DE102011117582B4

DE102011117582B4 - Reaktanten für Ladungstransfer-Reaktionen in Massenspektrometern

Info

Publication number: DE102011117582B4
Application number: DE102011117582A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hartmer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-07-25
Anticipated expiration: 2031-11-03
Also published as: US20130115711A1; GB2497391B; DE102011117582A1; GB201219646D0; US9557297B2; GB2497391A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Substanzen für die Herstellung von Anionen, die für Ladungstransfer-Reaktionen in Massenspektrometern geeignet sind, insbesondere zur Fragmentierung mehrfach positiv geladener Biopolymer-Ionen durch Elektronentransfer oder zur Ladungsminderung durch Protonentransfer. Es werden Diketone, insbesondere α-Diketone, als eine neu gefundene Klasse von Substanzen vorgeschlagen, die sowohl für die Herstellung von Radikal-Anionen für Dissoziationen durch Elektronentransfer (ETD = electron transfer dissociation) mit hoher Ausbeute an Fragmentionen wie auch für die Herstellung nichtradikaler Anionen für die Ladungsminderung mehrfach geladener Analytionen durch Protonentransfer-Reaktionen (PTR) zu verwenden sind. Diese Substanzen haben günstige Eigenschaften für ihre Handhabung und für die damit verbundenen analytischen Verfahren: Sie sind weitgehend ungiftig, überdecken einen günstigen Bereich der Molekülmassen, und ihre Flüchtigkeit erlaubt es, sie in ungeheizten Behältern außerhalb des Vakuumsystems zu bewahren, wodurch ein Wiederbefüllen der Behälter erleichtert wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Substanzen für die Herstellung von Anionen, die für Ladungstransfer-Reaktionen in Massenspektrometern geeignet sind, insbesondere zur Fragmentierung mehrfach positiv geladener Biopolymer-Ionen durch Elektronentransfer oder zur Ladungsminderung durch Protonentransfer.
Es werden Diketone, insbesondere α-Diketone, als eine neu gefundene Klasse von Substanzen vorgeschlagen, die sowohl für die Herstellung von Radikal-Anionen für Dissoziationen durch Elektronentransfer (ETD = electron transfer dissociation) mit hoher Ausbeute an Fragmentionen wie auch für die Herstellung nichtradikaler Anionen für die Ladungsminderung mehrfach geladener Analytionen durch Protonentransfer-Reaktionen (PTR) zu verwenden sind. Diese Substanzen haben günstige Eigenschaften für ihre Handhabung und für die damit verbundenen analytischen Verfahren: Sie sind weitgehend ungiftig, überdecken einen günstigen Bereich der Molekülmassen, und ihre Flüchtigkeit erlaubt es, sie in ungeheizten Behältern außerhalb des Vakuumsystems zu bewahren, wodurch ein Wiederbefüllen der Behälter erleichtert wird. Es ist zu erwarten, dass bestimmte chirale Diketone sogar Analyt-Ionen mit stereogenen Zentren stereoselektiv fragmentieren können.
Stand der Technik
Die Sequenzen der Grundbausteine von Biopolymeren und deren posttranslationale Modifikationen (PTM) werden heute vorwiegend mit Tandem-Massenspektrometern aufgeklärt. Im Folgenden werde insbesondere auf Peptide und Proteine als Biopolymere eingegangen, wobei aber die Erfindung nicht auf diese beschränkt werden soll. So stellen beispielsweise Oligosaccharide eine weitere Gruppe von Biopolymeren dar; deren monomere Grundeinheiten, die Zuckerbausteine, linear und verzweigt miteinander verknüpft sein können. Eine Schlüsseltechnik für diese Untersuchungen ist die Fragmentierung der Biopolymer-Ionen im Massenspektrometer. Es gibt dabei die beiden grundverschiedenen Arten der ergodischen und der nicht-ergodischen, durch Elektronen induzierten Fragmentierung, für die jeweils mehrere Verfahren bekannt sind. Die durch Elektronen induzierte Fragmentierung der Peptid- oder Protein-Ionen ist zur ergodischen Fragmentierung komplementär, weil sie erstens an anderen Stellen der Aminosäuren innerhalb der Kette aus Aminosäuren spaltet und zweitens nicht die Seitenketten der posttranslationalen Modifikationen bei der Fragmentierung ablöst, wie das bei der ergodischen Fragmentierung der Fall ist. Durch Vergleich der ergodisch mit den nicht-ergodisch gewonnenen Fragment-Ionenspektren können sowohl die Sequenzen wie auch Masse und Position der Modifikationen abgelesen werden.
Das einfachste durch Elektronen induzierte Fragmentierungsverfahren ist die Elektronentransfer-Dissoziation. So können bestimmte Arten negativer Reaktant-Ionen verwendet werden, um mehrfach positiv geladene Biopolymer-Ionen, insbesondere Peptid- oder Protein-Ionen, durch einen Transfer eines Elektrons zu spalten („ETD” = electron transfer dissociation). Die Reaktant-Ionen sind regelmäßig Radikal-Anionen der Form M eines Moleküls M; diese Radikal-Anionen geben leicht Elektronen ab. Der Stand der Technik ist in den Dokumenten US 2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) und DE 10 2005 004 324 B4 (R. Hartmer und A. Brekenfeld) beschrieben. Es wird in beiden Schriften dargelegt, wie mehrfach geladene positive Peptid- oder Protein-Ionen durch Reaktant-Anionen mit diesem Verfahren fragmentiert werden. Die Elektronentransfer-Dissoziation ist eine spezielle Form der allgemeinen Gruppe von Reaktionen durch Ladungstransfer.
Eine zweite vielfach angewendete Form der Ladungstransfer-Reaktionen ist die Reaktion zwischen vielfach positiv geladenen Analyt-Ionen und nichtradikal negativ geladenen Ionen der Formen (M-H)^– oder (M+H)^–, mit denen die Anzahl der jeweiligen Ladungen an den positiven Analyt-Ionen vermindert werden können („PTR” = proton transfer reactions, auch „charge stripping” genannt). Die dazu erforderlichen nichtradikalen Anionen können in günstigen Fällen in Elektronenanlagerungs-Ionenquellen durch Änderung der Betriebsbedingungen aus den gleichen Substanzen gewonnen werden, die auch zur Herstellung der Radikal-Anionen für ETD dienen (siehe die Dokumente DE 10 2006 049 241 B4 oder US 7,582,862 B2 ; R. Hartmer). Durch die Ladungsverminderung können hoch geladene Analyt-Ionen in weniger hoch geladene Ionen umgewandelt werden, um die Komplexität der Massenspektren aus Gemischen vieler verschieden hoch geladener Analyt-Ionen zu vermindern und günstige Biopolymer-Ionen für die Elektronentransfer-Dissoziation herzustellen.
Die Reaktionen zur Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) wie auch zur Ladungsverminderung durch Protonenübertragung (PTR) finden in Reaktionszellen statt, in denen sowohl positive wie auch negative Ionen gespeichert werden können. Das können beispielsweise zweidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen mit besonderen Pseudopotentialschwellen an den Enden, aber auch dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen sein. Diese Reaktionszellen sind regelmäßig mit einem Dämpfungsgas befüllt, in dem die Ionenbewegungen thermalisiert werden. Es sind Massenspektrometer mit beiden Sorten von Reaktionszellen auf dem Markt und dem einschlägigen Fachmann bekannt. Die positiven Analyt-Ionen und die negativen Reaktant-Ionen werden in der Regel zeitlich nacheinander in die Ionenfallen eingebracht und dort gemischt. Die Reaktionen können dann ohne weiteres Zutun ablaufen.
Im zitierten Dokument von D. F. Hunt et al. wird dargelegt, dass Substanzen für die Bildung von ETD-Reaktant-Ionen in der Gruppe der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (polyaromatic hydrocarbons) zu finden sind. Im Einzelnen werden die Substanzen Anthracen, Naphtalen, Fluoren, Phenanthren, Pyren, Fluoranthen, Chrysen, Triphenylen, Perylen, Acridin und weitere aufgeführt; bei einigen dieser Substanzen werden allerdings, wie aus Tabelle 1 des zitierten Dokuments hervorgeht, aus der Elektronenanlagerungsionenquelle stets auch nichtradikale Anionen der Form (M-H)^– mitgeliefert, die hier unerwünschte Protonentransfer-Reaktionen erzeugen. Es sind also nicht alle dieser polyzyklischen Aromaten gleich günstig für ETD. Insgesamt nachteilig ist bei allen polyzyklischen Aromaten, dass sie sehr niedrige Dampfdrucke besitzen. Es ist daher notwendig, diese Substanzen zur Vermeidung einer Kondensation in kühleren Zuleitungen in einem geheizten Gefäß dicht an der ebenfalls zu beheizenden Elektronenanlagerungs-Ionenquelle im Inneren des Massenspektrometers zu halten, was ein Wiederbefüllen kompliziert macht, wenn es nicht gar Servicepersonal des Herstellers erfordert. Es könnten zwar auch alle Zuleitungen beheizt werden, die von einem beheizten Gefäß außerhalb des Vakuumsystems zur Elektronenanlagerungs-Ionenquelle führen, aber die gleichmäßige Beheizung von Zuleitungen, die durch die Wand des Vakuumsystems führen, ist außerordentlich schwierig.
Unter einer hohen ETD-Effektivität der Anionen einer Substanz soll hier verstanden werden, dass einerseits eine hohe Ausbeute an Fragmentionen erzielt wird und andererseits keine wesentlichen Anteile von Protonentransfer-Reaktionen auftreten. In diesem Sinne ist, nach D. F. Hunt, Fluoranthen besonders ETD-effektiv.
Im Dokument DE 10 2008 059 779 A1 (R. Hartmer; korrespondierend zu GB 2 465 891 A ; US 2010-0140466-A1 ), das hier durch Referenz vollinhaltlich eingeschlossen werden soll, werden aliphatische Substanzen mit Elektronenaffinitäten zwischen 0,3 und 0,8 Elektronenvolt, insbesondere 1,3,5,7-Cyclooctatetraen (m = 104,15 u, EA = 0,550 eV); Trichlorethen, (m = 131,39 u; EA = 0,400 eV), Tetrachlorethen (m = 165,83 u; EA = 0,64 eV) und 2,3-Butandion (m = 86,09 u; EA = 0,69 eV) vorgeschlagen. Der Vorteil dieser Substanzen liegt darin, dass sie wegen ihrer höheren Dampfdrucke in einem ungeheizten Gefäß außerhalb des Massenspektrometers gehalten werden können, was ein Wiederbefüllen einfach macht. Das anfänglich stark bevorzugte 1,3,5,7-Cyclooctatetraen hat sich inzwischen für einige Arten von Reaktionszellen als nicht übermäßig geeignet herausgestellt, da es in diesen Zellen sehr schnell die nur schwach angelagerten Elektronen verliert. Als beste Substanz dieser Gruppe gibt 2,3-Butandion gute Ausbeuten an Fragmentionen der mehrfach positiv geladenen Analytionen. Die ETD-Effektivität reicht an die des Fluoranthen heran.
2,3-Butandion hat aber auch Nachteile. Erstens ist es ein Atem- und Augen-Reizstoff mit stark diskutierter Giftigkeit (in Europa als Butter-Aroma zugelassen, obwohl die Verursachung von Lungen-Krankheiten bekannt ist), daher ist seine Handhabung, gerade wegen des ansonsten günstigen hohen Dampfdrucks, nicht einfach und ungefährlich. Zum Zweiten hat es eine sehr kleine Molekülmasse von nur 86 atomaren Masseneinheiten. Soll es in einer Hochfrequenz-Speicherzelle eingelagert werden, so muss die Hochfrequenzspannung so weit erniedrigt werden, dass wegen des beschränkten Massenbereichs alter solcher Speicherzellen schwere positive Ionen verloren gehen. Und drittens kann die Elektronenanlagerungs-Ionenquelle, die zur Herstellung der Anionen verwendet wird, von Butandion nicht umschaltbar auch die nichtradikalen Anionen herstellen, die für Protonentransfer-Reaktionen (PTR) zur Ladungsminderung verwendet können. Die Suche nach weiteren, günstigen Substanzen für die ETD war daher nicht abgeschlossen.
Im Dokument WO 2011/092515 A1 (J. M. Brown et al.; „Fragmentation Reagents for Mass Spectrometry”) werden Substanzen mit Franck-Condon-Faktoren zwischen 0,1 und 1,0 und Elektronen-Affinitäten zwischen 0,1 und 150 kJ/Mol (1,55 eV) beansprucht. Es wird eine lange Liste von über 90 Substanzen angegeben, angeführt von 1,3- und 1,4-Dicyanobenzol. Die Liste enthält aromatische wie auch aliphatische Verbindungen aus den verschiedensten Substanzklassen.
Die Elektronenaffinität (EA) ist diejenige Energie, die man aufwenden muss, um das Elektron aus dem Radikal-Anion wieder zu entfernen, also die Bindungsenergie des zugefügten Elektrons. Diese Bindungsenergie darf nicht zu klein sein, da sonst einerseits die Substanz kaum Elektronen aufnimmt und andererseits die Anionen nach Aufnahme eines Elektrons auch leicht das Elektron wieder verlieren. Die Bindungsenergie darf aber auch nicht zu groß sein, da sonst die positiven Biopolymer-Ionen das Elektron nicht abtrennend an sich ziehen können, also nicht den Elektronentransfer bewirken können.
Die oben aufgeführten aliphatischen ETD-Substanzen wurden der sehr umfänglichen NIST-Datenbank für organische Substanzen (webbook.nist.gov) entnommen, die eine der vollständigsten Datenbanken für physikalisch-chemische Daten der organisch-chemischen Substanzen darstellt. In deren Tabelle der organischen Substanzen mit bekannten Elektronenaffinitäten sind im Bereich von EA = 0,3 bis 0,8 eV insgesamt nur etwa 200 Substanzen, darunter nur wenige passende Aliphate, verzeichnet, wohingegen fast alle polyzyklischen Aromaten aus dem oben zitierten Dokument US 2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) dort zu Enden sind. Es ist anzunehmen, dass für eine große Mehrzahl an organischen Substanzen, vor allem für aliphatische Substanzen, die Elektronenaffinitäten nicht bekannt sind, so dass eine Suche in der Fachliteratur wenig Erfolg verspricht.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Ausgangssubstanzen für die Herstellung von Anionen für Ladungstransfer-Reaktionen bereitzustellen, insbesondere Substanzen für die Herstellung von radikalen Anionen zur Elektronentransfer-Dissoziation mit hoher ETD-Effizienz, die nicht mit den bei den bisher bekannten ETD-Reagenzien beobachteten Nachteilen behaftet sind.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es wird für die Herstellung von ETD-Reaktant-Ionen, aber auch für die Herstellung von PTR-Reaktant-Ionen, die Verwendung von Substanzen aus der Substanzklasse der Diketone vorgeschlagen, vorzugsweise α-Diketone, deren Molekülmassen schwerer als 2,3-Butandion sind. Substanzen dieser Klasse können recht gleichmäßig den Bereich von m/z = 100 u bis m/z = 200 u und höher abdecken, so dass die Masse m/z der Reaktant-Ionen durch Wahl des entsprechenden Diketons auf die analytische Aufgabe abgestimmt werden kann. Die meisten dieser Substanzen sind ungiftig; sie werden teilweise als Duftstoffe in Parfümen verwendet. Ihre Dampfdrucke sind um zwei bis drei Zehnerpotenzen höher als die der polyzyklischen Aromaten, sie können daher in Gefäßen außerhalb des Massenspektrometers gehalten werden. Zumindest aus einigen dieser Substanzen konnten in entsprechend betriebenen Elektronenanlagerungs-Ionenquellen durch einfache Umstellung der Betriebsbedingungen nichtradikale Anionen für Protonenübertragungs-Reaktionen (PTR) hergestellt werden.
Es gibt sehr viele Substanzen, die in diese Substanzklassen fallen. Als Beispiele werden 2,3-Pentandion (H₃C-CO-CO-CH₂-CH₃; m = 100 u), 3,4-Hexandion (H₃C-CH₂-CO-CO-CH₂-CH₃, m = 114 u), 2,3-Hexandion (H₃C-CO-CO-CH₂-CH₂-CH₃, m = 114 u), 3,4-Heptandion (m = 128 u), 2,3-Heptandion (m = 128 u), 2,3-Oktandion (m = 142), 3,5,5-Trimethyl-1,2-Cyclo-Hexandion (m = 154 u), 2,2,5,5-Tetramethylhexan-3,4-dion (m = 170 u) und 2,2,7,7-Tetramethyloktan-4,5-dion (m = 196 u) vorgeschlagen. Diese Substanzen sind aber ausdrücklich nur Beispiele; es gibt viele weitere Diketone als Kandidaten für die Herstellung erfolgreicher ETD-Anionen.
Es wird außerdem erwartet, dass sich mit chiralen Reaktant-Ionen, beispielsweise aus Campherchinon (m = 166 u) hergestellt, auch chirale Analyt-Ionen selektiv fragmentieren lassen. Damit stünde ein Werkzeug für die stereoselektive Analyse von Substanzen mit einem oder mehrerer stereogenen Zentren zur Verfügung.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt die Strukturformeln einiger Alkan-α-Diketone.
gibt die allgemeine Strukturformel für lineare Alkan-α-Diketone wieder, (n) mit n ≥ 0 und (m) mit m ≥ 0 geben die Längen der Alkylgruppen an.
stellt die allgemeine Strukturformel für zyklische α-Diketone dar, (n) mit n ≥ 0 gibt die Anzahl der Kohlenstoffe in der eingeschlossenen Kette wieder.
zeigt eine allgemeine Strukturformel für verzweigte zyklische α-Diketone, (n) mit n ≥ 0 gibt die Längen der Alkylgruppe an, zusammen mit einem konkreten Beispiel.
gibt eine allgemeine Strukturformel für mehrfach zyklische α-Diketone wieder, (n) mit n ≥ 0 und (m) mit m ≥ 0 geben die Längen der Alkylgruppen an.
zeigt die beiden Enantiomere des Campherchinons, einem bizyklischen α-Diketon.
zeigt das Hex-3-en-2,5-dion, das einfachste χ-Diketon mit einer C=C-Doppelbindung zwischen den beiden Ketongruppen.
stellt ein Schema eines Ionenfallen-Massenspektrometers für die Durchführung von ETD dar, mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) zur Erzeugung der mehrfach positiv geladenen Analytionen, einer Elektronenanlagerungsionenquelle (8) für die Erzeugung der negativ geladenen Reaktant-Ionen (Radikal-Anionen) und Endkappenelektroden (11, 13) und Ringelektrode (12) einer 3D-Ionenfalle, die als Reaktionszelle für die ETD dient. Das Ionenleitsystem (9), hier als Multipol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten. Nach dem Stand der Technik befindet sich die Ausgangssubstanz zur Herstellung der Radikal-Anionen in einem beheizten Behälter (18) nahe an der Ionenquelle (8); die Verwendung von leichtflüchtigen Ausgangssubstanzen nach dieser Erfindung ermöglicht es aber, den Substanzbehälter (19), der von Methangas aus einem Vorratsbehälter (20) durchströmt wird, ungeheizt außerhalb des Vakuumsystems zu montieren.
gibt gemessene Fragmentionenspektren von „Substanz P” wieder, die a) durch Fluoranthen (m = 202 u), b) durch 3,4-Hexandion (m = 114 u) und c) durch 2,3-Heptandion (m = 128 u) gewonnen wurden. Fluoranthen wird bisher als bester Kandidat für ETD-Reaktionen betrachtet; die Fragmentierungen durch die beiden Diketone sind praktisch gleichwertig mit der des Fluoranthens. Substanz P ist ein Peptid, das häufig als Testsubstanz für ETD verwendet wird. Die y-Achse hat in allen drei Spektren den gleichen Maßstab.
zeigt in einem Massenspektrum die Ausbildung von radikalen Anionen M•– der Masse m/z = 114 u aus 2,3-Hexandion (m/z = 114 u).
gibt ein Massenspektrum der nichtradikalen Anionen (M-H)^– (m/z = 113 u), die durch Änderung der Betriebsbedingungen in derselben Elektronenanlagerungs-Ionenquelle gewonnen wurden. Es handelt sich um ein deprotoniertes Anion ausgehend von 2,3-Hexandion, mit einem Nebenprodukt bei m/z = 129 u. Das Nebenprodukt entsteht in der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle, die mit Methan als Thermalisierungsgas arbeitet, aus einer Radikal-Radikal Reaktion aus einem Methylradikal und Radikalanion von Hexandion. Das Nebenprodukt ist wie das nichtradikale Anion als Reaktant-Ion für PTR wirksam.
Beste Ausführungsformen
Aus dem zitierten Dokument von D. F. Hunt et al. geht hervor, dass die aromatischen Ringe in polyzyklischen Aromaten Gruppen sind, die sich ganz allgemein für eine Elektronenanlagerung mit günstigen Elektronenaffinitäten eignen. Aus grundsätzlichen Erwägungen scheinen Substanzen mit Doppelbindungen, insbesondere auch Polyene, besonders günstige Ausgangssubstanzen zu sein. Polyene sind organische Verbindungen, die zwei oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten. Die Suche nach aliphatischen Substanzen mit Doppelbindungen, die sich besonders für ETD eignen, war aber bis auf die eingangs aufgezählten und einige der im oben zitierten Dokument WO 2011/092515 A1 genannten Substanzen bisher nicht erfolgreich.
In der Literatur sind nur unzureichende Angaben über Elektronenaffinitäten organischer Substanzen zu finden. Es war daher unklar, welche anderen chemischen Gruppen innerhalb der Moleküle für eine günstige Elektronenanlagerung verantwortlich sein könnten. Für die Aliphaten ergab sich, dass die Gruppe zweier benachbarter Ketone, wie sie innerhalb des Moleküls 2,3-Butandion auftritt, in ähnlicher Weise wie die aromatischen Ringe für diese genügend feste, aber auch noch genügend reaktive Elektronen-Anlagerung verantwortlich sein könne. Substanzen mit benachbart stehenden, sogenannt „vicinalen” Ketongruppen nennt man „α-Diketone”. In der langen Liste der im oben zitierten Dokument WO 2011/092515 A1 angegebenen Substanzen sind keine Diketone angeführt.
Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass sieh alle bisher untersuchten α-Diketone hervorragend für die Herstellung radikaler Anionen für den Prozess der Elektronentransfer-Dissoziation eignen, und zwar mindestens genauso gut wie das bisher einzig untersuchte 2,3-Butandion.
Es wird daher vorgeschlagen, für die Herstellung von ETD-Reaktant-Ionen Ausgangssubstanzen aus der Substanzklasse der Diketone, insbesondere der α-Diketone, zu verwenden, deren Molekülmassen mit m ≥ 100 atomare Masseneinheiten schwerer als 2,3-Butandion sind. Es stehen sehr viele solche α-Diketone zur Verfügung, die recht gleichmäßig den Bereich von m/z = 100 u bis m/z = 200 u und auch höher abdecken können, so dass die Masse m/z der Reaktant-Ionen durch die Wahl des Diketons auf die analytische Aufgabe abgestimmt werden kann.
Als einige wenige Beispiele aus der Vielzahl von α-Diketonen, für die in den bis einige Strukturformeln dargestellt sind, werden hier folgende Substanzen kurz vorgestellt:
2,3-Pentandion (H₃C-CO-CO-CH₂-CH₃; m = 100 u; Siedepunkt 110 bis 112°C) ist eine ungiftige, gelbe Flüssigkeit mit stechendem Geruch und wurde in vielen Lebensmitteln wie beispielsweise Erbsen, Tomaten, Kartoffeln, Milch, Fleisch und Nüssen nachgewiesen. Die Strukturformel entspricht der allgemeinen Darstellung in mit n = 0 und m = 1.
Die beiden α-Diketone 3,4-Hexandion (m = 114 u) und 2,3-Hexandion (m = 114 u), beide in dargestellt, sind zwar entflammbar, aber im Gegensatz zum hochgiftigen 2,5-Hexandion, bei dem die beiden Ketongruppen nicht benachbart sind, sind sie nicht giftig. 3,4-Hexandion ist leicht hautreizend, daher ist 2,3-Hexandion, das gelegentlich in Parfümen eingesetzt wird, zu bevorzugen. Wie in den und dargelegt, ergeben sie in Elektronenanlagerungs-Ionenquellen in steuerbarer Weise sowohl radikale Anionen der Form M'^– mit der Ionenmasse m/z = 114 u wie auch nichtradikale Anionen der Form (M-H)^– mit der Ionenmasse m/z = 113 u. zeigt als Spektrum b) die Fragmentionen, die durch das radikale Anion von 2,3-Hexandion durch Elektronentransfer-Dissoziation gewonnen wurden.
3,4-Heptandion (m = 128 u) und 2,3-Heptandion (m = 128 u), letzteres ebenfalls in dargestellt, sind ebenfalls zwei α-Diketone ohne besondere Gefahrenbezeichnung, außer für ihre Entflammbarkeit. Sie werden ebenfalls in Parfümen eingesetzt. Sie sind beide sowohl für die Erzeugung von Radikalanionen der Masse 128 u für ETD wie auch für nichtradikale Anionen der Masse 127 u für PTR geeignet. zeigt das Fragmentionenspektrum, das aus Substanz P durch ETD mit Anionen von 2,3-Heptandion erzeugt wurde.
Die Reihe kann weiter zu schwereren unverzweigten oder verzweigten Alkan-α-Diketonen fortgesetzt werden, beispielsweise zu 2,3-Oktandion (m = 142) oder sogar zu 2,2,7,7-Tetramethyloktan-4,5-dion ( ; m = 196 u).
Es können jedoch auch zyklisch gebundene α-Diketone verwendet werden. In ist die allgemeine Strukturformel für unverzweigte zyklische α-Diketone wiedergegeben, in die Strukturformel für verzweigte α-Diketone. wie beispielsweise 3,5,5-Trimethyl-1,2-Cyclo-Hexandion (m = 154 u), das ebenfalls in gezeigt ist. Eine allgemeine Strukturformel für bizyklische α-Diketone ist in wiedergegeben. Als Beispiel dazu werden in die beiden Enantiomere des Campherchinons (m = 166 u) gezeigt, die beide ebenfalls ungiftig sind.
Die Elektronenaffinitäten von einigen β-Diketonen sind in einem Übersichtartikel von P. Kebarle (Chem Rev. 1987, 87, 513–534) beschrieben. Allerdings liegen diese Elektronenaffinitäten mit 1.44 eV für Malonsäureanhydrid und 1.21 eV für Phtalsäureanhydrid oberhalb des günstigsten Bereiches, der bis etwa 0.8 eV reicht.
χ-Diketone, die zwischen den beiden Ketongruppen eine C=C-Doppelbindung tragen, wie beispielsweise Hex-3-en-2,5-dion ( ), könnten ebenfalls gut als ETD-Substanzen brauchbar sein; die Erfindung soll also nicht nur auf α-Diketone eingeschränkt sein.
Diese im Einzelnen genannten Substanzen sind aber ausdrücklich nur Beispiele; es gibt viele weitere Diketone als Kandidaten für die Herstellung erfolgreicher ETD-Radikal-Anionen. Die meisten dieser Substanzen sind ungiftig, im Gegensatz zu 2,3-Butandion.
Besonders vorteilhaft ist es, dass die Dampfdrucke der meisten Diketone um zwei bis drei Zehnerpotenzen höher sind als die der polyzyklischen Aromaten. Sie sind in der Regel bei Normaltemperatur größer als 0,1 Pascal. Sie können daher in ungeheizten Gefäßen außerhalb des Massenspektrometers gehalten und durch das Thermalisierungsgas, beispielsweise Methan, mit in die Elektronenanlagerungs-Ionenquelle mitgenommen werden. Soweit untersucht, liefern diese Substanzen in entsprechend betriebenen Elektronenanlagerungs-Ionenquellen durch Einstellung entsprechender Betriebsbedingungen auch nichtradikale Anionen für Protonenübertragungs-Reaktionen (PTR).
Detaillierte Untersuchungen zum Verlauf der Elektronentransfer-Dissoziation der Arbeitsgruppe um S. McLuckey (H. P. Gunawardena et al.; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127(36), 12627–12639: „Electron Transfer versus Proton Transfer in Gas-Phase Ion/Ion Reactions of Polyprotonated Peptides”) und von D. Simons (Chem. Phys. Letters 2010, 484, 81–95: „Mechanisms for S-S and N-Cα bond cleavage in peptide ECD and ETD mass spectrometry”) kommen zu dem Ergebnis, dass vor der Elektronenübertragung ein gemeinsamer Übergangskomplex gebildet wird, der aus dem Reaktant-Ion und dem Biopolymer-Ion besteht. Die Ausbildung des Komplexes ist um ein vielfaches langsamer als die Elektronenübertragung selbst und bestimmt den Zeitablauf der Reaktion. Sollten sich diese Ergebnisse als schlüssig erweisen, so ist zu erwarten, dass es bei der Ausbildung der Komplexe zu sterischen Behinderungen kommen kann, wenn die Reaktant-Ionen und die Biopolymer-Ionen entsprechend geformt sind. Die sterischen Behinderungen und Bevorzugungen könnten dann analytisch ausgenutzt werden, beispielsweise für Untersuchungen der Chiralität von Biopolymer-Ionen.
Die Substanzklasse der Diketone erlaubt es im Gegensatz zur bisher am besten für ETD untersuchten Substanzklasse der polyaromatischen Kohlenwasserstoffe, in das Alkylgerüst der linearen oder zyklischen Diketone gezielt Kohlenstoffatome einzubauen, die ein chirales Zentrum besitzen, das aus vier unterschiedlichen Substituenten besteht. Enantiomere (Moleküle mit Spiegel-Symmetrie) oder Diastereomere (Moleküle mit mehreren chiralen Zentren) sind besondere Formen chiraler Moleküle. Dem einschlägigen Fachmann sind Wege bekannt, Diketone mit gewünschter Chiralität zu synthetisieren.
Proteine, die teilweise oder vollständig aus den nicht natürlich vorkommenden D-Aminosäuren aufgebaut sind, sind als pharmakologische Wirkstoffe besonders interessant. Die hohe Wirksamkeit derartiger Proteine beruht unter anderem darauf, dass der enzymatische Abbau des Proteins in vivo aufgrund der eingebauten D-Aminosäuren langsamer verläuft. Für die Charakterisierung derartiger nicht natürlich vorkommender Proteine ist die Analyse der Stereoinformation der Kohlenstoffatome der Aminosäuren äußerst interessant.
Es ist zu erwarten, dass durch chirale, insbesondere enantiomere Reaktant-Ionen, rein oder angereichert, zwischen Proteinen mit natürlich vorkommenden L-Aminosäuren und solchen mit nicht natürlich vorkommenden D-Aminosäuren unterschieden werden kann. Die Ausbeuten der Elektronentransfer-Dissoziation mit enantiomeren Reaktant-Ionen wird vermutlich in Abhängigkeit des R- bzw. S-Enantiomers unterschiedlich sein, weil im Übergangskomplex aus Reaktant-Ion und Protein-Ion die Anlagerung des Reaktant-Ions an einer bestimmten Seite sterisch gehindert ist. Liegt in dem zu untersuchenden Protein eines der beiden Enantiomere der Aminosäure vor, dann wird die Höhe des Fragment-Ions im Vergleich zu den ebenfalls auftretenden Fragment-Ionen aller anderen Aminosäuren unterschiedlich sein.
Im Vergleich zu Proteinen, die bis auf wenige Ausnahmen aus den natürlich vorkommenden L-Aminosäuren aufgebaut sind, ist die Anzahl der Kohlenstoffe, die in R- bzw. S-Konfiguration vorkommen können, bei natürlichen Zuckerbausteinen weitaus höher. Ein einzelner reduzierter Aldohexose-Zuckerbaustein beispielsweise hat in der geöffneten Form vier Kohlenstoffe mit sogenannten stereogenen Zentren. Die meisten der möglichen Diastereomere kommen auch real in der Natur vor.
Elektronentransfer-Dissoziationen von mehrfach positiv geladenen Oligosacchariden liefert nach jüngsten Untersuchungen von L. Han und C. Costello (J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011, 22(6); 997–1013: „Electron Transfer Dissoziation of Milk Oligosaccharides”) hilfreiche Strukturinformation über die Zuckerbausteine in Ergänzung zu den bisher üblicherweise verwendeten ergodischen stoßinduzierten Fragmentierungen. Die Anzahl an sogenannten Ringspaltungen, die für die Zuordnung der einzelnen Zuckerbausteine von besonderem Vorteil sind, ist bei Elektronentransfer-Dissoziationen von Oligosacchariden mit Magnesiumkationen als Addukt-Ion besonders hoch. Bei den hier genannten Untersuchungen wurden Reaktant-Ionen ausgehend von Fluoranthen verwendet, das keinen chiralen Kohlenstoff besitzt. Es kann deshalb auch keine stereoselektive Elektronentransfer-Dissoziation zu beobachten sein.
Es ist aber zu erwarten, dass auch hier durch chirale, insbesondere enantiomere Reaktant-Ionen zwischen diastereomeren Zuckerbausteinen, eingebaut in die Oligosaccharide, unterschieden werden kann. Die Ausbeuten der Elektronentransfer-Dissoziation mit enantiomeren Reaktant-Ionen werden auch hier vermutlich in Abhängigkeit des R- bzw. S-Enantiomers unterschiedlich sein, weil im Übergangskomplex aus Reaktant-Ion und Oligosaccharid die Anlagerung des Reaktant-Ions an einer bestimmten Seite sterisch gehindert ist. Liegt in dem zu untersuchenden Oligosaccharid eines der möglichen Diastereomere der Zucker vor, dann wird die Intensität des Fragment-Ions im Vergleich zu den ebenfalls auftretenden Fragment-Ionen aller anderen Zuckerbausteine unterschiedlich sein.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht daher darin, für die Elektronentransfer-Dissoziation chirale, insbesondere enantiomere oder diastereoisomere Diketon-Ionen zu verwenden. Ein Beispiel ist durch das Radikalanion des Campherchinons ( ) gegeben. Durch wenige Reaktionsschritte lassen sich enantiomere Campherchinone sehr einfach herstellen; dem einschlägigen Fachmann sind die Wege dazu bekannt.
Auxiliare sind Hilfsstoffe, die bei einer chemischen Reaktion das Verhältnis von Reaktionsprodukten beeinflussen. Ein bekanntes Beispiel ist das sogenannte Evans-Auxiliar, ein chirales Oxazolidinon, das benannt nach dem Nobelpreisträger D. Evans zu einer enantioselektiven α-Alkylierung von Carbonsäureester führt. Ein weiteres chirales Auxiliar ist das Helmchen-Auxiliar, benannt nach dem Chemiker C. Heimchen, das aus natürlich vorkommendem Campher gewonnen wird. Die meisten chiralen Auxiliare leiten sich von in der Natur vorkommenden chemischen Stoffen ab und sind daher vielfach leicht zugänglich.
Stereoselektive Elektronentransfer-Dissoziationen oder Protonentransfer-Reaktionen in Massenspektrometern, die durch ein chirales Reaktant-Ion gesteuert werden, sind bislang in der Literatur nicht beschrieben. Chirale Reaktant-Ionen bieten aber die Möglichkeit, die Reaktionen zwischen Reaktant-Ionen und Biopolymer-Ionen gezielt zu lenken, so dass die genannten Reaktionen stereoselektiv verlaufen.
Ein Beispiel eines Ionenfallenmassenspektrometers zur Durchführung der Elektronentransfer-Dissoziation ist in schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine Elektrosprüh-Ionenquelle (1) mit einer Sprühkapillare (2) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung der Biopolymere verwendet. Es werde hier angenommen, dass eine Mischung von Verdaupeptiden eines größeren Proteins untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare (3) und einen Abstreifer (4) mit den Ionenleitsystemen (5) und (9) durch die Druckstufen (15), (16), (17) zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11 und 13) und Ringelektrode (12) geführt und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme (5) und (9) bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie können als Quadrupol-, als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt sein.
Ein erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit massenselektivem Auswurf und einer Messung der ausgeworfenen Ionen im Ionendetektor (14) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über die Verdaupeptide, da in der Elektrosprüh-Ionenquelle praktisch nur Molekülionen und keine Fragmentionen gebildet werden, wenn auch in verschiedenen Ladungsstufen. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert man beispielsweise mit üblichen Mitteln die dreifach geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt, man überfüllt zunächst die Ionenfalle und wirft dann alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht dreifach geladene Ionen dieses Peptids sind. Die dreifache Ladung erkennt man am Abstand der Isotopenlinien voneinander, die für dreifach geladene Ionen genau 1/3 atomare Masseneinheiten beträgt. Stehen dreifach geladene Ionen nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung, so können auch Ionen einer anderen Ladungsstufe verwendet werden.
Diese nunmehr isolierten mehrfach geladenen Ionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sodann werden die negativ geladenen Ionen hinzugefügt. Diese Ionen werden hier in einer gesonderten Ionenquelle (8) für negative chemische Ionisierung (Elektronenanlagerungsionenquelle) erzeugt und über ein kleines Ionenleitsystem (7) zum Ionenleitsystem (9) geführt. Ionenleitsysteme dieser Art können sowohl positive, wie auch negative Ionen weiterleiten. Die negativen Reaktant-Ionen durch zwei verkürzte Stäbe des stabförmigen Oktopol-Ionenleitsystems (9) in dieses eingefädelt, gelangen so zur Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise durch eine Einschussoptik (10) eingespeichert. Sie reagieren dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven Ionen.
Für die meisten der bisher verwendeten Substanzen zur Herstellung der Radikal-Anionen war es wegen ihres niedrigen Dampfdrucks notwendig, sie in einem auf 50° bis 250° Celsius heizbaren Behälter (18) zu halten, der nahe zur gleichfalls geheizten Elektronenanlagerungsionenquelle (8) angebracht war. Dabei wurde meist auf jedes Ventil verzichtet, so dass ein Absperren des Substanzbehälters nicht möglich war. Wie schon im einleitenden Teil dargelegt, ist diese Anordnung nachteilig, weil sich dadurch die Substanzen schnell verbrauchen und für jedes Nachfüllen der Substanz das Vakuumsystem des Massenspektrometers belüftet werden muss. Extrem schneller Verbrauch konnte nur durch eine Abschaltung der Heizung verhindert werden. Durch die Neuerung, Substanzen höheren Dampfdrucks für ETD verwenden zu können, kann die Substanz, beispielsweise das 2,3-Heptandion, jetzt in einem Behälter (19) außerhalb des massenspektrometrischen Vakuumsystems gehalten werden. Das Nachfüllen wird jetzt sehr einfach. Außerdem kann der Behälter (19) bei Raumtemperatur gehalten werden. Es entfällt somit die Schwierigkeit, eine geheizte Gasleitung durch die ungeheizten Wände des Vakuumsystems führen zu müssen. Dieser Behälter (19) kann beispielsweise direkt vom Methan aus einem Vorratsbehälter (20) durchspült werden, das für die Elektronenanlagerungsionenquelle als Thermalisierungsgas gebraucht wird. Das Methan nimmt dabei genügend Substanz für die Erzeugung der Radikal-Anionen mit. Die Gasleitung kann dabei auch leicht durch ein Ventil (21) verschließbar gehalten werden. Dadurch kann die Zufuhr der Substanz und auch des Thermalisierungsgases bei Bedarf unterbrochen werden. Es können durch mehrere Behälter und mehrere Ventile auch mehrere Ausgangssubstanzen, beispielsweise solche mit verschiedenen Massen, umschaltbar verwendet werden.
Wie inzwischen weithin bekannt, bleiben beim Prozess der Elektronentransfer-Dissoziation manchmal die gebildeten Fragmentionen miteinander assoziiert und bilden dabei instabile Radikal-Kationen, die aber nicht sofort zerfallen. Es ist daher günstig, eine schwache dipolare Anregungswechselspannung für eine resonante Anregung dieser Radikal-Kationen an die beiden Endkappen (11, 13) der Ionenfalle zu legen. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass diese Radikal-Kationen rasch zerfallen, wozu nur relativ schwache Stöße notwendig sind, und wodurch die Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorten erhöht wird.
Die in der Elektronenanlagerungsionenquelle aus dem 2,3-Heptandion unter veränderten Betriebsbedingungen erzeugten nichtradikalen Anionen der Masse m = 127 atomaren Masseneinheiten können erfolgreich für eine Ladungsverminderung durch Protonentransfer-Reaktionen eingesetzt werden. Auch wenn diese nicht völlig sauber von den Radikal-Anionen getrennt aus der Ionenquelle extrahiert werden können, können sie gut für PTR eingesetzt werden, da sowieso aus Gründen der Zeitersparnis meist Ladungsverminderung und Elektronentransfer-Dissoziation gleichzeitig ausgeführt werden. Das Verhältnis beider Ionenarten lässt sich durch die Extraktionsspannung an der Ionenquelle in weiten Grenzen einstellen.
Der einschlägige Fachmann kann in Kenntnis darüber, dass auch Substanzen mit höheren Dampfdrucken mit einem weiten Bereich von Molekularmassen als Ausgangssubstanzen für die Herstellung von Radikal-Anionen für ETD verwendet werden können, weitere Maßnahmen treffen, die eine Handhabung des Massenspektrometers oder eine Durchführung der Analysenverfahren erleichtern.

Claims

Verwendung von Substanzen, die der Substanzklasse der α-Diketone angehören und eine Molekülmasse m größer oder gleich 100 atomaren Masseneinheiten haben, zur Herstellung von Anionen für Ladungstransfer-Reaktionen mit mehrfach geladenen Kationen in Massenspektrometern.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen zur Herstellung von Radikal-Anionen für die Elektronentransfer-Dissoziation von mehrfach geladenen Kationen in Massenspektrometern eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen zur Herstellung von nichtradikalen Anionen für die Protonentransfer-Reaktion mehrfach geladener Kationen in Massenspektrometern eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen bei Normaltemperatur Dampfdrucke über 0,1 Pascal haben.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen der Substanzklasse der offenkettigen Alkan-α-Diketone angehören.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen der Substanzklasse der zyklischen α-Diketone angehören.
Verwendung von Substanzen, die der Substanzklasse der Diketone angehören, wobei die Ketogruppen der Substanzen durch eine oder mehrere C=C-Doppelbindungen verbunden sind, und die eine Molekülmasse m größer oder gleich 100 atomaren Masseneinheiten haben, zur Herstellung von Anionen für Ladungstransfer-Reaktionen mit mehrfach geladenen Kationen in Massenspektrometern.
Verwendung von Substanzen, die der Substanzklasse der Diketone angehören, wobei mindestens ein Kohlenstoffatom im Alkangerüst der Substanzen vier verschiedene Substituenten enthält, wodurch Enantiomere oder Diastereomere gebildet werden, und die eine Molekülmasse m größer oder gleich 100 atomaren Masseneinheiten haben, zur Herstellung von Anionen für Ladungstransfer-Reaktionen mit mehrfach geladenen Kationen in Massenspektrometern.
Verfahren zur Durchführung einer Ladungstransfer-Reaktion zwischen Ionen, dadurch gekennzeichnet, dass Anionen aus Substanzen, die der Substanzklasse der α-Diketone angehören und eine Molekülmasse m größer oder gleich 100 atomaren Masseneinheiten haben, gebildet und mit mehrfach geladenen Kationen in einem Reaktionsraum zusammengebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Radikal-Anionen der α-Diketone zur Durchführung einer Elektronentransfer-Dissoziation mehrfach geladener Kationen gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass nichtradikale Anionen der α-Diketone zur Durchführung einer Ladungsminderung mehrfach geladener Kationen durch Protonentransfer gebildet werden.
Verfahren zur Durchführung einer Ladungstransfer-Reaktion zwischen Ionen, dadurch gekennzeichnet, dass Anionen aus Substanzen, die der Substanzklasse der enantiomeren oder diastereomeren Diketone angehören und eine Molekülmasse m größer oder gleich 100 atomaren Masseneinheiten haben, gebildet und mit mehrfach geladenen Kationen in einem Reaktionsraum zusammengebracht werden, wobei das enantiomere oder diastereomere Diketon im Überschuss für die Erzeugung von Anionen für die Ladungstransfer-Reaktion eingesetzt wird.