JP2023538876A - 生体物質中の感染性化合物を分離および／または検出および／または生体外で定量する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、微生物に結合することができるアポリポタンパク質Ｈ系ペプチド、ならびにそれを用いて生体物質中の感染性化合物の分離および／または検出および／または定量および／または生体外で同定する方法に関する。特に本発明は、微生物に結合することができるペプチド、かつ生体物質中に存在する微生物を捕捉するためのセンサーとしてのそれらの使用に関する。
Description
本発明は、生体物質中の感染性化合物を分離、および／または検出、および／または定量、および／または生体外で同定する方法に関する。
本特許出願では、用語「生体物質」は、生体組織、生体組織に由来する液状または固形状の調製物または抽出物、あるいは感染性化合物を含み得る天然媒体または非天然媒体、例えば排水もしくは果物および野菜の濯ぎ水などを意味する。このような物質はまた、上記に定義した少なくとも２つの物質の混合物であってもよく、従って、その物質は特に感染症に罹患している患者の組織、器官、糞便、または体液から調製されるか、あるいは「生体外」での培養から得られてもよく、そのような生体物質はまた、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、腹腔液、胸膜液、精液、または腹水液であってもよい。
本特許出願では、用語「感染性化合物」は、外因性または内因性の感染性媒体、あるいはそれらの代謝産物を意味し、その感染性化合物の中では、それは、例えばウイルス、細菌、または真菌を意味する。
β２－糖タンパク質Ｉと呼ばれ、あるいは「β２ＧＰＩ」と略される血漿糖タンパク質が以前から明示されていて、このヒト糖タンパク質の配列は、特に、J. LOZIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 3640-3644 (1984)およびT. KRISTENSEN et al., FEBS Letters, Vol. 289, p. 183-186 (1991)による論文中に示されている。このβ２ＧＰＩタンパク質は多型を有することが判明しているが、β２ＧＰＩという名称は、以下では全ての形態の総称と見做される。
国際出願ＷＯ ９４／１８５６９号では、特定の感染性化合物、特にタンパク質性化合物が、フランス特許２ ７０１ ２６３号に記載されるβ２ＧＰＩ形態表面に固定されることが示されている。国際出願ＷＯ ９４／１８５６９号の文献中には、ウイルス化合物を検出および／または測定する方法が提示され、この方法では、感染性のウイルス化合物がβ２ＧＰＩの使用形態表面に固定され、これによってこの形態のβ２ＧＰＩが生体物質中に含まれる感染性のウイルス化合物に付着して、このように捕捉されたウイルス化合物を分離して、次いでそれらを検出および／または測定する。欧州特許ＥＰ ０７７５ ３１５号では、特にタンパク質性の化合物である感染性化合物と任意の形態のβ２ＧＰＩとの間の複合物の形成が説明されていて、この感染性化合物は、特に細菌またはウイルスであってもよい。
現時点では、生体内でのβ２ＧＰＩの役割はよく分かっていない。しかし生体外での検討では、β２ＧＰＩは、負に帯電した構造物および分子、特に陰イオン性のリン脂質（ＰＬ）、血小板、アポトーシス細胞、ミトコンドリア、ＤＮＡ、胆汁酸に結合する特異性を有することが分かっている。抗リン脂質症候群（ＳＡＰ）などの特定の自己免疫性疾患では、β２ＧＰＩまたはβ２ＧＰＩ－ＰＬ複合体に対する抗体が注目されている。これらの抗体は、凝血を阻害するので循環性抗凝血剤と呼ばれている。これらは、血栓性の静脈または動脈の臨床症状および習慣性の流産をもたらす。ＳＡＰは、血小板減少症、冠動脈疾患または弁膜症、神経疾患、自己免疫性溶血性貧血などの様々な臨床症状を伴うことがある。これらの抗体の存在はまた、感染症（ウイルス、細菌、または寄生虫）および腫瘍形成（固形腫瘍、リンパ増殖症候群など）の際にも出現することもある。これらの性質は、S. Miyakis et al., Thrombosis Research, Vol. 114, Issues 5-6, 2004, p.335-346に纏められている。
ＳＡＰに関与するβ２ＧＰＩエピトープを決定するために、いくつかの検討が実施されてきた。結果としてGharavi et al., Journal of Autoimmunity (2000) 15, p.227-230は、β２ＧＰＩのＶドメイン(Vth domain)からのＧｌｙ２７４からＣｙｓ２８８までの１５個のアミノ酸（ａａ）のペプチドでマウスを免疫化することにより抗ＰＬ抗体および抗β２ＧＰＩ抗体を誘発している。この領域は、Hunt and Krilis, Journal of Immunology, 1994 Jan 15; 152 (2): 653-9が説明している領域に対応し、ＰＬとの連携を担っている。Ito et al., Human Immunology (2000) 61 (4), p.366-77は、ペプチドライブラリーを用いて、Ｔ細胞の応答に関与するβ２ＧＰＩの配列を特定した。Blank et al., PNAS (1999) 96 (9), p.5164-5168は、ＳＡＰに関与すると思われるβ２ＧＰＩの３種のペプチド配列を特定した。Pope et al., J. Immunol. (2012) 189, p.5047-5168は、β２ＧＰＩのＶドメイン(Vth domain)からのペプチドを用いて腸虚血の状況での炎症が軽減されることを説明している。最後にDu et al., Br J Haematol. (2012) 159 (1), p. 94-103は、β２ＧＰＩのドメインＩが血小板減少性血栓性紫斑病での保護効果を有すると考えられることを示している。
Nilsson et al., Mol Microbiol. (2008) 67 (3), p. 482-92は、β２ＧＰＩのドメインＶに由来する特定のペプチドの殺菌効果を示している。抗菌ペプチドがカチオン性かつ疎水性のアミノ酸の群と共通の構造を有すると仮定して、Yeaman and Yount, Pharmacol Rev. (2003) 55 (1), p.27-55は、６個のペプチド、すなわちβ２ＧＰＩのドメインＩに存在するＳＲＧＧＭＲＫ（ＳＲＧ７）ならびにβ２ＧＰＩのドメインＶに存在するＧＤＫＶＳＦＦＣＫＮＫＥＫＫＣＳ（ＧＤＫ１５）、ＧＤＫＶＳＦＦ（ＧＤＫ７）、ＣＫＮＫＥＫＫＣＳ（ＣＫＮ８）、ＦＫＥＨＳＳＬＡＦＷＫＴＤＡＳＤＶＫＰＣ（ＦＫＥ２０）、およびＦＫＥＨＳＳＬＡＦＷＫ（ＦＫＥ１１）を検討している。これらのペプチドの中で、ＧＤＫ１５とＣＮＫ８のみが大腸菌(E. coli)および化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)に対して殺菌効果を有する。この効果は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)に対しては少ない。他のペプチドには効果は殆どないか全くない。ＧＤＫ１５ペプチドとの接触後の細菌の生存率は、（試験された３種の菌株において）菌株に依って異なる。これらの全ての結果では、ペプチドと細菌の相互作用が３種の試験された菌株間で同一ではないと推測される。Agar et al., Blood (2011) 117 (25), p. 6939-47は、β２ＧＰＩのＶドメインへのグラム陰性細菌のＬＰＳの結合を説明していて、より正確には、Agar and coll., Thromb Haemost. (2011) 106 (6), p. 1069-75には、ＬＰＳへのβ２ＧＰＩの結合を阻害することができるこのドメインのペプチドであるＬＡＦＷＫＴＤＡを示している。
これらの文献から、β２ＧＰＩの２つのドメイン、すなわちドメインＩおよびドメインＶ、ならびにこれらのドメインに位置するペプチドが、種々のタンパク質メカニズム、すなわちＰＬへの結合、抗ＰＬの誘発、Ｔ細胞の応答、殺菌効果、ＬＰＳへの結合などに関与しているように見受けられる。Ｎｉｌｓｓｏｎが説明する検討では、ペプチドには殺菌効果があり、この効果は投与量と検討される細菌株に依存する。その検討では、Ａｇａｒはグラム陰性細菌にのみ見出されるＬＰＳ化合物へのβ２ＧＰＩの結合に注目している。しかしこれらのいずれ検討も、これらペプチドの細菌への結合、ならびにこれら同じ微生物の診断へのそれらペプチドの使用を公式には提示していない。
Ｎｉｌｓｓｏｎの検討は、β２ＧＰＩが化膿連鎖球菌(S. pyogenes)のＨタンパク質およびＭ１タンパク質に結合することを示しているが、この結合を担うβ２ＧＰＩ中のペプチド領域は検討していない。Zhang et al., Microbiology (1999) 145 (1), p.177-83は、黄色ブドウ球菌のＳｂｉタンパク質とのβ２ＧＰＩの結合を示している。これらの検討から、β２ＧＰＩと種々の細菌タンパク質との結合が明らかになった。これらのタンパク質には先験的には共通点はないので、当業者はいくつかの配列がこの結合に関与するはずであると考える。さらに、β２ＧＰＩの殺菌効果が実際にある場合に、（β２ＧＰＩのＶドメインに対応する）細菌－ペプチド結合は、これらのペプチドが付着する支持体により捕捉された細菌の培養物によっては検出ができないと思われる。従って上記の事実を考慮すると、当業者には、生体物質中の細菌の分離および／または検出および／または同定および／または定量の目的のために、全ての細菌に共通するβ２ＧＰＩペプチドへの細菌の固定法を探究する意向はなかったと思われる。最終的に、β２ＧＰＩの領域に対応するペプチドの種々のウイルスおよび真菌への結合に関する検討はなされてこなかった。これらは完全に異なる微生物、ウイルス、細菌、および真菌であるので、当業者には、生体物質中の細菌の分離および／または検出および／または同定および／または定量の目的のために、全ての細菌、ウイルス、および真菌に共通するβ２ＧＰＩペプチドへの細菌、ウイルス、または真菌の固定法を探究する意向はなかったと思われる。
本発明に従って、出願人は、β２ＧＰＩのＶドメインに対応する、以下では総称としてｐｅｐβ２ＧＰＩと呼ぶペプチドが、最終的には固形支持体に結合して、細菌、すなわちグラム陽性菌およびグラム陰性菌、ならびにＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルス、および真菌を結合する特性を有することを示した。
本発明に従って、この特性を用いて、分子生物学技術（ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ）および免疫酵素法、ＡＴＰ測定、および培養により、細菌、ウイルス、および真菌を捕捉して、それらを検出および／または定量する。
従って本発明は、微生物に結合することができる、
単独での
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ、
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）、
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）、
あるいはそれらを互いに結合して生成される以下の分子
Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ、または
Ｐ５：Ｒ－Ｘ－Ｒ’、
Ｐ６： Ｈ－（Ｒ）２－Ｋ、もしくは
Ｐ７： Ｈ－［（Ｒ）２－Ｋ）２－Ｋ
から選択されるペプチドに関し、上記の式中で、
ＲおよびＲ’は、同一または異なっていてもよく、Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ；またはＰ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ；またはＰ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣであってもよく、かつ
Ｘは、以下から選択される１つのスペーサーであってもよく、
・Ｓｐ１：－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ２：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｑは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｐおよびｑは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ４：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＺ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、Ｚは環状のＣ５Ｈ１０であり、ｍおよびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれ１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎおよびｐは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ５：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値２、３、４、５、または６、好ましくは３、４、５のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値４を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ６：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、およびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ７：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｎは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ８：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ９：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ１０：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１１：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－ＣＯ －（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１２：－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－；
・ＳＰ１３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ［ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－］（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
ここで当然のことであるが、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３では、任意のアミノ酸を、各回毎に１つだけであるが、任意の他のアミノ酸で置換してもよい。
単独での
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ、
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）、
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）、
あるいはそれらを互いに結合して生成される以下の分子
Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ、または
Ｐ５：Ｒ－Ｘ－Ｒ’、
Ｐ６： Ｈ－（Ｒ）２－Ｋ、もしくは
Ｐ７： Ｈ－［（Ｒ）２－Ｋ）２－Ｋ
から選択されるペプチドに関し、上記の式中で、
ＲおよびＲ’は、同一または異なっていてもよく、Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ；またはＰ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ；またはＰ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣであってもよく、かつ
Ｘは、以下から選択される１つのスペーサーであってもよく、
・Ｓｐ１：－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ２：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｑは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｐおよびｑは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ４：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＺ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、Ｚは環状のＣ５Ｈ１０であり、ｍおよびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれ１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎおよびｐは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ５：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値２、３、４、５、または６、好ましくは３、４、５のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値４を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ６：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、およびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ７：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｎは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ８：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ９：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ１０：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１１：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－ＣＯ －（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１２：－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－；
・ＳＰ１３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ［ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－］（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
ここで当然のことであるが、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３では、任意のアミノ酸を、各回毎に１つだけであるが、任意の他のアミノ酸で置換してもよい。
好ましくは、本発明に従ってペプチドは以下であってもよい：
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）
Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ；
Ｐ８：
Ｐ９：
Ｐ１０：Ｈ－（ＳＳＬＡＦＷＫ）２－Ｋ－ＮＨ２
Ｐ１１：Ｈ－（（ＳＳＬＡＦＷＫ）２－Ｋ）２－Ｋ－ＮＨ２；あるいは
以下の種々のスペーサーにより分離されたＡ：ＣＫＮＫＥＫＫＣおよびＢ：ＳＳＬＡＦＷＫを含むペプチド：
・Ｐ１２
・Ｐ１３
・Ｐ１４
・Ｐ１５
・Ｐ１６
・Ｐ１７
・Ｐ１８
・Ｐ１９
・Ｐ２０
・Ｐ２１
・Ｐ２２
・Ｐ２３
・Ｐ２４
・Ｐ２５
・Ｐ２６
・Ｐ２７
・Ｐ２８
・Ｐ２９
・Ｐ３０
・Ｐ３１
・Ｐ３２
・Ｐ３３
・Ｐ３４
・Ｐ３５
・Ｐ３６
・Ｐ３７
・Ｐ３８
・Ｐ３９
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）
Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ；
Ｐ８：
Ｐ１１：Ｈ－（（ＳＳＬＡＦＷＫ）２－Ｋ）２－Ｋ－ＮＨ２；あるいは
以下の種々のスペーサーにより分離されたＡ：ＣＫＮＫＥＫＫＣおよびＢ：ＳＳＬＡＦＷＫを含むペプチド：
・Ｐ１２
本発明はまた上述のようなペプチドに関し、それらを使用して生体物質中に存在する微生物を捕捉する。本発明に従って、前記微生物は、細菌、すなわちグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、あるいは真菌であってもよい。
本発明はまた、固形支持体に結合された少なくとも１種の前述のペプチドを含むことを特徴とする微生物センサーに関する。
本発明は、上述のようなペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩおよびプロセスの実行のための支持固体を含む生体物質中で、細菌、ウイルス、および真菌を分離する、および／または検出する、および／または同定する、および／または定量する方法に関する。
前記方法は、生体外で実施することが好ましい。
用語「固形支持体」は、Current Protocols in Immunology「免疫学での最新手法」by Editions Coligan J., Bierer B., Margulies D., Shevach E., Strober W., and Coico R., Wiley Interscience, 2013に説明されるうちの１種の支持体のような本分野では既知の任意の固形支持体を指す。この支持体は、例えば、ＥＬＩＳＡ型のマイクロタイタープレート、ニトロセルロースなどの膜、クロマトグラフィー用のゲル、例えばポリスチレン製のビーズ、例えばポリスチレンまたはポリプロピレン製の管などであってもよい。
本発明に従って、生体物質中に存在する微生物を捕捉するための前記生体外での方法は、以下の工程を含む：
・請求項３に記載の微生物センサーを潜在的に微生物を含む生体物質と接触させる第１の工程；
・２分～２４時間の期間に亘って前記センサーと前記生体物質を培養する第２の工程、
・前記生体物質と前記センサーを分離する第３の工程；および
・前記センサーに付着した前記微生物を検出、および／または同定、および／または定量する第４の工程。
・請求項３に記載の微生物センサーを潜在的に微生物を含む生体物質と接触させる第１の工程；
・２分～２４時間の期間に亘って前記センサーと前記生体物質を培養する第２の工程、
・前記生体物質と前記センサーを分離する第３の工程；および
・前記センサーに付着した前記微生物を検出、および／または同定、および／または定量する第４の工程。
上述のようなペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩのうちの１つ以上の固形支持体への付着は、Current Protocols in Immunology「免疫学での最新手法」by Editions Coligan J., Bierer B., Margulies D., Shevach E., Strober W., and Coico R., Wiley Interscience, 2013に説明される方法などの本分野では既知の任意の方法に従って、ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩの反応基と支持体の反応部位との反応によって実施される。
この反応は、好ましくは０℃～４０℃の温度で実施され、ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩは、ｐＨが２．５～１０．５、好ましくは５．５～７．５の緩衝液中に入れられる。好ましくは、等張性またはほぼ等張性の緩衝液を用いる。緩衝液はリン酸塩型または酢酸塩型であってもよい。得られた溶液は、０．００５～１００ｇ／Ｌの濃度のペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを有することが好都合である。支持体は、０～４０℃の温度かつ３０分～２４時間の培養時間でペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを含む緩衝液との接触を継続させることが好都合である。培養後に、未反応のペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを含む緩衝液を支持体から分離して、この支持体をペプチドを含有する緩衝液と同じ緩衝液で洗浄することが好ましい。ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩと反応していない支持体の活性部位を飽和させる必要がある場合がある。この場合に、ウシアルブミン、ウシ胎児血清、カゼイン、グリシン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０または８０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００などの界面活性剤の各溶液から選択される他の活性基を、これらの活性部位に反応させる。
ウシ血清アルブミンの溶液、特にペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩのために使用される緩衝液中の２％溶液を、この目的のために使用することが好都合である。支持体をまた、好ましくは反応後に洗浄し乾燥させる。
上述のような１つ以上のペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを担持する固形支持体の生体物質との反応は、Current Protocols in Immunology「免疫学での最新手法」by Editions Coligan J., Bierer B., Margulies D., Shevach E., Strober W., and Coico R., Wiley Interscience, 2013に説明されるプロセスなどの本分野では既知の任意のプロセスに従って実施される。次いでペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩが固定された支持体を、細菌を含有できる生体物質と接触させる。生体物質を、３．５～１０、好都合には５．６～７．６のｐＨを付与する緩衝液を用いて希釈することが好ましい。この反応を、０℃～５０℃、好都合には３７℃に近傍の温度で、２分～２４時間に亘って実施することが好ましい。次いで生体物質を、少なくとも１つの細菌を有するかまたは必要に応じて固定されたペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを担持する支持体から分離する。次いで生体物質を、必要に応じて溶液で、好ましくは緩衝液で洗浄する。
ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを含む固形支持体表面に固定された感染性化合物の分離または単離を、Guide to protein purification. Methods in enzymology.「タンパク質精製ガイド。酵素学での方法」Published by Deutscher M., Academic Press, 1990に説明される方法などの親和性クロマトグラフィー用に使用される任意の溶出法に従って実施してもよい。生体物質を、ｐＨが２～１１．５で０～５ ＭのＮａＣｌ濃度を有する緩衝液を用いて、好都合にはｐＨが２．５の０．１ ｍｏｌ／Ｌのグリシン－ＨＣｌ緩衝液を用いて、ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩを含む固形支持体から分離または溶出する。
ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩに付着した感染性化合物の検出および／または同定および／または定量は、Current Protocols in Immunology「免疫学での最新手法」by Editions Coligan J., Bierer B., Margulies D., Shevach E., Strober W., and Coico R., Wiley Interscience, 2013に説明される抗体による検出および／または同定および／または定量を用いる手法などの任意の既知の手法で実施されてもよい。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指す。用語「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団からなる抗体組成物を指す。この用語は、この抗体を産生する種、その起源、またはそれが産生される方法に関して限定はされない。ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩに付着した細菌の検出および／または同定および／または定量は、好ましくは感染性化合物の脂質性の抗原またはタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施される。既知の方法では、この抗体を酵素マーカー、コロイド状の金に、あるいは放射性、蛍光性、または発光性のトレーサーに結合させてもよい。
過剰の抗体を洗浄により除去する。次いで既知の方法で、抗体を酵素マーカーに結合する場合に、抗体に結合される酵素に対する特異的な基質を付加して、一定の条件で着色生成物に転換する。前記着色化合物の形成は、所望の感染性化合物の存在を示し、その同定ならびに定量ができるようになる。
ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩに付着した感染性化合物の検出および／または同定および／または定量は、培養法および染色法による検出および／または同定および／または定量を用いる手段など、既知の手段により実施できる。
ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩに付着した感染性化合物の検出および／または同定および／または定量は、核酸技術に基づく方法による検出および／または同定および／または定量を用いる手段など、またCurrent Protocols in Molecular Biology「分子生物学での最新手法」Edited by Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J. & Struhl K., Wiley Interscience, 2003に説明される標識プローブとのハイブリダイズによる、あるいはポリメラーゼにより達成される連鎖反応（「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」と呼ぶ技術）による特定の核酸の配列決定および／または検出および／または同定および／または定量など、任意の既知の手段により実施できる。
ペプチドすなわちｐｅｐβ２ＧＰＩに付着した感染性化合物の検出および／または同定および／または定量は、ＡＴＰ測定法による検出および／または同定および／または定量を用いる手段など、任意の既知の手段により実施できる。
以下に示す実施例は、純粋に本発明の非限定的な説明を目的として、本発明に対する理解を深める。
実施例１：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズ表面へのウイルスの結合
使用するウイルスは、培養上清液に由来するサケの貧血の原因となるＩＳＡＶウイルス（感染性サケ貧血ウイルス）である。
使用するウイルスは、培養上清液に由来するサケの貧血の原因となるＩＳＡＶウイルス（感染性サケ貧血ウイルス）である。
ウイルスの固定を意図して使用されるマイクロビーズは、「Ｅｓｔａｐｏｒ（商標）超常磁性小球体」の名称でＭＥＲＣＫ社が販売する、直径が０．３００～０．５００ ｎｍの磁性マイクロビーズである。
ｐｅｐβ２ＧＰＩを、供給元の推奨に従ってマイクロビーズに接合させた。要約すると、マイクロビーズをｐＨ６．０のリン酸緩衝液中に懸濁する。次いでビーズを、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ－ヒドロキシコハク酸イミドの存在で１５分間活性化する。２ｍＭのＨＣｌで洗浄した後に、ビーズをｐｅｐβ２ＧＰＩを含むｐＨ７．５のリン酸緩衝液中に懸濁する。この結合緩衝液中でのｐｅｐβ２ＧＰＩの濃度は２０ｍｇ／Ｌであり、マイクロビーズを、２５℃の温度で３時間に亘って穏やかに一定に振盪しつつ緩衝液中で培養する。次にマイクロビーズを、１，５００ ｒｐｍで遠心分離して上清液を除去し、遠心分離後の小球を、ｐｅｐβ２ＧＰＩの結合用に使用されるのと同じ緩衝液中に懸濁させて、所望の試験用のｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆されたマイクロビーズの懸濁液を形成する。
検討対象の１００μＬのウイルス培養上清液を、９００μＬのｐＨ７．５のトリス緩衝液および１０μＬのマイクロビーズとともにエッペンドルフ管に入れる。この管を水平に振盪させてマイクロビーズをよく混合して、それぞれの管を３７℃または室温（２２℃）で３０分間培養する。次いでそれぞれの管内で、外側から管の壁面に当てて配置した磁石によってマイクロビーズを液相から分離して、ウイルスＲＮＡを抽出する。このビーズを、ＱＩＡＧＥＮ社が販売するＱＩＡａｍｐ ＲＮＡウイルスキットであるＲＮＡ抽出キット中に含まれるウイルス溶解緩衝液と接触させて、販売元の推奨に従ってウイルスＲＮＡを分離する。
次いでＲＮＡを、以下の手順に従って、逆転写酵素の存在で相補性ＤＮＡに転写する。
最終的に相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ポリメラーゼを用いる連鎖反応によって増幅して、以下の手順に従って定量する。
使用したプライマーは、
プライマーＩＳＡＶ－Ｆ（センス）：３’－ＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴ－５’、および
プライマーＩＳＡＶ－Ｒ（アンチセンス）：３’－ＣＡＧＧＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴ－５’である。
プライマーＩＳＡＶ－Ｆ（センス）：３’－ＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴ－５’、および
プライマーＩＳＡＶ－Ｒ（アンチセンス）：３’－ＣＡＧＧＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴ－５’である。
得られた結果を以下の表１に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドがＩＳＡＶウイルスの捕捉に有効であることを示している。
実施例２：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへのウイルスの結合
使用したウイルスは、培養上清液に由来するＩＰＮウイルス（感染性膵臓壊死ウイルス）であり、サケの膵臓の壊死の原因となるものである。
実施例１の説明と同じ手順を実施した。
使用したウイルスは、培養上清液に由来するＩＰＮウイルス（感染性膵臓壊死ウイルス）であり、サケの膵臓の壊死の原因となるものである。
実施例１の説明と同じ手順を実施した。
使用したプライマーは、
プライマーＩＰＮＶ－Ｆ（センス）：５’－ＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴ－３’、および
プライマーＩＰＮＶ－Ｒ（アンチセンス）：５’－ＣＧＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＴ－３’である。
プライマーＩＰＮＶ－Ｆ（センス）：５’－ＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴ－３’、および
プライマーＩＰＮＶ－Ｒ（アンチセンス）：５’－ＣＧＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＴ－３’である。
得られた結果を以下の表２に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドがＩＰＮウイルスの捕捉に有効であることを示している。
実施例３：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへのウイルスの結合
使用したウイルスは、患者の血漿中に存在するＨＣＶウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス）である。
使用したウイルスは、患者の血漿中に存在するＨＣＶウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス）である。
実施例１の説明と同じ手順を実施した。
使用したプライマーは、
プライマーＫＹ８０（センス）：５’－ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ－３’、および
プライマーＫＹ７８（アンチセンス）：５’－ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ－３’である。
プライマーＫＹ８０（センス）：５’－ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ－３’、および
プライマーＫＹ７８（アンチセンス）：５’－ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ－３’である。
得られた結果を以下の表３に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドがＨＣＶウイルスの捕捉に有効であることを示している。
実施例４：ＥＬＩＳＡ型マイクロタイタープレートへのウイルスの結合
所望の化合物は、内因性ヒトレトロウイルス抗原（ＨＥＲＶ：ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）である。この検討は、自己免疫疾患を患う患者からの血清ならびに健康なドナーからの血清について実施した。
所望の化合物は、内因性ヒトレトロウイルス抗原（ＨＥＲＶ：ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）である。この検討は、自己免疫疾患を患う患者からの血清ならびに健康なドナーからの血清について実施した。
用いた支持体は、「ＤＹＮＡＴＥＣＨ」社から販売される、９６個のウェルと平底部を有するＥＬＩＳＡ型のマイクロタイタープレートである。健康なドナーからの４個の血清試料および自己免疫疾患を患う患者からの４個の血清試料を用いた。
血清試料を、ｐＨ７．６±０．０５の５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ緩衝液で１０倍に希釈する。１００μＬのこの溶液をマイクロプレートの各ウェルの平底部に入れる。
次いでこれを＋３７℃で９０分間培養する。次にそれぞれのウェルからこの液体を吸引する。次いで、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムならびに０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含み７．００±０．０５のｐＨを有する３００～４００μＬのリン酸緩衝液を、それぞれのウェルに導入する。
支持体と３分間接触させた後に緩衝液を吸引する。この洗浄操作を３回実施する。
次いで内因性ＨＥＲＶ－Ｗレトロウイルスのエンベロープタンパク質に対する１００μＬの特異的マウスモノクローナル抗体溶液を各ウェルに添加する。
このプレートを３７℃で６０分間放置する。
このプレートを３７℃で６０分間放置する。
この培養の後に、プレートのウェルの内容物を吸引する。上述の３００～４００μＬのリン酸緩衝液をそれぞれのウェルに導入し、３分間の接触時間の後に緩衝液を吸引する。この洗浄操作を３回実施する。
次いでマウス抗体を認識するポリクローナル抗体溶液を、１ウェル当たり１００μＬ添加する。プレートを３７℃で６０分間放置する。この培養の後に、プレートのウェルの内容物を吸引する。上述のリン酸緩衝液を各ウェルに３００～４００μＬ導入し、３分間の接触時間の後に緩衝液を吸引する。この洗浄操作を６回実施する。
ｏ－フェニレンジアミン、２ＨＣｌのクエン酸ナトリウム緩衝液溶液を、それぞれのウェル当たり１００μＬ添加する。それを室温で３０分間培養させた後に、それぞれのウェルに５０μＬの２ＮのＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させる。反応の最終点に得られる４９２ｎｍでの吸光度を、プレートリーダーロボットを用いて測定する。
以下の表の結果は、Ｐ／２Ｎで表されるが、Ｐは所定の血清について得られた吸光度の平均値に対応し、Ｎは健康なドナーから得られた吸光度の平均値を２倍したものに対応する。
４人の病気の対象のうちの２人に対して、ＨＥＲＶエンベロープ抗原が、試験した２種のペプチドにおいて有効であることが明らかになった（４人の健康な対象では有効でない）。
実施例５：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌の結合
用いた細菌は、臨床分離株由来の大腸菌株(E.Coli)Ｂ６０９４である。予備培養物を、３７℃で１６時間に亘って以下の組成を有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中で培養する。
バクト・トリプトン：１０ｇ
酵母エキス：５ｇ
食塩：１０ｇ
ｐＨ：７．５
水量：１０００ｇ
この予備培養物を、直ちに使用するか、または４．５℃で保存する。
用いた細菌は、臨床分離株由来の大腸菌株(E.Coli)Ｂ６０９４である。予備培養物を、３７℃で１６時間に亘って以下の組成を有するＬＢ（ルリア・ベルターニ）培地中で培養する。
バクト・トリプトン：１０ｇ
酵母エキス：５ｇ
食塩：１０ｇ
ｐＨ：７．５
水量：１０００ｇ
この予備培養物を、直ちに使用するか、または４．５℃で保存する。
この実施例で用いる細菌の結合を意図するマイクロビーズは、０．３００～０．５００ μｍの直径を有する「Ｅｓｔａｐｏｒ（商標）超常磁性小球体」の名称でＭＥＲＣＫ社が販売する磁気マイクロビーズである。
これらのマイクロビーズを、β２ＧＰＩを含むｐＨ６．０の酢酸緩衝液中に懸濁する。この結合緩衝液中のβ２ＧＰＩの濃度を１００μｇ／ｍＬとして、マイクロビーズを、２５℃の温度で３時間に亘って穏やかに一定に振盪しつつ緩衝液中で培養する。次いでマイクロビーズを１５００ｒｐｍで遠心分離して上清液を除去して、遠心分離後の小球を、β２ＧＰＩの結合に使用したものと同じ緩衝液に懸濁し、試験すべきβ２ＧＰＩで被覆されたマイクロビーズの懸濁液を形成する。
検討する細菌の１ｍＬの培養液を溶血管内に入れる。１００μＬの商標名がＴＴＧＢの緩衝液、次いで２０μＬのマイクロビーズを添加する。この管を水平に攪拌してマイクロビーズをよく混合して、３７℃または室温（２２℃）で３０分間培養する。培養の終了時に、マイクロビーズを管の壁面に対し外側に配置された磁石の手段によって液相から分離する。次いでマイクロビーズをＬＢ培地で２回洗浄し、次に以下の配合組成を有する１ ｍＬのＢＴＳ（トリプチカーゼ大豆ブロス）培養培地中に再懸濁する。
カゼインペプトン：１７．０ｇ
大豆粉ペプトン：３．０ｇ
Ｄ（＋）－ブドウ糖：２．５ｇ
塩化ナトリウム：５．０ｇ
リン酸二カリウム：２．５ｇ
水量：１０００ｇ
ｐＨ：７．３
この培養液を使用前に沸騰させ、次いでオートクレーブで滅菌する。
カゼインペプトン：１７．０ｇ
大豆粉ペプトン：３．０ｇ
Ｄ（＋）－ブドウ糖：２．５ｇ
塩化ナトリウム：５．０ｇ
リン酸二カリウム：２．５ｇ
水量：１０００ｇ
ｐＨ：７．３
この培養液を使用前に沸騰させ、次いでオートクレーブで滅菌する。
２０μＬのマイクロビーズ懸濁液を採取して、以下の配合組成を有するＴＳ寒天（トリプチカーゼ大豆寒天）を含むペトリ皿内に展開する。
カゼインペプトン：１５．０ｇ
大豆粉ペプトン：５．０ｇ
塩化ナトリウム：５．０ｇ
寒天：１５．０ｇ
ｐＨ：７．３
カゼインペプトン：１５．０ｇ
大豆粉ペプトン：５．０ｇ
塩化ナトリウム：５．０ｇ
寒天：１５．０ｇ
ｐＨ：７．３
ペトリ皿を＋３７℃で２４時間培養する。次いで寒天表面に増殖した細菌を数える。
得られた結果を以下の表５に纏めてある。それらの結果は、試験したペプチドの全てが、臨床分離株からの大腸菌(E.coli)Ｂ６０５４の捕捉に有効であることを示している。
実施例６：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌の結合
用いた細菌は、採取した大腸菌(E.Coli)の株ＡＴＣＣ ８７３９から得た。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
用いた細菌は、採取した大腸菌(E.Coli)の株ＡＴＣＣ ８７３９から得た。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
得られた結果を以下の表６に纏めてある。それらの結果は、試験したペプチドの全てが、臨床分離株からの大腸菌(E.coli)ＡＴＣＣ ８７３９の捕捉に有効であることを示している。
実施例７：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌の結合
用いた細菌は、Sotto et al., Diabetes Care (2008) 31 (12), p. 2318-24に説明する、糖尿病患者の足の傷から単離された黄色ブドウ球菌(S. aureus)ＳＡ ３７８８０４の菌株である。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
用いた細菌は、Sotto et al., Diabetes Care (2008) 31 (12), p. 2318-24に説明する、糖尿病患者の足の傷から単離された黄色ブドウ球菌(S. aureus)ＳＡ ３７８８０４の菌株である。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
得られた結果を以下の表７に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドが、臨床分離株からの黄色ブドウ球菌(S. aureus)ＳＡ ３７８８０４の捕捉に有効であることを示している。
実施例８：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌の結合
β２ＧＰＩおよびそれに由来するペプチドが接合したビーズを用いて、処理廃水中に存在する細菌を捕捉した。この水は、Ｇｒａｕ－ｄｕ－Ｒｏｉの処理施設から浄水器の出口で回収した。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
β２ＧＰＩおよびそれに由来するペプチドが接合したビーズを用いて、処理廃水中に存在する細菌を捕捉した。この水は、Ｇｒａｕ－ｄｕ－Ｒｏｉの処理施設から浄水器の出口で回収した。前記の実施例の説明と同じ試験を実施した。
得られた結果を以下の表８に纏めてある。それらの結果は、試験したペプチドの全てが、処理施設からの処理廃水に存在する細菌を捕捉するのに有効であることを示している。
実施例９：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌の結合
β２ＧＰＩおよびそれに由来するペプチドが接合したビーズを、ヒト血液中に存在する細菌の捕捉のために用いて血液培養によって増殖させた。
β２ＧＰＩおよびそれに由来するペプチドが接合したビーズを、ヒト血液中に存在する細菌の捕捉のために用いて血液培養によって増殖させた。
これらの血液培養を、静脈血試料（約１０ｍＬ）をＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）３Ｄ型の好気性バイアルに入れて実施する。次いで、これらのフラスコを自動システムにより３５℃で少なくとも５日間培養する。これらの瓶には、各瓶の底部に配置されたセンサーを有する比色検出システムが備えられている。細菌の増殖によって生成される二酸化炭素がセンサーの色を変化させ、この色の変化は自動化システムによって検出されて、細菌の増殖の存在を示す。これらの血液培養は実用的であると言える。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）３Ｄバイアルには活性炭の粒子が存在していて、患者の血液中に潜在的に存在する抗生物質を阻害し、それによって微生物の検出を向上させる。血液培養で陽性と判明した細菌の存在を確認するために、病院では血液寒天培地で培養を実施する。従って、病院からの全ての結果により、以下のことを特定できる。
・陽性の血液培養（自動化システムで陽性、かつ培養で陽性）、
・陰性の血液培養（自動化システムで陰性）、および
・偽陽性の血液培養（自動システムで陽性、かつ培養で陰性）
・陽性の血液培養（自動化システムで陽性、かつ培養で陽性）、
・陰性の血液培養（自動化システムで陰性）、および
・偽陽性の血液培養（自動システムで陽性、かつ培養で陰性）
β２ＧＰＩおよびそれらに由来するペプチドで被覆されたマイクロビーズと血液中に存在する細菌との相互作用を試験するために、１ｍＬの血液培養物を各試料から採取し、１５ ｍＬ管に入れる。２０μＬのマイクロビーズを添加し、それぞれの管を水平に振盪しながら３７℃で培養する。次いで管を磁場中に置いてマイクロビーズを壁面に保持し上清液を除去する。次にマイクロビーズを、前に提示したのと同じ組成の滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、次いでマイクロビーズを１５０μＬのＢＴＳ培養培地中に再懸濁させる。マイクロビーズにより捕捉された細菌を検出するために、ＴＳ寒天上での培養およびＰＣＲの２つの方法を用いた。
培養による細菌捕捉の検出のために、このように得られた５０ μＬのマイクロビーズ懸濁液を採取して、それらをＴＳ寒天を含むペトリ皿内に展開する。ペトリ皿をオーブン中で３７℃で２４時間培養する。次いで寒天上に増殖した細菌を数えた。
得られた結果を以下の表９に纏めてある。それらの結果は、試験したペプチドが、試験した４個の血液培養中に存在する細菌を捕捉するのに有効であることを示している。
ＰＣＲによる細菌捕捉を実証するために、このように得られた５０ μＬのマイクロビーズの懸濁液を採取して細菌ＤＮＡを抽出する。
細菌を、１００μＬの「Ｃｈｅｌｅｘ ３０％」（ＢｉｏＲａｄ社のＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）の添加により溶解する。混合物を９５℃で１０分間培養して、次いで１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。ＤＮＡを含む上清液を－２０℃で保存する。
３μＬの抽出されたＤＮＡに、４７μＬの増幅溶液（ＡｑｕａｐｕｒｅゲノムＤＮＡ単離キット）を添加し、最終濃度を以下の通りとする。
２００ｍＭのｄＸＴＰ：５μＬ、
緩衝液５Ｘ：１０μＬ、
２ｍＭのＭｇＣｌ２：５μＬ、
１０μＭに希釈した以下の各プライマー：１μＬ
２７Ｆ：５’－ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’
１４９２Ｒ：５’－ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’
５ｕ／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社のＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈｔ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）：１μＬ、
注入水の量：５０μＬ
２００ｍＭのｄＸＴＰ：５μＬ、
緩衝液５Ｘ：１０μＬ、
２ｍＭのＭｇＣｌ２：５μＬ、
１０μＭに希釈した以下の各プライマー：１μＬ
２７Ｆ：５’－ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’
１４９２Ｒ：５’－ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’
５ｕ／μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社のＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈｔ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）：１μＬ、
注入水の量：５０μＬ
均質化の後に反応混合物をサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ ｐｅｒｓｏｎｎａｌ）に入れ、次のプログラムにかける。
９５℃で２分間の初期変性
続けて以下を含む３０サイクル
９５℃で１分
６２℃で３０秒
７２℃で１分
次いで７２℃で７分間の最終伸長
９５℃で２分間の初期変性
続けて以下を含む３０サイクル
９５℃で１分
６２℃で３０秒
７２℃で１分
次いで７２℃で７分間の最終伸長
約１４００ ｂｐの増幅産物の存在の検証を、１μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む０．５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中の１．５％のアガロースゲル上で試料の一部を泳動させて実施する。このゲルを、ＵＶ照明により視覚化する。ＰＣＲ産物を、２７Ｆプライマーを用いるＣｏｇｅｎｉｃｓ社（Ｍｅｙｌａｎ， Ｆｒａｎｃｅ）による自動配列決定法により直接的に配列決定する。
得られた結果を次の図１に示す。それらの結果は、試験したペプチドが、試験した２個の血液培養物中に存在する細菌を捕捉するのに有効であることを示している。
図１：ペプチドＰ１１による血液培養中に存在する細菌の捕捉
図１：ペプチドＰ１１による血液培養中に存在する細菌の捕捉
実施例１０：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズ表面へのＨＳＶウイルスおよびＢＶＤＶウイルスの結合
試験したウイルスは、ＨＳＶウイルス（単純ヘルペスウイルス）およびＢＶＤＶウイルス（ウシウイルス性下痢ウイルス）である。
実施例１の説明と同じ手順を実施した。
使用するプライマーは以下の通りである。
ＨＳＶでは
ＨＳＶ－１（センス）：ＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧ
ＨＳＶ－１（アンチセンス）：ＡＣＣＣＴＴＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＡＣＣＣ
ＢＶＤＶでは
ＢＶＤＶ（センス）：ＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣ
ＢＶＤＶ（アンチセンス）：ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡ
試験したウイルスは、ＨＳＶウイルス（単純ヘルペスウイルス）およびＢＶＤＶウイルス（ウシウイルス性下痢ウイルス）である。
実施例１の説明と同じ手順を実施した。
使用するプライマーは以下の通りである。
ＨＳＶでは
ＨＳＶ－１（センス）：ＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧ
ＨＳＶ－１（アンチセンス）：ＡＣＣＣＴＴＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＡＣＣＣ
ＢＶＤＶでは
ＢＶＤＶ（センス）：ＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣ
ＢＶＤＶ（アンチセンス）：ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡ
得られた結果を以下の表１０に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドがＨＳＶウイルスおよびＢＶＤＶウイルスの捕捉に有効であることを示している。
実施例１１：ｐｅｐβ２ＧＰＩで被覆された磁気マイクロビーズへの細菌と酵母の結合
試験した細菌は、Ｃ３大腸菌(E.coli)ＡＴＣＣ １１１０５、Ｃ５黄色ブドウ球菌(S. aureus)ＡＴＣＣ ６５３８、Ｈ６１大腸菌(E.coli)Ｂ６０５４、Ｃ１：大腸菌(E.coli)ＡＴＣＣ ８７３９、Ｈ４６：Ｃ．アルビカンス１、およびＨ：６０ ＳＣＮである。
試験した細菌は、Ｃ３大腸菌(E.coli)ＡＴＣＣ １１１０５、Ｃ５黄色ブドウ球菌(S. aureus)ＡＴＣＣ ６５３８、Ｈ６１大腸菌(E.coli)Ｂ６０５４、Ｃ１：大腸菌(E.coli)ＡＴＣＣ ８７３９、Ｈ４６：Ｃ．アルビカンス１、およびＨ：６０ ＳＣＮである。
実施例９の説明と同じ手順およびプライマーにより実施した。
得られた結果を以下の表１１に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドが細菌と酵母に有効であることを示している。
得られた結果を以下の表１１に纏めてある。それらの結果は、試験した全てのペプチドが細菌と酵母に有効であることを示している。
Claims (6)
- 微生物に結合することができるペプチドであって、
単独での
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ、
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）、
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）、あるいは
それらを互いに結合して生成される以下の分子
Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ；または
Ｐ５：Ｒ－Ｘ－Ｒ’、
Ｐ６： Ｈ－（Ｒ）２－Ｋ、もしくは
Ｐ７： Ｈ－［（Ｒ）２－Ｋ）２－Ｋ
から選択され、ここで、
ＲおよびＲ’は、同一または異なっていてもよく、Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ；またはＰ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ；またはＰ３：直線状のＣＫＮＫＥＫＫＣであってもよく、かつ
Ｘは、以下から選択される１つのスペーサーであってもよく、
・Ｓｐ１：－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ２：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｑは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｐおよびｑは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ４：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＺ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、Ｚは環状のＣ５Ｈ１０であり、ｍおよびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれ１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎおよびｐは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ５：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を独立して有してもよい整数であってもよく；かつｎは、数値２、３、４、５、または６、好ましくは３、４、５のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値４を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ６：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、およびｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ７：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－；式中、ｍおよびｎは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは３、４、５、６、または７のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ８：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ９：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－；式中、ｍは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を有してもよい整数であってもよく；ｎは、数値１、２、３、４、または５、好ましくは２、３、または４のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値３を有してもよい整数であってもよく；かつｐは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値６を有してもよい整数であってもよい；
・Ｓｐ１０：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－（ＣＨ２）ｑ－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１、２、または３のうちのいずれか１つ、好ましくは数値２を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１１：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－ＣＯ －（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、数値１または２のうちのいずれか１つ、好ましくは数値１を独立して有してもよい整数であってもよい；
・ＳＰ１２：－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨＣＨ２ＯＨ－ＮＨ－；
・ＳＰ１３：－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ［ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－］（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＮＨ－；式中、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、数値１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４、５、６、７、または８のうちのいずれか１つ、より好ましくは数値５を独立して有してもよい整数であってもよい；
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３では、任意のアミノ酸を、各回に１つだけであるが、任意の他のアミノ酸で置換してもよいことが理解される、
ペプチド。 - Ｐ４：ＣＫＮＫＥＫＫＣＧＧＳＳＬＡＦＷＫ、
Ｐ１：ＳＳＬＡＦＷＫ、
Ｐ２：環状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋有り）、
Ｐ３：直鎖状のＣＫＮＫＥＫＫＣ（ジスルフィド架橋無し）、
Ｐ８：
Ｐ１１：Ｈ－（（ＳＳＬＡＦＷＫ）２－Ｋ）２－Ｋ－ ＮＨ２、あるいは
以下の異なるスペーサーにより分離されたＡ：ＣＫＮＫＥＫＫＣおよびＢ：ＳＳＬＡＦＷＫを含むペプチド：
・Ｐ１２
- 生体物質中に存在する微生物を捕捉するために使用される、請求項１または２に記載のペプチド。
- 前記生体物質中の微生物は、細菌、すなわちグラム陽性菌およびグラム陰性菌、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルス、または真菌であることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
- 固形支持体に結合された、請求項１～４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のペプチドを含むことを特徴とする、微生物センサー。
- 生体物質中に存在する微生物を捕捉するための生体外での方法であって、
・請求項５に記載の微生物センサーを潜在的に微生物を含む生体物質と接触させる第１の工程；
・２分～２４時間の期間にわたり前記センサーと前記生体物質を培養する第２の工程；
・前記生体物質と前記センサーを分離する第３の工程；および
・前記センサーに付着した前記微生物を検出および／または同定および／または定量する第４の工程、
を含むことを特徴とする、方法。
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