其中缓冲组合物通过增强与转导物的疏水相互作用而调节分析物的相互作用。
10.权利要求1的比色系统，其中受体包括磷脂。
11.权利要求10的比色系统，其中磷脂选自胆碱磷酸，磷酸乙醇胺，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，及其组合。
12.一种检测分析物的方法，包括
形成比色传感器，所述传感器包括受体和含联乙炔的聚合组合物，其中受体被引入到聚合组合物中以形成能够表现出颜色变化的转导物；
使传感器与探测物接触；
在含有两种或更多种不同缓冲液的缓冲组合物存在下，进一步使传感器与怀疑含有目标分析物的样品接触；和
如果存在分析物，观察到颜色变化。
13.一种检测分析物的方法，包括：
形成比色传感器，所述传感器包括受体和含联乙炔的聚合组合物，其中的受体被引入到聚合组合物中以形成在探测物存在下能够表现出颜色变化的转导物；
在包括两种或更多种不同缓冲液的缓冲组合物存在下，使所述转导物与怀疑含有目标分析物的样品，和对目标分析物和受体均具有亲和性的探测物接触；和
如果存在分析物，观察到基本无颜色变化。
14.权利要求13的方法，其中分析物选自金黄色葡萄球菌，蛋白质A，PBP2’，埃西氏大肠杆菌和绿脓杆菌。
15.权利要求13的方法，其中在转导物与怀疑含有分析物的样品接触的60分钟内发生可观察到的颜色变化。
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