MX2007007179A - Sensores colorimetricos construidos de materiales de diacetileno. - Google Patents

Abstract

Se describen sensores colorimetricos para la deteccion de un analito. Tambien se describen los metodos para uso del sensor colorimetrico y un kit para la deteccion colorimetrica de un analito.

Description

SENSORES COLORIMETRICOS CONSTRUIDOS DE MATERIALES DE DIACETILENO CAMPO DE LA INVENCIÓN Las técnicas actuales para la detección de microbios, particularmente bacterias resistentes a antibióticos, generalmente son consumidores de tiempo y típicamente involucran el cultivo de la bacteria en la forma pura. Uno de dichos de microbios de significativo interés es el Staphylococcus a ureus ("S. a ureus" ) , que es un patógeno que causa un amplio espectro de infecciones incluyendo: lesiones superficiales tales como abscesos pequeños de piel e infecciones de heridas; las condiciones sistémicas y amenazantes de la vida tales como endocarditis, neumonía y septicemia; así como enfermedades debidas a la producción de una toxina bacteriana (toxinoses) tales como envenenamiento de alimentos y el síndrome del choque tóxico. S . aureus es resistente a todos los antibióticos excepto a algunos cuantos seleccionados . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha intentado el análisis de los microbios utilizando una amplia variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, los métodos incluyen el uso de inmunocromatografía fluorométrica (por ejemplo, un procedimiento de medición de analito rápido tal como se describe en la patente de E. Ü7 A. No. 5,753,517, ELISA (por Ref. 183112 ejemplo, ELISA colorimétrico) y otras técnicas colorimétricas . Los sensores colorimétricos que incluyen materiales de polidiacetileno (PDA, por sus siglas en inglés) se describen en la patente de E. Ü7 A. No. 5,622,872, y la publicación WO 02/00920; las patentes de Estados Unidos Nos. 6,395,561 Bl; 6,306,598 Bl; 6,277,652; 6,183,722; y 6,080,423. Los diacetilenos son típicamente incoloros como monómeros en solución, y experimentan la adición de la polimerización, ya sea térmicamente o a través de radiación actínica. Según la polimerización avanza, estos compuestos experimentan un contrastante cambio de color de azul a púrpura. Cuando se exponen a un estímulo externo tal como calor, tensión física, o cambio de solventes o contraiones, los polidiacetilenos exhiben además un cambio de color producido por la distorsión de la conformación de la estructura plana. Por ejemplo, los ensambles de polidiacetileno se sabe que cambian de color de azul a rojo con un aumento en la temperatura o cambios en el pH debido a cambios en cuanto a conformación en la estructura conjugada como se describe en Mino, y otros, Langmuir, Vol. 8, pág. 594, 1992; Chance, y otros, Journal of Chemistry and Physi cs, Vol. 71, 206, 1979; Shibutag, Thin Solid Films, Vol. 179, pág. 433, 1989; Kaneko, y otros, Thin Solid Films, Vol. 210, 548, 1992; y patente de U. S. No. 5,672,465.

Aunque estos métodos para la detección de S . a ureus, así como otros microbios, han sido descritos en la técnica, podrían ser ventajoso métodos de detección mejorados . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un sensor colorimétrico para detectar la presencia de analitos a través de cambios en el espectro (cambios de color visibles al ojo desnudo o un colorímetro) que ocurre como un resultado de la interacción de los analitos en una forma que causa cambios en la conformación a ensambles de polidiacetileno. Los ensambles de polidiacetileno indican la presencia de un analito en una forma simple pero altamente sensible. Se provee un sistema colorimétrico para detectar un analito, que comprende un sensor colorimétrico que comprende un receptor; una composición polimerizada que comprende al menos un compuesto de diacetileno (esto significa que la composición polimerizada está formada de la polimerización del compuesto de diacetileno) ; en donde el receptor se incorpora en la composición polimerizada para formar un transductor; y una composición reguladora de pH que media la interacción entre el analito y el transductor, en donde el sistema regulador de pH incluye dos o más diferentes reguladores de pH; en donde el transductor exhibe un cambio de color cuando se pone en contacto con un analito.

En una modalidad, la composición reguladora de pH es una composición de un regulador de pH resistente altamente iónico con un regulador de pH de baja resistencia iónica. En una modalidad preferida, la composición reguladora de pH se selecciona del grupo que consiste de regulador de pH HEPES, regulador de pH de imidazol, regulador de pH PBS, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el regulador de pH media la interacción del analito a través de interacciones iónicas con el transductor. En otra modalidad, la composición reguladora de pH media la interacción del analito mejorando las interacciones hidrofóbicas con el transductor. El transductor se puede dispersar en una solución acuosa o recubrir un sustrato. En otra modalidad, el sistema colorimétrico además comprende una sonda. En una modalidad preferida, la sonda se selecciona del grupo que consiste de fibrinógeno, estreptavidina, IgG, y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, el sistema colorimétrico además comprende un agente tensioactivo. En una modalidad preferida, el agente tensioactivo comprende un agente tensioactivo no iónico. En una modalidad ilustrativa, el transductor del sistema colorimétrico es un liposoma y/o exhibe un cambio de color después del contacto con una composición reguladora de pH . En una modalidad ilustrativa, el compuesto de diacetileno (es decir, el material de partida para el material de polidiacetileno) es de la fórmula en donde R1 comprende al R comprende en donde R3, R8, R13, R21, R24, R31, y R33 son independientemente alquilo de C?-C20; R4, R5, R7, R14, Rld, R19, R20, R22, R25 y R32 son independientemente alquileno de C?-C?4; R6, R15, R18, y R26 son independientemente alquileno de C?~C?4, alquenileno de C2-C8, o arileno de Cg-C?3; R9 es alquileno de C?-C? o -NR34-; R10, R12, R27, y R29 son independientemente alquileno de C?-C?4 o (alquileno de C?-C?4) - (arileno de C2-Cs) ; R11 y R28 son independientemente alquinilo de C2-C30, R17 es un grupo de activación de éster; R 23 es un arileno de C6-C?3; R , 30 es alquileno de C?-C?4 o -NR36 ; R34 y R36 son alquilo de Cx- ; P es de 1-5 (aquí, el "diacetileno" se utiliza para abarcar los compuestos con de 2 a 10 enlaces C-C triples); y n es 1-20; en donde R1 y R2 no son iguales. En una modalidad, el receptor en el sistema colorimétrico comprende un fosfolípido seleccionado del grupo que consiste de fosfocolinas, fosfoetanolaminas, fosfatidil etanolaminas, fosfatidil serinas, fosfatidil gliceroles, y combinaciones de los mismos. También se provee un método para la detección un analito. El método incluye la forma de un sensor colorimétrico que comprende un receptor y una composición polimerizada que comprende un diacetileno (es decir, la composición polimerizada se deriva de la polimerización del diacetileno) en donde el receptor está incorporado en la composición polimerizada para formar un transductor capaz de exhibir un cambio de color; poner en contacto el sensor con una sonda; poner en contacto el sensor con una muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo en la presencia de una composición reguladora de pH que comprende dos o más diferentes reguladores de pH; y observar un cambio de color si el analito está presente. En otra modalidad, se provee un método para la detección de un analito, que comprende la formación de un sensor colorimétrico, comprendiendo un receptor y una composición polimerizada que comprende un diacetileno, en donde el receptor se incorpora en la composición polimerizada para formar un transductor capaz de exhibir un cambio de color en la presencia de una sonda; poner en contacto el transductor con una muestra que sospecha que contiene un analito objetivo, y una sonda que tiene una afinidad tanto para el analito objetivo como para el receptor en la presencia de una composición reguladora de pH que comprende dos o más diferentes reguladores de pH; y no observar esencialmente ningún cambio de color si el analito está presente. Preferiblemente, la sonda y la muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo se pueden combinar para formar una mezcla antes de poner en contacto el transductor. En una modalidad ilustrativa, el analito se selecciona del grupo que consiste de S . a ureus, proteína A,PBP2', E . coli , y Pseudomonas aeruginosa . En la mayoría de las modalidades, el sistema colorimétrico exhibe un cambio de color observable dentro de 60 minutos de contacto con el transductor con un analito. DEFINICIONES Estas definiciones deberán aplicarse para los siguientes términos definidos, a menos que se de una definición diferente en las reivindicaciones o en cualquier lugar en esta especificación: Como se utiliza aquí, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente cíclico de cadena recta o ramificada que tiene un número especificado de átomos de carbono. Los grupos alquilo incluyen aquellos con de 1 a 20 átomos de carbono. Ejemplos de "alquilo" como se utilizan aquí, incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, isobutilo, e isopropilo, y similares. Se entiende que cuando se previenen porciones cíclicas, al menos tres carbonos en dicho alquilo deben estar presentes. Dichas porciones cíclicas incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo, y cicioheptilo. Como se utiliza aquí, el término "alquileno" se refiere a un grupo de hidrocarburo divalente cíclico de cadena recta o ramificada que tiene un número especificado de átomos de carbono. Los grupos alquileno incluyen aquellos con de 1 a 14 átomos de carbono. Ejemplos "alquileno" como se utiliza aquí, incluyen, pero se limitan a, metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno y similares. Se entiende que cuando se previenen porciones cíclicas, por lo menos tres carbonos en dicho alquileno deben estar presentes. Dichas porciones cíclicas incluyen ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, y cicloheptileno. Como se utiliza aquí, el término "alquenileno" se refiere a un grupo hidrocarburo divalente cíclico de cadena recta o ramificada que tiene un número especificado de átomos de carbono y uno o más enlaces de carbono—carbono doble. Los grupos alquenileno incluyen aquellos de 2 a 8 átomos de carbono. Ejemplos de "alquenilo" como se utiliza aquí, incluyen, pero no se limitan a, eteno-1, 2-diil, propen-1,3-diil, y similares. Como se utiliza aquí, el término "arileno" se refiere a grupos carbocíclicos aromáticos insaturados divalentes que tienen un solo anillo, tal como fenileno, o múltiples anillos condensados, tal como naftileno o antrileno. Los grupos arileno incluyen aquellos con 6 a 13 átomos de carbono. Ejemplos de "arileno" como se utiliza aquí incluyen, pero no se limitan a, bencen-1, 2-diilo, bencen-1,3-diilo, bencen-1, 4-diilo, naftalen-1, 8-diilo, y similares. Como se utiliza aquí, el término "alquileno-arileno" se refiere a una porción de alquileno como se definió anteriormente enlazada a una porción de arileno como se definió anteriormente. Ejemplos de "alquileno-arileno" como se utiliza aquí incluyen, pero no se limitan a, -CH2-fenileno, -CH2CH2-fenileno, y -CH2CH2CH2-fenileno . Como se utiliza aquí, el término "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente cíclico de cadena recta ramificada que tiene de 2 a 13 átomos de carbono y por lo menos un enlace carbono-carbono triple. Ejemplos de "alquinilo" como se utiliza aquí, incluyen, pero no se limitan a, etinilo, propinilo y butinilo. Como se utiliza aquí, el término "analito (s)" se refiere a cualquier material que pueda detectarse a través del sistema sensor de la presente invención. Dichos materiales incluye, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, organismos patogénicos y no patogénicos, toxinas, receptores y fragmentos de membrana, compuestos orgánicos volátiles, enzimas y sustratos de enzimas, anticuerpos, antígenos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos de péptidos. "Analito objetivo" se refiere al material activado para la detección en un sistema sensor. Como se utiliza aquí, el término "bacteria" se refiere a todas las formas de microorganismos considerados como siendo una bacteria incluyendo cocos, bacilos, espiroquetas, esferoplastos, protoplastos, etc. Como se utiliza aquí, el término "receptor" se refiere a cualquier molécula o ensamble de moléculas con una afinidad para un analito objetivo y/o una sonda. El receptor incluye, pero no se limita a, receptores sintéticos o de existencia natural tales como lípidos, proteínas de membrana de superficie, enzimas, lectinas, anticuerpos, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas, ácidos nucleicos, c-glicosidas, carbohidratos, gangliosidas, y agentes de quelatación . Como se utiliza aquí, los términos "ensamble", o "auto-ensamble" se define en cualquier auto-ordenación de moléculas de diacetileno y fosfolípidos antes de la polimerización. Ver, J. Israelachvili, Intermolecular and Surfa ce Forces (2o. Ed.), Academia Press, New Cork (1992), págs. 321-427. Como se utiliza aquí, el término "monocapa (s) de auto-ensamble" (SAM, por sus siglas en inglés) se refiere a cualquier película orgánica ultradelgada ordenada formada sobre un sustrato dado a través de la auto-ordenación espontánea. A. Ulman, An In troduction to Ul tra thin Organi c Films, Academia Press, New Cork (1991), págs. 237-301. Como se utiliza aquí, el término "transductor" describe un material capaz de cambiar un evento de reconocimiento tal como un enlace covalente o una interacción no covalente (por ejemplo, interacción electrostática, interacción polar, las fuerzas van der Waals) al nivel molecular en una señal observable. "Sondas" se refiere a un constituyente que es capaz de interactuar con el analito objetivo y/o el receptor. Por consiguiente, la sonda es un tipo de "reactivo de enlace detectable", es decir, un agente que específicamente reconoce e interactúa o se enlaza con un analito (es decir, el analito objetivo) y/o el receptor, en donde la sonda tiene una propiedad que permite la detección cuando está enlazada. "Específicamente interactúa" significa que el agente de enlaza detectable físicamente interactúa con el analito o receptor objetivo para la exclusión sustancial de otros analitos también presentes en la muestra. El enlace de un reactivo de enlace detectable útil de acuerdo con la invención tiene una estabilidad que permite la medición del enlace . Los términos "comprende" y variaciones de la misma no tienen un significado limitante cuando estos términos aparecen en la descripción y las reivindicaciones. Las palabras "preferido" y "preferible" se refieren a las modalidades de la invención que pueden ofrecer ciertos beneficios bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, otras modalidades también pueden ser preferidas, bajo las mismas o diferentes circunstancias. Además, la relación de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no pretende excluir otras modalidades del alcance de la invención. Como se utiliza aquí, "un", "uno", "el, la", "por lo menos uno", y "uno o más" se utilizan intercambiablemente. Todos los números se asumen en la presente a modificarse por el término "aproximadamente". La relación de los intervalos numéricos a través de los puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4 y 5). La breve descripción de la presente invención anterior, no pretende describir cada modalidad descrita o cada implementación de la presente invención. La descripción siguiente más particularmente ejemplifica modalidades ilustrativas. En algunos lugares a lo largo de esta aplicación, son provistas guías a través de listas de ejemplos, cuyos ejemplos se pueden utilizar en varias combinaciones. En cada instancia, la lista relacionada sirve solamente como un grupo representativo y no deberá interpretarse como una lista exclusiva. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática de un sensor colorimétrico de la presente invención. La Figura 2 muestra una representación esquemática de un arreglo de sensor colorimétrico de la presente invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un sistema sensor colorimétrico para la detección de un analito. El sistema colorimétrico incluye un sensor colorimétrico que comprende un receptor y un material de diacetileno polimerizado (ensambles de polidiacetileno, que se refieren a una estructura de polidiacetileno organizada que puede (pero no necesariamente) incluir otros componentes), en donde el receptor está incorporado en el polidiacetileno para formar un transductor capaz de proveer un cambio de color después del enlace con una sonda y/o analito. El sensor colorimétrico puede funcionar en solución o recubriendo un sustrato.

ENSMAMBLES DE POLIDIACETILENO Los compuestos de diacetileno de la presente invención pueden autoensamblarse en solución para formar ensambles ordenados que se pueden polimerizar utilizando cualquier radiación actínica tal como, por ejemplo, radiación electromagnética en UV, o un intervalo visible de espectro electromagnético. La polimerización de los compuestos de diacetileno dan como resultado productos de reacción de polimerización que tienen un color en el espectro visible menor de 570 nanómetros (nm) , entre 570 nm y 600 nm (incluyendo los puntos finales) o mayor de 600 nm, dependiendo de su conformación y exposición a factores externos. Típicamente, la polimerización de los compuestos de diacetileno descritos en la presente da como resultado redes de polímero de fase azul meta-estables que incluyen una estructura de polidiacetileno. Estas redes de polímero de fase azul meta-estables experimentan un cambio de color de azulado a roj izo-anaranjado después de la exposición a factores externos tales como calor, un cambio en el solvente o contraión, si está disponible, o tensión física, por ejemplo . La habilidad de los compuestos de diacetileno y productos de polimerización descritos en la presente para experimentar un cambio de color visible después de la exposición a tensión física los convierte en candidatos para la preparación de dispositivos de percepción para la detección de un analito. Los ensambles de polidiacetileno formados a partir de los compuestos de diacetileno descritos pueden funcionar como un transductor en aplicaciones de biopercepción. Los requerimientos estructurales de una molécula diacetilénica para una aplicación de percepción dada son típicamente específicos de aplicación. Las características tales como la longitud de cadena global, solubilidad, polaridad, cristalinidad, y la presencia de grupos funcionales para la modificación adicional molecular cooperativamente determinan la habilidad molecular diacetilénica para servir como un material de percepción útil. Por ejemplo, en el caso de la biodetección de un analito en medio acuoso, la estructura del compuesto diacetilénico deberá ser capaz de formar una dispersión estable en agua, polimerizando eficientemente a un material de color, incorporando la química de receptor apropiada para el enlace con un analito, y la transducción de la interacción de enlace a través de medios de un cambio de color. Estas habilidades dependen de las características estructurales de los compuestos de diacetileno. Los compuestos de diacetileno de la presente invención poseen las capacidades descritas anteriormente y pueden fácil y eficientemente polimerizarse en ensambles de polidiacetileno que experimentan los cambios de color deseado. Adicionalmente, los compuestos de diacetileno permiten la incorporación de grandes exceso de material no polimerizable, tales como el receptor descrito a continuación, el cual aún forma una solución polimerizable estable . Los compuestos de diacetileno descritos (el material de partida) se puede sintetizar en una forma de alto rendimiento rápida, incluyendo métodos de alto rendimiento de síntesis. La presencia de la funcionalidad en las estructuras de los compuestos diacetilénicos (el material de partida) tales como heteroátomos por ejemplo, provee la posibilidad de la fácil elaboración estructural con el fin de cumplir con los requerimientos de una aplicación de percepción dada. Los compuestos diacetilénicos se pueden polimerizar en la estructura de polidiacetileno deseada conteniendo una red a través de la adición de diacetileno a un solvente adecuado, tal como agua por ejemplo, sonicar la mezcla, y después irradiar la solución con luz ultravioleta, típicamente a una longitud de onda de 254 nm. Después de la polimerización la solución experimenta un cambio de color a azulado-púrpura. Los diacetilenos (el material de partida) útiles en la presente invención típicamente contienen un promedio de longitud de cadena de carbono de al menos 8 con por lo menos un grupo funcional tal como grupo carboxilo, grupos amina primario o terciario, esteres de metilo de carboxilo, etc. Los diacetilenos adecuados incluyen aquellos descritos en la patente de E. U. A. No. 5,491,097 (Ribi y otros), publicación PCT No. WO 02/00920, patente de E. U. A. No. 6,306,598 y publicación PCT WO 01/71317. En una modalidad preferida, los ensambles de polidiacetileno incluyen compuestos polimerizados resultando de los diacetilenos de la fórmula: en donde R1 es al R2 es en donde R3, R8, R13, R21, R24, R31, y R33 son independientemente alquilo; R4, R5, R7, R14, R16, R19, R20, R22, R25 y R32 son independientemente alquileno; R6, R15, R18, y R26 son independientemente alquileno, alquenileno, o arileno; R9 es alquileno -NR34-; R10, R12, R27, y R29 son independientemente alquileno o alquileno-arileno; R11 y R28 son independientemente alquinilo; R17 es un grupo de activación de éster; R23 es un arileno; R30 es alquileno-NR36; R34 y R36 son independientemente H o alquilo de C?-C4; y n es 1-20; en donde R1 y R2 no son iguales. Los compuestos ilustrativos además se describen en la publicación de patente No. 2005/0101794-A1 y la publicación de E. U. A. Nos. 2004/0126897-A1 y 2004/0132217-Al.

En una modalidad preferida, R1 es en donde R7 es etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, heptametileno, octametileno, o nonametileno, y R6 es etileno, trimetileno, etenileno, o fenileno; y en donde R es en donde R ,20 es etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, heptametileno, octametileno, o nonametileno, y en donde R21 es undecilo, tridecilo, pentadecilo, heptadecilo; y en donde p es 1. La invención es inclusiva de los compuestos descritos en la presente incluyendo isómeros, tales como isómeros estructurales e isómeros geométricos, sales, solvatos, polimorfos y similares. Los diacetilenos de la fórmula XXIII se pueden preparar como se mencionó en el Esquema de Reacción 1 en donde n es típicamente de 1 a 4 y m es típicamente de 10 a 14.

Esquema de Reacción 1 Los compuestos de la fórmula XXIII se pueden preparar a través de oxidación de compuestos de la fórmula XXII mediante la reacción con un agente de oxidación adecuado en un solvente adecuado tal como DMF, por ejemplo. Los agentes de oxidación adecuados incluyen el reactivo Jones y dicromato de piridinio, por ejemplo. La reacción anterior típicamente corre durante un periodo de tiempo de 1 hora a 48 horas, generalmente 8 horas, a una temperatura de 0°C a 40°C, generalmente de 0°C a 25°C. Los compuestos de la fórmula XXII se pueden preparar de compuestos de la fórmula XXI a través de la reacción con un cloruro ácido adecuado. Los cloruros ácidos adecuados incluyen cualquier cloruro ácido que de el producto deseado tal como cloruro de lauroilo, cloruro de 1-doceanoilo, cloruro de 1-tetradecanoilo, cloruro de 1-hexadecanoilo, y cloruro de 1-octadecanoilo, por ejemplo. Los solventes adecuados incluyen éter, tetrahidrofurano, diclorometano y cloroformo, por ejemplo. La reacción anterior típicamente corre durante un periodo de tiempo de 1 hora a 24 horas, generalmente 3 horas, a una temperatura de 0°C a 40°C, generalmente de 0°C a 25°C, en la presencia de una base tal como trialquilamina o base piridina. Los compuestos de la fórmula XXI están ya sea comercialmente disponibles (por ejemplo, en donde n es 1-4) o se pueden preparar de compuestos de la fórmula XVIII a través de compuestos XIX y XX como se describe en el Esquema de Reacción 1 y se describe en Abrams, Suzanne R.; Shaw, Angela C. "Triple-bond isomerizations : 2- a 9-decyn-l-ol", Org. Syn th . (1988), 66, 127-31 y Brandsma, L. "Preparative Acetilenic Chemistry", (Elsevier Pub. Co . , New York, 1971), por ejemplo. Los compuestos diacetilénicos como se describe en la presente también se pueden preparar a través de la reacción de compuestos de la fórmula XXII con un anhídrido tal como anhídrido succínico, glutámico, o ftálico en la presencia de un solvente adecuado, tal como tolueno. La reacción anterior típicamente corre durante un periodo de tiempo de 1 hora a 24 horas, generalmente 15 horas, a temperatura de 50°C a 125°C, generalmente de 100°C a 125°C. Los sensores colorimétricos que comprenden los diacetilenos polimerizados pueden servir como la base para la detección colorimétrica de un evento de reconocimiento molecular. El sensor se puede preparar a través de la adición de un receptor a monómeros de diacetileno ya sea antes o después de la polimerización. El receptor es capaz de funcionalizar los ensambles de polidiacetileno a través de una variedad de medios incluyendo el mezclado físico, el enlace covalente, y las interacciones no covalentes (tales como interacciones electrostáticas, interacciones polares, etc . ) . Después de la polimerización o a partir de ésta el receptor efectivamente se incorpora con la red del polímero de tal forma que la interacción del receptor con un analito da como resultado un cambio de color visible debido a la perturbación de la estructura del polímero ene-yne conjugado. La incorporación del receptor con el ensamble de polidiacetileno provee una forma estructural capaz de la deformación en respuesta a la interacción o enlace con una sonda y/o analito. Los receptores particularmente útiles son ensambles de moléculas anfifílicas con una arquitectura molecular en forma de barra que se pueden caracterizar a través del parámetro de empaque definido como: v/ (A01C) ( Israelachvili, J. N. y otros; Q. Rev. Biophys; 13, 121, 1980), en donde v es el volumen absorbido por los componentes de hidrocarburo de las moléculas (por ejemplo, las cadenas de hidrocarburo de un fosfolípido o ácido graso) ao es el área efectiva absorbida por el grupo principal polar (por ejemplo, el grupo principal de fosfato de un fosfolípido o el grupo principal del ácido carboxílico del ácido graso) e lc es la así llamada longitud crítica, y generalmente describe la longitud de la molécula a la temperatura de su ambiente. Las moléculas anfifílicas preferidas para un receptor son aquellas con valores de parámetros de empaque v/ (aolc) entre 1/3 y 1. Los ejemplos de receptores útiles incluyen, pero no se limitan a, lípidos, proteínas de membrana de superficie, enzimas, lectinas, anticuerpos, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas, ácidos nucleicos, c-glicosidas, carbohidratos, gangliosidas, y agentes de quelatación. En la mayor parte de las modalidades, el receptor es un fosfolípido. Los fosfolípidos adecuados incluyen fosfocolinas (por ejemplo, 1, 2-dimeristoil-sn-glicerol-3-fosfocolina) , fosfoetanolaminas, y fosfatidiletanolaminas, fosfatilserinas y fosfatilgliceroles tales como aquellos descritos en Silver, Frian L., The Physical Chemistry of Membranas, Capítulo 1, págs. 1-24 (1985) . En una modalidad, el receptor se mezcla físicamente y se dispersa entre el polidiacetileno para formar una estructura en donde la estructura por sí misma tiene una afinidad de enlace para la sonda y/o el analito de interés. Las estructuras incluyen, pero no se limitan a, liposomas, micelas, y lámelas. En una modalidad preferida, la estructura es un liposoma. Ya que no pretende estar unido por teoría, se cree que el fosfolípido imita una membrana de célula mientras los ensambles de polidiacetileno permiten que ocurran los cambios físico-químicos de los liposomas que se van a traducir en un cambio de color visible. Los liposomas según preparados poseen una morfología, tamaño, distribución y otras características físicas bien definidas tales como el potencial de superficie bien definido. La relación del receptor a los compuestos de diacetileno (material de partida) en el liposoma puede variar con base en la selección de materiales y la respuesta colorimétrica deseada. En la mayor parte de las modalidades, la proporción de fosfolípidos al compuesto de diacetileno (material de partida) será de al menos 25:75, y más preferiblemente de al menos 40:60. En una modalidad preferida, los liposomas están compuestos del compuesto diacetileno: HO (0) C (CH2) 2C (0) 0 (CH2) 4C=C-C=C (CH2) 40 (O) C (CH2) ?2CH3 [ácido mono- ( 12-tetradecanoiloxi-dodeca-5, 7-dinil) succínico], y el fosfolípido 1, 2-dimeristoil-sn-glicero-3-fosfocolin [DMPC] zwiteriónico mezclado en una proporción de 6:4. En la presente, la explicación de los sistemas PDA está dirigida al uso de liposomas en el ensamble receptor; sin embargo, esta explicación también se aplica a otros ensambles de receptor, incluyendo, por ejemplo, otras configuras planas.

Los liposomas se preparan a través de la sonicación de la sonda de la mezcla del material suspendido en una solución reguladora de pH que es referido como una preparación reguladora de pH . Por ejemplo, la preparación reguladora de pH puede ser una regulador de pH (pH=7.2) de ácido N-2hidroxietilpiperazin-N' -2-etansulfónico de baja resistencia iónica (5 mM) [HEPES]. Otro regulador de pH de preparación útil es un regulador de pH (pH=8.5) de Tris hidroximetilaminoetano (2 mM) de baja resistencia iónica [TRIS] . El sistema colorimétrico de la presente invención se diseña para explotar la forma en que una sonda puede interactuar con los liposomas que contienen tanto un receptor, tales como fosfolípidos, como diacetilenos polimerizados. Los liposomas se pueden utilizar como modelos para membranas biológicas que interactúan con una sonda, tal como una proteína, como se describe en Oellerich, S. y otros; J. Phys. Chem B; 2004, 108, 3871-3878; y Zuckermann, M. J. ; Heimburg T.; Biophysi. J. ; 2001, 81, 2458-2472. En general, en una alta relación de concentraciones de lípido a proteína, las proteínas adsorberán la superficie de los liposomas principalmente a través de interacciones electrostáticas. Ya que la concentración de la proteína se incrementa, y la relación de la concentración de lípido a la proteína se disminuye, las proteínas continúan adsorbiendo electrostáticamente la superficie de liposoma hasta que saturan o envuelven completamente los liposomas. Ya que este proceso avanza, ambos liposomas y proteínas pueden experimentar cambios morfológicos en conformación, hasta que el segmento hidrofóbico de las proteínas que cubren la superficie del liposoma pueden iniciar la interacción con el interior hidrofóbico de la estructura del liposoma. En este punto, las proteínas se pueden hacer hidrofóbicamente enlazadas y penetrar la estructura del liposoma, dando como resultado el cambio morfológico sustancial en la estructura del liposoma, con el tamaño y la permeabilidad de los liposomas cambiando drásticamente. Eventualmente, las capas de proteínas pueden dar como resultado la pérdida de la estabilidad, floculación y finalmente la precipitación de la suspensión. La presencia de estas interacciones electrostáticas es altamente dependiente no solamente del tipo de proteínas y lípidos presentes sino del entorno también. Aunque se desee estar unido por teoría, se cree que la resistencia iónica de un sistema regulador de pH dado podría ser útil en el establecimiento del potencial de superficies tanto de los liposomas como de las proteínas cargadas, y de esta forma su habilidad para interactuar significativamente de forma electrostática. Por ejemplo, en un sistema regulador de pH de baja resistencia iónica (2-5 mM) a un pH neutral (por ejemplo, HEPES, TRIS), una sonda cargada puede electrostáticamente adsorber los liposomas de polidiacetileno. Aunque la adsorción inicial no puede por sí misma activar un cambio sustancial en el tamaño y morfología del liposoma, y de esta forma una respuesta colorimétrica inicialmente pequeña o legible, si la sonda está presente en exceso con relación al lípido, es probable que la sonda eventualmente se haga hidrofóbicamente enlazada al liposoma y penetre su estructura de membrana interior. En este punto, se podría esperar que las tensiones mecánicas más grandes impartidas por la incorporación de la sonda dentro de la estructura del liposoma pudieran significativamente cambiar la conformación del polidiacetileno, dando como resultado una respuesta colorimétrica concomitante fácilmente observable. Alternativamente, si la sonda está negativamente cargada a un pH neutral su capacidad para interactuar electrostáticamente con el liposoma de polidiacetileno se inhibe severamente, y la habilidad de generar una respuesta colorimétrica debido a la interacción hidrofóbica entre la sonda y los liposomas de polidiacetileno que contienen el receptor se pueden comprometer. En este caso, el uso de un regulador de pH de alta resistencia iónica (>100 mM) a pH neutral (por ejemplo salina regulada en el pH de fosfato (PBS), regulador de pH de imidazol) podría proveer medios para disminuir el potencial de la superficie de los liposomas (a través de la clasificación de la carga de superficie de los liposomas), facilitando la interacción directa hidrofóbica de las sondas no cargadas con el liposoma, y dando como resultado la incorporación de esa proteína dentro de la estructura del liposoma. De esta forma, en este caso, el sistema regulador de pH ayuda en la habilitación de una respuesta colorimétrica sustancial, lo cual por el contrario no tomaría lugar. Aunque la resistencia altamente iónica del regulador de pH, debido a su efecto sobre el potencial de la superficie de los liposomas, pueden introducir una respuesta colorimétrica significativa en la ausencia de una sonda, se ha determinado que cuando la sonda está presente, la respuesta colorimétrica significativamente se mejora debido a las interacciones hidrofóbicas de proteína-liposoma . Este resultado tuvo consecuencias prácticas muy útiles: el tiempo de detección a un límite dado de detección puede ser significativamente acortado, o inversamente, para un tiempo de ensayo fijo el límite de la detección puede ser significativamente disminuido. Con base en este fenómeno, la sonda se puede seleccionar con base en su habilidad para interactuar específicamente tanto como un analito dado objetivo y el liposoma de polidiacetileno para activar una respuesta colorimétrica del liposoma conteniendo polidiacetileno es directamente proporcional a la concentración de la sonda o un complejo de sonda-analito en aquellos casos del análisis directo. La selección de la sonda para una aplicación particular dependerá en parte del tamaño, forma, carga, hidrofobicidad, y afinidad hacia las moléculas de la sonda. Las sondas pueden estar positivamente cargadas, negativamente cargadas, o zwiteriónicas dependiendo del pH del ambiente. A un pH por debajo del punto isoeléctrico de una sonda, la sonda está positivamente cargada, y por arriba de este punto está negativamente cargada. Como se utiliza aquí, el término "punto isoeléctrico" se refiere a un pH en el cual la sonda tiene una carga neta de cero. Con el fin de diseñar un ensayo bioquímico con un sistema de polidiacetileno/fosfolípido, conociendo el punto isoeléctrico del receptor (o sonda) afectará la selección de las combinaciones reguladores de pH. Una sonda con un punto isoeléctrico inferior puede requerir reguladores de pH o resistencia iónica más alta para obtener un cambio en la morfología del liposoma. Una proteína de punto isoeléctrico más alto se puede utilizar en un regulador de pH de baja resistencia iónica como un regulador de pH HEPES para producir un cambio de color. Dado este mecanismo general es importante definir los ensayos de detección tomando en consideración no solamente en la composición de liposoma de polidiacetileno (por ejemplo, la selección del fosfolípido que se está utilizando y la proporción del fosfolípido a diacetileno) , y la sonda que se está utilizando (por ejemplo, polimixina, fibrinógeno, anticuerpos), sino también el entorno acuoso establecido por la selección del sistema regulador de pH. La composición reguladora de pH de la presente invención provee un sistema capaz de resistir los cambios en pH en la presencia de otros componentes, consistiendo de un par ácido-base conjugado en donde la proporción del aceptor del protón al donador del protón es casi una unidad. Además, las composiciones reguladoras de pH de la presente invención median la interacción física o química entre el analito y el componente del sensor colorimétrico. Por ejemplo, en una modalidad, a composición reguladora de pH inhibe la interacción del analito con el receptor. En otra modalidad, la composición reguladora de pH facilita la interacción del analito con el receptor. Las composiciones reguladoras de pH que pueden ser particularmente útiles incluyen el regulador de pH HEPES, regulador de pH de imidazol, y regulador de pH PBS. En una modalidad preferida, una combinación de reguladores de pH (es decir, reguladores de pH diferentes, se utiliza para ajustar la resistencia iónica apropiada para una aplicación dada con base en la selección de la sonda y/o analito objetivo a ser detectado. La combinación de dos o más reguladores de pH diferentes es un medio convencional de personalizar las propiedades físicas del sistema regulador de pH para lograr el balance apropiado de los componentes electrostáticos e hidrofóbicos en la interacción de la sonda liposoma-proteína . Por ejemplo, en un sistema que contiene solamente regulador de pH HEPES, que tiene un pH de 7.2, polimixina (con un punto isoeléctrico de 7.7) tiene una carga positiva y fácilmente se adhiere al grupo principal polar cargado negativamente de un fosfolípido, y puede inducir un cambio de color de azul a rojo en el sensor colorimétrico. El fibrinógeno, con un punto isoeléctrico de 5.3, tiene una carga negativa en la misma composición reguladora de pH HEPES, que evita la adsorción o interacción electrostática con un grupo principal polar de los fosfolípidos. Alternativamente, la presencia de los reguladores de pH con resistencia iónica más alta, tal como imidazol o PBS, la resistencia iónica altera la morfología de liposoma (u otra estructura de transductor) para exponer las porciones hidrofóbicas. En los sistemas colorimétricos que contienen composiciones reguladoras de pH de resistencia iónica más alta, el fibrinógeno contiene partes hidrofóbicas en la estructura que interactúan con los fosfolípidos para causar un cambio de color.

Un método conveniente para lograr el balance óptimo de los componentes electrostáticos e hidrofóbicos en las interacciones de liposoma-proteína es utilizar una mezcla de dos o más reguladores de pH diferentes. Por ejemplo, mezclar un regulador de pH orgánico de baja resistencia iónica (HEPES, Tris) , con un regulador de pH inorgánico (PBS) a una resistencia iónica diferente, puede permitir que se extienda el intervalo de propiedades reguladoras de pH asociadas para casos reguladores de pH individuales. Por lo tanto, el sistema regulador de pH mezclado se puede diseñar para proveer una interacción de liposoma-proteína optimizado. Un sistema regulador de pH mezclado también podría proveer una forma de personalizar a que extensión el sistema regulador de pH es una interacción contra un regulador de pH no de interacción. Por ejemplo, un regulador de pH de interacción (PBS, imidazol) puede "diluirse" con un regulador de pH no de interacción (HEPES) para personalizar su efecto en la morfología del liposoma. Por supuesto, el efecto opuesto (un regulador de pH no de interacción que se hace más interactivo) también se puede lograr utilizando un sistema regulador de pH mezclado. Finalmente, en una forma análoga, se podría introducir un componente agente tensioactivo en la composición reguladora de pH que pueda ayudar a la interacción hidrofóbica de una sonda con el sensor colorimétrico. Los agentes tensioactivos que pueden particularmente útiles en la presente invención incluyen agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos no iónicos polialcoxilados, y en particular polietoxilados, pueden estabilizar los componentes de la presente invención en soluciones particularmente bien. Los agentes tensioactivos de tipo no iónico que pueden ser útiles incluyen: 1. Monoalquila tos de sorbi tan extendidos a óxido de polietileno (es decir, Polisorba tos) . En particular, un polisorbato 20 comercialmente disponible como NIKKOL TL-10 (de Barret Products) es muy efectivo. 2. Al canoles polialcoxilados . Los agentes tensioactivos tales como aquellos comercialmente disponibles bajo la designación de la marca comercial BRIJ de ICI Specialty Chemicals, Wilmington, DE, teniendo un HLB de al menos 14 han probado ser útiles. En particular, BRIJ 78 y BRIJ 700, que son etoxilatos de alcohol estearílico que tienen de 20 a 100 moles de óxido de polietileno, respectivamente, han probado ser muy útiles. También es útil el ceteareth 55, que está comercialmente disponible bajo el nombre comercial de PLURAFAC A-39 de BASF Corp., Performance Chemicals Div., Mt . Olive, NJ. 3. Alquí fenoles polial coxilados . Los agentes tensioactivos útiles de este tipo incluyen octil polietoxilado o fenoles nonilos que tiene valores HLB de por lo menos 14, que están comercialmente disponibles bajo las designaciones comerciales ICONOL y TRITÓN, de BASF Corp., Performance Chemicals Div., Mt . Olive, NJ y Union Carbide Corp., Danbury, CT, respectivamente. Los ejemplos incluyen TRITÓN X 100 (un fenol octilo que tiene 15 moles de óxido de etileno disponible de Union Carbide Corp., Danbury, CT) e ICONOL NP40 (fenol nonilo que tiene 40 y 70 moles de unidades de óxido de etileno, respectivamente, disponible de BASF Corp., Performance Chemicals Div., Mt . Olive, NJ) . Derivados sulfatados y fosfatados de estos agentes tensioactivos también son útiles. Los ejemplos de dichos derivados incluyen nonoxinol-4-sulfato de amonio, el cual está comercialmente disponible bajo la designación comercial RHODAPEX CO-436 de Roída, Dayton, NJ. 4. Polaxámeros . Agentes tensioactivos basados en copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO, por sus siglas en inglés) y óxido de propileno (PO, por sus siglas en inglés) que ha demostrado que son efectivos en la estabilización de polímeros formadores de película de la presente invención y proveen buena humectación. Tanto los bloques EO-PO-EO como PO-EO-PO se espera que trabajen bien mientras el HLB sea de al menos aproximadamente 14, y preferiblemente de al menos 16. Dichos agentes tensioactivos están comercialmente disponibles bajo las designaciones comerciales de PLURONIC y TETRONIC de BASF Corp., Performance Chemicals Div., Mt . Olive, NJ. Se observa que los agentes tensioactivos PLURONIC de BASF han reportado valores HLB que están calculados de manera diferente que los descritos anteriormente. En dicha situación los valores HLB reportados por BASF deberían utilizarse. Por ejemplo, los agentes tensioactivos PLURONIC preferidos son L-64 y F-127, que tienen HLB de 15 y 22, respectivamente. Aunque los agentes tensioactivos PLURONIC son bastante efectivos en la estabilización de las composiciones de la presente invención y son bastante efectivos con yodo como el agente activo, pueden reducir la actividad antimicrobiana de las composiciones utilizando povidona-yodo como el agente activo. 5. Esteres polialcoxilados . Los glicoles polialcoxilados tales como glicol etilénico, glicol propilénico, glicerol y similares pueden parcialmente o completamente esterificarse, es decir, se pueden esterificar uno o más alcoholes, con un ácido (de C8-C22) alquilcarboxílico. Dichos esteres polietoxilados tienen un HLB de al menos 14, y preferiblemente de al menos aproximadamente 16, son adecuados para uso en composiciones de la presente invención. Poligl ucosidas de alquilo . Los poliglucosidas de alquilo, tales como aquellas descritos en la patente de E. U. A. No. 5,951,993 (Scholz y otros), partiendo de la columna 9, línea 44, son compatibles con los polímeros formadores de película de la presente invención y pueden contribuir a la estabilidad del polímero. Los ejemplos incluyen glucopon 425 que tiene un alquilo de C8-C16 de cadena larga con una longitud de cadena promedio de 10.3 carbonos y 1-4 unidades de glucosa. Finalmente, el sistema de detección basado en materiales colorimétricos de la presente invención depende de uno o más de los siguientes factores: la arquitectura molecular de los compuestos de diacetileno; el tipo de porción de receptor utilizada; la morfología (tamaño y estructura) de los liposomas y otras estructuras de agregado potenciales de diacetileno y moléculas receptoras; la sonda de proteína utilizada; y el sistema regulador de pH utilizado para llevar a cabo el ensayo. MÉTODOS DE DETECCIÓN La presente invención provee un método para el análisis de un analito, que comprende poner en contacto el sensor colorimétrico anteriormente mencionado con una muestra de solución o superficie conteniendo un analito y utilizando una medición de adsorción o una observación visual con el ojo desnudo para detectar un cambio de color el sensor colorimétrico . En una modalidad alternativa, la presente invención provee un método para la detección indirecta de un analito a través de la sección de una sonda con una afinidad para enlazarse tanto con el receptor incorporado en los ensambles de polidiacetileno y el analito. La sonda selecciona demostrará una afinidad competitiva con el analito. Cuando el analito de interés está presente, la sonda se unirá al analito en lugar de al receptor en la estructura del polidiacetileno, dando como resultado un cambio de color inversamente proporcional a la concentración del analito. Si el analito está ausente, la sonda se unirá al receptor incorporado en la estructura del polidiacetileno, dando como resultado un cambio de color de azul a rojo. La sonda puede ponerse en contacto con el sensor después de que el analito contacta al sensor, o se puede mezclar con el analito antes de que la mezcla se ponga en contacto con el sensor. En un ensayo de detección inversa, la sonda y el analito objetivo puede interactuar en la solución reguladora de pH, la cual subsecuentemente se coloca en contacto con el sensor. La concentración de la sonda libre de regulador de pH es dependiente de la cantidad del analito objetivo presente: entre más alta es la concentración del analito, menor será la concentración restante de la sonda. Ya que la respuesta colorimétrica del sensor es proporcional a la cantidad de la sonda libre disponible, la respuesta colorimétrica es inversamente proporcional a la concentración del analito. En algunos casos, la sonda puede formar un complejo con el analito el cual puede interactuar directamente con el sensor, produciendo un ensayo directo en donde la respuesta colorimétrica es directamente proporcional a la concentración del analito. En una modalidad, el método de la invención comprende proveer una muestra de prueba que comprende el analito en una composición reguladora de pH que provee una sonda en una composición reguladora de pH, combinando la muestra de prueba en la sonda en donde la sonda muestra una mayor afinidad de enlace al analito que el receptor, y detectar el cambio con un biosensor. También es importante reconocer que algunos ensayos la sonda podría generarse in situ a través de la fragmentación o por el contrario usando el analito objetivo como se explica más adelante. La sonda además puede considerarse una proteína o fragmento de proteína externamente presente en la pared celular de un organismo que está disponible para la interacción directa con el sensor. La interacción entre la sonda y el analito pueden operar para la exclusión de la interacción con el liposoma. Alternativamente, la sonda puede interactuar con el analito para formar un complejo con el complejo resultante interactuando con el liposoma. La sonda se puede poner en contacto con el sensor en solución o recubrir un sustrato. La sonda será cualquier molécula con una afinidad tanto para el analito objetivo como para el receptor. Las sondas posibles para uso en la presente invención incluyen membranas que interrumpen péptidos tales como alameticina, magainina, gramicidina, sulfato de polimixina B y melitina; fibrinógeno; estreptavidina; anticuerpos, lectinas, y combinaciones de estas. En algunas modalidades, se utiliza un anticuerpo como la sonda. El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina que tiene la capacidad específicamente unirse a un antígeno dado inclusive de los fragmentos de enlace del antígeno del mismo. El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos completos de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc.), y fragmentos de los mismos que también específicamente reaccionan con una proteína de vertebrado (por ejemplo, mamífero). Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas convencionales y fragmentos clasificados para utilidad en la misma forma como anticuerpos completos. De esta forma, el término incluye segmentos de proteínas proteolíticamente divididas o recombinantemente preparadas de una molécula de anticuerpo que es capaz de selectivamente reaccionar con una cierta proteína. Los ejemplos no limitantes de dichos fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen F(ab'), F(ab)2, Fv, anticuerpos de una sola cadena (scFc) conteniendo un dominio VL y/o VH unido a través de un enlazador de péptido. Los scFv pueden estar covalentemente o no covalentemente enlazados para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de enlace. Los anticuerpos se pueden marcar con cualquier porción detectable conocida por un experto en la técnica. Son conocidos varios anticuerpos en la técnica. Por ejemplo los anticuerpos S . a ureus están comercialmente disponibles de Sigma and Accurate Chemical. Preferiblemente, la concentración del anticuerpo utilizado es de al menos dos nanogramos por mililitro (ng/ml). Típicamente la concentración del anticuerpo es de al menos 100 nanogramos/ml . Por ejemplo una concentración de 100 microgramos/ml se puede utilizar. Típicamente no se utilizan más de aproximadamente 500 microgramos/ml. En otras modalidades, se utiliza el fibrinógeno como sonda. Sin pretender estar unido por teoría, se cree que una proteína unida al fibrinógeno expresada o presente en o sobre el analito reacciona con el fibrinógeno. Por ejemplo, S . a ureus expresa la proteína enlazada el fibrinógeno por lo general referida como un factor de aglomeración que reacciona con el fibrinógeno cuando se pone en contacto. La concentración de fibrinógeno para producir esta reacción típicamente es de al menos 0.0001% en peso y generalmente no más de 5% en peso. El plasma humano y el plasma de animal (por ejemplo de conejo) son medios que contienen fibrinógeno adecuados. Los productos de plasma comercialmente disponibles generalmente incluyen un anticoagulante tal como EDTA, citrato, heparina, etc. el fibrinógeno derivado de humano está comercialmente disponible de Sigma Aldrich, St . Louis, MO. Utilizando el método indirecto de detección, es posible la alta sensibilidad que provee niveles bajos de detección con base en la concentración de la sonda utilizada. Para la estrategia de detección, las concentraciones de la sonda se pueden seleccionar para corresponder a los niveles de concentración deseados de detección. El método de detección indirecta utilizando la sonda permite el diseño del sistema alrededor del tipo concentración de la sonda para la sensibilidad deseada en una aplicación dada. Esto permite que el transductor sea universal a múltiples analitos de interés. Por ejemplo, un solo transductor (combinación de polidiacetileno/receptor) podría servir para detectar múltiples analitos a través de la variación de la sonda en contacto con el transductor de acuerdo con la afinidad de la sonda para el analito. Los analitos de interés particular para detectar son microbios (es decir, microorganismos) tales como la bacteria gram positiva, gram negativa, hongos, protozoarios, microplasmas, levadura, virus, y aún virus envueltos en lípido. Los organismos particularmente relevantes incluyen miembros de las familias En terobacteria cetae, o del género Staphylococcus spp, Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Esherichia spp., Bacillus spp., Listeria spp., Vibrio spp., así como el virus de herpes, Aspergillus spp., Fusarium spp., y Candida spp. Los organismos particularmente virulentos incluyen Staphylococcus aureus (incluyendo cepas resistentes tales como Staphylococcus aureus resitente a Meticilina (MRSA) ) , S. epidermidis , Sreptococcus pneumoniae , S. agalactiae , S. pyogenes, Enterococcus faecalis , Vancomycin Resistant Enterococcus (VRE) , Staphylococcus aureus resistente a Vancomicina (VRSA) , Staphylococcus aureus Intermediario de Vacomicina (VISA) , Bacillus anthracis , Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli, Aspergillus Níger, A. fumigatus , A. clavatus , Fusarium solana, F. oxysporum, F. chamydosporum, Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, V. parahemolyticus , Salmonella Cholerauis , S. Typha , S. Typhimurium, Candida albicans , C. glabrata , C. krusei, y múltiples barras de gram negativas resistentes al fármaco (MDR) . De particular interés es la bacteria gram positiva, tal como Staphylococcus aureus. Típicamente, estos se pueden detectar a través de la detección de la presencia de un componente de pared celular característico de la bacteria, tal como la proteína de pared celular. También, de particular interés son los microbios resistentes a antibióticos incluyendo MRSA, VRSA, VISA, VRE, y MDR. Típicamente, estos se pueden detectar a través de la detección adicional de la presencia de un componente de célula interna, tal como una proteína de membrana. Dichos microbios u otras especies de interés se pueden analizar en una muestra de prueba que pueden derivarse de cualquier fuente, tal como un fluido fisiológico, por ejemplo, sangre, saliva, fluido de lentes oculares, fluido sinovial, fluido de la espina cerebral, pus, sudor, exudado, orina, moco, leche de lactante o similar. Además, la muestra de prueba se puede derivar de un sitio del cuerpo, por ejemplo, herida, piel, orificios nasales, cuero cabelludo, uñas, etc. Como se utiliza aquí "muestra de prueba" se refiere a una muestra que contiene el analito objetivo. Preferiblemente, la muestra es un líquido o gas y más preferiblemente, un líquido. La técnica describe varias técnicas de muestreo de paciente para la detección de S . a ureus . Dichas técnicas de muestreo son adecuadas para el método de la presente invención también. Es común obtener una muestra limpiando los orificios nasales de un paciente. Una técnica de muestre particularmente preferida incluye los orificios nasales anteriores del sujeto (por ejemplo, pacientes) limpiados con hisopo de rayón estéril. Se utiliza un hisopo para muestrear cada sujeto, es decir, un hiso para ambos orificios nasales. El muestreo se lleva a cabo a través de la inserción del hisopo de rayón (comercialmente disponible de Puritan, East Grinstead, UK bajo la designación comercial de "Pure-Wraps" seco o pre-humedecido con una solución apropiada en la punta anterior del orificio nasal del sujeto y rotando el hisopo durante dos revoluciones completas a lo largo de la superficie mucosal del orificio nasal. El hisopo después se cultiva directamente o se extrae con una solución apropiada típicamente incluyendo agua opcionalmente en combinación con un regulador de pH y por lo menos un agente tensioactivo. Además de los fluidos fisiológicos, otras muestras de prueba pueden incluir otros líquidos así como un sólido (s) disuelto (s) en un medio líquido. Las muestras de interés pueden incluir procesar corrientes, agua, tierra, plantas u otra vegetación, aire, superficies (por ejemplo, superficies contaminadas), y similares. La muestra de prueba (por ejemplo, líquido) se puede someter al tratamiento anterior, tal como dilución o fluido viscoso. La muestra de prueba (por ejemplo, líquido) se puede someter a otros métodos de tratamiento antes de la inyección en el cuerpo de la muestra tal como concentración (a través de filtración, destilación, diálisis o similar) , dilución, filtración, inactivación de los componentes naturales, adición de reactivos, tratamiento químico, etc. Un método de tratamiento que puede mejorar la detección de señal del analito objetivo involucra el lisado de células para formar fragmentos de pared celular y analizar los fragmentos de pared celular, como se describe en la publicación de patente de E. U. A. No. 2005/0153370. En particular, los métodos son útiles para detectar uno o más componentes de paredes celulares que son característicos de un microbio, particularmente Staphylococcus a ureus . El método incluye: proveer una muestra de prueba que incluye células no cultivadas; lisar las células no cultivadas para formar un lisato que incluye fragmentos de pared celular; y analizar los fragmentos de pared celular para un componente de pared celular característico del analito; en donde el componente de pared celular característico del analito despliega una señal mejorada relativa al mismo componente en las células no usadas . Los componentes de pared celular incluyen, por ejemplo, proteínas de pared celular tales como proteína A y componentes de superficie microbiana reconociendo las moléculas de matriz adhesivas (MSCRAMM) , tales como las proteínas enlazadas a fibrinógeno (por ejemplo factores de aglomeración, proteínas enlazadas a fibronectina, proteínas enlazadas a colágeno, proteínas enlazadas a polisacáridos relacionados con heparina/heparina, y similares. La proteína A y los factores de aglomeración, tales como los factores de enlace a fibrinógeno y los factores de aglomeración, A, B y Efb, también so particularmente útiles en métodos para detectar la presencia de Staphylococcus a ureus . Otros componentes de pared celular incluyen polisacáridos capsulares y carbohidratos de pared celular (por ejemplo ácido teicoico y ácido lipoteicoico) . La lisación puede incluir poner en contacto las células con un agente de lisación o lisar físicamente las células. La lisación se pueden conducir bajo condiciones convencionales, tales como por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 5°C a aproximadamente 37°C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C. Significativamente, el lisado puede ocurrir utilizando células no cultivadas, es decir, una muestra de prueba directa, aunque las células cultivadas se pueden utilizar también . Como resultado del lisado de células para formar fragmentos de paredes celulares y el mejoramiento resultante de la señal de los componentes de paredes celulares, las muestras tienen concentraciones relativamente bajas de especies de interés que se pueden evaluar. Por ejemplo, para ciertas modalidades, la muestra de prueba puede incluir una concentración relativamente baja de microbios, particularmente Staphylococcus a ureus . Dicha concentración relativamente baja incluye, por ejemplo, menos de aproximadamente 5 X 104 de unidades formadoras de colonia ("cfu") por mililitro (cfu/ml) de microbio, menos de aproximadamente 5 X 103 cfu/ml, menos de aproximadamente 1000 cfu/ml, y aún menos de aproximadamente 500 cfu/ml. Los microbios, tales como S . a ureus, se pueden detectar a altos niveles también, en la escala de tanto como 5 X 107 cfu/ml, por ejemplo. Los agentes de lisación adecuados incluyen, por ejemplo, enzimas tales como lisostafina, lisozima, endopeptidasas, N-acetimuramul-L-alanina amidasa, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa, y ALE-1. Las varias combinaciones de enzima pueden utilizarse si se desea. La lisostafina es particularmente útil en métodos de detección de la presencia de Staphylococcus a ureus . Otros agentes de lisación incluyen sales (por ejemplo, sales caotrópicas) , agentes solubilizantes (por ejemplo, detergentes), agentes de reducción (por ejemplo, DTT, DTE, cisteína, N-acetil cisteína) , ácidos (por ejemplo, HLC) , bases (por ejemplo, NaOH) . Se pueden utilizar si se desean varias combinaciones de dichos agentes de lisación. Un ejemplo es sí S . a ureus está presente, las células usadas en la muestra de prueba se pueden analizar para proteína A, la cual es característica de S. a ureus, y se puede detectar con un anticuerpo específico de proteína A inmovilizado en la superficie del biosensor. Adicionalmente, las células lisadas, tales como la bacteria S . a ureus liberan marcadores de proteína desde la porción interna de las células (según opuesto a la porción de la pared celular de la célula) . Dichos marcadores de proteína se pueden detectar por sondas, tales como un anticuerpo. La muestra de prueba y las sondas se pueden combinar en una variedad de formas adecuadas. En un aspecto, la sonda es provista al sensor y e la muestra de prueba es provista al sensor colorimétrico como porciones separadas, y aún en cualquier orden. Por ejemplo, la superficie puede estar recubierta con una solución conteniendo fibrinógeno y opcionalmente secarse. En otro aspecto, la muestra de prueba y la sonda se combinan como una mezcla y la mezcla es provista al sensor colorimétrico. En una modalidad preferida, la sonda interactúa con la muestra de prueba conteniendo el analito antes de poner en contacto con el sensor colorimétrico. Ventajosamente, el método de la invención tiene una sensibilidad mejorada. Como se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, S . a ureus se puede detectar a concentraciones de 5 X 102 unidades formadoras de colonia ("cfu") por milímetro, 5 X 103 cfu/ml, y 5 X 102 cfu/ml. Por consiguiente, un experto en la técnica aprecia que el método de la presente invención se puede utilizar para detectar un analito objetivo a concentraciones tan bajas como 5 X 102 cfu/ml (por ejemplo, cualquier concentración específica entre las concentraciones manifestadas a incrementos de 10 cfu/ml).

Un analito objetivo también se puede detectar a niveles más altos también, en la escala de hasta tanto como 5 X 107 cfu/ml . Alternativamente, o además de, el método de la invención también ventajosamente da como resultado una velocidad de detección mejorada. El dispositivo utilizado en la presente es capaz de detectar un analito en un periodo relativamente corto de tiempo. Por ejemplo, S . aureus se puede detectar en cualquiera de las concentraciones previamente descritas en menos de aproximadamente 120 minutos (por ejemplo, 90 minutos, 60 minutos, 30 minutos, 10 minutos) . APLICACIONES Los sensores colorimétricos de la presente invención formados de los compuestos de diacetileno descritos son tratables para una variedad de aplicaciones que demandan un costo efectivo, diagnósticos estables, exactos, consistentes y rápidos fuera de las instalaciones del laboratorio. Las aplicaciones incluyen la prueba del punto de cuidado, diagnósticos de pruebas en el hogar, detección militar e industrial de patógenos terminales en el aire o agua y VOC y procesamiento de alimentos. En una modalidad, los sensores colorimétricos se pueden utilizar para la detección de la bacteria gram-negativa en fluidos biológicos para diagnosticar la presencia de una infección. Por ejemplo, la presencia de una bacteria gram-negativa en orina es indicativa de una infección urinaria. Un sensor colorimétrico que comprende los ensambles de polidiacetileno de la presente invención pueden indicar la presencia de la bacteria gram-negativa tal como S . a ureus en fluidos biológicos a través del cambio de color ya sea en una solución o como recubriendo un sustrato. En ciertas modalidades, los sensores colorimétricos de la presente invención podrían complementarse con otros métodos de diagnóstico conocidos para proveer una determinación multi-proyección de la presencia de bacteria u otros analitos. En una modalidad, los sensores colorimétricos de la presente invención podrían utilizarse en conjunción con apositos para heridas para detectar la presencia de una infección. El sensor podría integrarse en el aposito como una capa directa o indirectamente en contacto con la herida. El sensor también se podría insertar en el aposito durante uso. Alternativamente, se podría concebir una construcción de un aposito en donde el exudado de la herida podría dirigirse desde la herida a una porción del aposito no en contacto con la herida en donde está localizado el sensor, a través de canales de microfluido tales como aquellos descritos en la patente de E. U. A. No. US 6,420,622 Bl . El sensor también se podría utilizar como un diagnóstico independiente en la evaluación de una infección de vida analizando el analito extraído de un hisopo de herida. Un sensor que comprende los ensambles de polidiacetileno se pueden obtener sin la necesidad de formar una película a través del procedimiento LB convencional (Langmuir-Blodgett ) antes de transferirlo a un soporte apropiado. Alternativamente, los ensambles de polidiacetileno se pueden formar sobre un sustrato utilizando el procedimiento LB conocido como se describe en A. Ulman, An Ins troduction to Ul tra thin Organi c Films, Academia Press, New Cork (1991), págs. 101-219. La presente invención puede proveer capacidad de biopercepción en un producto adhesivo. Los sensores están autocontenidos y no requieren instrumentación adicional para transportar un resultado medible. Alternativamente, el uso con otro instrumento analítico es posible para demás mejorar la sensibilidad, tal como la fluorescencia con la fase "roja" fluorescente desarrollada después de la detección del analito. Los sensores funcionan para proveer un dispositivo de clasificación rápido, es decir, menos de 30 minutos, y preferiblemente menos de 15 minutos, cuando se desea la detección de una presencia de umbral de un analito específico. Adicionalmente, los sensores de la presente invención son desechables y relativamente no costosos. En una modalidad de la invención, el sensor colorimétrico comprende un transductor formado de un receptor incorporado dentro de los ensambles de polidiacetileno en solución. La solución puede ser provista en un simple sistema de recipiente, con el analito directamente adicionado al recipiente conteniendo una solución con el transductor específico para el analito de interés. Alternativamente, el sensor colorimétrico podría comprender múltiples recipientes en un kit, con cada recipiente conteniendo un transductor que comprende ensambles de polidiacetileno con receptores incorporados particulares a diferentes analitos. Para aquellas aplicaciones en donde el analito no puede ser adicionado directamente al transductor de polidiacetileno, también se podría utilizar un sistema de recipiente de dos partes. Un componente del recipiente podría contener reactivos para la preparación de la muestra del analito físicamente separado del segundo compartimiento conteniendo el transductor formado a partir de los ensambles de polidiacetileno. Una vez que se completa la preparación de la muestra, la barrera física que separa los compartimientos podría removerse para permitir que el analito se mezcle con el transductor para la detección. El sensor colorimétrico según preparado después se puede recubrir sobre un sustrato sólido ya sea manchando la sustancia y permitiendo que el agua se evapore o extruyendo la suspensión a través de una membrana de tamaño de poro asociado, atrapando los ensambles de polidiacetileno y dando como resultado una membrana recubierta, la cual subsecuentemente se deja secar. Las membranas o propiedades son generalmente aquellas con un tamaño de poro de 200 nm o menor, comprendiendo materiales de tipo policarbonato, nylon, PTFE, polietileno (otros se pueden enumerar) . Estos sustratos pueden estar ya sea recubiertos con una suspensión polimerizada de los ensambles de diacetileno, o la suspensión se puede recubrir en una forma no polimerizada y subsecuentemente polimerizar en el estado recubierto. En otra modalidad de la presente invención, el sensor colorimétrico es un indicador rápido en un formato de cinta o de etiqueta como se describe en la Figura 1. La Figura 1 muestra una cinta o etiqueta 10 cubierta con un adhesivo sensible a la presión 20 y un transductor 30 recubierto sobre un sustrato 40. Los sustratos adecuados para uso con la presente invención se pueden caracterizar por las mediciones del ángulo de contacto utilizando agua milli-Q- (Millipore) y yoduro de metileno (Aldrich) como se describe en la solicitud publicada de E. U. A. No. 2004-0132217-A1. El sustrato 40 puede incluir sustratos altamente planos, tales como oro evaporado sobre obleas de sílice atómicamente planas (111), obleas de sílice atómicamente planas (111), o vidrio flotado, el cual está descubierto y modificado con monocapas de auto-ensamble (SAM) para alterar su energía de superficie en una forma sistemática; o sustratos con una topografía altamente texturizada que pueden incluir sustratos de papel, recubrimientos receptivos de tinta polimérica, películas poliméricas estructuras, películas microporosas, y materiales de membrana. En una modalidad de la invención que mantiene la fase "azul" original de los ensambles de polidiacetileno después del secado, el sustrato 40 exhibe ángulos de contacto avanzados con yoduro de metileno por debajo de 50°. Esta condición corresponde a sustratos caracterizados por un componente de dispersión de su energía de superficie mayor de 40 dinas/cm. En una modalidad alternativa, los sustratos con estas propiedades que tienen un ángulo de contacto avanzado con agua menor de 90° dan como resultado recubrimientos secos que contienen una mezcla de las fases azul y roja. Esta condición podría corresponder a superficies en donde el componente de energía de superficie de dispersión podría ser menor de 40 dinas/cm pero con un componente de energía de superficie polar mayor de al menos 10 dinas/cm. Haciendo referencia de nuevo a la FIGURA 1, el adhesivo sensible a la presión 20 puede fijar la cinta o etiqueta 10 a la superficie para detección directa de un analito. En adhesivo sensible a la presión 20 se aisla del transductor conteniendo los ensambles de polidiacetileno para potencialmente minimizar los efectos adversos. En la FIGURA 1, el adhesivo sensible a la presión 20 rodea al transductor 30 localizado en el centro de la cinta o etiqueta 10. En una modalidad alternativa (no mostrada) , el adhesivo sensible a la presión y el transductor se combinan. Opcionalmente, la cinta etiqueta 10 contendrá una ventana transparente en el lado de la cinta o la etiqueta 10 que no contiene adhesivo sensible a la presión 20. La ventana podría centrarse por debajo del transductor 30 para permitir al usuario ver el cambio de color sin remover la cinta o etiqueta 10 de la superficie que contiene el analito. En la FIGURA 2, la cinta o etiqueta 110 se muestra como arreglo 111 compuesto de transductores múltiples 112, 113, 114, 115 y 116. Cada uno de los transductores 112, 113, 114, 115 y 116, podría formarse de ensambles de polidiacetilenos iguales o diferentes con cada ensamble de polidiacetileno incorporando el mismo o un receptor diferente. Para transductores variables 112, 112, 114, 115 y 116, el arreglo 111 se puede diseñar para detectar múltiples analitos a varios niveles de concentración. Alternativamente, cualquiera de los transductores 112, 112, 114, 115 se pueden reemplazar con una prueba de diagnóstico alternativa. Otras modalidades contempladas con la presente invención son provistas en la serie de E. U. A. No. 10/738,573. Para las aplicaciones que requieren la preparación de la muestra del analito, un kit podría contener un recipiente para el almacenamiento del reactivo y el mezclado del analito antes de poner en contacto el sensor colorimétrico recubierto sobre un sustrato bidimensional. En una modalidad, el kit podría comprender un recipiente para el almacenamiento del reactivo y la preparación del analito, con un sistema de etapa que contiene el transductor de la presente invención recubierto sobre el sustrato. EJEMPLOS La presente invención no deberá considerarse limitada a los ejemplos particulares descritos a continuación, sino más bien deberá entenderse que cubre todos los aspectos de la invención como se establecen equitativamente en las reivindicaciones anexas. Pueden ser aplicables varias modificaciones, procedimientos equivalentes, así numerosas estructuras para las cuales la presente invención será fácilmente aparente para los expertos en la técnica a los cuales la presente invención está dirigida después de la revisión de la especificación instantánea. Todas las partes, porcentajes, relaciones, etc., en los ejemplos y en resto de la especificación están en moles a menos que se indique lo contrario. Todos los solventes y reactivos sin un proveedor nombrado se compraron de Aldrich Chemical; Milwaukee, Wl . El agua se purificó a través del uso de un purificador de agua U-V Milli-Q con una resistividad de 18.2 Mohms/cm. (Millipore, Bedford MA) .

La respuesta colorimétrica (CR, por sus siglas en inglés) se determinó utilizando una imagen tomada utilizando una cámara digital. La imagen se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, (CA) para obtener los valores de canal RGB (Rojo, Verde, Blue) para cada prueba del sensor de polidiacetileno. Los calores del canal rojo y azul gon dados a través de la ecuación CR = ( (PRmiciai- PRmuestra) /PR?mc?ai) en donde PR = porcentaje del valor rojo de la muestra, y se da a través de la ecuación PR = Rvaior/ (Rvaior+BVaior) *100, en donde Rvaior y Bvaior corresponden al valor del canal rojo y azul del sensor de polidiacetileno respectivamente . Tabla de Abreviaturas Ejemplo Preparativo 1 - Preparación de una suspensión de liposomas de diacetileno Se preparó diacetileno HO (O) C (CH2) 2C (O) O (CH2) 4C=C-C=C (CH2) 40(0) C (CH2) i2CH3, como en el Ejemplo 6 de la publicación de solicitud de patente de E. U. A. No. 2004/0132217. El procedimiento básico involucró reaccionar 5,7-dodecadnn-l, 12-d?ol (HO (CH2) 4C=C-C=C (CH2) 40H con cloruro de miristoilo y la subsecuente reacción ese producto con anhídrido succínico para producir el diacetileno, HO(0)C(CH2)2C(0)0(CH2)4C=C-C=C(CH2)40(0)C(CH2)?2CH3, como un sólido blanco. Una mezcla de (6:4) del compuesto de diacetileno: Se pesó HO(0)C(CH2)2C(0)0(CH2)4C=C- C=C (CH2) 40(0)C (CH2) i2CH3 (ácido mono-12-tetradecanoilox?-dodeca-5, 7-diin?l) éster succínico), y fosfolípido 1,2- dimeristoil-sn-glicero-3-fosfocolina zwiteriónico (DMPC, peso de la fórmula (F.W.) 678 disponible de Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) en un recipiente de vidrio y se suspendió en regulador de pH de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N' -2-etansulfónico (HEPES) (5 mM, pH 7.2) para producir una solución de 1 mM. Esta solución después se sónico con la sonda utilizando un sonicador de sonda Misonix XL202 comercialmente disponible de Misonix Inc., Farmington, NY) durante 2 minutos, y se colocó en un refrigerador a 4°C durante aproximadamente 20 horas. El procedimiento dio como resultado la formación de una suspensión de liposoma estable. Ejemplo Preparativo 2 - Polimerización de la suspensión de liposoma de diacetileno La suspensión preparada en el Ejemplo Preparativo 1 se filtró a través de un filtro de jeringa de 1.2 µm y se polimerizó a través de la irradiación de la muestra por debajo de una lámpara UV de 254 nm (comercialmente disponible de VWE Scientific Products; West Chester, PA) a una distancia de 3 cm durante 10 minutos, dando como resultado la observación de un color azul siendo desarrollado. Ejemplo preparativo 3 - Preparación de muestras recubiertas de la suspensión de liposoma de diacetileno La suspensión preparada en el Ejemplo Preparativo 1 se recubrió sobre membranas de policarbonato porosas de diámetro 25 (mm) con poros de diámetro 200 (nm) Avestin, Inc.

Ottawa, Canadá) las muestras del detector colorimétrico. Las membranas se recubrieron utilizando un procedimiento de extrusión manual como sigue. La membrana de policarbonato a ser recubierta se colocó en una cámara de acero inoxidable de un sistema extrusor manual, designación comercial LIPOFAST, disponible de Avestin, Inc. (Ottawa, Canadá) . La membrana recubrió la parte inferior de un anillo 0 de la base de TEFLON. Se tomó cuidado de evitar la flexión y/o plegado de la membrana. El bloque del anillo 0 TEFLON se colocó dentro del alojamiento de acero inoxidable en la parte superior de la membrana. La cámara después se selló ajustando tapas de acero inoxidable a mano. Se rellenó una jeringa estrecha de gas (500-microlitros (µl) Hamilton) con una suspensión de liposomas de diacetileno y se unió a la base de una segunda jeringa que se unió a la otra tapa. Los liposomas de la primera jeringa se forzaron lentamente a través de la cámara con una presión siempre constante. La membrana capturó los liposomas en la superficie permitiendo que el regulador de pH transparente fluyera lentamente a través y dentro de la segunda jeringa. Esta acción se consideró un recubrimiento de un paso. Las muestras de membrana utilizadas como detectores en este ejemplo utilizados dos pases de recubrimiento. El segundo pase se aplicó como el primero a través de una porción de 0.5 mililitros (ml) de liposoma siendo aplicado a la membrana ya recubierta. La segunda jeringa conteniendo el regulador de pH filtrado se removió y el contenido se descartó. La tapa final de acero inoxidable se desatornilló y el bloque de anillo 0 de TEFLON se removió. La membrana húmeda se removió y se colocó recubriendo uno de los lados del portaobjetos de vidrios y se colocó en un refrigerador a 5°C durante al menos 3 horas. La mezcla después se secó en un secador conteniendo CaS04 durante 30 y se expuso a 254 nanómetros de luz UV (nm) durante 30-90 segundos. El sustrato recubierto con PDA (círculo de 25 milímetros (mm) ) se cortó en cuatro cuartos. Cada muestra de cuarto se utilizó como una muestra para un experimento. Ejemplo Preparativo 4 - Preparación de Salina Regulada en el pH con Fosfato (solución reguladora de pH PBS) Se preparó una solución de salina regulada en pH con fosfato (PBS), a través de la dilución de un concentrado líquido de PBS 10 veces (comercialmente disponible de EMD Biosciences, San Diego CA) . Esto dio como resultado una solución regulada en pH con PBS con la siguiente composición de sal: 10 mM de fosfato de sodio, 137 mM de cloruro de sodio, 2.7 de cloruro de potasio. La solución regulada en el pH con PBS tiene un pH de 7.5 a 25°C.

Ejemplo Preparativo 5 - Preparación de Salina Regulada en el pH con fosfato con PLURONIC L64 (solución reguladora de pH PBS L64) La solución reguladora de pH PBS L64 se preparó tomando la solución reguladora de pH PBS como se preparó en el Ejemplo Preparativo 4, y adicionando 0.2% (v/v) del agente tensioactivo PLURONIC L64 (disponible de BASF Corporation, Mount Olive, NJ) . La solución reguladora de pH PBS L64 tuvo un pH de 7.5 a 25°C. Ejemplo Preparativo 6 - Preparación de la Suspensión de Bacteria S. aureus La bacteria S. aureus se obtuvo de la Colección de Cultivo de Tipo Americano (Rockville, MD) , bajo la designación comercial "ATCC 25923". La bacteria se cultivó en cultivos de caldo durante la noche (17-22 horas a 37°C) preparado a través de la inoculación de 5-10 mililitros de Caldo de Soya Tríptico estéril preparado (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) con la bacteria. Los cultivos se lavaron a través de centrifugación (8, 000-10,000 rpm durante 15 minutos en un centrífugo No. 5804R modelo Eppendorf (Brinkman Instruments, Westbury, NY) y se volvió a suspender en regulador de pH PBS L64 y se lavó a través de centrifugación durante 3 ciclos adicionales con esta solución.

Ejemplo Preparativo 7 - Preparación de la Suspensión de Bacteria S. epidermidis La bacteria S . epidermidis se obtuvo de la Colección de Cultivo de Tipo Americano (Rockville, MD) , bajo la designación comercial "ATCC 12228". La bacteria se cultivó en cultivos de caldo durante la noche (17-22 horas a 37°C) preparado a través de la inoculación de 5-10 mililitros de Caldo de Soya Tríptico estéril preparado (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) con la bacteria. Los cultivos se lavaron a través de centrifugación (8,000-10,000 rpm durante 15 minutos en un centrifugo modelo Eppendorf número 5804R (Brinkman Instruments, Westbury, NY) y se volvió a suspender en regulador de pH PBS L y se lavó a través de centrifugación durante 3 ciclos adicionales con esta solución. Ejemplo Preparativo 8 - Preparación de la Suspensión de Bacterias E. coli La bacteria E. coli se obtuvo de la Colección de Cultivo de Tipo Americano (Rockville, MD) , bajo la designación comercial "ATCC 25922". La bacteria se cultivo en cultivos de caldo durante la noche (17-22 horas a 37°C) preparado a través de la inoculación de 5-10 milímetros de Caldo de Soya Tríptico estéril preparado (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) con la bacteria. Los cultivos se lavaron a través de centrifugación (8,000-10,000 rpm durante 15 minutos en un centrifugo modelo Eppendorf No. 5804R (Brinkman Instruments, Westbury, NY) y se volvió a suspender el regulador de pH HEPES y se lavó a través de centrifugación durante 3 ciclos adicionales con esta solución. Ejemplo 1 - Detección de la Fase de Solución de la Sonda de Proteina de Fibrinógeno Se disolvió fibrinógeno de plasma humano (disponible de Sigma Aldrich, St . Louis, MO, cat. No FR4129) en regulador de pH de Imidazol a una concentración de 0.5% (v/v) . El fibrinógeno en la solución reguladora de pH de imidazol (lOOµl) se mezcló con lOOµl de la solución de liposoma de polidiacetileno azul preparado en el Ejemplo Preparativo 2. También se preparó una muestra de control conteniendo 100 µl de solución reguladora de pH de imidazol sin fibrinógeno y 100 µl de solución de liposoma de polidiacetileno preparada en el Ejemplo Preparativo 2. Aunque ambas muestras cambiaron de azul a rojo en los primeros 20 minutos, la muestra de de suspensión conteniendo fibrinógeno se floculó y subsecuentemente se precipitó en un total de 30 minutos. La suspensión de la muestra de control permaneció estable durante el tiempo de observación completo. Ejemplo 2 - Detección de la Fase de Solución de Sonda de Proteina del Anticuerpo IgG anti Staphylococcus aureus de Conejo Se disolvió en anticuerpo IgG anti Staphylococcus a ureus de conejo (obtenido de Achúrate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, cat. 0. YVS6881) en solución reguladora de pH de imidazol a una concentración de 100 µl/ml. El anticuerpo en la solución reguladora de pH de imidazol (100 µl) se mezcló con 100 µl de la solución de liposoma de polidiacetileno azul (preparado en el Ejemplo Preparativo 2) . También se preparó una muestra de control conteniendo 100 µl de solución reguladora de pH de imidazol sin el anticuerpo y 100 µl de la solución de liposoma de polidiacetileno azul (preparado en el Ejemplo Preparativo 2). Aunque ambas muestras cambiaron de azul a rojo en los primeros 30 minutos, la muestra de de suspensión que contuvo el anticuerpo se floculó y subsecuentemente se precipitó después de 24 horas. La suspensión de la muestra de control permaneció estable durante el tiempo de observación completo. Ejemplo 3 - Detección de la Fase de Solución de la Sonda de Proteina de Fibrinógeno en la Presencia de S. aureus y solución reguladora de pH PBS L64 Se mezcló fibrinógeno en solución reguladora de pH imidazol (100 µl) como se preparó en el Ejemplo 1, con 100 µl de la solución de liposoma de polidiacetileno azul (preparado como en el Ejemplo Preparativo 2) y 100 µl de solución reguladora de pH PBS L 64 conteniendo 106 cfu/ml de la bacteria S . a ureus como se preparó en el Ejemplo Preparativo 6. También se preparó una muestra de control mezclando 100 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH de imidazol, lOOµl de solución de liposoma de polidiacetileno azul y 100 µl de solución reguladora de pH PBS L64 sin la bacteria S . a ureus . Ambas muestras cambiaron de azul a rojo en 30 minutos, pero en contraste con el Ejemplo 1, las suspensiones permanecieron estables en ambas muestras durante un periodo de observación de 24 horas. Ejemplo 4 - Detección de la Fase de Solución en una Sonda de Proteina del Anticuerpo IgG anti Staphylococcus aureus de Conejo en la Presencia de S . aureus y Solución Reguladora de pH PBS L64 La solución de liposoma de polidiacetileno azul como se preparó en el Ejemplo Preparativo 2 se mezcló con el anticuerpo en solución reguladora de pH de imidazol como se preparó en el Ejemplo 2 y la solución reguladora de pH PBS conteniendo la bacteria S . a ureus se preparó como en el Ejemplo Preparativo 6, utilizando tres diferentes combinaciones : Muestra 4A - 100 µl de solución de liposoma de polidiacetileno azul + 100 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH de imidazol + 100 µl de solución reguladora de pH PBS conteniendo 107 cfu/ml de bacteria S . a ureus . Muestra 4B - 100 µl de solución de liposoma de polidiacetileno azul + 100 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH de imidazol + 100 µl de solución reguladora de pH PBS sin bacteria.

Muestra 4C - 100 µl de solución de liposoma de polidiacetileno azul + 100 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH de imidazol sin anticuerpo + 100 µl de solución reguladora de pH PBS sin bacteria. El color de las muestras después de 45 minutos se registró en la Tabla 1 siguiente. TABLA 1 Ejemplo 5 - Detección de la Sonda de Proteina de Fibrinógeno Utilizando Muestras Recubiertas de Polidiacetileno Tres sustratos recubiertos con polidiacetileno como se preparó en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de una cavidad en una placa de microtitulación de 24 cavidades (disponible comercialmente de Corning Incorporates, Corning NY, cat. No 3524 bajo la designación comercial COSTAR), y se agregaron las siguientes soluciones: Muestra 5A - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH de imidazol como se preparó en el Ejemplo 1 + 250 µl solución reguladora de pH PBS L64. Muestra 5B - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH de imidazol + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 107 cfu/ml de la bacteria S . a ureus como se preparó en el Ejemplo Preparativo 6. Muestra 5C - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH de imidazol + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 107cfu/ml de S . epidermidis como se preparó en el Ejemplo Preparativo 7. El tiempo requerido para cada muestra para cambiar de azul a rojo se registró en la Tabla 2 siguiente. TABLA 2 Ejemplo 6 - Detección de S. aureus en solución reguladora de pH PBS L64 a Varias Concentraciones Utilizando una Sonda de Proteina de Fibrinógeno en Solución Reguladora de pH de Imidazol Seis sustratos recubiertos con polidiacetileno como se preparó en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. El fibrinógeno en la solución reguladora de pH de imidazol (250 µl) como se preparó en el Ejemplo 1 se mezcló con 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo la bacteria S. aureus como se preparó en el Ejemplo Preparativo 6, produciendo una serie de mezclas de muestras conteniendo varias concentraciones de bacteria. La concentración de la bacteria se enumera en la Tabla 3 siguiente. Las diferentes mezclas de muestra se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo los substratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). Se tomó una fotografía a los 6 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated. La respuesta colorimétrica (CR, por sus siglas en inglés) , se determinó como se describe anteriormente- Los datos en la Tabla 3 siguiente reportan la respuesta colorimétrica como una función de la concentración de la bacteria. TABLA 3 Ejemplo 7 - Detección de S . aureus en Solución Reguladora de pH PBS L64 Utilizando una Sonda de Proteina Conjugada de Anticuerpo-Estreptavidina y Muestras Recubiertas de Polidiacetileno Dos sustratos recubiertos con polidiacetileno como se preparó en el Ejemplo de Preparación 3 se colocaron en la parte inferior de cavidades separadas de una placa de microtitulación de 24 cavidades. Se preparó una sonda de proteína del anticuerpo IgG anti Staphylococcus a ureus de conejo conjugado con estreptavidina en la siguiente forma. El anticuerpo conjugado con estreptavidina se disolvió en solución reguladora de pH de imidazol a una concentración de 100 µg/ml. Después se prepararon las siguientes soluciones: Muestra 7A - 250 µl de anticuerpo conjugado con estreptavidina en solución reguladora de pH de imidazol + 250µl de solución reguladora de pH PBS como se preparó en el Ejemplo Preparativo 4. Muestra 7B - 250 µl de anticuerpo conjugado con estreptavidina en solución reguladora de pH de imidazol + 250 µl de solución reguladora de pH PBS conteniendo 106 cfu/ml de la bacteria S. a ureus en solución reguladora de pH PBS como se preparó en el Ejemplo Preparativo 6. Las soluciones se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos después del mezclado, y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo los sensores de polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). La Tabla 4 siguiente registra el tiempo requerido para cada sensor para cambiar de azul a rojo. TABLA 4 Ejemplo 8 - Detección de Estreptavidina Utilizando la Sonda de Proteina Conjugada con Anticuerpo-Biotina Utilizando Muestras Recubiertas de Polidiacetileno Cuatro sustratos recubiertos con polidiacetileno como se preparó en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de cavidades separadas de una placa de microtitulación de 24 cavidades. Se disolvió una sonda de proteína del anticuerpo monoclonal IgG de la anti proteína A de ratón conjugado con biotina (comercialmente disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, cat. No 13-3150) en solución reguladora de pH PBS a una concentración de lOOµg/ml. La estreptavidina (comercialmente disponible de Jackson Immuno Research, West Grove, PA, Cat. No 016-050-084) se disolvió en solución reguladora de pH PBS a una concentración de 100 µg/ml . Después se prepararon las siguientes soluciones de muestra : Muestra 8A - 300 µl de solución reguladora de pH de imidazol . Muestra 8B - 150 µl de solución reguladora de pH de imidazol + 150 µl de estreptavidina en solución reguladora de pH PBS. Muestra 8C - 100 µl de solución reguladora de pH de imidazol + 100 µl de estreptavidina en solución reguladora de pH PBS + 100 µl de anticuerpo conjugado con biotina en solución reguladora de pH PBS. Muestra 8D - 150 µl de solución reguladora de pH de imidazol + 150 µl de anticuerpo conjugado con biotina en solución reguladora de pH PBS. Las soluciones se sometieron a vórtice y se dejaron reposar 5 minutos después del mezclado, y después se adicionaron a cavidades separadas conteniendo los sensores de polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). La Tabla 5 siguiente registra el tiempo requerido para cada sensor para cambiar de azul a rojo.

TABLA 5 Ejemplo 9 - Detección de S. aureus en Solución Reguladora de pH PBS L64 a Varias Concentraciones Utilizando una Sonda de Proteina de Fibrinógeno en Solución Reguladora de pH PBS L64 Seis sustratos recubiertos con polidiacetileno como se prepara en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. El fibrinógeno se disolvió en solución reguladora de pH PBS L64, a una concentración de 0.5% (v/v). Similarmente, el fibrinógeno también se disolvió en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.05% (v/v) . Se prepararon las siguientes soluciones de muestra: Muestra 9A - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.5% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 sin bacteria. Muestra 9B - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.5% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus como se preparó en el Ejemplo Preparativo 6. Muestra 9C - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.5% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 105 cfu/ml de la bacteria S. a ureus . Muestra 9D - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.05% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 sin bacteria Muestra 9E - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.05% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus . Muestra 15F - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.05% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 105 cfu/ml de la bacteria S . a ureus . Para propósitos de comparación también se prepararon otras dos muestras: Muestra 9G - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.5% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 105 cfu/ml de la bacteria S . epidermidis como se preparó en el ejemplo Preparativo 7. Muestra 9H - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.05% + 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo 105 cfu/ml de la bacteria S . epidermidis . Las diferentes mezclas de muestras se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo los sustratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 30 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 6 siguiente reportan una respuesta colorimétrica (CR) para estas muestras. TABLA 6 Ejemplo 10 - Detección de S. aureus Completo en Muestras Clinicas Utilizando una Sonda de Proteina de Fibrinógeno en Solución Reguladora de pH PBS L64 Muestras de hisopos nasales de 6 pacientes se recolectaron, se recolectaron dos hisopos de . cada paciente para un total de 12 muestras. Las muestras de hisopos nasales se obtuvieron limpiando los orificios nasales anteriores del paciente utilizando un hisopo de rayón estéril (comercialmente disponible de Puritan, East Grinstead, UK bajo la designación comercial de "Pure-Wraps") . El muestreo se llevó a cabo insertando el hisopo de rayón en la punta anterior de los orificios nasales del sujeto y rotando el hisopo por dos revoluciones completas a lo largo de la superficie mucosal de los orificios nasales. Cada muestra de hisopo se eluyó utilizando 1 ml de solución reguladora de pH PBS L64. Una muestra de cada 6 pacientes se analizó utilizando sensores de polidiacetileno recubiertos como se prepararon en el Ejemplo Preparativo 3. La segunda muestra del mismo paciente se eluyó utilizando 1 ml de solución reguladora de pH PSB L64 y se cultivaron para obtener un conteo bacteriano para la comparación que se reporta en la Tabla 7 siguiente. El procedimiento de cultivo para estos ejemplos sigue lo generalmente descrito en The Staphylococci in Human Disease; Crossley, K.B. and Archer, G.L. editores, Churchill Liningston, NY, 1997, pp . 233-252. Las muestras a analizar con los sensores de polidiacetileno se prepararon mezclando 250 µl de fibrinógeno disuelto en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 0.5% (v/v) y 250 µl de la solución eluida para cada hisopo del paciente. La solución de muestra se sometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos y después se colocó sobre los sensores recubiertos con polidiacetileno, que habían sido colocados en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 45 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 7 siguiente reportan la respuesta colorimétrica como una función de la concentración de bacteria . TABLA 7 Ejemplo 11 - Detección de S . aureus Lisado en Muestras Clinicas Utilizando una Sonda de Proteina de Fibrinógeno en Solución Reguladora de pH PBS L64 Las muestras de hisopos nasal de 5 pacientes se recolectaron, se recolectaron dos hisopos de cada paciente para un total de 10 muestras. Las muestras se obtuvieron como en el Ejemplo 10. Una muestra de cada 5 pacientes se analizó utilizando los sensores de polidiacetileno recubiertos como se prepararon en el Ejemplo Preparativo 3. La segunda muestra del mismo paciente se eluyó utilizando 1 ml de solución reguladora de pH PSB L64 y se cultivó para obtener un conteo bacteriano como se describe en el Ejemplo 10. Las muestras a analizarse con los sensores de polidiacetileno se prepararon como sigue. Primero, la bacteria S . a u re u s presente en la muestra de hispo eluida de 1 ml se liso mezclando con un volumen equivalente de una solución reguladora de lisado consistiendo de lisostafina (número de catálogo L-4402, Sigma Aldrich) en solución reguladora de pH PSB L64 a una concentración de 3 µg/ml. Después, se mezclaron 250 µl de la solución usada con 250 µl de fibrinógeno disuelto en solución reguladora de pH PBS L64 en la concentración de 0.5% (v/v) . La solución de muestra se sometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos y después se colocó sobre sensores recubiertos con polidiacetileno que habían sido colocados en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 42 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 8 siguiente reportan la respuesta colorimétrica como una función de la concentración de bacteria.

TABLA 8 Ejemplo 12 - Detección de S. aureus Lisado en Muestras Clinicas Utilizando una Sonda de Proteina del Anticuerpo IgG de Anti- Staphylococcus aureus de Conejo en Solución Reguladora de pH PBS L64 Las muestras de hisopos nasal de 6 pacientes se recolectaron, se recolectaron dos hisopos de cada paciente para un total de 12 muestras. Las muestras se obtuvieron como en el Ejemplo 10. Una muestra de cada 6 pacientes se analizó utilizando los sensores de polidiacetileno recubiertos como se prepararon en el Ejemplo Preparativo 3. La segunda muestra del mismo paciente se eluyó utilizando 1 ml de solución reguladora de pH PSB L64 y se cultivó para obtener un conteo bacteriano como se describe en la Tabla 9 siguiente. El procedimiento de cultivo se hizo como se describió en el Ejemplo 10. Las muestras a analizarse con los sensores de polidiacetileno se prepararon como sigue. Primero, la bacteria S. a ureus presente en la muestra de hisopo eluida de 1 ml se liso mezclando con un volumen equivalente de una solución reguladora de lisado consistiendo de lisostafina (número de catálogo L-4402, Sigma Aldrich) en solución reguladora de pH PSB L64 a una concentración de 3 µg/ml. En segundo lugar se mezclaron 250 µl de la solución usada con 250 µl de anticuerpo IgG anti Staphylococcus a ureus de conejo (obtenido de Accurate Chemicals) disuelto en solución reguladora de pH PBS L64 a una concentración de 100 µg/ml. La solución de muestra se sometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos y después se colocó sobre sensores recubiertos con polidiacetileno que habían sido colocados en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). Se tomó una fotografía a los 20 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 9 siguiente reportan la respuesta colorimétrica como una función de la concentración de bacteria .

TABLA 9 Ejemplo 13 - Comparación en la Eficiencia de Detección de Sensores Recubiertos con Polidiacetileno para S. aureus Lisado Contra S. aureus Completo Utilizando una Sonda de Proteina del Anticuerpo IgG de Anti- Staphylococcus aureus de Conejo en Solución Reguladora de pH PBS L64s Una formulación de (60/40) de HO (0) C (CH2) 2C (0) 0 (CH2) 4C=C-C=C (CH2) 40 (0) C (CH2) 12CH3 diacetileno y 1, 2-dimeristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) preparado en el Ejemplo preparativo 1 se recubrió sobre membranas de policarbonato porosas de 25 mm de diámetro con poros de 200 nm de diámetro (Avestin, Inc. Ottawa, Canadá) para hacer muestras detectoras colorimétricas . Las muestras detectoras se prepararon como en el Ejemplo Preparativo 3. El sustrato recubierto de polidiacetileno (círculo de 25 milímetros (mm) ) se cortó en cuatro cuartos. Cada muestra de cuarto se utilizó como una muestra para un experimento. Los sustratos se colocaron en cavidades separadas de placas de microtitulación de 24 cavidades. Las soluciones de muestras bacterianas completas se prepararon mezclando 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo la bacteria S . a ureus competa ATCC 25923 con 250 µl de solución de anticuerpo. La solución de anticuerpo conteniendo el anti- Staphylococcus aureus de conejo (Número de catálogo YVS6881, Accurate Chemicals and Scientific Corp.) a una concentración de 100 µg/ml en solución reguladora de pH PBS L64. Las muestras conteniendo la bacteria S . a ureus usada ATCC 25923 en solución reguladora de pH PBS L64 se preparó utilizando un regulador de pH de lisación que consistió de lisostafina (comercialmente disponible de Sigma-Aldrich, número de catálogo L-4402) a una concentración de 3 microgramos/mililitros en solución reguladora de pH PSB L6 . Las soluciones de muestra de bacteria usada consistieron de 250 µl de la bacteria S . a ureus lisada (ATCC 25923) en PBS L64 mezclado con 250 µl de solución de anticuerpo preparada como se describió anteriormente. La concentración de la bacteria utilizada en las muestras de prueba varió ente 0 y 105 cfu/ml como se reporta en la Tabla 10 siguiente. La mezcla de la solución de bacteria anticuerpo se dejó reposar durante 5 minutos y después se agregó a una placa de 24 cavidades conteniendo el sustrato recubierto con polidiacetileno. Las muestras de control también se prepararon para la comparación. Las muestras de control no contuvieron bacteria y consistieron simplemente de 250 µl de regulador de pH PBS-L64 mezclado con 250 µl de solución de anticuerpo preparada como se describió anteriormente. Se tomó una fotografía cada 5 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (San José, CA), designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0. Los datos en la Tabla 10 siguiente muestran la diferencia en la respuesta colorimétrica entre una muestra de control y la muestra conteniendo la bacteria (ya sea completa o usada), medido a los 15 minutos. TABLA 10 Concentración Diferencia de la Diferencia de de Bacteria Respuesta Respuesta (cfu/ml) Colorimétrica de Colorimétrica de Control para la Control para la Bacteria Completa (? Bacteria Lisada (? Fracción Roja) Fracción Roja) 0 0 0 100 0.05 0.17 1,000 0.05 0.58 10, 000 0.05 0.52 100,000 0.04 0.64 Ejemplo 14 - Efecto de la Composición de Solución Reguladora de pH en la Detección de S. aureus Lisado y S. aureus Completo Utilizando una Sonda de Proteina del Anticuerpo IgG anti Staphylococcus aureus de Conejo y Sensores de Polidiacetileno Recubiertos Treinta y dos sustratos recubiertos con polidiacetileno preparados como en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de cavidades separadas en placas de microtitulación de 24 cavidades. Se prepararon las siguientes soluciones de muestra: Muestra 14A - 500 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de la bacteria S . aureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. Muestra 14B - 400 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . aureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 100 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14C - 350 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S. aureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 150 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14B - 400 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . aureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 100 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14D - 300 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 200 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14E - 250 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 250 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14F - 200 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . aureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 300 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14G - 150 µl de anticuerpo en solución reguladora de pH PBS L64 como se preparó en el Ejemplo 2 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento dado en el Ejemplo 11 + 350 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 14H - 500 µl de solución HEPES con anti Staphylococcus a ureus de conejo (número de catálogo YVS6881, Achúrate Chemical and Scientific Corp.) a una concentración de 100 µl/mg y conteniendo ya sea 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. También se prepararon una serie de soluciones de muestras de control que fueron idénticas en composición a las Muestras 14A-14H excepto que no contuvieron bacteria completa o lisada. Las diferentes muestras de mezcla se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo sustratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). Se tomó una fotografía a los 40 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 11 siguiente muestran la diferencia en la respuesta colorimétrica entre una muestra de control y la muestra conteniendo la bacteria (ya sea completa o lisada), medido a los 15 minutos. TABLA 11 Ejemplo 15 - Efecto de la Composición de la Solución Reguladora de pH en la Detección de S. aureus Lisado y S. aureus Completo Utilizando una Alta Concentración de la Sonda de Proteina de Fibrinógeno y Sensores de Polidiacetileno Recubiertos Se colocaron treinta y dos sustratos recubiertos con polidiacetileno como se prepararon en el Ejemplo Preparativo 3 en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. Se prepararon las siguientes soluciones de muestra: Muestra 15A - 500 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. Muestra 15B - 400 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S. a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 100 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 15C - 350 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 150 µl de solución reguladora de pH HEPES.

Muestra 15D - 300 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 200 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 15E - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 250 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 15F - 200 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 300 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 15G - 150 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 350 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 15H- 500 µl de solución reguladora de pH HEPES con fibrinógeno (disponible de Sigma, cat. No FR4129, Lot# 083K7604) a una concentración de 0.5% (v/v) y conteniendo ya sea 103 cfu/ml de la bacteria S . aureus completa ó 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. En todas las soluciones de muestra 15-15H, el fibrinógeno se disolvió en soluciones reguladoras de pH a una concentración de 0.5% (v/v). También se prepararon una serie de soluciones de muestra de control que fueron idénticas en composición a las Muestras 15A-15H excepto que estas no contuvieron bacteria completa o lisada. Las diferentes mezclas de muestra se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo los sustratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI). Se tomó una fotografía a los 40 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . La respuesta colorimétrica (CR) se determinó. Los datos en la Tabla 12 siguiente muestran la diferencia en la respuesta colorimétrica entre una muestra de control y la muestra conteniendo la bacteria (ya sea completa o lisada) , medida a los 15 minutos.

TABLA 12 Ejemplo 16 - Efecto de la Composición la Solución Reguladora de pH en la Detección de S. aureus Lisado y S. aureus Completo Utilizando una Baja Concentración de la Sonda de Proteina de Fibrinógeno y Sensores de Polidiacetileno Recubiertos Se colocaron treinta y dos sustratos recubiertos con polidiacetileno como se prepararon en el Ejemplo Preparativo 3 en la parte inferior de cavidades separadas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. Se prepararon las siguientes soluciones de muestra: Muestra lßA - 500 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S. a ureus completa o 103 cfu/ml de bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. Muestra 16B - 400 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 100 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16C - 350 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 150 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16D - 300 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 200 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16E - 250 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 250 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16F - 200 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S. a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 300 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16G - 150 µl de fibrinógeno en solución reguladora de pH PBS L64 conteniendo ya sea 103 cfu/ml de bacteria S . a ureus completa o 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11 + 350 µl de solución reguladora de pH HEPES. Muestra 16H- 500 µl de solución reguladora de pH HEPES con fibrinógeno (disponible de Sigma, cat. No FR4129, Lot# 083K7604) a una concentración de 0.05% (v/v) y conteniendo ya sea 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus completa ó 103 cfu/ml de la bacteria S . a ureus lisada a través del procedimiento de lisación dado en el Ejemplo 11. En todas las soluciones de muestra 16A-16H, el fibrinógeno se disolvió en soluciones reguladoras de pH a una concentración de 0.05% (v/v). También se prepararon una serie de soluciones de muestra de control que fueron idénticas en composición a las Muestras 16A-16H excepto que estas no contuvieron bacteria completa o lisada. Las diferentes mezclas de muestra se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo sustratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 40 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . Los datos en la Tabla 13 siguiente muestran la diferencia en la respuesta colorimétrica entre una muestra de control y la muestra conteniendo la bacteria (ya sea completa o lisada), medida a los 15 minutos. TABLA 13 Ejemplo 17 - Detección de S. aureus Resistente a Metacilina (MRSA) Utilizando un Anticuerpo Monoclonal Pre-Reaccionado con Proteina A y Sensores de Polidiacetileno Recubiertos Anticuerpo IgG?K monoclonal contra PBP2' en reacciones cruzadas MRSA con proteína A. Este anticuerpo se pre-reaccionó con la proteína A y después se expuso a MRSA lisado (colección de cultivo 3M #360) . El procedimiento para la lisis de MRSA se siguió como en el Ejemplo 11. El MRSA lisado se preparó en PBS L64 como se describió en el Ejemplo 13. La concentración de la bacteria lisada y utilizada en este ejemplo fue de 105 y 103 cfu/ml. Se utilizó una muestra de control sin bacteria pero conteniendo solamente el agente de lisis en PBS L64. El anticuerpo monoclonal contra PBP2' se preparó en regulador de pH HEPES a una concentración de 100 µg/ml. La proteína A (Zymed, San Francisco, CA, catálogo # 10-1006) también se preparó en regulador de pH HEPES a una concentración de 200 µg/ml. Se utilizaron dos combinaciones diferentes de solución de bacteria y reguladores de pH HEPES conteniendo el anticuerpo y la Proteína A como se describe a continuación. Muestra 17A - 150 µl de solución del anticuerpo monoclonal contra PBP2' en regulador de pH HEPES se mezclaron con 100 µl de la Proteína A en regulador de pH HEPES. Este recipiente se sometió a vórtice y se dejó reposar durante cinco minutos. La Muestra 17A después se mezcló con 250 µl de solución de PBS L64 conteniendo ya sea 103 ó 105 cfu/ml o la muestra de control sin bacteria. El recipiente se sometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos. Tres muestras de PDA recubiertas sobre la membrana de policarbonato como se describe en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en la parte inferior de una placa de 24 cavidades. Las soluciones con niveles variables de bacteria se midieron en pipetas en cavidades separadas. El cambio de color de azul fue seguido y reportado en la Tabla 14 siguiente. TABLA 14 Muestra 17B - 150 µl de solución del anticuerpo monoclonal contra PBP2' en regulador de pH HEPES se mezcló con 50 µl de Proteína A en regulador de pH HEPES. El recipiente se sometió a vórtice y se dejó reposar durante cinco minutos. La Muestra 17B después se mezcló con 300 µl de solución de PBS L64 conteniendo ya sea 103 ó 105 cfu/ml o la muestra de control sin bacteria. El recipiente se sometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos. Se colocaron tres muestras de PDA recubiertas sobre la membrana de policarbonato como se describió en el Ejemplo Preparativo 3 en el fondo de una placa de 24 cavidades. Las soluciones con niveles de bacteria variables se midieron con pipetas en cavidades separadas. El cambio de color de azul se siguió y se reportó en la Tabla 15 siguiente. TABLA 15 Ejemplo 18 - Detección de S. aureus Resistente a Metacilina (MRSA) Utilizando un Anticuerpo Monoclonal Como la Sonda de Proteina y Sensores de Polidiacetileno Recubiertos El procedimiento para la lisis de MRSA es seguido como en el Ejemplo 11. El MRSA lisado se preparó en PBS L64 como se describió en el Ejemplo 13. La concentración de la bacteria lisada y utilizada en este ejemplo fue de 105 y 103 cfu/ml. También se utilizó una muestra de control sin bacteria pero conteniendo solamente el agente de lisis e PBS L64. El anticuerpo IgGiK monoclonal contra PBP2' se preparó en regulador de pH HEPES a una concentración de 100 µg/ml. Después de prepararon las siguientes soluciones de muestra : Muestra 18A - 250 µl de solución de anticuerpo monoclonal contra PBP2' en solución reguladora de pH PBS L64 se mezcló con 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 no conteniendo bacteria. El recipiente después se cometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos. Muestra 18B - 250 µl de solución de anticuerpo monoclonal contra PBP2' en solución reguladora de pH PBS L64 se mezcló con 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 no conteniendo 103 cfu/ml de MRSA lisado. El recipiente después se cometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos. Muestra 18C - 250 µl de solución de anticuerpo monoclonal contra PBP2' en solución reguladora de pH PBS L64 se mezcló con 250 µl de solución reguladora de pH PBS L64 no conteniendo 105 cfu/ml de MRSA lisado. El recipiente después se cometió a vórtice y se dejó reposar durante 5 minutos. Tres muestras de PDA recubierto sobre membrana de policarbonato como se describe en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en el fondo de una placa de 24 cavidades. Las soluciones con niveles variables de bacteria se midieron por pipetas en cavidades separadas, y la placa de microtitulación se agitó en un agitador Modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 45 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . La respuesta colorimétrica para cada muestra se reportó en la Tabla 16 siguiente. TABLA 16 Ejemplo 19 - Detección de E. coli en Solución Reguladora de pH HEPES a Varias Concentraciones Utilizando una Sonda de Proteina de Polimixina en Solución Reguladora de pH PEHES Cinco sustratos recubiertos con polidiacetileno como se preparó en el Ejemplo Preparativo 3 se colocaron en el fondo de cavidades separas en una placa de microtitulación de 24 cavidades. El sulfato de polimixina B (comercialmente disponible de Aldrich) se disolvió en solución reguladora de pH HEPES, a una concentración de 26 nanomoles/ml . Se prepararon las siguientes soluciones de muestra. Muestra 19A - 500 µl de sulfato de polimixina B en solución reguladora de pH HEPES con bacteria. Muestra 19B - 500 µl de sulfato de polimixina B en solución reguladora de pH HEPES conteniendo 103 cfu/ml de bacteria E . coli como se preparó en el Ejemplo de Preparación 8. Muestra 19C - 500 µl de sulfato de polimixina B en solución reguladora de pH HEPES conteniendo 105 cfu/ml de bacteria E . col i como se preparó en el Ejemplo de Preparación 8. Muestra 19D - 500 µl de sulfato de polimixina B en solución reguladora de pH HEPES conteniendo 107 cfu/ml de bacteria E. coli como se preparó en el Ejemplo de Preparación 8. Muestra 19E - 500 µl de sulfato de polimixina B en solución reguladora de pH HEPES conteniendo 109 cfu/ml de bacteria E . coli como se preparó en el Ejemplo de Preparación 8. Las diferentes mezclas de muestra se sometieron a vórtice y se dejaron reposar durante 5 minutos y después se agregaron a cavidades separadas conteniendo los sustratos recubiertos con polidiacetileno. La placa de microtitulación se agitó en un agitador modelo 6000 Eberbach (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI) . Se tomó una fotografía a los 30 minutos utilizando una cámara digital. La fotografía se escaneó utilizando el software de Adobe Systems Incorporated (designación comercial ADOBE PHOTOSHOP versión 5.0, San José, CA) . La respuesta colorimétrica (CR) se determinó. Los datos en la Tabla 17 siguiente reportan la respuesta colorimétrica como una función de la concentración de la bacteria Ejemplo 20 - Liposomas con Acido Tricosadiinoico como Diacetileno Los liposomas con ácido tricosadiinoico se hicieron utilizando el procedimiento en el Ejemplo Preparativo 1. Se prepararon muestras de (60/40) de ácido 10,12-tricosadiinoico/1, 2-DMPC en 5 mmoles en regulador de pH 7.2 HEPES para dar soluciones de 10 ml que fueron de 1 mM en diacetileno para la sonicación y formación de liposoma. Las soluciones concentradas de ácido 10, 12-tricosadiinoico y 1,2-DMPC de manera de manera separada en diclorometano de tal forma que 1 ml de cada solución cuando se evaporó a sequedad y se rehidrató en volumen de 10 ml de regulador de pH dio un complejo (60/40) de ácido 10, 12-tricosadiinoico /1,2-DMPC que fue de 1 mM en diacetileno. Las soluciones de diclorometano se colocaron en un recipiente de 6 dram después se hicieron girar evaporados bajo presión reducida a una temperatura de entre 25 y 30°C hasta que removió el solvente orgánico. El residuo además se secó bajo alto vacío (200 m Torr) durante 10 minutos para remover los últimos rastros del solvente. Las muestras se volvieron a hidratar utilizando 10 ml de regulador de pH HEPES. Esta solución después se sondeó con sonicación utilizando un sonicador de sonda Misonix XL202 (comercialmente disponible de Misonix Inc., Farmington, NY) . Se corrieron una serie de niveles de energía de sonicación en estas muestras de 10 ml . Los intervalos incluyeron niveles de energía de 3, 4, 5 y 6 en donde el nivel de energía 3 se corrió durante 10 a 20 minutos, el nivel de energía 4 de 2.5 a 7.5 minutos, el nivel de energía 5 de 1 a 3 minutos y el nivel de energía 6 de 1 a 4 minutos en longitud. Las soluciones se sonicaron y su apariencia se comparó con los estándares de turbidez McFarland para nebulosidad. Una escala de 0.5 es básicamente transparente y de 4.0 la cual fue nebulosa. Las soluciones se sonicaron a un intervalo de entre 1.0 y 2.0 a una escala de turbiedad. Después de la sonicación todas las muestras se enfriaron a temperatura ambiente (tapadas) y se colocaron en un refrigerador a 5°C durante 20 horas para la formación de vesículas.

Después de 20 horas varias muestras formaron vesículas aceptables que parecen similares en tamaño a liposomas en el Ejemplo Preparativo 1. Estas muestras después se utilizaron para investigación adicional. Las muestras que formaron una fase de liposoma gris se recubrieron como en el Ejemplo Preparativo 3. Los liposomas de la fase gris se recubrieron sobre 200 mM de membranas de policarbonato. El grosor del recubrimiento varió de 2, 3 y 4 pases por membrana a 500 µl por pase. Después se secaron en un refrigerador durante 8 horas y se colocaron en un desecador durante la noche. Las muestras se expusieron a UV bajo una lámpara de longitud de onda de 254 nanómetros hasta que hubieron cambiado a un color azul similar a aquellas muestras hechas en el Ejemplo Preparativo 2 (aproximadamente 0.630% de azul) a través de inspección visual. Para estos lotes se descubrió que el porcentaje máximo de color azul, aproximadamente 0.644%, ocurrió después de 5-7 segundos de la exposición UV. Esto es mucho más rápido que el diacetileno en el ejemplo preparativo 2 (color similar alcanzado en 30 segundos de exposición) . Las muestras polimerizadas se cortaron en 4 piezas. Las piezas de muestra se colocaron en el fondo de las cavidades en una placa de titulación de 24 cavidades. El procedimiento del Ejemplo 18 se siguió para crear soluciones de Muestra 20A, 20B y 20C que tuvieron anticuerpo más niveles de bacteria de 0, 1000 cfu/, 100,000 cfu/ml. Estas soluciones se expusieron en duplicado a muestras de cubiertas con PDA polimerizado. La placa de titulación se colocó en un agitador y la velocidad de agitación se estableció a 60 ciclos/minuto. El cambio de color de la muestra se monitoreó con el tiempo. Ninguna de las muestras cambió el color a rojo. Todas estas permanecieron azules aún después de exposición durante la noche. Se cree que con el ajuste del sistema regulador de pH y el uso de dos sistemas reguladores de pH para la formación de liposoma, la respuesta se puede ajustar para dar un cambio de color a rojo con este sistema PDA. El sistema actual se formuló para la detección con PDA del Ejemplo Preparativo 1. El PDA del Ejemplo 20 es lo suficientemente diferente en estructura para tener influencia sobre el carácter de la superficie de las vesículas y su interacción con la sonda y requiere un sistema regulador de pH diferente para lograr una respuesta colorimétrica. Serán evidentes varias modificaciones y alteraciones a esta invención para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención. Se debe entender que esta invención no pretende estar indebidamente limitada por las modalidades ilustrativas establecidas en la presente y que dichas modalidades se presentan a manera de ejemplo solamente, con el alcance de la invención previsto a limitarse solamente por las reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un sistema colorimétrico para detectar un analito, caracterizado porque comprende: un sensor colorimétrico que comprende: un receptor; una composición polimerizada que comprende por lo menos un compuesto de diacetileno; en donde el receptor está incorporado en la composición polimerizada para formar un transductor; y una composición reguladora de pH que media la interacción entre el analito y el transductor, en donde el sistema regulador de pH comprende dos o más reguladores de pH diferentes; el transductor exhibe un cambio de color cuando se pone en contacto con un analito. 2.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición reguladora de pH comprende dos o más reguladores de pH seleccionados del grupo que consiste de regulador de pH HEPES, regulador de pH de imidazol, regulador de pH PBS y combinaciones de los mismos. 3.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende una sonda . A . - El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda se selecciona del grupo que consiste de fibrinógeno, estreptavidina, IgG, y combinaciones de los mismos. 5.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un agente tensioactivo. 6.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transductor es una liposoma . 7.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transductor exhibe un cambio de color después del contacto con una composición reguladora de pH . 8.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el regulador de pH media la interacción del analito a través de interacciones iónicas con el transductor. 9.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición reguladora de pH media la interacción del analito mejorando las interacciones hidrofóbicas con el transductor. 10.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor comprende un fosfolípido. 11.- El sistema colorimétrico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste de fosfocolinas, fosfoetanolaminas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, y combinaciones de los mismos. 12.- Un método para la detección de un analito, caracterizado porque comprende: formar un sensor colorimétrico, que comprende un receptor y una composición polimerizada que comprende un diacetileno, en donde el receptor está incorporado en la composición polimerizada para formar un transductor capaz de exhibir un cambio de color; poner en contacto el sensor con la sonda; además poner en contacto el sensor con una muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo en la presencia de una composición reguladora de pH que comprende dos o más reguladores de pH diferentes; y observar un cambio de color si el analito está presente . 13.- Un método para la detección de un analito, caracterizado porque comprende: formar un sensor colorimétrico, que comprende un receptor y una composición polimerizada que comprende un diacetileno, en donde el receptor está incorporado en la composición polimerizada para formar un transductor capaz de exhibir un cambio de color en la presencia de una sonda; poner en contacto el transductor con una muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo, y una sonda que tiene una afinidad tanto para el analito objetivo como para el receptor en la presencia de una composición reguladora de pH que comprende dos o más reguladores de pH diferentes; y observar esencialmente ningún cambio de color si el analito está presente. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el analito se selecciona del grupo que consiste de S . a ureus, proteína A, PBP2', E . coli y Pseudomonas aeruginosa . 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cambio de color observable ocurre dentro de los 60 minutos después del contacto con el transductor con la muestra que se sospecha que contiene un analito.