CN101014857B - 用于生物多聚体序列分析的电子转移解离 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在质谱仪中通过使用电子转移解离片段化离子的新方法,所述方法用于使用质谱仪进行肽和蛋白的序列分析。对于肽而言,本发明通过使用RF场装置,促进了沿着肽主链的片段化,并使得可以推断出包括经修饰的氨基酸的样品的氨基酸序列。
Description
相关申请
本申请根据35USC§119(e)要求下述美国临时申请的优先权:2004年3月12日提交的系列号为60/552,876的申请、2004年5月20日提交的系列号为60/572,884的申请和2004年8月6日提交的系列号为60/599,341的申请,其中公开的内容在此以援引的方式纳入本说明书。
背景技术
蛋白和肽的研究和鉴定已成为现代生物学的一个重要分支,并具有了其专用名称:蛋白质组学。质谱成为用于分析肽和蛋白的最重要的手段之一,并且在该领域中进行了多种不同的质谱实验。本发明涉及质谱用于鉴定肽和蛋白的氨基酸序列的用途,所述鉴定中应用的“自下而上”和“自上而下”技术以前在文献中均有描述。目前这类实验中应用最广泛的是“自下而上”的蛋白质组学实验。然而本文描述的本发明将明显改进“自上而下”型实验和任何使用串联质谱(MS/MS)的蛋白质组学质谱测定试验的实施。
在“自下而上”型实验中,被分析的蛋白混合物通常来自一些生物样品(如细胞裂解物),因此可能含有相对含量跨越几个数量级的多达几千种蛋白。这类蛋白样品使用蛋白水解酶(通常为胰蛋白酶或胰蛋白酶和细胞内溶素(endoLys)的组合)消化,导致形成胰蛋白酶肽(消化通常产生约三十种肽/蛋白)的复杂混合物。在消化步骤之后和将样品导入质谱仪之前,通常进行样品清洗、分离、分级和/或化学衍生物化的多个步骤。在一个实施方案中,处理过的肽样品通过纳流(nanoflow)-HPLC(5-200nL/min)进行色谱分离并导入质谱仪,所述纳流-HPLC直接接口于下述三种不同型号质谱仪之一的电喷雾离子化源:Finnigan LCQ Deca或LCQ XP(RF三维四极杆离子阱(RF 3D quadrupole ion trap));Finnigan LTQ(径向弹射(radial ejection)RF二维四极杆离子阱);或Finnigan LTQ/FT仪器(串联RF二维四极杆离子阱/傅立叶变换离子回旋共振质谱仪)。
电喷雾离子化源将从HPLC柱上洗脱的中性样品肽转化为用于质谱仪分析的气相中的离子。在水化酸性溶液中,胰蛋白酶肽在氨基末端和C端氨基酸的侧链(Lys和Arg)上均发生质子化。当电喷雾肽进入质谱仪时,水分被抽离,而带正电的氨基通过氢键结合质子并将质子沿肽主链转移至酰胺基上。结果每个从HPLC上洗脱的胰蛋白酶肽种类的聚集物被转化为沿着肽主链的不同位点质子化的离子化肽分子的集合。
根据一种方法,通过下述一系列步骤获得由不同的肽种类产生的离子MS/MS谱。
1.肽离子被导入并在RF四极杆离子阱(2D或3D)中被捕获。
2.在与选定的肽前体离子种类相关的狭窄质荷比(m/z)范围之外的所有离子均从阱中被排出。
3.分离出的前体肽离子被动力学激发并经过碰撞激活解离(collisionally activated decomposition,CAD)。
4.存留的产物离子进行质量分析以产生质(m/z)谱。
在步骤2中,质子化的肽离子经过与存在气压约为1-5毫托的氦原子的几百次或几千次的碰撞。在这一过程中,离子的内能以小增量方式增长,直至其超过破坏分子的肽主链中的质子化酰胺键所需的活化能(这一过程也经常被称为碰撞诱导解离,CID)。理想的结果是质量相差一个氨基酸的b型和y型片段离子的集合。图1显示了描述不同类型肽主链切割的命名法。b型离子包括氨基末端加上一个或多个氨基酸残基。y型离子包括羧基末端加上一个或多个氨基酸残基。对于相差一个氨基酸的同类型片段的m/z值相减可得出质量,并由此鉴定两个片段中较长一个的多出的残基。继续此过程就可以读出目标肽反向(y离子)和正向(b离子)的氨基酸序列。熟练的分析者可以确定前体肽的全部或部分氨基酸序列。也可以用计算机程序将肽MS/MS谱与来源于蛋白和核酸数据库的肽的理论MS/MS谱相比较,从而对每一个MS/MS谱产生可能的前体肽(及其结构)的列表。
通常样品都相当复杂,因此可能有几十种或几百种不同的肽从LC柱上同时洗脱。为给与仪器记录更高百分比的共洗脱肽前体的MS/MS谱的时间,可使用被称为峰扩展(Peak Parking)的方法来扩展色谱以提供10秒至200秒的样品峰宽。峰扩展的使用在以前的文献中有所描述并为本领域技术人员所知。通常该实验是自动的,并且涉及序列质谱实验的 重复,所述序列质谱实验包括初步的全扫描MS实验,并(通过所得m/z谱的自动分析)从中选择用于后续MS/MS分析的前体m/z峰。依赖于仪器速度和色谱峰宽(个别种类洗脱的持续时间),通常为了从初始的仅有MS的实验鉴定前体的m/z值,要获得3至10个MS/MS谱。前体m/z值筛选所依赖的数据的标准被设计为使得冗余MS/MS谱及已知背景和污染物峰的MS/MS谱最小化。单次的这类数据依赖模式的LC MS/MS实验时间可由30分钟至4小时不等,并可记录几千个肽离子MS/MS谱。在色谱过程结束时,初始混合物中的肽通过针对各种蛋白和核酸数据库处理所记录的肽前体的MS/MS谱的设置而被鉴定。用于分析数据的计算机程序为市售可得的,包括SEQUEST(由Thermo Electron出售)和MASCOT(MatrixScience)计算机程序。通常,使用上述技术可在单次4小时的色谱过程中获得6000个胰蛋白酶肽的序列。可以容易地鉴定出存在于复杂混合物中的5-10fmol水平(上柱量)的肽。
在这些肽的复杂混合物的分析中,记录的唯一性MS/MS谱越多,对混合物的特性鉴定得就越完全,就能从源蛋白中观察到越多比例的肽(序列覆盖),从而能鉴定它们的确定性也就越大。因此获得单次MS/MS谱的时间很重要。不能在少于2秒的时间里产生一个MS/MS谱的质谱仪或进行MS/MS的方法被认为是不适于例如“自下而上”型的蛋白质组学实验的色谱应用的。
用于产物离子产生的CAD的应用受到下列不利条件的困扰,包括:
a)经过翻译后修饰(即磷酸化和糖基化等等)的肽经常因为失去修饰部分而片段化,这更甚于由肽主链的切割而片段化。这些肽离子前体类型中仅有相当少部分(约20%-30%)产生可解释/可检索的产物肽离子谱。
b)包含多个碱性氨基酸残基(Lys、Arg和His)的肽会因此携带两个以上的电荷,并且难以沿肽主链随机片段化,这样会在使用上述技术分析时提供不完全的序列信息。
c)含40个以上氨基酸残基的肽也难以沿肽主链随机片段化,也会提供不完全的序列信息。
因此,需要片段化肽以产生可解释/可检索的产物肽离子谱的合适分布的改进方法。在气相中使质子化肽或蛋白片段化的另一策略可参见McLafferty,et al.,in 1998(J.Am.Chem.Soc.1998,120, 3265-3266)。这一技术涉及存储在傅立叶变换质谱仪的ICR室中的质子化肽与热电子的相互作用。这一过程被称为电子捕获解离(ECD)。最初提出的这一解离过程的机理如下:
在多电荷肽上的质子化氨基RH3 +与热电子的反应释放约6eV的热并形成中性高价氮种类RNH3 ·(见图2A-C)。该化合物随后在比通过分子振荡模式的能量离域更短的时间尺度内解离为RNH2和一个氢原子H·。该氢原子吸附到肽主链上并诱导切割反应以产生a、c、y和z型的片段离子同系物。c和z型离子通常含量较多。在相差一个氨基酸的给定离子系中再进行m/z值相减得到质量,从而鉴定两个片段中较长一个的多出的残基。继续此过程就可以读出目标肽反向(y和z离子)和正向(a和c离子)的氨基酸序列。由于移动电子这一机理提出的最早,所以又提出了解释发现的该机理各种缺陷的其他机理,例如ECD等价片段化多钠化(sodiated)蛋白和肽离子(通过加上Na+而不是H+的离子化)的能力。
这一方法有下列优点,包括:
1)经过翻译后修饰(磷酸化或糖基化)的肽主要在肽主链的键上片段化,可容易地由质谱仪测序。失去翻译后修饰部分的片段化和失去其他侧链部分的片段化仅为次要的副反应或完全观察不到。
2)含有多个碱性残基(并由此在气相中携带两个以上的正电荷)的肽仍然或多或少地沿肽主链片段化并可容易地被测序。
3)ECD片段化不受待测肽大小的限制。McLafferty研究组提供了广泛的证据证明ECD可用于确定完整蛋白的序列并在完整蛋白上确定翻译后修饰的部位。
然而,McLafferty技术也受到下列多种不利条件的困扰,包括:
1)很难在ECD反应发生所需的近似热动力学能量水平同时约束正离子和电子。直到最近,这才仅能够在FT-ICR质谱仪的置于高磁场中的ICR室中实现。上述ECD ICR仪器使用超导磁体以产生通常大约4.7至9特斯拉(Tesla)的磁场,因此每台仪器需耗资50万至150万美元。目前大多数蛋白质序列分析在RF四极杆离子阱、RF四极杆线性阱、Q-TOF(四极杆飞行时间)或TOF-TOF仪器上进行。在除FTICR以外的其他质谱仪上实现ECD的主要困难为:通常在CAD过程中用来容纳离子的不均匀RF场装置(RF阱和离子导向装置)不能约束电子。这是因为电子的质量太小。注入这些装置的电子也难以在近似的热能量水平上保持足够使 ECD反应以任何效率发生的时间间隔。因此,虽然一些研究组最近报道在RF离子阱中实行了ECD,但是这些实验的灵敏度/片段化离子产率要比用ETD所得的结果低得多。
2)在傅立叶变换仪器上的ECD不是很有效。从最先进的仪器上所知的最佳的数据表明总(综合)产物离子信号大约是前体信号的20%(前体到离子的转化效率为20%)。与之相比,市售的应用CAD的离子阱仪器通常根据前体离子可产生的前体到产物的转化效率在50-100%的范围内。肽离子具有的前体到产物的转化效率通常在这一范围的高端。例如使用RF-多极(multipole)的Q-TOF仪器的碰撞室具有的前体到产物的转化效率稍微低一些,但通常也能在30-90%的范围内。
3)大多数已公布的ECD谱是几十个所记录质谱的平均值(或总和)。通常需要大约一秒钟产生一个单次FT/ICR谱。这意味着通常需要几十秒来记录一个具有合适的信噪比的ECD产物离子谱。可能需要至少30个离子来产生可检出的离子信号。与此相反,使用基于倍增管的检测器的RF四极杆离子阱和Q-TOF型的仪器可以容易地检测单个离子。
4)DCE的另一个缺点是:当前体离子是大型肽或者蛋白离子时,推测该前体的产物离子经常通过非共价键(氢键)结合在一起,并且在ECD实验条件下难以解离。需要第二解离步骤以破坏这些氢键并使得ECD产物离子(c和z型产物离子)可被观察到。
本发明提供一种在RF场质谱仪或RF场离子容纳装置中片段化带正电荷肽的新方法,所述方法用于质谱法进行的肽或蛋白序列分析。本发明涉及使用气相负离子将电子转移至带正电的样品离子而使得带正电的样品离子片段化。
发明内容
本发明公开涉及一种在质谱仪中片段化带正电荷肽的新方法,所述方法用于质谱法进行的肽或蛋白序列分析。根据一个实施方案,多肽离子通过电子转移解离活动而沿着肽主链随机片段化,其中目标多肽是离子化的,并被注入至四极杆线性离子阱中。带有一个或多个正电荷的离子化多肽气相离子被导入至四极杆线性离子阱中,使得气相反应物离子与离子化多肽可在受控条件下混合以便使电子从负离子转移至正离子, 并由此诱导电子转移解离多肽产物离子的产生。
根据一个实施方案,提供了一种解离多电荷正离子的方法。所述方法包括如下步骤:将多电荷正离子导入RF电场离子容纳装置;将气相电子转移反应物负离子导入上述离子容纳装置;然后将被导入的反应物负离子或其衍生的反应物离子与多电荷正离子混合,以便反应物负离子或其衍生的反应物离子将电子转移至多电荷正离子或其衍生的多电荷正离子,从而产生解离产物正离子。该过程在本文中被称为电子转移解离(ETD)。在上述实施方案中离子的混合包括为使电子转移发生而实行的离子云的重叠。
根据一个实施方案,使用了包括从多电荷多肽离子的电子转移(夺取)的离子-离子反应,以便在RF电场离子容纳装置中导致多肽分析物离子的反电子转移解离(NETD)。在ETD过程中,多电荷多肽分析物离子为正离子(阳离子)。在NETD过程中,多电荷多肽分析物离子为负离子(阴离子)。使用反电子转移解离(NETD)的术语将这一过程与ETD区分。ETD和NETD代表了两个独立和不同的促进离子-离子反应的解离类型,它们所涉及的分析物离子的电性和相对于分析物离子的电子转移方向都是相反的。
根据一个实施方案,离子化的多肽为多去质子化的肽,自由基气相离子选自任何惰性气体正离子(例如He、Ne、Xe、Ar、N2 +、O2 +、CO+)或任何其他自由基正离子,例如质子化的多芳烃。电子的转移放出足够的热以诱导样品分子的片段化。在另一个实施方案中,使用气相负离子将电子转移至带正电的样品正离子,该过程放出足够的热以诱导样品分子的片段化。根据一个实施方案,自由基气相负离子带一个或多个电荷,并沿着二维多极阱的线性轴被注入,多肽正离子前体从与气相负离子相反的方向沿着二维多极阱的线性轴被注入。
对于肽而言,本发明促进了沿肽主链的片段化,从而可以推导出样品的氨基酸序列。根据一个实施方案,提供了分析多肽氨基酸序列的方法。所述方法包括如下步骤:将多电荷多肽注入四极杆线性离子阱中,并将该多电荷多肽空间隔离在离子阱的第一限定区域内;将单电荷或多电荷气相负离子注入四极杆线性离子阱中,并将该负离子空间隔离在离子阱的第二限定区域内;混合所述气相负离子与多电荷多肽以便使电子从自由基负离子转移至多电荷多肽,并由此诱导电子转移解离产物离子 的产生;通过从电子转移解离产物离子中分离剩余的自由基气相离子而终止反应,通过杆电极上的槽将电子转移解离产物离子连续共振注入离子检测器中,以进行离子的质谱分析和多肽的氨基酸序列测定。
附图说明
图1为质谱法肽分析产生的不同类型的肽主链切割和切割产物的相关术语的示意图。注:a、b、c型片段离子含有前体肽离子的氨基端,而x、y、z型片段含有前体肽离子的C端。低能量CAD过程主要切割酰胺连接而形成b/y型片段对;ECD和ETD切割胺键而大多形成c/z型片段离子。
图2为表示本文所述的为进行ETD实验的仪器装置和添加到Finnigan LTQ的组件的示意图。斜体字列出的项是添加组件,在前透镜和后透镜上的星号表示在此处施加次级RF电压。NICI(负离子化学离子化)离子源(示于右侧)通过添加的两个八极杆和一个八极杆间透镜与线性离子阱相接。这些添加组件用于产生负离子(如需要时或可为正离子)并将其输送至线性离子阱内。
图3为Finnigan MAT 4500 NICI源的示意图。
图4为显示Finnigan MAT 4500 NICI源(在初始实验中)如何用固体探测管将蒽导入的示意图。
图5A-5H为线性离子阱运行以实现正性和负性注入、同时+/-储存和离子/离子反应的示意图。在正常操作中初始正离子从装置前部注入,并在线性阱中心区累积(图5A)。接着,通过所有其他离子被径向弹射出选定的m/z窗(window)的方式筛选并分离出一个选定前体离子种(图5B)。然后,选定前体类型的离子通过调整前区的直流补偿被移至线性离子阱的前区(图5C)。图5D和图5E显示通过提高线性离子阱中心区和后区的直流补偿而将负离子从后源注入的过程。在这种方式下,正离子包含于前区,而负离子被注入穿过后区并在中心区累积。图5E中,在负离子和正离子被混合和反应之前对负离子进行m/z筛选(m/z分离)。最后,通过在透镜上施加由150Vp、600kHz的RF产生的轴向约束假电压(pseudo-potential),使正离子和负离子在联合捕获区混合并反应(图5F)。通过降低中心区的直流补偿和除去假电压以终止反应过程,并诱导阴离子的轴向释放,但还使剩余的前体及产物正离子在轴向留存。通 过缓慢上升主RF(图5G)及m/z连续地径向地将(经过共振激发的)离子弹射至检测器,从而对这些正离子进行m/z分析。或者,可以通过简单的反转直流补偿的方法存留负离子并进行m/z分析(图5H)。
图6表示的是磷酸肽与蒽负离子进行50毫秒反应所得的单扫描ETDMS/MS谱的数据,所述磷酸肽是LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1)、带三个电荷、m/z为482。c型和z型片段离子的预计m/z值分别示于序列的上方和下方。带下划线的是观察到的片段。注意到z5和c7的m/z值都与含有质子夺取产物的离子簇——(M+2H)+2离子的m/z值在722处重叠。c型和z型的所有其他可能的离子都在谱中出现。总反应时间为300毫秒。
图7A-7C表示使用nHPLC-μESI和ETD-MS/MS结合的肽混合物的数据依赖分析。图7A为总离子色谱图(峰宽约为10秒)。图7B表示对100fmol的三质子化肽DRVYIHPFHL(SEQ ID NO:2)的500至600毫秒的单扫描ETD谱所记录的结果。图7C表示对1fmol的三质子化肽DRpSPIRGpSPR的500至600毫秒的单扫描ETD谱所记录的结果。
图8A和8B表示在对人类核蛋白胰蛋白酶消化物中产生的磷酸肽的数据依赖分析过程中,所记录的单扫描(500至600毫秒)CAD和ETD谱的比较。在MS分析之前,将所有的肽都转化为甲酯的形式并进行固定化金属亲和色谱。图8A显示的CAD谱上主要为对应于脱磷酸和脱甲醇或水部分的片段离子。图8B显示了含有14个可能的c型和z型产物离子中的13个的ETD谱。注意到该谱中没有对应于脱磷酸的片段离子。
图9显示的是同一个+7ACTH肽(SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVRVYP7+;SEQID NO:72)(m/z 420)与荧蒽负离子反应~75ms所得的MS/MS谱(图9上栏)以及所述肽与荧蒽负离子反应后再使所得的多电荷产物离子与正合适的六氟化硫负离子反应约200ms所得的MS/MS谱(图9下栏)的比较。
图10A和10B显示的是+7ACTH肽(SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVRVYP7+;SEQID NO:72)(m/z 420)与荧蒽负离子反应约20ms所得的MS/MS谱(图10A)以及所述肽与荧蒽负离子反应后再使所得的多电荷产物离子与正合适的苯甲酸负离子反应约150ms所得的MS/MS谱(图10B)的比较。
图11A和11B显示的是m/z为412.6的人类核磷酸肽离子用标准CAD方法得到的MS/MS谱(图11A)与相同的磷酸肽用ETD得到的MS/MS谱(图 11B)的比较。由标准CAD方法得到的谱(图11A)提供了对鉴定该磷酸肽足够的结构上可知的片段化信息。相反地,用ETD的MS/MS(图11B)提供了几乎完全的c和z离子系列,使得可以鉴定前体离子的整个结构。注:-OCH3表示C端转化为甲酯,e表示谷氨酸甲酯,NL意为标准化强度。
图12A和12B显示的是由CAD和ETD产生的四磷酸化人类核肽的片段化模式的比较。图12A为带四电荷的人类核磷酸肽的CAD MS/MS谱,包含强的中性脱磷酸的信号。图12B为同一磷酸肽的相应的ETD谱,该谱显示几乎完全的c型和z型片段离子系列。注:CAD和ETD谱是在一次分析中连续获得的(扫描号2681和2682)。注:-OCH3表示C端转化为甲酯。
图13显示的是m/z为202的荧蒽负离子与m/z为482的三质子化磷酸肽(LPISASHpSpSKTRSEQ ID NO:1)反应50ms所得的单扫描ETD-MS/MS谱。
图14A和14B显示的是通过CAD和ETD解离分析磷酸化肽RKpSILHTIR(SEQ ID NO:68)所得的谱。CAD谱(图14A)中的大部分信号对应的是脱磷酸离子,仅有小部分为肽主链的片段化离子。同一个肽的ETD谱显示了沿肽主链切割产生的完整的c和z离子系列(图14B)。
图15A和15B显示的是通过CAD和ETD解离分析四质子化肽离子KKFELLPgTPPLSPSRR(SEQ ID NO:69)所得的谱。从被O-GlcNAc修饰的肽所得的CAD谱显示了对应O-GlcNAc氧鎓离子的m/z为204的离子和对应中性脱去203(GlcNAc)的(M+3H)+3前体离子的m/z为623的离子(图15A)。其余CAD谱的信号包括少量的b、y和a型离子。在KKFELLPgTPPLSPSRR(SEQ ID NO:69)的ETD谱中观察到几乎完整的该肽的c和z离子系列(图15B)。
图16A和16B显示的是通过CAD和ETD解离分析三质子化肽GRLGsSRAGR(SEQ ID NO:70)所得的谱。在对该m/z为337的三质子化离子使用CAD所得的谱中有一个m/z为311主要离子,其对应的是从(M+3H)+3的前体离子上脱去(SO3)的离子。上述结果见于图16A。其余的离子在该谱中不可检出。当对GRLGsSRAGR(SEQ ID NO:70)使用ETD片段化时可观察到完整的c和z离子系列,而没有可观察到的从前体离子脱SO3的离子(图16B)。
图17显示的是三去质子化磷酸肽LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1) 与Xe自由基正离子反应200ms所得的串联质谱(10个单扫描质谱的平均)。
图18A-18E显示的是通过CAD和ETD解离分析二质子化肽RPKPQFFGLM(SEQ ID NO:71)所得的谱。图18A显示与荧蒽自由基负离子反应100ms所得的谱。图18B显示与荧蒽自由基负离子反应100ms后再在q=0.25、标准化激活能为35%的条件下进行CAD所得的谱。图18C显示在q=0.25、标准化激活能为35%的条件下进行CAD所得的谱。图18D显示与荧蒽自由基负离子反应100ms后再在q=0.13、标准化激活能为17%的条件下进行CAD所得的谱。图1E显示在q=0.13、标准化激活能为17%的条件下进行CAD所得的谱。
具体实施方式
定义
在本文中使用的术语“卤素”或“卤(代)”包括溴、氯、氟和碘。
本文中使用的术语“卤代烷基”指的是带有至少一个卤素取代基的烷基,例如氯甲基、氟乙基或三氟甲基等等。
本文中使用的术语“C1-Cn烷基”(其中的n为整数)代表具有从一到一个特定数目的碳原子的支链或直链的烷基。典型地,C1-C6烷基包括但不限于:甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等等。
本文中使用的术语“芳基”指的是具有一个或多个芳环的单碳环或多碳环系统,包括但不限于:苯基、苯甲基、萘基、四氢萘基、2,3-二氢化茚基、茚基、蒽基等等。“任选取代芳基”包括具有从零至四个取代基的芳基化合物,“取代芳基”具有从一至三个取代基的芳族化合物,其中所述取代基包括羟基、C1-C4烷基、卤素或氨基取代基。
术语“多芳烃”指的是包括两个或更多芳环(选自芳环和杂芳环结构)的多碳环系统,包括但不限于:萘、芴、菲、芘、荧蒽、1,2-苯并菲(chrysene)、苯并[9,10]菲、苝、吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9-蒽腈(9-anthracenecarbonitrile)、硫芴、1,10’菲咯啉、9’蒽腈和蒽醌。“取代多芳烃”包括至少具有一至三个取代基的多芳烃化合物,其中所述取代基包括芳基、杂芳基、羟基、C1-C4烷基、卤素、-CN或氨基取代基。
术语“杂环基”指的是包括一个或多个杂原子的单碳环或多碳环系统,其中所述杂原子选自氧、硫和氮。
本文中使用的术语“杂芳基”指的是具有一个或多个芳环的单碳环或多碳环系统,所述芳环包含一个或多个杂原子(例如O、N和S),包括但不限于:呋喃基、噻吩基、吡啶基等等。
本文中使用的术语“大分子”指的是单体单位或其衍生物的多聚体,包括合成来源的多聚体和天然存在的多聚体。大分子的实例包括多肽、多糖和核酸。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”和“蛋白”指的是氨基酸的多聚体,而不考虑多聚体的长度,因此上述术语可互换使用。虽然特定实施方案可能特指或排除多肽的化学修饰或表达后修饰,但上述术语在本发明中也不特指或排除多肽的化学修饰或表达后修饰。多肽的化学修饰包括糖基、芳基、磷酸基、脂基、遍在蛋白质基团等基团的共价结合,上述修饰在表达上都包含于多肽这个术语中。此外,经过上述修饰的多肽可能被特化为个别的种以被本发明包括或排除。多肽的修饰可发生于多肽的任何位置,包括肽主链、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。应当理解同一类型的修饰可能以相同或不同的程度存在于给定多肽的某些位置。(参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993);POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983);Seifter et al.,Meth.Enzymol.182:626-646(1990);Rattan et al.,Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992))。
实施方案
本发明公开涉及在质谱仪系统中影响多肽离子解离的离子-离子反应的用途。更具体而言,本发明公开一方面涉及离子-离子反应的应用,所述反应涉及在RF电场离子容纳装置中将电子转移至多电荷多肽分析物离子,并由此促进多肽离子的电子转移解离(ETD)。
根据另一个实施方案,使用了包括从多电荷多肽离子的电子转移(夺取)的离子-离子反应,以便在RF电场离子容纳装置中导致多肽分析物 离子的反电子转移解离(NETD)。在ETD过程中,多电荷多肽分析物离子为正离子(阳离子)。在NETD过程中,多电荷多肽分析物离子为负离子(阴离子)。使用反电子转移解离(NETD)的术语将该过程与ETD区分。ETD和NETD代表了两个独立和不同的促进离子-离子反应的解离类型,它们所涉及的分析物离子的电性和相对于分析物离子的电子转移方向都是相反的。下文将解释和显示这两个不同过程导致沿着分析物多肽离子的肽主链的不同化学键的解离。
根据一个实施方案,将多电荷多肽负离子注入四极杆线性离子阱中,并将该负离子限制在离子阱的第一限定区域内。将带有与多肽离子相反电荷的单电荷或多电荷自由基气相正离子沿四极杆线性离子阱的轴线方向注入四极杆线性离子阱中。将这两种离子或由初始注入种类衍生的离子在线性离子阱中混合,以使电子从负离子转移至正离子,并由此诱导反电子转移解离(NETD)产物负离子的产生。根据一个实施方案,多肽为多去质子化的,气相离子为正离子。在一个实施方案中,正离子为任何惰性气体正离子(例如He、Ne、Xe、Ar、N2 +、O2 +、CO+)或任何其他自由基正离子,例如或者为多质子化多芳烃或取代多芳烃,它可从多肽负离子夺取一个电子。
根据一个实施方案,提供了一种解离多电荷正离子的方法。所述正离子可选自包括大分子的宽范围的物质,所述大分子例如核酸、多糖和多肽及包括药物学试剂和有机化合物复杂混合物的其他化合物。所述方法包括如下步骤:将多电荷正离子导入RF电场离子容纳装置;将气相电子转移反应物负离子导入上述离子容纳装置;然后混合被导入的反应物负离子,以便反应物负离子或其衍生的反应物离子将电子转移至多电荷正离子。在本发明范围内考虑到相应的正离子和/或负离子可被直接注入至RF电场离子容纳装置中以便混合和反应,或者可在注入后和混合前对注入的正离子和/或负离子进行进一步的操作。
根据一个实施方案,在正离子被注入至RF电场离子容纳装置之后,对正离子进行了一步或多步的如下操作。对所述的初始正离子群可进行m/z分离、质子转移电荷还原(包括离子驻留(ion parking))、光解离、碰撞激活和离子-分子反应,以产生初始注入的正离子群的衍生多电荷正离子。类似地,在初始注入的负离子与正离子(或正离子衍生物)混合之前可对负离子进行各种操作。具体而言,对负离子群可进行一步或多步的如下操作:m/z分离、光解离、碰撞激活和离子-分子反应,以 产生初始注入的负离子群的衍生单电荷或多电荷负离子。
因此,在一个实施方案中,将多电荷正离子导入RF电场离子容纳装置;将气相电子转移反应物负离子导入上述离子容纳装置;被导入的负离子和正离子可任选的经过进一步操作,然后将被导入的反应物负离子或其衍生的反应物离子与多电荷正离子或其衍生的多电荷正离子相混合,以便反应物负离子或其衍生的反应物离子将电子转移至多电荷正离子或其衍生的多电荷正离子,从而产生解离产物正离子。
根据一个实施方案,被导入的多电荷正离子为多肽。根据一个实施方案,被导入的反应物负离子或其衍生的反应物离子与多电荷正离子或其衍生的多电荷正离子的动能小于1电子伏特。根据一个实施方案,使用了与背景气体分子的碰撞以使负离子和多电荷正离子的动能降低至接近混合和反应步骤中的热量水平。
根据一个实施方案,RF电场离子容纳装置为RF离子导向装置。在另一个实施方案中,RF电场离子容纳装置为RF离子阱。适用于本发明的这类装置为RF线性多极离子阱,并且在一个实施方案中,RF离子阱为RF三维多极离子阱。在一个实施方案中,负离子沿着RF线性多极离子阱的线性轴被注入。
根据一个实施方案,提供了一种片段化带多个正电荷的多肽的方法。所述方法包括如下步骤:将带多个正电荷的多肽导入离子阱中,将气相负离子导入离子阱中,混合所述气相负离子与带多个正电荷的多肽,以便使电子从负离子转移至带多个正电荷的多肽,并由此诱导带多个正电荷的多肽的片段化,以产生电子转移解离产物离子。在此处使用的术语“将离子导入离子阱”的意图不仅包括那些直接被注入离子阱的离子,还包括那些在初始注入的离子被注入之离子阱中之后产生的衍生物离子。所述离子阱可选自任何本领域技术人员已知的离子容纳装置。合适的装置包括傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪,RF三维多极离子阱(QIT)和RF线性二维多极离子阱。在一个实施方案中,基于装置分离储存负离子/正离子和随后混合它们的能力来选择装置。在一个实施方案中,离子阱为RF离子阱,更具体地在一个实施方案中,RF离子阱为分段线性RF多极离子阱。
在混合多电荷多肽和负离子的过程之中或之后,可对电子转移解离产物离子施加附加的激活能量。更具体而言,可提供给电子转移解离产物离子足够的能量以诱导电子转移型解离途径,而不产生相应的常规碰撞激活解离产物。根据一个实施方案,该过程产生的CAD产物少于20%,在进一步的实施方案中产生的CAD产物少于10%,在更进一步的实施方案中产生的CAD产物少于5%,在再进一步的实施方案中产生的CAD产物少于1%。可以以光激活或碰撞激活的形式提供能量。在一个实施方案中,对电子转移解离产物离子进行低能量偏共振碰撞激活,其中产生的产物中常规碰撞激活解离产物不到20%。根据一个实施方案,在多电荷多肽与负离子混合之后,对电子转移解离产物离子进行进一步激活,所述激活使用q=0.15或更小、标准化激活能为20%或更小、时间60ms的降低的Finnigan LTQ CAD条件。在一个实施方案中,降低的激活条件包括q值为0.13或更小、标准化激活能为17%,时间60ms。
根据一个实施方案,在多电荷多肽与负离子混合并形成了电子转移解离产物离子后,将剩余的负离子排出线性离子阱,而将电子转移解离产物存留在线性离子阱中。随后对存留的电子转移解离产物离子进行低能量偏共振碰撞激活,该激活不足以产生总离子产物的少于20%或少于5%的常规碰撞激活解离产物。
本发明方法产生的电子转移解离产物可用于质量(m/z)分析。根据一个实施方案,提供了一种分析多肽氨基酸序列的方法。所述方法包括如下步骤:将多电荷多肽正离子导入RF离子阱中,将气相负离子导入RF离子阱中,混合气相负离子与多电荷多肽正离子,以便使电子从负离子转移至多电荷多肽正离子,并由此诱导电子转移解离产物离子的产生,通过将剩余的气相离子与电子转移产物正离子物理分离而终止反应,并对存留在阱中的正离子进行m/z分析。存留的正离子可含有电子转移产物正离子或这些电子转移产物正离子衍生的正离子。根据本发明的公开,术语“混合”意图包括使两个离子云重叠而使ETD发生的方法。
在对所述电子转移解离产物离子进行质量(m/z)分析和检测之前,在一个实施方案中,第一型负离子被从离子阱中排出,然后将第二型负离子导入离子阱,其中第二型负离子可以基本专一地将质子转移给正离子,然后将所述第二型负离子与正离子混合并反应。根据一个实施方案,所述第二型负离子来源于含羧酸、酚和醇盐的化合物。在一个实施方案中,所述第二型负离子为选自下列化合物的负离子:苯甲酸、PDCH、 SF6和PFTBA。
根据一个实施方案,将带多个正电荷的多肽注入四极杆线性离子阱中,并将该多肽隔离在离子阱的第一限定区域内。将单电荷或多电荷气相负离子注入四极杆线性离子阱中,并将该负离子空间隔离在离子阱的第二限定区域内。根据一个实施方案,负离子为自由基气相负离子,多肽为多质子化的多肽。然后混合所述气相负离子与多电荷多肽以便使电子从自由基负离子转移至多电荷多肽,并由此诱导电子转移解离产物离子的产生。
电子转移解离(ETD)诱导多肽沿着肽主链片段化,从而可用质谱进行多肽序列分析。电子转移解离(ETD)结合了两种现有方法——碰撞诱导解离(CID)和电子捕获解离(ECD)——的优势。ECD现在局限地用于(用于分析目的)在超导磁体中使用Penning阱作为质量分析器的昂贵的傅立叶变换仪器。与之相反,ETD与CID相似,可适用于各种RF四极杆离子阱质谱仪和Q-TOF型仪器,也适用于其他混合型仪器,所述混合型仪器使用(或适于使用)RF多极线性阱以在最后的质量分析器之前累积离子。ETD与ECD产生相同类型的片段离子,从而可理想地用于含有多个碱性氨基酸和翻译后修饰的肽的鉴定。如本文所示,ETD技术在色谱时间尺度(约200-500ms/谱)内产生高质量的谱(前体到产物的转化效率约为5-20%)。
根据一个实施方案,使用气相负离子在质谱仪的RF多极离子阱中将电子转移给带正电荷的样品(图2显示了仪器示意图)。上述过程中放出的热足以使样品分子片段化。对于肽而言,本发明促进了沿肽主链的片段化,从而可以推导出样品的氨基酸序列。使用这一方法,可使用例如甲烷在化学离子化(CI)源中产生负离子作为反应物气体(见图3和图4)。用70eV的电子对1托压力的甲烷电子轰击可产生CH4 +·、CH3 +和一群相近似的热电子。
方程式1:CH4+e70eV→CH4 +·+e- <70eV+e- Thermal
方程式2:CH4+e70eV→CH3 ++H·+e- <70eV+e- Thermal
为产生用于ETD反应的负离子,分子被汽化至化学离子化源中使其与热电子群反应。此为公知技术,前人已有描述(Hunt et al.,Anal.Chem.1976,48,2098和Hunt et al.,Anal.Chem.1978,50,1781-1784)。任何具有积极的电子亲和力(EA)(通过放热反应形成稳定或瞬时稳定的自由基负离子)的分子都可具有电子供体的功能,从而具有在电子转移解离反应中作为反应物的潜力。然而,应注意到非自由基(偶数电子)负离子也可以作为电子供体。潜在反应物负离子的实例如下:
方程式3(六氟化硫):SF6+e- Thermal→SF6 ·-
方程式4(全氟苯):C6F6+e- Thermal→C6F6 ·-
方程式5(全氟苯):C6F6+e- Thermal→C6F5 ·-+F·
方程式6(蒽):C14H10+e- Therma1→C14H10 ·-(蒽自由基负离子)
非自由基蒽离子的方程式如下:
C14H10 ·-→C14H9 -+H·(单分子分解产物)
C14H10 ·-+CH4→C14H11 -+CH3 ·(离子-分子反应产物)
根据本发明的一个实施方案,提供了一种在质谱仪中随机解离带正电离子的方法。在一个实施方案中,所述方法包括在RF场仪器中将电子从气相负离子转移到带正电离子的步骤。在一个实施方案中所述负离子为单电荷负离子,在另一个实施方案中所述RF场仪器为分段二维多极阱,在一个实施方案中所述仪器为分段二维四极阱。在一个实施方案中,稳定或瞬时稳定的负离子沿分段二维多极阱的轴向被注入以防止电子从反应物负离子上被碰撞激活而脱离。在进一步的实施方案中,带正电的离子沿分段二维多极阱的轴向被注入分段二维多极阱的与负离子注入端相对的一端。
根据一个实施方案,通过下述方式进行ETD实验:将电喷雾离子化产生的质子化肽沿轴向注入分段二维多极阱的一端,并将它们储存于前段(图5A-5C)。将负离子从相对一端沿轴向注入同一分段二维多极阱(图5D)。负离子储存于线性离子阱的中段(图5D和图5E)然后使其与正离子混合(图5F)。在规定的反应时间后沿轴向排出负离子,而对产物正离子进行质量分析(图5G和图5H)。
根据一个实施方案,通过连续离子/离子反应与在线色谱相结合,可将ETD用于完整蛋白的直接序列分析。在该实施方案中,在线性离子阱质谱仪中多电荷多肽先被分离并与单电荷或多电荷负离子反应。在一个实施方案中负离子为自由基负离子,在另一个实施方案中负离子为单电荷自由基负离子。在相对短时间的反应(约5至约20毫秒)后将剩余的负离子从离子阱中排出,并使多肽离子产物与注入离子阱的第二种负离子反应。注入离子阱的第二种负离子是基于它们转移质子的能力而选择的。 将质子转移至多肽离子产物可以简化产物谱,使其只包括单质子化片段离子,从而产生表现前体蛋白N端和C端特征的单电荷c型和z型片段离子的同系列。在一个实施方案中,注入离子阱的第二种负离子为偶数电子的苯甲酸的负离子,反应进行约75至约150毫秒。
当多电荷(质子化)肽(M+nH)+n遇到奇数电子负离子A·-或偶数电子负离子A-时会发生不同的反应。这里的n为限定前体离子初始电荷数的一个整数(假定为2或更大)。申请人主要观察到的反应包括下列的电子转移(方程式7和9)或质子转移(方程式8和10)。电子转移反应(方程式7和9)产生氢自由基,氢自由基诱导在ECD条件下观察到的肽主链片段化。质子转移反应(方程式8和10)减少肽上的电荷,但不能促进片段化。质子转移反应中释放的能量保留在含有新形成的共价键的产物中,因此能量集中于AH或AH·中,而不在质子化肽中。
方程式7:[M+nH]+n+A·-→[M+nH]·(n-1)++A→[M+(n-1)H](n-1)++H·+A
方程式8:[M+nH]+n+A·-→[M+(n-1)H](n-1)++[AH]·
方程式9:[M+nH]+n+A-→[M+(nH)]·(n-1)++[A]·→[M+(n-1)H](n-1)++H·+A·
方程式10:[M+nH]+n+A-→[M+(n-1)H](n-1)++[AH]
当正离子与负离子形成可随后解离产生各种产物离子的结合复合物时也观察到了相关反应。
电子转移包括前体正离子从反应物负离子夺取电子。与该过程几乎同时地紧接着发生所得自由基正离子的解离。多电荷肽正离子的解离主要产生c’型和z型片段种类,较少地产生a型和y’型片段种类。
电子转移
方程式11:[M+nH]n++[A]-·→[M+nH]·(n-1)++A
氢释放
方程式12:[M+nH]·(n-1)+→[M+(n-1)H](n-1)++H·氢释放
重组和解离
方程式13a:[M+(n-1)H](n-1)++H·→[Ci+(m+1)H](m)++[ZN-i+(n-1-m)H]·(n-1-m)+
c’ z
或
方程式13b:[M+(n-1)H](n-1)++H·→[Ai+mH]·(m)++[YN-i+(n-m)H](n-1-m)+
a y’
根据残留质子在肽上的位置,产物可被离子化或不被离子化。此处的下标i是对于含有氨基端的产物,根据标准表示法限定的肽主链的切割位置。数字N和m为分别限定肽或片段上的氨基酸数目和c型或a型片段上所保留质子数的整数。据信在ETD中产生产物种类的机理与用ECD所观察到的产生同样片段的机理相同。
根据一个实施方案,在质谱仪中随机片段化肽的方法包括如下步骤:
通过将无机或有机分子汽化至Townsend放电源或常规负离子化学离子化源中而从低电子亲和力底物中产生气相负离子,上述操作在例如甲烷、异丁烷或氩气的缓冲气体条件下进行。这些源产生大量供气相有机或无机分子捕获的热电子。
将所需的负离子以消除或最小化电子脱离对负离子的破坏的方式注入离子储存装置。在一个实施方案中,该步骤包括将负离子沿装置的轴向注入分段Thermo Electron二维四极杆线性离子阱(LTQ)和在该装置第二段储存所述离子。这一方法使氦浴气体能量碰撞最小化。因此,上述方法可使得从具有宽范围电子亲和力的底物中产生用于ETD的负离子。
多电荷多肽可由电喷雾离子化产生并被注入至用于与负离子反应的离子储存装置中。在一个实施方案中,该步骤包括将多电荷正离子沿装置的轴向注入分段二维四极杆线性离子阱和在该装置第一段储存所述离子。
两个离子群在第二段混合以使电子从负离子转移至多电荷正离子。从自由基至带正电样品的电子转移放出足够的热以使样品分子片段化。对于肽而言,本发明促进了沿肽主链的片段化,从而可以推导出样品的氨基酸序列。
反应物负离子
如上所述,任何具有积极的电子亲和力(EA)(通过放热反应形成稳定或瞬时稳定的自由基负离子)的分子都可具有电子供体的功能,从而具有在电子转移解离反应中作为反应物的潜力。另外,我们还鉴定了一些形成偶数电子种类的化合物,所述偶数电子种类在与多电荷肽反应时转移电子并实行ETD。因此,形成自由基并不是鉴定一个负离子是否具有电子转移能力的唯一标准。我们的初始研究使用了来源于下列一些化合物的负离子:FC-43(全氟三丁基胺,PFTBA)、六氟化硫(SF6)、全氟-1,3-二甲基环己烷(PDCH)、六氟苯(C6F6)。在上述研究中观察到了ETD型片段化,但主要发生的是质子转移反应。然后我们开始着力于分离与选定的肽离子反应的特定的负离子。当时,我们发现背景离子——而非上述的种类——与低水平ETD片段化有关。从六氟化硫和PDCH分离负离子的研究证实这些离子仅诱导质子转移反应,并观察不到可检出的ETD。
然后研究了例如可转化为C14H10 -的蒽的芳族种类作为反应物的结果。为使质子转移至负离子的反应最小化,也可使用9,10-二苯蒽作为反应物。其他可以用作反应物以促进电子转移解离的芳族化合物包括芳烃(多环芳基)和取代芳烃。根据一个实施方案,一种多环芳烃具有如下通式:
其中n为1或0;
X选自S,O,N,NH,CR5和CHR5;
Y选自S,O,N,NH,CR6和CHR6;
W选自S,O,N,NH,CR7和CHR7;
U选自S,O,N,NH,CR8和CHR8;
Z选自S,O,N,NH,CR3、CHR3和-CHR8CHR7-,T和V各自独立地选自S,O,N,NH,CR5和CHR5;其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、C5-C6芳基、C5-C6杂芳基、卤素、CN、C1-C4烷基、氨基和羟基,或者R1和R8和/或R2和R7与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环或C5-C6杂芳环,或者R7和R5和/或R6和R8与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环或C5-C6杂芳环,或者R2和R3与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环或C5-C6杂芳环。
根据一个实施方案,n为1,X和Y各自独立地选自S,O,N,NH,CH和CH2;W为CR7或CHR7,并且U为CR8和CHR8,其中R7和R8各自独立地选自H、C5-C6芳环、C5-C6杂芳环,或者R1和R8与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环,C5-C6杂芳环,并且R2和R7与它们所结合的 原子一起形成C5-C6芳环,C5-C6杂芳环。在另一个实施方案中,T和V各自独立地选自S,O,N,NH,CH2和CH,Z选自S,O,N,NH,CH和CH2,R1和R2各自独立地选自H、C5-C6芳基、C5-C6杂芳基、卤素、CN、C1-C4烷基、氨基和羟基。在另一个实施方案中,T和V各自独立地选自S,O,N,NH,CH2和CH,R1为H并且Z为CHR3,其中R2和R3与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环,C5-C6杂芳环。在另一个实施方案中,T和V各自独立地选自S,O,N,NH,CH2和CH,并且Z为-CHR8CHR7-,其中R1和R8与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环,C5-C6杂芳环,并且R2和R7与它们所结合的原子一起形成C5-C6芳环,C5-C6杂芳环。
所有测试过的芳烃在与多电荷肽反应时都有一定的诱导电子转移解离的能力。测试过的负离子包括:萘、芴、菲、芘、荧蒽、1,2-苯并菲、苯并[9,10]菲、苝、吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9-蒽腈、硫芴、1,10’菲咯啉、9’蒽腈和蒽醌。上述所有化合物所产生的负离子都在一定程度上诱导电子转移解离。尽管所有这些芳烃都促进电子转移,但是荧蒽的效果特别好。下面是一些化合物的化学结构,测定过它们的ETD诱导能力:
因此,芳烃化合物代表了广泛的一类化合物,它们在转化为相应的负离子时可以将电子转移至多电荷正离子。而且,对这些化合物的包括硫、氧或氮原子的修饰(杂环)不改变它们的电子转移能力,因此经修饰的化合物也包括在这类电子转移促进化合物中。因此,在本发明的一个实施方案中,根据本发明以负离子形式使用了多环和杂环化合物用于促进多肽的电子转移解离。表1显示了化合物、分子量及其相应负离子的观察到的m/z值。
表1
化合物 | 分子量(道尔顿) | 负离子m/z(道尔顿/电荷) |
萘 | 128 | 127、128、129 |
芴 | 166 | 165、166、180 |
菲 | 202 | 177、178 |
芘 | 202 | 201、202 |
荧蒽 | 202 | 202 |
1,2-苯并菲 | 228 | 227、228、229 |
苯并[9,10]菲 | 228 | 227、228、229 |
苝 | 252 | 252 |
9’蒽腈 | 203 | 202、203 |
吖啶 | 179 | 178、179 |
1,10’菲咯啉、 | 180 | 179、180 |
2,2’联吡啶、、 | 156 | 155、156 |
2,2’联喹啉、 | 256 | 256 |
硫芴 | 184 | 183、184 |
蒽醌 | 208 | 207、208 |
仪器操作
根据一个实施方案,进行上述实验的仪器为经过改进的市售系统——改进的Finnigan LTQ(Thermo Electron),所述改进是为了在二维多极离子阱中实行改进的片段化多肽方法所需的步骤。也可以使用含有其他市售或订制的组件的其他备选仪器配置。在ESI源至RF四极杆线性阱(RF QLT)之间的离子通道机件和对离子通道施加电压的机件没有改变。图2概括显示了对仪器所作的改进。
简而言之,对Finnigan LTQ二维多极线性离子阱进行了如下改进。在仪器的后真空凸缘处连接了一个第五差分抽气真空区域以使其适应Finnigan MAT 4500离子源。使用Alcatel 2008A旋转叶片机械泵支持的Pfeiffer TMH230-160型双级涡轮分子泵的高真空级抽空上述区域。使用了标记为Rear Octopole#1和Rear Octopole#2的两个RF八极杆导向装置运输从Finnigan MAT 4500离子源发射的离子。分隔两个RF八极杆离子导向装置的平透镜的孔径作为附加的真空区Vacuum region#5和包含RF线性四极杆离子阱QLT的LTQ的真空区域之间的不同抽气传导的限制。Rear Octopole#1包括一对2英寸长的八极杆电极组件(r0=.108in),与Finnigan LCQ头尾相接并且电学上连接为一个单元。Rear Octopole#2仅为一个单独的LCQ八极杆电极组件。RF QLT的组件在机械方面没有改动。但是改变了前透镜与后透镜电极的电学连接,使得对于这些透镜RF电压可以叠加于由标准电子装置提供的DC偏置电压之上。
离子源透镜电压由Finnigan MAT 4500 PPNICI控制模块提供,灯丝能量和发射控制由Finnigan MAT 4600四极杆电子模块(QEM)提供。离子源加热器的能量和调节由基于Omega Model CN9000A温控器和1.5A 24VAC转换器的自制装置提供。离子源的校准气体电磁阀由另一个自制装置操纵。用球阀[A and N Corporation]替换了离子源的标准探测器真空联锁波纹管阀。用一组开关阀和Alcatel Model 2012机械泵在探测器联锁和校准气体入口处提供大致的真空。
由自制的电子模块提供后八极杆RF和DC电压以及QLT端透镜的RF电压,所述自制电子模块使用了由Finnigan LCQ和TSQ 7000仪器改进的电路图。虽然两个八极杆由相同的RF电压驱动,但是它们具有各自的DC偏置电压。类似地,QLT端透镜接受相同的次级RF电压,但是也具有各自的DC偏置电压。由两个频率合成器——Wavetek/Rockland Model5100和Stanford System Model_DS340——分别提供八极杆和端透镜RF电路的基准频率。后八极杆和端透镜RF电压的振幅均由LTQ电路中空余的DAC(数码至模拟转换器,Digital to Analog Converter)控制。将仪器中植入的计算机控制系统重新设置,使其可以在质谱实验(扫描功能)的进行过程中控制上述电压。
当在负离子化学离子化模式下操作时,离子源透镜L1、L2和L3(L1是距离子室最近的透镜,L3是最远的)分别具有+10V、+70V和+23V的 DC偏置电压。为将负离子运输至QLT,相邻两杆之间的RF电压通常为零峰值振幅约300V、频率约2.2MHz。当要中断离子向QLT的运输(门关闭)时,就将后八极杆射频振幅变为零。
将标准纳流ESI源用于该仪器。对大多数研究而言,以100nl/min的流速灌注含40%水化乙腈、0.1%乙酸的标准肽混合物。未对上述源进行改进。对于LC/MS实验,必须对上述源进行适当的改进,并电学上连接自制填充毛细管HPLC柱和我们在实验室中使用的集成激光驱动(integral laser pulled)电喷雾发射器。
改进了管理质谱仪的控制以进行ETD MS/MS实验的计算机程序。径向弹射RF四极杆线性离子阱的操作详细描述于Schwartz et al.(J.Am.Soc.Mass Spectrum.2002,13,659-669)。该文献中描述的仪器是Finnigan LTQ的直接前身。装置操作的基本步骤示于图5A-5H,并在下文详细讨论。
操作步骤
多电荷肽正离子由电喷雾离子化(ESI)产生。将含有1pmol/μl肽的40%水化乙腈溶液(0.1%乙酸)灌注至SilicaTM熔化硅发射器(30μm尖端,New Objective,Woburn,MA,USA)中。肽研究包括了促肾上腺皮质激素片段1-24(ACTH激素,Sigma-Aldrich,St,Louis,MO,USA)和内部合成的磷酸肽。使用甲烷缓冲气体(MG Industries,Malvern,PA,USA)的负离子化学离子化用于产生SF6(MG Industries,Malvern,PA,USA)和PDCH(Sigma-Aldrich,St,Louis,MO,USA)的负离子。调整Finnigan LTQ线性离子阱质谱仪使其适用于Finnigan 4500化学离子化源(Finnigan,Sunnyvale,CA,USA),所述化学离子化源连接于装置后部,与原装的纳米喷雾源相对。扫描活动的顺序为:前体离子的隔离(在线性四极杆离子阱中)、用于离子/离子反应的负离子的导入和最后的产物离子的质谱分析,更详细的描述如下:
1.将由ESI产生的正离子注入QLT中,它们在此被碰撞稳定化和捕获。图5A
正离子的注入示于图5A。气压接口的分离器电极保持在地电势0V,这样进入QLT的正离子在0V时具有的动能基本为零。然后偏转处于地电势的后透镜电极,提高DC轴向电势以使得注入的离子经过与背景的少量耗散碰撞后被反射向装置的前部。注入的离子经过进一步与氦原子(约3毫托)的动量消耗碰撞,这有效地减弱了它们的轴向运动并使它们被轴向DC阱捕获,所述轴向DC阱由装置中心区的低偏置电压产生。上述碰撞也减弱了离子的径向运动,使得离子在RF四极场的径向强聚焦作用的影响下驰豫至装置的中心轴附近。除非经过进一步动力激发,否则与氦的碰撞将使被捕获的正离子的动能和内能在约1-2毫秒内降低至接近的热水平。完全碰撞驰豫的被捕获离子将保持被限制于中心轴的约1.0mm的范围内。
通常,为避免空间电荷作用干扰QLT的正常运行,需要防止质荷比在所需的m/z范围以外的离子的累积。这通过在RF四极捕获场上叠加一个补充的双极带宽AC场来实现,这样可以将在四极场中具有特征运动频率(对于装置轴横向运动)的、偏离前体m/z窗中离子运动频率的离子共振弹射出去。对前体离子的注入和累积的RF四极场的最佳强度不能使得前体离子有效地累积并获得通常所需的约3Th(道尔顿/单位电荷)或更窄的m/z分离条带。所以不得不说“注入波形(injection waveform)”分离是相当粗糙的,通常仅能防止m/z比在前体m/z比约±2-10%以外的离子的累积。
2.前体m/z分离。图5B
在终止正离子注入和停止施加任何“注入波形”场之后的几毫秒内,可提高RF四极捕获场的强度以使得可以在所需的m/z分辨率和高效率(前体离子的最低损失)下有效地分离离子。应用了高分辨率“波形”场以使得在前体m/z窗以外的所有正离子都被共振弹射出QLT。通常多于90%的前体离子被存留下来。在m/z分离过程中,QLT的前区和后区的偏置电压相对于中心区保持在约+12V,以将正离子限制在装置的中心区内。
3.前体正离子重新定位至QLT的前区。图5C
在前体m/z分离完成之后,将前区的DC偏置电压降低至比中心区的低1伏。保持前透镜DC偏置电压高于中心区和前区,以保持对正离子的轴向限制作用。在几毫秒之内,所有原先在中心区的前体离子弥散至前区,在此再次经过与氦原子的耗散碰撞使它们停留下来。
4.将由NICI源产生的负离子注入QLT中,它们在此被碰撞稳定化和捕获于装置的中心区。图5D
当前体离子被移至前区时,升高中心区、后区和后透镜的DC偏置电压,使它们高于地电位以进行负离子的注入和捕获。NICI源的偏置为0V以保持前区为负DC偏置电压,这样既保持着前体离子的捕获又在前区产生对负离子的轴向电位屏障。使中心区的偏置比后区的更高以使得负离子在装置的中心区累积。这一步骤与步骤1中的正离子的注入与累积相似,不过负离子是从装置后端注入,而且由于负离子被定义为带负电,所以DC偏置电压为相反的信号。
在负离子注入过程中技术上可以应用“注入波形”以共振弹射出那些m/z比既不接近所需反应物负离子m/z比又不接近之前选出前体正离子m/z比的负离子。但是我们怀疑,即使对那些很可能促进ECD的负离子种类进行温和能量的碰撞也很容易使它们脱去电子。因此除与离子注入相关的激发以外,对反应物负离子任何额外的动力学激发都可能造成我们所需分离的离子的损失。所以不需要再注入过程中进行反应物负离子分离。依赖于NICI源提供的负离子流,负离子注入的通常持续时间为1毫秒至1秒不等(理想情况为仅几毫秒)。
5.反应物负离子m/z分离或m/z消除。图5E
在负离子注入终止后几毫秒之内,调整RF四极捕获场的强度以使得在可获得最佳m/z分辨率和效率的条件下有效地分离前体。所述反应物负离子m/z分离示于图5E。如上所述,反应物负离子“注入波形”能且仅能共振弹射出那些m/z比既不接近所需反应物负离子m/z比又不接近之前选出前体正离子m/z比的负离子。因此m/z比接近之前选出的前体m/z窗的非所需负离子将不会被弹射出去。这种分布并不理想。因而需要在QLT的设计和/或驱动电压上进行实质的改变以防止这一问题。本发明的实践确实保证了大多数不需要的负离子在起动正离子-负离子反应之前从阱中被排出。
在一个单纯的RF四极捕获场中离子运动的基本属性为:在任一特定的RF四极捕获场的强度下,对于离子捕获均有一个相应的阈值m/z比(该值与场强度成比例)。只有m/z比在此阈值以上的离子才被捕获。m/z比低于此阈值的离子被径向弹射出去。我们通常对施加于QLT电极的RF电压强度进行简单的操作就可将低于所关注的反应物负离子m/z比的不需要的负离子种类排除。
一种测定哪种负离子促进ECD的简单方法是:在离子-离子反应之前或之中,使用单频率“波形”共振弹射出对应目标负离子的相当窄m/z范围的离子。这种手段可导致留在阱中的负离子的较低动力学激发,由 此降低因电子脱离而造成负离子损失的可能性。
6.混合前体正离子和反应物负离子以诱导正离子-负离子反应和ETD产物离子的产生。图5F
当所需的被捕获前体正离子和反应物负离子群建立和允许碰撞驰豫以后,在QLT两端透镜板上均施加次级RF电压(根据我们的术语,施加于QLT电极以影响径向容纳的RF电压为初级RF电压)。这个次级RF电压的作用是排斥正离子和负离子。对于任一给定的m/z,这种排斥效果都可以作为与m/z相反变化的排斥电压的模式,并在书面语中称为假电压或效应电压。为影响在QLT相同的区同时捕获的正离子和负离子,并使正离子-负离子反应由此发生,施加于捕获段和端透镜的DC偏置电压是相等的(名义上为0.000伏)。施加于端透镜的次级RF电压形成的假电压提供对于正离子和负离子的必要的轴向捕获。以上示于图5F。
在本发明所有研究中,在正离子-负离子反应间隔中施加于两端透镜的次级RF电压振幅V2为100V(0至峰值),频率f2为约600kHz(四极场频率f1的1/2)。这足以同时捕获m/z比在从低于100u至高于2000u范围内的两种极性的离子。轴向假电压仅在接近端透镜附近有明显作用,因此负离子和正离子都可以弥散至装置的全部三个区并自由反应。目前,我们只能设置QLT的三个区的DC偏置电压等值至±0.030伏以内。控制上述电压的DAC的一个单独增量就对应偏置电压的0.063伏的变化。由于在300℃时一个离子的平均热动能约为0.030eV,所以偏置电压的上述小差异会引起被捕获的正离子和负离子的分离。然而,就我们所观察的大量正离子-负离子反应产物来说,上述情况总的来说似乎不会发生。被捕获的离子群在每一段可能足够高以至于产生补偿空间电荷电压。离子可能会自己分散以提供均匀的轴向电压,由此使离子可以沿装置的轴自由移动。可以相信,离子的轴向迁移率可能是依赖于m/z的,较低m/z的离子通常被限制为距离中心轴较近。这可能是所观察到的ETD产物离子依赖于前体m/z的原因。所以在正离子-负离子反应过程中,三个区段的DC偏置电压在±0.001伏以内相匹配将会是优选的。这样的偏置差异产生的正离子-负离子分离可在实验室温度下被忽略。可以通过重复改变偏置差异的符号以至于可以持续地迫使被捕获的离子再分布并因此保持混合,以可能避免正离子-负离子分离。
反应物负离子群越大,由前体离子向产物离子的转化就越快。当反 应物负离子群大小合适时,足够使大多数前体正离子反应的离子-离子反应时间通常为30-100毫秒。对于在此显示的结果,通常分离了大约3000-30000前体离子(假设前体种类带三个电荷,并且对应10000-100000的AGC MSn目标值)。对离子-离子反应有效的反应物负离子的初始数量可能至少比初始正离子群多3至10倍。如前所述,促进ETD类型的反应物负离子的初始数量可能依赖于被导入NICI离子源的化合物有几个量级的变化。
ETD和质子转移产物离子可能潜在地经历与反应物负离子的进一步反应。这种次级反应会引起中和,并因此损失任何单电荷正离子产物。还可能产生既不包括起始前体肽正离子的N端也不包括其C端的第二代产物离子。这种“内部片段”产物离子是不期望的,因为它们会使所得产物离子的解释复杂化。已经开发了在3D RF四极杆离子阱中抑制上述次级反应的电荷还原(质子转移)离子-离子实验方法(参见U.S.专利申请公开No.US 2002/0092980和US 2002/0166958,其公开内容在此引用)。期望这些方法可以适用于在2D RF四极杆离子阱中反应物负离子和ETD产物正离子之间的次级反应。
尽管也许在需要更长的反应时间、更长的离子累积时间和可能更高的最小样品水平这些方面是不期望的,使用大的前体正离子与反应物负离子的比值可能产生较少的次级产物离子。由于前体正离子群应该总是比产物正离子群大得多,负离子与前体离子反应的可能性比和产物离子反应的可能性大得多。相信可以根据前体的累积速度(从ESI源产生前体离子的速度)自动调节前体离子与反应物离子的比值,由此在前体离子过量时减少次级产物离子的产生。
在我们目前的试验中,质子转移通常产生大量的初级和次级产物离子。例如,带四个电荷的前体离子[M+4H]4+通过一系列的质子转移反应产生带三个电荷的初级产物离子[M+3H]3+,以及带两个电荷的次级产物离子[M+2H]2+,和带一个电荷的次级产物离子[M+H]+。次级产物离子可能与ETD产物离子具有相同的m/z比,并因此干扰它们的观测。在正离子-负离子反应中的初级质子转移产物离子的连续共振弹射消除了这种干扰性次级质子转移产物离子的产生。这还防止了由初级和次级质子转移产物产生的次级ETD产物离子的产生和观测。我们成功地证实了这一方法,尽管它并未用于收集此处所示的数据。
7.离子-离子反应的终止和产物离子质量分析的准备。图5G和5H。
为结束正离子-负离子反应,相对于端区和端透镜的DC偏置电压降低了中心区的DC偏置电压。在2毫秒以内,所有的正离子迁移至QLT的中心区,所有的负离子迁移至QLT的端区。然后,切断施加于端透镜板的轴向捕获RF电压(次级RF电压)释放负离子。这示于图5G中。为诊断目的,获得未反应的反应物负离子的m/z谱经常是有用的。这可以通过消除中心区的相对DC偏置电压,而不是如上文所述的将其降低,从而终止正离子-负离子反应而容易地实现。上述方法在中心区中存留负离子,并轴向提取正离子。这示于图5H中。
在对产物正离子进行质量分析之前,可能需要通过共振弹射具有特定m/z比的正离子进行消除。消除的可能对象是未反应的前体正离子和质子转移产物离子(电荷还原产物离子)。假定目前可得的前体至ETD产物离子的效率为约10-20%,为获得合适量ETD产物的合理策略是分离相当过量(大约5-10倍)的前体正离子,所述前体正离子可直接进行m/z分析并且满足用于m/z任务准确度和分辨率(谱空间电荷极限[25])的仪器技术指标。然而在正离子-负离子反应步骤之后,存留的ETD产物离子的总量(更明确地是指存留的ETD产物离子的总电荷)在谱空间电荷极限以内。
消除与未反应的前体离子和任何存留的质子转移产物离子相关的多余电荷可使ETD产物离子的质谱分析具有良好的m/z准确度和分辨率。由于存留的ETD产物离子的总电荷接近谱空间电荷极限——仪器可提供的最高的产物离子谱的动态范围。这将改善较少组分ETD产物离子(即小ETD峰)的观测。
8.最终离子群的质量分析
以常规方法[Bier-Syka,Schwartz et al.]获得两种选定极性的最终离子群的m/z谱。离子m/z连续地被共振弹射,经过杆电极上的槽到达离子检测器。
在上面列举和讨论的实验的八个步骤中,步骤1、2和8与使用CAD的标准QLT MS/MS实验相比基本上没有改变。应当理解上述步骤通常作为较长的实验顺序的一部分进行。正离子注入时间通常可通过一个(或几个)预实验决定,所述预实验可以估测在正离子注入步骤1的过程中前体正离子在阱中的累积速度,并预先决定将用于实验的全部前体正离 子电荷的目标数量。这种在RF四极杆离子阱质谱仪中调节储存离子电荷(空间电荷)的方法在本领域被称为自动获取控制(AGC)。预期可以使用一个合适的AGC方案以控制用于正离子-负离子反应的反应物负离子群。在本文所显示的数据中,使用了标准MS/MS LTQ AGC预扫描在前体分离步骤之后实现对前体正离子电荷的调节。但还没有实现对选定的反应物负离子的自动调节方案。
在上述过程的步骤的排序中隐含了一个假设:正离子前体的m/z比反应物负离子的大。如果将进行m/z分离的反应物负离子的m/z比值比特定的前体m/z窗大得多,则可能需要颠倒正离子和负离子注入和分离的步骤。最适于反应物负离子分离的捕获条件可能不适于捕获较低m/z的正离子。在这种情况下,应先注入并在中心区收集负离子。m/z分离反应物负离子后再将其重置于后区。然后注入并在中心区捕获正离子,在不引起反应物负离子共振弹射的条件下m/z分离前体正离子。实验其余部分与上述的相同。
以上的讨论着重于在RF QLT质谱仪上实现ETD。在RF多极离子阱中应用不依赖带电符号的离子捕获以用于离子-离子型实验的各种质谱仪系统都适于进行ETD MS/MS实验。在一个实施方案中,适于进行前体正离子和反应物负离子分离并适于进行不依赖带电符号的捕获以用于ETD过程的RF阱装置可为6段阱。该装置实质上是由一对三段阱(如LTQ装置)首尾相连的QLT结构组成。这种“双重”三段阱可使前体正离子和反应物负离子都独立地进行m/z分离。显然这种“双重”阱的一半也可以进行扫描和m/z分析。如果前体正离子和负离子的m/z筛选可以在它们注入RF四极杆线性阱之前完成,那么2段或4段(这取决于用于轴向捕获的次级RF电压是施加于端透镜板还是作为端区的相对杆之间的双极电压)也是很令人满意的。
将本发明的方法与用于反应的单独负离子和多电荷肽正离子的分离联合使用会显著地影响质谱学在蛋白质组学上的应用。例如,由McLuckey等人详细说明的全部质子转移实验(例如带电状态还原、气相浓缩、离子驻留等等)都可在允许数据依赖操作和色谱的时间尺度内在同一台质谱仪上与ETD和CAD串联使用。这类实验的实例包括将多电荷正离子通过质子转移反应转化为选定带电状态(离子驻留)。在信号被浓缩至一种带电状态后,再使正离子接触诱导电子转移的负离子以产生ETD产物 离子。如果选定的正离子带电荷很高,可仅通过注入质子转移负离子进行额外步骤的带电状态还原。最后的结果包括为从带不同多电荷前体的先前浓度产生的单电荷或双电荷的c和z产物(在线性离子阱的分辨能力之内)的质谱。显然,不需要如上所述的离子驻留的初始步骤就可以容易地进行ETD产物离子的带电状态还原。
在一些情况下,特别是对于蛋白或大肽,可按照如下顺序操作质谱仪:(1)气相浓缩(离子驻留),(2)完整前体的ETD,(3)完整前体的CID以产生一些多电荷片段离子,然后将所述片段离子顺序暴露于(4)ETD。所得的ETD谱(由步骤4形成)可显示由b或y离子产生的序列信息。上述策略可结合日益普遍的“自上而下”蛋白测序方法(步骤2)和更常规的“自下而上”方法(步骤3和4)的优点。在某种程度上,步骤3(已知CID偏好某些切割方式,如脯氨酸N端侧链和C端至组氨酸)与常规的“自下而上”蛋白质组学中的酶消化相类似,仅有少许差异。也就是说,由每个b、y产物获得的MS3谱(例如肽MS/MS谱)可产生序列信息,从所述序列信息中可得知蛋白质分子质量和ETD产物谱。
实施例1
用于多肽的电子转移解离的负离子的用途
根据一个实施方案,将FC-43(全氟三丁基胺,PFTBA)、六氟化硫(SF6)、全氟-1,3-二甲基环己烷(PDCH)、六氟化苯(C6F6)和蒽导入NICI(负离子化学离子化)源以产生用于实验的负离子。在所有情况下,在上述源中产生的负离子在与标准肽前体离子反应时都至少产生一些ETD产物。当将用于电子撞击离子化源质谱仪的标准m/z校准物FC-43导入所述源时,仅以很低的前体至ETD产物转化效率产生少量c和z离子。在后来的实验中,将上述分子单独地导入离子源并且都产生了我们的标准前体离子的广泛的c型和z型片段化,所述标准前体离子为三电荷磷酸肽(LPISASHpSpSKTR)+3;SEQ ID NO:1。前体至ETD产物的转化效率从对SF6和PDCH的约0.1-1%、对(C6F6)的约0.5-5%至对蒽和9,10二苯蒽的约5-20%不等。
可产生与由蒽产生的负离子的前体至ETD产物差不多高的转化效率的负离子的其他来源为CI离子源中的“残留”或“背景”气体。在此实验之前,在离子-离子反应起始时增加前体离子的数量并不能提高ETD产 物离子的数量(绝对数量)。这有些奇怪,因为相信在整个离子-离子反应过程中存在于离子阱中的负离子要远比前体正离子多。并且还证实在离子-离子反应结束时负离子群也没有消耗完。在上述条件下,产生的ETD产物的数量应与前体正离子的初始数量近似的成比例(一级动力学理论应适用)。事实上,产生的质子转移产物似乎与前体离子的初始数量成近似比例。如果产物是由负离子混合物中的一种(或几种)少量组分参与的反应产生,并且该少量组分在离子-离子反应过程中消耗完,那么就可以解释上述观测结果。
一种可能性是:上述假设的少量组分负离子是由残留的离子源中的背景气体(污染)产生,它与ETD产物离子的产生有关。在这一实验中,使用残余量的FC-43、SF6、PDCH和C6F6以及各种在CI离子源中通过电子捕获产生离子的未知化合物作为反应物负离子。当使用大量的从“背景化合物”产生的反应物负离子群时,ETD产物离子的数量变得与反应物离子的初始数量成比例。实验的前体至产物的转化效率也有了显著提高。
考虑到将选定的狭窄m/z窗范围的离子共振弹射的能力,改进了这一方法,这样可以从存在于离子-离子反应过程中的离子中包括或排除某一特定的反应物离子种类。用上述方法测量了从“背景”化合物中产生的主要反应物负离子产生ETD产物的能力。在离子-离子反应过程中将m/z值为181的反应物负离子种类排除会使ETD产物相对于质子转移产物减少3-5倍,而质子转移产物并没有明显减少。相信这一种类为C6F5CH2 -,它由C6F6 ·-和甲烷在NICI离子源中的离子分子反应形成。此外由蒽(通过C14H10 ·-和CH4的离子分子反应)产生的反应物负离子也促进ETD。当将蒽导入NICI源以产生上述反应物负离子时,ETD产物与前体正离子的初始数量成比例的产生。还观测到随着在离子-离子反应过程中施加于QLT的RF电压的改变,质子转移至ETD产物的比例也发生改变。
实施例2
用电子转移解离质谱仪进行多肽序列分析
仪器改进和操作
使用市售的QLT:Finnigan LTQ质谱仪(Thermo Electron,Walthan,MA)进行所有实验,所述仪器装备了改进的纳流电喷雾离子化(ESI)源(见图2-4)。改进了上述LTQ使其可在仪器后部连接一个Finnigan 4500 CI源。八极杆离子导向器将负离子从CI源运输至QLT,所以通过施加于八极杆离子导向器的RF电压的开/关来控制负离子束的进入。图5A-5H显示了在三段装置的两端各装有ESI和CI源的线性离子阱的示意图。为产生和分析离子/离子反应的产物,改进了仪器控制软件(ITCL编码),将图 5A-5H中显示的扫描活动引入到标准QLT MSn扫描功能中。
样品导入
多电荷(质子化)多肽由ESI产生。将含有1pmol/μl肽的40%水化乙腈溶液(0.1%乙酸)灌注至SilicaTip熔化硅发射器(30μm尖端,New Objective,Woburn,MA)中。样品包括血管紧张素I(DRVYIHPFHL;SEQ ID NO:2,Sigma-Aldrich)和内部合成的磷酸肽:LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1)、APVAPRPAApTPNLSK(SEQ ID NO:3)和DRpSPIRGpSPR(SEQ ID NO:4)。用甲烷缓冲气体的负离子CI源(MG Industries,Malven,PA)被用于产生蒽(Aldrich)的负离子。将蒽通过即加热批入口(improvised heat-batch inlet)导入CI源,所述入口由气体色谱加热室和连接至熔化硅限制室的热传送线组件(Thermo Electron)组成(见图4)。
色谱
将Agilent(Palo Alto,CA)1100系列二元HPLC系统连接到QLT质谱仪用于通过nHPLC-micro-ESI-MS(nHPLC-μESI-MS/MS)进行在线肽分离和分析。
合成肽分析
将一种含有由10种合成肽(1-100fmol)的混合物上样到一个聚酰亚胺包被的熔化硅微毛细管“前置柱”(360μm外径×75μm内径;Polymi-cro Technologies,Phoenix)上,所述前置柱端部通过聚四氟乙烯管(0.06英寸外径×0.012英寸内径(1英寸=2.54em),Zeus Industrial Products,Orangeburg,SC)连接至分析柱。所述分析柱(360μm外径×50μm内径)含5cm的5-μm C18反相填充材料并装配有集成激光驱动电喷雾发射器端(Martin et al.,(2000)Anal chem.72:4266-4274)。用下列梯度以60nl/min的速度洗脱肽:0-100%的B液体洗脱17分钟,100-0%的B液体洗脱18分钟[A液体为100mM水化乙酸 (Sigma-Aldrich);B液体为含100mM乙酸的70∶30乙腈(Mallinckrodt)/水溶液]。用数据依赖装置记录谱。仪器每一循环获得一个全扫描质谱(300-600m/z)和全扫描质谱所记录的含量最高的三种离子的三个ETDMS/MS谱(每循环1秒钟)。
复杂混合物分析
将纯化核蛋白的300μg等分试样在100mM NH4HCO3中用胰蛋白酶(Promega;1∶20,酶/底物)37℃消化过夜。溶液用乙酸酸化并干燥。将肽转化为甲酯形式(Ficarro et al.,(2002)Nat,Biotechnol.20,301-305)。冻干除去试剂并将样品重溶于含等份MeOH和MeCN及0.01%乙酸的混合液中。将样品的一半上样至Fe3+活化的固定化金属亲和色谱柱(360μm外径×100μm内径)上对磷酸肽进行富集,所述色谱柱填充了6cm的POROS 20 MC金属螯合亲和色谱填充材料(Per-SeptiveBiosystems,Framingham,MA)。将磷酸肽用15μl的250mM抗坏血酸(Sigma)洗脱至(上述的)C18微毛细管前置柱上。该前置柱端部与(上述的)分析柱连接,用下列梯度的液体洗脱磷酸肽:0-60%的B液体洗脱60分钟,60-100%的B液体洗脱70分钟。如上所述地记录谱,不过要在全扫描质谱中选出含量最高的五种离子做MS/MS谱(ETD;循环时间1.5秒)。
结果
图6显示的是对二磷酸化合成肽LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1)产生的(M+3H)3+离子记录的单扫描ETD质谱。该谱的总获取时间为300毫秒。待解离的正离子通过含1pmol/μl水平样品的灌注溶液的ESI在QLT的前端产生。所得的全扫描谱含有m/z分别为482和722的(M+3H) +3和(M+2H)+2离子的混合物。用于电子转移解离反应的反应物负离子在连接于QLT后端的CI源中产生。用70-eV的电子轰击1托压力的甲烷气体产生带正电的反应物离子CH5 +和C2H5 +加上一群热电子或近热电子。当蒽C14H10挥发至CI源中时,产生的大部分负离子为偶数电子种类,化学式分别为C14H9 -和C14H11 -,m/z分别为177和179。
当C14H9 -和C14H11 -与LPISASHpSpSKTR产生的(M+3H)+3离子反应(约50毫秒)时,它们都是起碱和单电子还原剂的作用。质子夺取产生在(M+2H)+2和(M+H)+产物,分别在以m/z 722和1443为中心的离子簇中观察到。在这些离子簇中还存在具有分别对应(M+3H)+2和(M+3H)+的组合 物的离子群。上述离子簇的分离和碰撞激活从奇数电子离子组分中产生c型和z型片段离子混合物,从偶数电子离子组分中产生b型和y型片段离子混合物(数据未示出)。我们从同位素分布估计30-50%的电荷转移产物离子为非共价结合的已解离前体离子。它们很容易被CAD解离。
电子转移也导致直接产生c型和z型片段离子。图6中,从该样品产生的c型和z型产物离子的预计m/z值显示于肽序列的上方和下方。观察到的片段用下划线标出,占总产物离子流的31%。注意到在c型和z型离子系列中仅有4个片段没有观察到。这4个中的两个发生在与对应于大量的(M+2H)+2种类的离子簇相重叠的m/z值处。另两个c型和z型片段离子没有产生,因为它们的形成包含脯氨酸环状结构中的N-CH键的切割。当这个键被破坏时,新片段仍通过环上的其它原子保持连接。因此,分别以脯氨酸为N端或C端的c型和z型产物离子的形成在ECD或ETD谱上均观察不到。
为证实在色谱时间尺度内产生ETD谱的可行性,我们使用nHPLC-μESI-MS/MS分析了一个含有10种1至100fmol水平的合成肽的混合物。图7A显示的是离子色谱图,其包括的信号分别对应于DRVYIHPFHL(SEQ IDNO:2;100fmol)、APVAPR-PAApTPNLSK(SEQ ID NO:3;10fmol)和DRpSPIRGpSPR(SEQ ID NO:4;1fmol)的(M+3H)+3离子,m/z分别为433、524和434。峰宽范围为10-14秒。当仪器在数据依赖模式下操作时,每一样品记录多个单扫描ETD谱(这种情况下每谱500-600毫秒)。图7B和7C分别显示了上述肽中的两个:DRVYIHPFHL(SEQ ID NO:2)和DRpSPIRGpSPR(SEQ ID NO:4)的单扫描ETD谱。对于血管紧张素DRVYIHPFHL(SEQ ID NO:2),18个可能的c型和z型片段离子中的14个出现在ETD谱中(图7B)。缺少的那些片段不是那些发生在很低的m/z值处的片段,就是因为通过切割组氨酸环结构而形成所以观察不到的片段。对1fmol的双磷酸化肽DRpSPIRGpSPR(SEQ ID NO:4)记录的单扫描ETD谱现实于图7C。即使在这种样品水平上,谱中还包括了18个可能的c型和z型片段离子中的12个。六个丢失片段中的四个是因为两个脯氨酸五元环结构的切割。上述的两个肽都可以由观察到的片段离子容易地被测序。
图8显示的是由双磷酸化肽ERpSLpSRER(SEQ ID NO:5)的(M+3H)+3离子(m/z 412)产生的常规CAD和ETD MS/MS谱。两个谱都是从由人类核蛋白的胰蛋白酶消化物产生的磷酸肽的nHPLC分析过程中获得的。所有的肽在用MS分析之前都被转化为甲酯的形式并经过固定化金属亲和色谱。在低能量CAD谱(图8A)中观察到的片段化主要是对应于从丝氨酸的侧链上脱去一分子或两分子磷酸的离子。还观察到大量的由于额外的脱水或脱甲醇形成的离子。由于肽主链切割产生的片段离子不存在或是存在的相对离子丰度<0.5%。因此不可能进行序列分析。
ETD谱(图8B)中的信息内容与在低能量CAD谱中观察到的明显不同。不存在因脱磷酸产生的离子,并且片段化主要沿着肽主链发生。14个可能的c型和z型片段离子中的13个出现在谱中。这完全足够确定上述序列ERpSLpSRER(SEQ ID NO:5)。
讨论
图6、7、8中所示的片段化质量和程度以及检出的样品水平(图7C)都是从至今所记录的几百个肽的谱中观察到的结果中具有代表性的,所述肽也包括经过PTM的肽(数据未示出)。这些谱可以由人工(重新)解释,或结合例如SEQUEST的算法用于搜索数据库,以产生肽序列(Eng et al.,(1994)J.Am.Soc.Mass Spectrom.5,976-989)。通常非磷酸化胰蛋白酶肽的CAD串联质谱产生的交叉相关分数为2.0-4.0。使用ETD,经过或未经过PTM的胰蛋白酶肽的串联质谱产生的交叉相关分数为3.0至6.5不等。当校正SEQUEST使其考虑到ETD片段化独有的特性特征之后,这些分数可能还会提高(例如临近脯氨酸的c型和z型片段的缺失)。
本研究的一个副产物是基于径向弹射QLT质谱仪的离子/离子仪器的发展。常规QLT装置使用DC电压提供轴向离子容纳。因此,在阱的任一给定区域或段内只能限制住一种极性的离子,这使得市售QLT不能用于离子/离子反应。在本文所述的改进型QLT中,由RF限制场完全实现了正离子和负离子的共捕获。与RF电压相重叠施加于端透镜的次级RF电压可实现所需的不依赖带电符号的轴向捕获。
对于离子/离子实验,QLT仪器比起QIT仪器具有一些独特的优势,包括更大的离子容量(30倍)和更高的离子注入效率(10至30倍)(39)。如图5A-5H所示,对施加于QLT各段和端透镜的DC偏置电压进行操作可使前体正离子和反应物负离子在负离子注入和分离时轴向分离。通过调整上述DC偏置电压来控制离子/离子反应的开始和终止。由于不同类型的离子可使用两种不同的离子源从装置两端注入,所以仪器的物理几何结构也有一些优势。此外,由于负离子是沿着RF四极场的零位轴注入,因此它们受到的动力学激发最小。以这种方式注入的负离子在与氦缓冲气体的稳定化碰撞过程中似乎较少地遭受电子的脱离。负离子的“软”注入是选择用于本研究的QLT的关键考虑因素,因为预计最好的负离子电子供体也可能容易过早的脱去电子。
对于本研究改进的市售QLT仪器并未被设计为用于涉及离子/离子反应的实验。将来的被设计为用于此目的的线性阱仪器毫无疑问会包括附加的段为多个RF、AC、DC场的叠加提供控制。这些特征甚至可以实现更广泛的离子/离子操作,这几乎肯定会包括前体和反应物离子簇的完全独立分离。此外,我们还想实现防止ETD产物进行后续离子/离子反应的技术,所述后续离子/离子反应导致电荷的中和或额外片段的形成。
由于在QLT中进行CAD、ETD和质子转移(电荷还原)的时间尺度都很短(几十毫秒),所以可将多个离子反应步骤结合到个别的MS/MS或MSn实验中。在“自下而上”型蛋白质组学实验(对蛋白混合物胰蛋白酶消化产生的肽进行数据依赖HPLC MS/MS分析)的环境中,我们希望ETD能够促进例如Lys-C或Asp-N的蛋白水解酶的使用,所述蛋白水解酶产生平均长度为20-25残基的肽。用ESI可将这样的肽转化为带三至六个电荷的前体离子从而成为ETD的理想候选物。在ETD之后,我们预计可用离子/离子反应、质子夺取(电荷还原)反应以保证c型和z型片段离子在质量分析前基本都成为带+1电荷的状态。
基于初步的结果,我们相信应用MS3实验的方法可能是从小蛋白或大肽中产生序列信息的理想方法。典型的MS3实验应包括以下步骤:(i)用气相浓缩(用“离子驻留”的质子转移的电荷还原)将由ESI蛋白离子化获得的初始的不同带电状态的混合物转化为单电荷状态(前体离子m/z);(ii)前体离子的m/z分离和CAD,以产生有限系列的大产物离子[C端到Asp残基的切割产生的b型离子或N端到Pro残基的切割产生的y型离子];(iii)单个CAD产物离子的m/z分离和ETD,以及(iv)第二代产物离子的m/z分析。所得的ETD MS3谱可以产生来源于单个b型或y型中间产物离子(MS2产物离子)的序列信息。一系列这样的MS3实验可以产生所有主要中间产物离子的序列信息。
在上述方法中,第一个解离步骤(CAD)类似于常规自下而上蛋白质 组学分析中的酶消化步骤。MS3谱相当于从胰蛋白酶肽获得的MS2谱。然而,在提出的MS3方法中,每个b型或y型产物离子的MS3谱提供分子量已知的蛋白的一部分的序列信息。
实施例3
用电子转移解离质谱法进行磷蛋白组分析
磷酸化形成了细胞内信号网络的基础,但是蛋白磷酸化的大规模分析还很难实现,因为它发生的水平很低并且磷酸化的肽很难用常规的碰撞激活解离(CAD)MS/MS进行测序。本文描述这样一种方法,它使用:(1)Lys-C以产生大的(15-30残基)多电荷肽的混合物,(2)固定化金属亲和色谱(IMAC)以富集磷酸肽,(3)电子转移解离以使磷酸肽片段化(不脱去磷酸),和(4)新的软件算法(OMSSA)以帮助数据库搜索。该方法的用途通过分析全酵母裂解物和显示磷酸肽在两种不同细胞系统中的不同表达(磷酸化图谱,phosphoprofiling)得以证实。
方法
用Trizol从酿酒酵母(S.cerevisae)中提取蛋白,用Lys-C或胰蛋白酶消化,并用甲醇-HCl将所得的肽转化为甲酯形式。为进行差异显示实验,将来源于两个样品的肽分别转化为d0-和d3-甲酯形式并在分析前混合。然后通过IMAC富集磷酸肽并通过在改进的Finnigan LTQ仪器(适合于装配一个用于离子/离子反应的附加离子源)上的nRP-HPLC-μESI-MS/MS分析磷酸肽。在数据依赖模式下操作仪器以获得ETD谱或连续CAD/ETD谱。ETD谱通过以下步骤产生:从前部将磷酸肽正离子注入线性离子阱,然后与从后部注入的蒽负离子进行短时间反应(~65毫秒)。
结果
ETD促进肽主链的片段化而形成c/z离子对,并保持了翻译后修饰的完整。本实验室使用新的基于概率的程序——开放式质谱法搜索算法(OMSSA)优化了ETD谱的数据库搜索,尤其是对磷酸肽的搜索。
迄今为止,应用对酵母全细胞裂解物的IMAC富集策略,通过单次90分钟实验接着1小时的数据库搜索,以高置信度鉴定了将近1000个磷酸肽。初步的实验结果与以前对酵母研究获得的结果较好的吻合,以前的研究在酵母中通过碰撞激活解离观察到~1000个磷酸肽(在CAD MS上中性脱去标志性磷酸),但仅有216个可通过SEQUEST和/或通过人工解释 而鉴定。
实施例4
连续离子/离子反应
如上所述,某一种负离子主要作为ETD或PTR反应物。通过将正离子暴露于任一种类的负离子可分离和连续的进行上述分离反应。例如,高电荷肽前体离子(例如z>4)可用ETD诱导型负离子进行解离,接着除去那些反应物并导入次级PTR诱导型负离子。可调整次级反应的持续时间,以使得产物种类的带电状态在受控方式下还原。也就是说,一个+10前体肽可通过ETD解离而产生带电为+1至+9的片段。当然,如此高电荷的同位素峰的m/z分辨率会有问题;所以可调整次级PTR反应的持续时间以使得ETD产物转化为主要为+1的带电状态。上述反应的净效果是将初始产生的不同带电状态的ETD片段转化为低带电状态,并由此简化谱的解释过程。
显然,ETD和PTR的其它序列或顺序、单独地或串联地,也可以应用于其它离子操作方法中(例如激活或m/z筛选)。在一些情况下,在ETD或其它离子操作技术之前对正离子前体进行电荷还原可能是有利的。
方法:
将Finnigan LTQ线性离子阱质谱仪进行了改进,使之适用于在装置后部、对着厂家纳米喷雾源肽离子产生装置安装一个化学离子化源。使用负离子化学离子化(甲烷缓冲)产生荧蒽、苯甲酸和六氟化硫的负离子。通过由气体色谱加热室和热的传输线组成的批入口实现荧蒽和苯甲酸的导入。通过漏泄阀直接将六氟化硫导入至源中(其为气体)。为进行不依赖带电符号的捕获,改进了LTQ的电路,以使得可在LTQ的端透镜上叠加次级RF捕获电压。
结果
使用改进的线性离子阱质谱仪,我们证实了使用连续离子/离子反应的高电荷肽的直接判断(interogation)。在此,+7ACTH肽(SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVRVYP7+;SEQ ID NO:72)(m/z 420)先被分离并与荧蒽负离子反应~75毫秒(ETD)。由此反应产生的谱示于图9(上栏)。肽基本上沿肽主链裂解;然而,许多片段具有的电荷超过了在此使用的质谱仪的分辨能力(见插入图,用黑点标注了m/z)。为避免这一问题,我们执行了连续离子/离子反应。在此实验中,在ETD反应之后排出多余的荧蒽负离子,所得的多电荷产物离子与正合适的六氟化硫负离子反应(~200ms)。该次级反应(质子转移,PTR)简化了产物谱使其仅包括单质子化的片段,并使各种c型和z型离子集中至单电荷状态。上述反应的净效果是产生了一个均匀系列的单电荷的表征前体肽N端和C端序列的c型和z型离子(线性阱具有的极限m/z范围为2000)。注:多电荷片段的消除示于上方的插入图。
在图10A和10B中,我们进行了相同的实验,只是这次使用苯甲酸代替六氟化硫作为PTR负离子。注:我们减少了初始ETD反应的持续时间。并且,由ETD实验产生的多电荷片段离子在次级PTR反应后被还原和集中至主要为+1带电状态。当反应持续时间延长时,带更高电荷的片段集中至低带电状态——在与苯甲酸反应150ms的情况下主要为单电荷产物(图10B)。显然,由ETD反应产生质量较大的c型和z型片段离子,不幸的是简化的质子转移反应增加了它们的m/z值使之超出了我们有限的质量范围。可以通过选择PTR反应时间来产生与仪器m/z分辨能力的上限相容的主要为双电荷或单电荷的片段离子,从而扩展仪器有效范围。可调整PTR反应持续时间以产生与质量分析仪m/z分辨能力相称的带电状态的产物。或者,将这种离子/离子装置与其它质量分析仪相联合也能扩展其质量范围的限制(例如TOF、ICR-MS、轨道质谱(orbitrap)等等)。
实施例5
LTQ-ETD仪器的改进、调节和操作
所有的实验都在装配了改进的纳流电喷雾离子化源的市售Finnigan LTQ质谱仪(Thermo Electron,San Jose,CA)上进行(见图2)。改进了LTQ使之适于在仪器后部安装Finnigan 4500CI源(Thermo Electron)。八极杆离子导向器将负离子从CI源运输至QLT,所以通过施加于八极杆离子导向器的RF电压的开/关来控制负离子束的进入。为产生和分析离子/离子反应的产物,改进了仪器控制软件(ITCL编码)使其包括所需的扫描活动。
合成磷酸肽的制备
基于在碰撞激活中存在特征性的脱磷酸,通过一系列持续的实验室手段筛选出下列磷酸肽的标准品:RLPIFNRIpSVSE(SEQ ID NO:6)、 pSRpSFDYNYR(SEQ ID NO:7)、RpSpSGLpSRHR(SEQ ID NO:8)、RSMpSLLGYR(SEQ ID NO:9)、GpSPHYFSPFRPY(SEQ ID NO:10)、DRpSPIRGpSPR(SEQ ID NO:11)、LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1)、RRpSRpSPYYSR(SEQ ID NO:12)、SRVpSVpSPGR(SEQ ID NO:13)、APVApSPRPAApTPNLSK(SEQ ID NO:14)(其中“p”在磷酸化位点之前)。使用标准Fmoc固相化学方法(AMS 422多肽合成仪,Gilson,Middleton,WI)进行合成。
人类核蛋白的纯化和消化
HEK细胞在T-150(150cm2)培养瓶中生长至会合,并血清饥饿过夜。用胰蛋白酶/EDTA释放细胞,用无血清培养基洗涤一次并分成两个10mL的等分试样(2×106细胞/mL)。第一份等分试样在含10μM毛喉素的DMSO中37℃培养10分钟。对照细胞做同样处理,不过是仅用10μL的DMSO(0.1%终浓度)处理。将悬浮细胞以片状沉淀下来,并在含下述成分的低渗缓冲液中匀浆(douncing)裂解细胞:10mM HEPES,pH7.9,10mM KCl,1.5mM MgCl2,2mM EDTA,2mM EGTA,2mMNa3VO4,2.1mg/mL NaF,1nM冈田酸,0.5mM PMSF,0.5mM AEBSF,2μg/mL抑酶醛肽,2μg/mL胃酶抑制剂,2μg/mL牛胰蛋白酶抑制剂,20μg/mL苯甲脒。核的片状沉淀用低速离心分离并在TRIzol试剂(Invitrogen/Gibco,Carlsbad,CA)中重悬。弃去RNA和DNA部分。蛋白片状沉淀在胍:HCl/乙醇溶液中洗涤并用超声法在1%SDS中重悬。悬液在3500MW Slide-A- 盒(Pierce,Rockford,IL)中对2升1%SDS透析过夜。用BCA分析测得蛋白浓度为~6mg/mL(19,20)。从对照样中取相当于~300μg总蛋白的等分试样,稀释至含0.1%SDS的100mM NH4HCO3溶液中,在100℃加热10分钟。将蛋白用胰蛋白酶(1∶20)在37℃消化过夜。将肽用乙酸酸化至pH3.5。来自经毛喉素处理的细胞的蛋白没有进行分析。
人类核蛋白磷酸肽的分析——ETD
通过进行反应两次使人类核肽转化为甲酯形式。此外,将肽重溶于等份乙腈和甲醇的0.01%水化乙酸溶液中,用250mM山梨酸(Sigma,St,Louis,MO)进行IMAC洗脱和最后2小时的反相分离(如上所述)。将荧蒽通过即加热批入口导入CI源,所述入口由气体色谱加热室(设置为120℃)和连接至熔化硅限制室的热传送线组件(Thermo Electron,SanJose,CA)组成。使用甲烷缓冲气体(MG Industries,Malvern,PA)的负离子CI用于产生荧蒽(Aldrich,St.Louis,MO)的负离子。使用通过ITCL产生的方法在数据依赖的设置下记录谱,以用于CAD和ETD片段化方法的直接比较。指示仪器进行全MS扫描后选择五个含量最高的m/z值的CAD和ETD。对于CAD,自动获取控制的目标设置为20000,对于ETD设置为50000。负离子注入时间为25ms,然后使其与肽反应55ms,然后弹射产物离子。
自动化肽鉴定
对于CAD,在上述实验的整个过程中使用SEQUEST(9)[v.27,rev.9(c)1993]和TurboSEQUEST[v.27,rev.11(c)1999-2002]。对于ETD数据,修改该算法以对c和z离子评分:(TurboSEQUEST v.27,rev.11(c)1999-2003“Sequest27_a_mod”)。通过对相应谱的人工解释证实存在的序列。
结果
人类核磷酸肽分析——ETD
我们最初的意图是用CAD串联MS鉴定来自人类核提取物的磷酸肽,结果检出了几百种磷酸化的肽;但是肽主链不完全的片段化使得仅能解释出大约十种磷酸肽的序列。来自人类核提取物的含量最高的磷酸肽为一种双磷酸化的肽(m/z 412.6),其CAD谱显示的是中性脱磷酸、水、甲醇(图11A)。在另一个分析中,我们应用ETD串联MS分析这同一个样品。由这同一个肽获得的ETD谱不含有任何上述中性丢失,而是显示了完整的c型和z型离子系列,这使得可以鉴定该磷酸肽为eRpSLpSReR(SEQ ID NO:15),该磷酸肽来自人类富含精氨酸/丝氨酸的核剪切因子3蛋白(图11B)。小写字母“e”表示谷氨酸的甲酯转化形式,“p”表示磷酸化的丝氨酸残基。
为提供这两种方法(CAD和ETD)的直接比较,我们进行了第三个实验:连续的对洗脱中的磷酸肽交替进行CAD和ETD。这使得可以紧接着CAD谱获得ETD谱,以控制分离的样品之间的峰强度差异和实验性差异。对于m/z 412.6观察到了类似的CAD片段化形式(数据未示出)。此外,图12A显示的从上述实验记录的谱为含有很强的中性丢失的四电荷肽(不充分的主链片段化阻碍了这个肽的序列分析)。对相应ETD谱(随后的扫描)显示它是一个四磷酸化的肽(图12B)。除了z3和c9以外的每个产物离子都出现于谱中。上述两个离子未能被检出的原因是:由于脯氨酸的环结构使得在酰胺氮和α碳之间的切割从来不能被观察到。
在用ETD重新分析一百种以上的人类核磷酸肽之后。表2部分列出(50多个新序列)了用ETD串联MS鉴定和用SEQUEST(计算机评分算法)进行序列分析的磷酸肽。检查了人工确认的肽。
表2用ETD检出的人类核磷酸肽
分析号:Linden_Con_ETDCAD042604
表2续
A4-2.经确认的用ETD检出的人类核磷酸肽的名称
1.gi|7657864|gb|AAF66079.1|与核蛋白NP220相匹配
2.gi|9956070|gb|AAG02007.1|与人类KIAA0723蛋白mRNA类似
3.gi|4827040|ref|NP_005110.1|甲状腺激素受体相关蛋白3
4.gi|7706549|ref|NP_057591.1|CDC2相关蛋白激酶7
5.gi|9558733|ref|NP_037425.1|转化体-2α;htra-2α;推定MAPK激活蛋白PM24
6.gi|6002476|gb|AAF00003.1|热休克抑制蛋白1
7.gi|33356174|ref|NP_002678.2|桥粒相关蛋白(pinin)
8.gi|29561827|emb|CAD87817.1|SI:zC263A23.9.1(与人类富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子3蛋白相类似的新蛋白)
9.gi|21237808|ref|NP_620706.1|染色质c2同种型b的SWI/SNF相关基质相关肌动蛋白依赖性调节因子。
10.gi|14603220|gb|AAH10074.1|FUSIP1蛋白
11.gi|6649242|gb|AAF21439.1|AF201422_1剪切共激活剂亚基SRm300
12.gi|5902076|ref|NP_008855.1|富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子1
13.gi|5821151|dbj|BAA83717.1|RNA结合蛋白
14.gi|42542379|ref|NP_005830.2|丝氨酸/精氨酸重复基质1
15.gi|4759172|ref|NP_004710.1|富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子2
16.gi|4506903|ref|NP_003760.1|富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子9
17.gi|4506901|ref|NP_003008.1|富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子3
18.gi|26252134|gb|AAH40436.1|剪切因子p54
19.gi|23271009|gb|AAH34969.1|丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PRP4K
20.gi|21758154|dbj|BAC05256.1|未命名蛋白产物
21.gi|20127499|ref|NP_006266.2|富含精氨酸/丝氨酸的剪切因子6
22.gi|1773227|gb|AAB48101.1|HP1HS-γ
23.gi|16265859|gb|AAL16666.1|AF419332_1TLS相关蛋白TASR-2
24.gi|602021|emb|CAA29961.1|未命名蛋白产物
实施例6
芳烃负离子促进电子转移解离的用途
研究了促进电子转移解离的负离子。很多这类负离子属于被称为芳烃的一类化合物。我们的结果证实,实际上测试过的所有芳烃在与多电荷肽反应时都具有一定的诱导电子转移解离的能力。测试过的负离子包括:萘、芴、菲、芘、荧蒽、1,2-苯并菲、苯并[9,10]菲、苝、吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9’蒽腈、硫芴、1,10’菲咯啉和蒽醌。尽管所有这些芳烃都促进电子转移,但是荧蒽和2,2’联喹啉的效果特别好。
图13显示的是m/z为202的荧蒽自由基负离子和m/z为482的正离子(三质子化肽,LPISASHpSpSKTR;SEQ ID NO:1)反应50ms所得的单扫描ETD-MS/MS谱。谱中仅观察到了电子转移的产物。在所观察到的产物中,有三分之二对应直接电子转移解离的产物。约1/3的产物为电子转移而未解离的产物。然而这些产物可以被碰撞激活而产生c型和z型的产物离子(参见低能量激活部分)。这表明初始的电子转移活动诱导肽主链的解离;然而,前体肽离子可通过其他的非共价相互作用而保持完整。另一方面,低能量激活可以引发一个类似于ETD的途径。在任一活动中,荧蒽的自由基负离子都以高效率诱导电子转移。
制成了一个电子转移解离效率相对于反应q值(q为在离子阱中与其他因素一起影响离子运动的一个简化的参数)的图。从这个图中对于电子转移(q值~0.33)的产物产生的计数(绝对值)为~1300。未反应时前体强度的计数为~3000。我们估计当电子转移效率为100%时可产生~2000的计数值(检测器对+2离子产生的反应为+3离子的~2/3)。从该图中我们估计电子转移的效率为60%。通过电子转移直接的解离应为该值的三分之二:~40%。
所有在此测试过的芳烃都以不同的效率诱导电子转移。基于上述结果,我们推断其他未经测试的芳烃也会有类似的表现。因此,总的来说芳烃化合物代表了与多电荷正离子反应时诱导电子转移的一类优选化合物。而且,对这些化合物的包括硫、氧或氮原子的修饰(杂环)也不会改变它们的电子转移能力,因此上述杂环化合物也包括在电子转移促进化合物的这一群组中。在表中显示了化合物、分子量及其相应负离子的m/z。其他测试过的化合物包括:吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9-蒽腈、硫芴、1,10’菲咯啉、9’蒽腈和蒽醌。所有这些化合物产生的负离子都在不同程度上诱导电子转移解离。
实施例7
使用ETD质谱法鉴定易变的翻译后修饰
不仅是磷酸化,其他很多翻译后修饰也是CAD易变的,因此难以通过CAD串联MS测序。我们在此提供以下三种最常见的和易出问题的修饰的ETD串联MS的实例:磷酸化、糖基化和磺化。
磷酸化的肽来源于全酵母裂解物,用胰蛋白酶消化,用IMAC富集并用如实施例5所述的连续CAD和ETD解离方法进行分析。典型的磷酸化肽及其在两种方法下的片段化的实例是在m/z407处观察到的三质子化肽。这个磷酸化的肽为RKpSILHTIR(SEQ ID NO:68),在其CAD串联质谱中观察到对应于中性脱磷酸的离子,而肽主链的片段化很少(图14A)。出现于CAD谱中的不到总离子的5%的低水平b和y离子不足以确定这个肽的序列。这同一个肽的ETD谱显示了显著的肽主链切割,从而产生完整的c型和z型离子系列并确定其序列为RKpSILHTIR(图14B,其中pS表示磷酸丝氨酸)。
将四质子化的糖基化肽(O-GlcNac)KKFELLPgTPPLSPSRR(SEQ ID NO:69)分子(m/z 518)也用CAD和ETD进行解离。CAD谱仅显示了两个离子,在m/z 204处的一个对应的是O-GlcNac氧鎓离子,相应的中性脱去203(GlcNac)的(M+3H)+3前体离子在m/z 623处(图15A)。CAD谱的其余部分包括了几个b型、y型和a型离子。但是ETD谱显示了该肽的几乎完整的c型和z型离子系列(图15B)。未观察到的c型和z型离子仅为涉及脯氨酸环结构的被禁止的切割。
磺化修饰是在此用ETD和CAD串联MS都进行分析的CAD易变型PTM的第三种类型。这里使用CAD和ETD质谱法对磺化肽GRLGsSRAGR(SEQ ID NO:70)进行片段化。使用CAD时,该m/z为337的三质子化离子的谱在m/z 311处有一个主要的离子,其对应于从(M+3H)+3前体离子脱去SO3。如图16A所示,未检出其他片段离子。这个肽的ETD串联MS产生了完整的c型和z型离子系列,没有可观察到的从前体离子脱SO3(图16B)。
磷酸化的肽和磺化的肽都会在表观质量上有+80Da的增加(PO3和SO3)。由于这两种PTM之间的质量差异为0.0843Da,所以如果不进行精确的测量,很难仅从质量上将磺化肽与磷酸化肽区别开。但是连续使用CAD和ETD就能容易地测定全部序列(ETD)并确定肽是磷酸化的还是磺化的(CAD)。使用CAD,可以由磷酸化肽前体质量减少98Da检出磷酸的脱去,而SO3的脱去表现为前体质量减少80Da。这就可以鉴定出该肽为磷酸化肽还是磺化肽。然后ETD谱可以典型的鉴定该肽的序列。
实施例8
肽负离子的电子转移解离
本发明公开的一方面涉及多电荷肽正离子与单电荷多核芳烃负离子的电子转移反应,并由此诱导广泛的肽主链片段化,上述反应称为电子转移解离(ETD)。然而根据一个实施方案,使用了改进的四极杆线性离子阱以检验多去质子化肽与正离子的反应。三去质子化磷酸肽LPISASHpSpSKTR(SEQ ID NO:1)与氙的自由基正离子反应200ms产生广泛片段化并伴随电荷还原(图17)。在解离产物中a型和x型片段离子含量最多。从电荷还原前体和a型和x型片段中都观察到了脱二氧化碳、脱磷酸及其多种组合。
Xe+的电子夺取产生含自由基的电荷还原肽,所述肽可被自由基的化学性质驱动而解离。为证实上述推论,我们跟踪了三去质子化三残基酸性肽EEA和Xe正离子的反应。该离子/离子反应使得形成了电荷还原肽,所述肽在第二个残基的羧基上含有自由基位点。从主链酰胺N上夺取一个氢自由基可促进邻近的C-C键的切割而产生a型和x型产物离子。
除了a型和x型产物以外,我们还注意到了一系列离子,所述的一系列离子的质荷比要比x型片段系列中所包括的离子荷质比低44个单位(图17)。我们认为这些x-44离子是由多去质子化肽丢给Xe+至少两个电子而产生的。一个电子的失去出现于c端,其自由基驱动化学性质诱导中性脱CO2,而另一个电子的失去诱导了肽主链的切割,从而产生在之前已经失去羧基端的x型片段(Xn --44,注:上述过程可以任意次序发生)。如果,例如三去质子化肽EEA的x2 2-产物通过随后与Xe+的反应失去了一个电子,中性脱CO2可引发产生x2 -·-CO2产物。对由双去质子化磷酸肽与Xe正离子反应(这样所观察到的产物可仅由单电子转移活动而产生)而产生的串联质谱的研究显示,Xn-CO2型产物离子的产生明显减少(观察到两种Xn-CO2产物相对于它们相应x型片段的丰度为~5%,数据未示出)。
我们的研究结果在某种程度上与Zubarev及其同事通过EDD对双去质子化雨蛙肽研究的结果相近似。例如,他们也注意到了从前体和许多 片段上的中性脱磷酸。然而,他们的实验产生a型、c型和z型片段离子,而我们的离子/离子反应主要形成a型和x型片段,很少有c型和z型片段(来自有限系列的其它肽,结果未示出)。可以想到高能量的电子在电子夺取中比此处使用的Xe正离子的选择性低。失去电子的初始位置的任何差异都可使EDD进入与反电子转移解离(NETD)中不同的反应途径。可获得两种电子脱离方式的进一步特征以揭示各方法之间的上述差异和其他可能的差异。
将Xe正离子用于电子夺取避免了质子转移副反应;注意质子转移至肽负离子会放出大量热。为研究肽负离子的质子转移反应,我们引入了另一种正离子——质子化的荧蒽。质子转移反应主要还原肽的电荷(方程式1:C16H11 ++[M-2H]2-→C16H10+[M-H]1-),同时仅有少量的片段化脱CO2(相对丰度~5%,数据未示出)。对电荷还原肽的同位素分布检测显示仍有小范围的电子转移发生;这种转移可能从荧蒽或低水平的背景正离子处发生。不论是上述哪种情况,由于中性丢失产物离子比电荷还原质子转移产物低45个单位,所以我们认为脱CO2是由电子转移副反应引发。
Wu和McLuckey描述了寡核苷酸负离子的电子转移和质子转移反应,其片段化主要通过前一种途径(该结果与我们对肽负离子的观察结果相同)。计算结果使他们认为反应的放热效应——而不是自由基位点的引入——是核苷酸负离子在离子/离子反应后片段化的主要驱动力。在另一个实验中,Zubarev等人用肽负离子与H+反应,观察到既没有脱CO2也没有主链的切割,这使他们认为肽负离子只有在自由基位点存在时才有活性。至少对于肽而言,我们的结果与Zubarev的结论相同:肽负离子失去电子诱导的片段化由自由基的化学性质驱动。简而言之,在多电荷肽上引入自由基位点可使其经过新的不会消耗过多(例如较低的激活能量)的片段化途径。称为电子转移反应的离子/离子化学作用提供了一种产生奇数电子多电荷肽的快速有效的方法。这些反应可以用于研究气相化学和用于多肽序列分析。
实施例9
用低能量偏共振激活引发电子转移解离
在电子转移活动后可能有两种结果:(1)接受电子的肽/蛋白可能经 过直接切割形成两个新种(c型和z型产物对或a和y产物对,但形成a和y产物对的概率低得多),或(2)肽/蛋白可能保留住额外的电子但不经过片段化。上述情况的实例可在图18A中找到,该图中显示双质子化肽RPKPQFFGLM(SEQ ID NO:71)(m/z 674)与荧蒽的自由基负离子反应100ms。在反应后观察到一些c型离子,这些c型片段代表上述的第一种过程(直接c/z型片段的产生)。在图18A中观察到的电子转移产物有相当一部分为电荷还原的完整前体自由基种类(M+2H)+·。
直接片段化与电荷还原而不解离的相对比例每个肽之间都不尽相同。我们观察到通常有如下的趋势:(1)对于前体离子的给定电荷状态,高m/z比趋于增加非解离自由基产物的产率,及(2)对于前体离子给定的m/z,低的前体电荷叶趋于相应地增加非解离产物离子的产量,高电荷状态相应地降低非解离产物的产率。例如,对于某一m/z的前体离子,在带电状态为+2或+3时主要产生完整的电荷还原自由基产物。而相同m/z的前体离子其带电状态为+10或更高时,将主要产生c、z、a和y产物离子,而完整的电荷还原自由基种类会是总产物离子产率的一小部分。注:不论任何m/z比或电荷的前体,几乎总会在与目前所研究过的所有负离子电子转移活动之后,观察到产生一些电荷还原而未解离的种类。
最近报道可在三维离子阱装置中在电子转移解离反应后实现完整的自由基电荷还原肽离子的碰撞激活(CAD)。在该实验中,电荷还原(M+2H)+·神经降压肽的CAD产生c/z型产物(电子转移解离的特征性片段)以及b/y型产物(碰撞激活的特征性片段)。在对电荷还原电子转移产物应用常规的碰撞激活时也观察到类似的结果。例如,图18A显示产生相当多的对应于肽RPKPQFFGLM(SEQ ID NO:71)的(M+2H)+·的产物离子。在分离该电荷还原的完整的自由基种类之后,在典型的FinniganLTQ CAD条件(q=0.25,标准化激活能35%,持续时间30ms)下进行的碰撞激活(图18B)产生ETD的特征性片段(c型和z型片段)和碰撞激活的特征性片段——m/z 1330(脱NH3)。相应非自由基完整的单电荷肽(M+H)+(m/z 1347)的碰撞激活产生同样的m/z 1330的优势产物离子(图18C)。这一结果与McLuckey及其同事观察到的相同,证实了电荷还原电子转移产物的碰撞激活可导致同时产生ETD和CAD的特征性片段。从分析的观点来看,出于以下理由并不需要从两种不同的过程产生产物的可能性。首先,由于需要确定每一个片段为c、z、b还是y,而会使产物 离子谱变得难于解释。其次,碰撞激活过程相关的所有局限性(如上所述)依然存在(中性脱去易变的PTM、H2O、NH3等等)。
为解决这一问题,通过使用偏共振激活策略来激活和解离上述电荷还原种类而大大降低了碰撞激活(解离)的程度。虽然这一方法还包括碰撞激活,但是在合适的弱碰撞激活条件下,所述激活提供的能量足以引发电子转移型解离途径,但不足以促进常规的碰撞激活解离产物的产生。所述弱碰撞激活条件的应用可发生于ETD反应中的任何时刻或在ETD反应终止之后。根据一个实施方案,在混合负离子与多电荷多肽正离子的步骤之后,该反应进一步提供足以引发电子转移型解离途径但不足以促进常规的碰撞激活解离产物的产生的能量。更具体而言,对多肽离子产物进行低能量偏共振激活。根据一个实施方案,终止ETD反应并将剩余的负离子排出离子阱,而将多肽离子产物存留于线性离子阱中,然后对多肽离子产物进行低能量偏共振激活。
图18D显示了上述的肽RPKPQFFGLM(SEQ ID NO:71)的(M+2H)+·的低能量偏共振激活(MS/ETD/MS/CAD/MS)。这里我们以低q值和较低的共振振幅(q=0.13,激活能17%,持续时间60ms)来激活完整的自由基产物,并将此波形轻微地施加于目标m/z值的偏共振。通过选择5u宽的完整自由基产物的分离窗来完成偏共振激活,所述完整自由基产物也改变在激活步骤中扫掠二极共振的m/z的范围。更大的窗并不会改变在m/z分离步骤后以m/z存留在阱中的离子数量或类型,然而,在开始共振激发RF扫描用于促进CAD时,它确实会增大离子共振频率和附加的场的频率之间的偏差。Mathieu参数q与在RF场中的离子特征性频率近似地成比例,因此离子存留在场中时可获得的最大可获得动能会随着离子频率的平方和q值变化。与图18B中所示的高能量激活不同,这种激活将电荷还原完整自由基离子群完全转化为c型或z型片段——片段仅来源于通过电子转移性解离途径。没有观察到与常规的碰撞激活解离途径相关的片段化产物。而且,对不含自由基的单电荷肽(M+H)+的(在上述条件下的)激活不诱导任何形式的片段化(图18E)。我们还注意到,由这种低能量激活产生的一些c型片段(c6和c7)转变为比由直接ETD解离产生的相同c型离子的m/z低一个单位的片段。我们目前还不能解释这一差异。这种低能量偏共振激活被认为是一种慢放热过程,它显然可以引发专一于电子转移解离途径的片段化。
Claims (38)
1.一种解离多电荷正离子的方法,所述方法包括以下步骤:
将多电荷正离子导入RF电场离子容纳装置;
将气相电子转移反应物负离子导入上述离子容纳装置;以及
将被导入的反应物负离子与多电荷正离子相混合,以便反应物负离子将电子转移至多电荷正离子,从而产生解离产物正离子;
其中所述多电荷正离子为多电荷质子化多肽正离子,所述气相电子转移反应物负离子为由多芳烃或取代多芳烃产生的气相电子转移反应物负离子,并且所述RF电场离子容纳装置包括RF离子导向器或RF离子阱之一。
2.根据权利要求1的方法,还包括对所述多电荷正离子进行选自以下的操作的步骤:m/z分离、质子转移电荷还原、光解离、碰撞激活、离子-分子反应或它们的组合,以产生衍生的多电荷正离子,并且其中将所述衍生的多电荷正离子与所述反应物负离子在所述混合步骤中混合。
3.根据权利要求1的方法,还包括对所述反应物负离子进行选自以下的操作的步骤:m/z分离、光解离、碰撞激活、离子-分子反应或它们的组合,以产生衍生的反应物负离子,并且其中将所述衍生的反应物负离子与所述多电荷正离子在所述混合步骤中混合。
4.根据权利要求1的方法,还包括以下步骤:
1)对所述多电荷正离子进行选自以下的操作:m/z分离、质子转移电荷还原、光解离、碰撞激活、离子-分子反应或它们的组合,以产生衍生的多电荷正离子;和
2)对所述反应物负离子进行选自以下的操作:m/z分离、光解离、碰撞激活、离子-分子反应或它们的组合,以产生衍生的反应物负离子,其中将所述衍生的多电荷正离子与所述衍生的反应物负离子在所述混合步骤中混合。
5.根据权利要求3或4的方法,其中所述衍生的反应物负离子包括单电荷负离子。
6.根据权利要求3或4的方法,其中所述衍生的反应物负离子包括多电荷负离子。
7.根据权利要求1的方法,其中所述RF电场离子容纳装置为RF离子导向器。
8.根据权利要求1的方法,其中所述RF电场离子容纳装置为RF离子阱。
9.根据权利要求8的方法,其中所述RF离子阱为RF线性多极离子阱。
10.根据权利要求8的方法,其中所述RF离子阱为RF三维多极离子阱。
11.根据权利要求1的方法,其中所述被导入的反应物负离子或其衍生的反应物离子与多电荷正离子或其衍生的多电荷正离子的动能在混合步骤中小于1电子伏特。
12.根据权利要求1的方法,其中使用了与背景气体分子的碰撞以使负离子和多电荷正离子的动能降低至接近用于混合步骤的热量水平。
13.根据权利要求9的方法,其中负离子是沿着RF线性多极离子阱的线性轴被注入。
14.根据权利要求1的方法,其中所述气相负离子由选自下列的低电子亲和力底物产生:蒽、9,10二苯蒽、萘、芴、菲、芘、荧蒽、1,2-苯并菲、苯并[9,10]菲、苝、吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9-蒽腈、硫芴、1,10’菲咯啉、9’蒽腈和蒽醌。
15.根据权利要求1的方法,所述方法还包括质量(m/z)分析和检测来源于所述解离产物正离子的离子的步骤。
16.根据权利要求9的方法,其中所述离子阱为分段线性RF多极离子阱。
17.根据权利要求9的方法,其中所述气相负离子为由多芳烃或取代多芳烃化合物产生的自由基气相负离子。
18.根据权利要求1的方法,其中所述多电荷多肽和气相负离子在直至所述混合步骤之前在离子阱中是空间上分离的。
19.根据权利要求9的方法,其中所述多电荷多肽正离子和气相负离子在直至所述混合步骤之前在离子阱中是空间上分离的。
20.根据权利要求1的方法,所述方法还包括附加的激活步骤,其中向未解离的电荷还原电子转移产物正离子提供足够的能量,以促使所述未解离的电荷还原电子转移产物正离子通过电子转移型解离途径解离,产生的常规碰撞激活解离产物少于20%。
21.根据权利要求1的方法,所述方法还包括附加的激活步骤,其中向未解离的电荷还原电子转移产物正离子提供足够的能量,以促使所述未解离的电荷还原电子转移产物正离子通过电子转移型解离途径解离,产生的常规碰撞激活解离产物少于5%。
22.根据权利要求20的方法,其中所述附加的激活步骤在负离子和带多个正电荷的多肽离子的混合步骤之后。
23.根据权利要求21的方法,其中所述附加的激活步骤在负离子和带多个正电荷的多肽离子的混合步骤之后。
24.根据权利要求21的方法,其中所述附加的激活步骤在负离子和带多个正电荷的多肽离子的混合步骤过程中进行。
25.根据权利要求24的方法,其中所述激活能以光激活或碰撞激活的形式提供。
26.根据权利要求8的方法,所述方法还包括以下步骤:
将剩余的负离子排出RF离子阱,而将电子转移产物正离子存留于线性离子阱中;以及
对电子转移产物离子进行低能量偏共振动力激发以实现碰撞激活,产生少于20%的常规碰撞激活解离产物。
27.根据权利要求1的方法,所述方法还包括以下步骤:
将第二型负离子导入至线性离子阱中,其中所述第二型负离子可基本专一地将质子转移给正离子;以及
将所述第二型负离子与正离子混合并反应。
28.根据权利要求27的方法,其中所述第二型负离子来源于选自下列的化合物:含羧酸、酚和醇盐的化合物。
29.根据权利要求28的方法,其中所述第二型负离子为选自下列的化合物的负离子:苯甲酸、PDCH、SF6和PFTBA。
30.根据权利要求1的方法,所述方法还包括质量(m/z)分析和检测所述电子转移解离产物离子或电子转移解离产物离子的衍生离子的步骤。
31.一种分析多肽的氨基酸序列的方法,所述方法包括:
将多电荷多肽正离子导入RF离子阱中;
将气相负离子导入RF离子阱中;
混合气相负离子与多电荷多肽正离子以便使电子从负离子转移至多电荷多肽正离子,并由此诱导电子转移解离产物离子的产生;
通过将剩余的气相负离子与电子转移产物正离子物理分离而终止反应;
对存留在阱中的正离子进行m/z分析;
其中所述多电荷多肽正离子为多电荷质子化多肽正离子,所述气相负离子为由多芳烃或取代多芳烃产生的气相电子转移反应物负离子。
32.根据权利要求31的方法,其中所述的电子转移解离产物正离子被m/z连续地从RF离子阱弹射至离子检测器。
33.根据权利要求32的方法,其中所述离子阱为线性RF多极离子阱。
34.根据权利要求33的方法,其中气相负离子是沿着线性离子阱的线性轴被注入。
35.根据权利要求34的方法,其中所述自由基气相负离子由选自下列的低电子亲和力底物产生:蒽、9,10二苯蒽、萘、芴、菲、芘、荧蒽、1,2-苯并菲、苯并[9,10]菲、苝、吖啶、2,2’联吡啶、2,2’联喹啉、9-蒽腈、硫芴、1,10’菲咯啉、9’蒽腈和蒽醌。
36.一种通过电子转移解离而解离多肽的方法,所述方法包括:
将多电荷多肽负离子导入RF电场离子容纳装置中;
将气相正离子导入RF电场离子容纳装置中;以及
混合自由基气相离子与离子化多肽以便使电子从负离子转移至正离子,并由此诱导反电子转移解离产物离子的产生;
其中所述多电荷多肽负离子为多电荷去质子化多肽负离子,所述气相正离子为由多芳烃或取代多芳烃产生的气相正离子,并且所述RF电场离子容纳装置包括RF离子导向器或RF离子阱之一。
37.根据权利要求36的方法,其中所述正离子选自惰性气体正离子。
38.根据权利要求37的方法,所述方法还包括质量(m/z)分析和检测所述反电子转移解离产物离子或反电子转移解离产物离子衍生的离子的步骤。
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Aebersold R et al.Mass spectrometry in proteomics.《Chemical Reviews》.2001,第101卷(第2期),269-295. * |
Syka John et al.Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》.2004,第101卷(第26期),9528-9533. * |
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