CN102435572B - 一种以聚联乙炔传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以聚联乙炔传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法。本发明在联乙炔囊泡传感器中插入磷脂，从而构成类生物膜的聚联乙炔/磷脂变色囊泡；通过测定变色囊泡与药物分子作用前后的变色程度，运用一定的模型和数学处理方法，求算药物分子与变色囊泡的亲和力。本发明具有简便、快速、重现性好等特点，分析所需的条件不高，在一般的实验室中只要利用普通的可见分光光度计即可实现，且可与高通量的微孔板模式兼容，适合药物-膜亲和力的高通量筛选。

Description

一种以聚联乙炔传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法

技术领域

本发明涉及一种以聚联乙炔光化学传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

细胞膜是重要的药物作用靶点，同时也是药物进入细胞的生理屏障，药物的活性和在人体内的转运与药物-膜亲和力密切相关，因此在新药研发初期对药物的细胞膜亲和力进行体外筛选是一项极其重要的研究内容。

正辛醇/水是最早用于测定药物-膜亲和力的体外系统，该系统以有机溶剂-正辛醇模拟细胞膜，通过测定药物在正辛醇/水两相中分配系数(K_oct)来反映药物的膜亲和力。但细胞膜是各向异性的脂质双分子层结构，因此正辛醇/水分配系数与药物-膜亲和力的相关性并不理想，它无法准确模拟药物与细胞膜之间的某些相互作用，如静电力和空间效应。采用具有脂质双层结构的脂质体模型来模拟细胞膜与实际情况则更加接近。脂质体/水系统评价药物-膜亲和力需借助超速离心法或平衡透析法得到药物的脂质体/水分配系数(K_m)，其关键步骤是将游离药物与和脂质体结合的药物分离，过程繁琐费力，使该法在药物-膜亲和力快速评价中的应用受到极大限制。

近年来，出现了一些使用类脂膜模型来测定药物-膜亲和力的新技术。磷脂膜色谱法(IAM)和固定化脂质体色谱法(ILC)是较早用于测定药物-膜亲和力的方法，此类方法以磷脂单层(IAM)或脂质体(ILC)为色谱固定相，通过测定色谱保留时间获得药物在流动相和固定相之间的分配比，进而反映药物-膜亲和力的大小；但是色谱柱制备较为繁琐、柱间的重现性较差，因而应用受到一定限制。国外也有研究者应用表面等离子共振传感技术(SPR)测定药物-膜亲和力，但是该技术设备要求先进，检测成本高昂，国内大部分药物研发机构难以承受。其他一些方法例如固定模担体技术(SSLM)和pH滴定法则由于分析过程较复杂，不适合用于药物-膜亲和力的快速筛选。

因此，为提高我国的新药研发速度与规模，亟需一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。

发明内容

本发明针对现有药物-膜亲和力测定方法的不足与缺陷，将低成本的、基于光化学信号传导特性的聚联乙炔(PDA)囊泡传感检测技术用于药物-膜亲和力测定，为新药研发单位与机构提供一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。

本发明所采用的聚联乙炔光化学传感器是一种具有变色性能的高分子材料，它是由联乙炔脂肪酸分子在紫外光照射下自聚合而成，其线性骨架的离域π电子在可见光区发生跃迁显蓝色。当聚联乙炔传感器表面活性分子发生分子识别反应时，聚联乙炔骨架受搅动引起构象变化，颜色从蓝色转变为红光，这种识别反应极为敏感，可以通过肉眼直接观察到。聚联乙炔传感器可以象其它传感器那样构成二维的薄膜传感器，而区别于其它光学传感器的突出特点是：聚联乙炔是两性分子，在溶液中可自动形成具有双层膜结构的聚联乙炔囊泡，构成囊泡传感器，表面插入生物活性分子后形成的三维作用更接近于实际生理环境。

本发明在联乙炔囊泡传感器中插入磷脂，从而构成类细胞膜的聚联乙炔/磷脂变色囊泡；通过测定囊泡与药物分子作用前后的变色程度，运用一定的模型和数学处理方法，求算药物分子与变色囊泡的亲和力，从而实现建立一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。

具体地说本发明的技术方案如下：

聚联乙炔/磷脂变色囊泡的制备方法：

将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为1∶4～4∶1)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混匀，在4℃中静置12小时后取出，在紫外光灯(波长为220～260nm)下边搅拌边照射，即形成蓝色的嵌有磷脂分子的聚联乙炔/磷脂变色囊泡。

聚联乙炔/磷脂变色囊泡变色响应的测定方法：

取囊泡混悬液，加入不同pH值的缓冲液，混匀后温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，分别计算药物加入前后的聚联乙炔/磷脂变色囊泡的蓝光分数PB＝A_蓝光/(A_蓝光+A_红光)，A_蓝光是囊泡在蓝光吸收波长(620～660nm)处的吸收度，A_红光是囊泡在红光吸收波长(520～560nm)处的吸收度；计算变色响应值CR，CR＝(PB₀-PB₁)/PB₀×100％，PB₀是药物加入之前囊泡的蓝光分数，PB₁是药物加入之后囊泡的蓝光分数；测定加入不同浓度的药物后聚联乙炔/磷脂变色囊泡的变色响应值CR，绘制药物浓度-变色响应值曲线。

药物-膜亲和力常数的测定方法：

(1)线性拟合方法

$\frac{1}{\mathrm{CR}}=\frac{1}{K_b\·{\mathrm{CR}}_{\max }}\·\frac{1}{\left[P\right]}+\frac{1}{{\mathrm{CR}}_{\max }}$

[P]为药物的浓度，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CR_max代表囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应。K_b用于表示药物与磷脂的亲和力，K_b越大，表明药物与磷脂的亲和力越大，反之，则表明药物与磷脂的亲和力越小。

在EXCEL软件中以1/CR对1/[P]作图，获得线性方程的截距与斜率，亲和力K_b＝截距/斜率。

(2)非线性拟合方法

$\mathrm{CR}=\frac{1/K_b+{\left[R\right]}_T+\left[P\right]-\sqrt{{(1/K_b+{\left[R\right]}_T+[P\left]\right)}^2-4{\left[R\right]}_T\left[P\right]}}{2\left[P\right]}\·{\mathrm{CR}}_{\max }$

[P]为药物的浓度，[R]_T代表囊泡上磷脂总数，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CR_max代表囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应。K_b用于表示药物与磷脂的亲和力，K_b越大，表明药物与磷脂的亲和力越大，反之，则表明药物与磷脂的亲和力越小。

在Original软件中编辑上述非线性方程，以CR对[P]进行非线性拟合，获得K_b值。

实际测定一般采用线性拟合方法，当采用线性拟合所得方程中截距出现负值时，采用非线性拟合方法。

相比于其他方法，本发明在评价药物-膜亲和力时具有以下优点：

(1)所用的传感器原件联乙炔酸是商品化的原材料，目前每克单价为400多元，而理论上每克联乙炔酸组成的变色囊泡可以进行数万次测定，而测定只需普通的可见分光光度计即可实现，具有低成本的优势；

(2)插入磷脂的聚联乙炔变色囊泡的形成是采用紫外光自组装的方式，组装完成后无需复杂的分离反应试剂的步骤，具有合成简单的优点；

(3)聚联乙炔变色囊泡能够模拟药物与细胞膜的三维作用，与细胞的实际生理环境更为相符；

(4)聚联乙炔变色囊泡的分子识别和信号转导都发生在同一个功能单体上，因此可与高通量的微孔板模式兼容，适合药物-膜亲和力的高通量筛选；

(5)亲和力测定结果的批内、批间重现性好，有利于该方法在新药研究中的大规模应用。

综上所述，本发明涉及的一种以聚联乙炔光化学传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法，具有简便、快捷、重现性好且检测成本低的优点，该发明的广泛应用将有利于提高我国的新药研发速度与规模。

附图说明

图1.聚联乙炔/磷脂变色囊泡在紫外光照射以及与药物作用前后的吸收光谱的特征变化(A：为与药物作用前的囊泡溶液吸收光谱，B：为与药物作用后的囊泡溶液吸收光谱，C：为未经紫外光照射组装的联乙炔酸与磷脂混合溶液吸收光谱)；

图2.药物与囊泡后变色响应的倒数值(1/CR)和加入药物浓度的倒数值(1/[P])的线性关系图(A：盐酸普鲁卡因；B：酒石酸美托洛尔；C：苯磺酸氨氯地平)；

图3.中性化合物的logK_b和logK_oct的线性关系；

图4.β-受体阻断药的logK_b和logK_m的线性关系；

图5.β-受体阻断药的logK_m和logK_oct的线性关系；

图6.β-受体阻断药的logK_b和logK_oct的线性关系；

图7.局麻药物的logK_b与其体内麻醉强度的线性关系；

图8.正构醇的logK_b值与其皮肤渗透系数的线性关系。

具体实施方式：

实施例1：聚联乙炔/磷脂变色囊泡与药物作用前后的吸收光谱变化

制备下列三种样品，分别在SHIMADZU UV2401紫外可见光分光光度仪上扫描500～700nm波长处的吸收光谱：

(1)将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为3∶2)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混匀，在4℃中静置12小时后取出，为未经紫外光照射组装的联乙炔酸/磷脂混合溶液；

(2)将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为3∶2)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混匀，在4℃中静置12小时后取出，在紫外光灯(波长为254nm)下边搅拌边照射，即形成蓝色的聚联乙炔/磷脂变色囊泡混悬液。取0.5ml囊泡混悬液，加入2ml Tris-HCl(pH7.4)缓冲液，为与药物作用前的囊泡；

(3)将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为3∶2)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混匀，在4℃中静置12小时后取出，在紫外光灯(波长为254nm)下边搅拌边照射，即形成聚联乙炔/磷脂变色囊泡混悬液。取0.5ml变色囊泡混悬液，加入2ml Tris-HCl(pH7.4)缓冲液，再加入0.2ml 3mM的苯磺酸氨氯地平溶液，涡旋后于室温温孵15min，为与药物作用后的囊泡；

由图1可以看出，未经紫外光照射组装的联乙炔酸/磷脂混合溶液在可见光区无明显的吸收，经紫外光照射组装的聚联乙炔/磷脂变色囊泡混悬液与药物作用前在640nm蓝光波长区域附近有较强的吸收，而与药物作用后，在540nm红光波长区域附近有较强的吸收。

实施例2：CR值的重现性

将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为3∶2)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混匀，在4℃中静置12小时后取出，在紫外光灯(波长为254nm)下边搅拌边照射，即形成蓝色的聚联乙炔/磷脂变色囊泡混悬液，按上述方法连续制备5批。每批样品按下法测定CR值：取0.2ml变色囊泡混悬液，加入2mlTris-HCl(pH7.4)缓冲液，分别加入不同浓度水平的苯磺酸氨氯地平溶液，涡旋后于25℃温孵15min，计算囊泡的变色响应值CR，CR＝(PB₀-PB₁)/PB₀×100％，其中PB为蓝光分数且PB＝A_640nm/(A_640nm+A_540nm)，A_640nm是囊泡在640nm处的吸收度，A_540nm是囊泡在540nm处的吸收度，PB₀是药物加入之前囊泡的蓝光分数，PB₁是药物加入之后囊泡的蓝光分数。

由表1中测定结果可见，按本发明中所述的制备方法制得的聚联乙炔/磷脂变色囊泡与药物作用后的CR值重现性较好。

表1.CR值的重现性

实施例3：K_b值的重现性

按“实施例2”中方法制备聚联乙炔/磷脂变色囊泡，按线性拟合方法分别测定盐酸普鲁卡因、酒石酸美托洛尔及苯磺酸氨氯地平三种药物的K_b值(图2)，用同一批次制备得到的囊泡测定三次，考察K_b值的批内重现性；用连续三个批次制备得到的囊泡分别测定三次，考察K_b值的批间重现性。由表2中测定结果可见，按本发明中所述的制备方法制得的聚联乙炔/磷脂变色囊泡与不同类别药物作用后，按照线性拟合方法测定得到的K_b值具有很好的重现性。

表2：K_b值的重现性

实施例4：中性化合物的K_b值与其正辛醇/水分配系数的关系

正辛醇/水是最早用于测定药物-膜亲和力的体外系统，该系统以有机溶剂-正辛醇模拟细胞膜，通过测定药物在正辛醇/水两相中分配系数(K_oct)来反映药物的膜亲和力。对于中性化合物，正辛醇/水分配系数能较好地反映其与膜的亲和力。本例代表性地选取了烷烃(环己烷、正己烷)，烯烃(辛烯、苯乙烯)，芳香烃(苯、甲苯)，杂环烃(喹啉)，醇和酚(正己醇、苯甲醇、苯酚)，醛和酮(丁醛、苯甲醛、环己酮)，醚(乙醚、苯甲醚)，酯(乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯)，硝基取代烃(硝基乙烷、硝基苯)，氯取代烃(一氯化苯、氯仿)等十类含不同官能团的中性化合物，利用本发明的测定方法测得其logK_b值，并与其logK_oct值进行线性回归，得到两者的线性关系方程为logK_oct＝1.516×logK_b+4.8927，R²＝0.9474(图3)；且每个化合物根据该线性关系方程预测得到的logK_oct与其实测值的相对误差均小于20％(表3)，表明K_b值能很好地预测中性化合物的正辛醇/水分配系数。

表3：21种中性化合物的K_b值与其正辛醇/水分配系数的关系

实施例5：β-受体阻断药的K_b值与其脂质体/水分配系数的关系

虽然正辛醇体系能较好地模拟药物的疏水作用，但实际细胞膜是各向异性的脂质双分子层结构，因此它无法准确模拟药物与细胞膜之间的其他一些相互作用，如静电力和空间效应。在这种情况下，对于许多含极性基团的药物分子而言正辛醇/水分配系数并不能很好地反映其与膜的亲和力，药物的脂质体/水分配系数更能代表其与膜的亲和力。本例代表性地选取了6种β-受体阻断药(盐酸普萘洛尔、盐酸醋丁洛尔、盐酸阿普洛尔、盐酸氧烯洛尔、盐酸阿替洛尔，酒石酸美托洛尔)，利用本发明的测定方法测得其logK_b值，与用传统的超滤法测得的脂质体/水分配系数K_m相比较，如图4所示，logK_b和logK_m的相关性很好(R²＝0.9793)；而β-受体阻断药的脂质体/水分配系数与其正辛醇/水分配系数之间相关性较差，logK_m和logK_oct的线性关系为R²＝0.8393(图5)；而logK_b和logK_oct之间的线性关系也较差R²＝0.7467(图6)。上述结果表明：K_b值与脂质体/水分配系数一样能较好地反映β-受体阻断药的膜亲和力。

实施例6：K_b值与局麻类药物体内麻醉强度的关系

局部麻醉药，是一类能局部可逆性阻断感觉神经冲动发生与传递的药物，简称“局麻药”。局麻药通过与神经细胞膜上Na⁺通道内口的相应结构域结合而引起通道的关闭，阻滞神经冲动的传导，产生麻醉作用。它可以作用于神经系统的任何部位以及各种神经纤维，使其支配区域的感觉和运动神经受到影响。由于其作用是可逆的，故作用结束后，神经功能可以完全恢复，对神经纤维和细胞均无损伤。故局麻药的麻醉强度与其同细胞膜的亲和力有十分密切的关系。因此，利用本发明的测定方法测得了6种局麻类药物(盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、盐酸丁卡因、盐酸丙胺卡因、盐酸布比卡因、盐酸甲哌卡因)的logK_b值，将logK_b与药物的体内麻醉强度进行相关拟合(图7)。结果表明二者有很好的相关性(R²＝9436)，说明局麻药的体内麻醉强度与其同的膜亲和力密切相关。

实施例7：K_b值与正构醇经皮渗透系数的关系

皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分组成，此外还有汗腺、皮脂腺和毛囊等附属器。表皮由内向外可分为五层，即基层、棘层、粒层、透明层和角质层，其中表皮中的角质层性质与其他各层有较大差异，是药物透皮吸收的主要屏障。角质层主要由角蛋白和脂类成分组成，这些脂类成分包括磷脂、鞘磷脂、胆固醇和一些脂肪酸。角质层中不存在主动转运的活性蛋白，完全是一个被动转运的屏障。因此，药物的透皮吸收与其同细胞膜的亲和力密切相关。故利用本研究设计的评价体系预测了8种正构醇同系物的logK_b值，并考察其与皮肤渗透系数(logK_P)的关系(图8)。结果表明，二者有很好的相关性(R²＝0.9754)，说明logK_b值与正构醇的皮肤渗透系数有着密切的关系。

Claims (2)

1.一种药物-膜亲和力的测定方法，包括以下步骤：

(1)制备聚联乙炔/磷脂变色囊泡；

(2)取囊泡混悬液，加入Tris-HCl缓冲液，混匀后温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，计算药物加入之前的聚联乙炔变色囊泡蓝光分数PB₀＝A_蓝光/(A_蓝光+A_红光)，A_蓝光是囊泡在蓝光吸收波长处的吸收度，A_红光是囊泡在红光吸收波长处的吸收度；

(3)取囊泡混悬液，加入Tris-HCl缓冲液，再加入一定量已知浓度的药物，混匀后于25℃温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，计算药物加入之后的聚联乙炔变色囊泡蓝光分数PB₁＝A_蓝光/(A_蓝光+A_红光)，A_蓝光是囊泡在蓝光吸收波长处的吸收度，A_红光是囊泡在红光吸收波长处的吸收度；

(4)计算变色响应值CR，CR＝(PB₀-PB₁)/PB₀×100％，PB₀是药物加入之前聚联乙炔的蓝光分数，PB₁是药物加入之后聚联乙炔的蓝光分数；

(5)测定加入不同浓度的药物后聚联乙炔变色囊泡的变色响应值CR，绘制药物浓度-变色响应值曲线；

(6)运用受体-变色响应的亲和力模型，采用一定的数学处理方法，对药物浓度-变色响应值曲线进行拟合，求算药物与变色囊泡的亲和力K_b，从而实现建立本发明所述的药物-膜亲和力测定方法；

所述的受体-变色响应的亲和力模型为：

$\frac{\mathrm{CR}}{{\mathrm{CR}}_{\max }}=\frac{\left[\mathrm{PR}\right]}{{\left[R\right]}_T}$

[R]_T代表变色囊泡上磷脂总浓度，[PR]代表药物与磷脂结合物的浓度，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CR_max代表变色囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应；

所述的对药物浓度-变色响应值曲线进行拟合采用如下的线性拟合方法或非线性拟合方法：

a)线性拟合方法

$\frac{1}{\mathrm{CR}}=\frac{1}{K_b\·{\mathrm{CR}}_{\max }}\·\frac{1}{\left[P\right]}+\frac{1}{{\mathrm{CR}}_{\max }}$

[P]为药物的浓度，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CR_max代表变色囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应；K_b用于表示药物与磷脂的亲和力，K_b越大，表明药物与磷脂的亲和力越大，反之，则表明药物与磷脂的亲和力越小；在EXCEL软件中以1/CR对1/[P]作图，获得线性方程的截距与斜率，亲和力K_b＝截距/斜率；

b)非线性拟合方法

$\mathrm{CR}=\frac{1/K_b+{\left[R\right]}_T+\left[P\right]\·\sqrt{{(1/K_b+{\left[R\right]}_T+[P\left]\right)}^2-4{\left[R\right]}_T\left[P\right]}}{2\left[P\right]}\·{\mathrm{CR}}_{\max }$

[P]为药物的浓度，[R]_T代表变色囊泡上磷脂总浓度，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CR_max代表变色囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应；K_b用于表示药物与磷脂的亲和力，K_b越大，表明药物与磷脂的亲和力越大，反之，则表明药物与磷脂的亲和力越小；在Origin软件中编辑上述非线性方程，以CR对[P]进行非线性拟合，获得K_b值。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述的蓝光吸收波长范围在620～660nm，红光吸收波长范围在520～560nm。

Images