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Die
Erfindung bezieht sich auf die Fragmentierung von mehrfach positiv
geladenen Biopolymer-Ionen durch Elektronentransfer (ETD = electron transfer
dissociation) in Reaktionen mit Radikal-Anionen.
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Die
Erfindung gibt bisher nicht bekannte Klassen von Substanzen an,
deren Radikal-Anionen zu Dissoziationen durch Elektronentransfer
mit hoher Ausbeute an Fragmentionen führen und die günstige Eigenschaften
für ihre Handhabung und für die damit verbundenen
analytischen Verfahren haben. So erlaubt es beispielsweise die hohe
Flüchtigkeit der Substanzen, sie in ungeheizten Behältern
außerhalb des Vakuumsystems zu bewahren, wodurch ein Austausch
der Behälter mit verbrauchten Substanzen erleichtert wird.
Das niedrige Molekulargewicht erlaubt die Messung auch sehr leichter
Fragmentionen bis herunter zu einzelnen endständigen Aminosäuren.
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Stand der Technik
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Die
Sequenzen der Grundbausteine von Biopolymeren und deren posttranslationale
Modifikationen (PTM) werden heute vorwiegend mit Tandem-Massenspektrometern
aufgeklärt. Eine Schlüsseltechnik ist dabei die
Fragmentierung der Biopolymer-Ionen. Es gibt dabei die beiden grundverschiedenen
Arten der ergodischen und der elektroneninduzierten Fragmentierung,
für die jeweils mehrere Verfahren bekannt sind,
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Im
Folgenden werde insbesondere auf Peptide und Proteine als Biopolymere
eingegangen. Die elektroneninduzierte Fragmentierung der Peptid- oder
Protein-Ionen ist zur ergodischen Fragmentierung komplementär,
weil sie erstens an anderen Stellen der Aminosäuren innerhalb
der Kette aus Aminosäuren spaltet und zweitens nicht die
Seitenketten der posttranslationalen Modifikationen bei der Fragmentierung
ablöst, wie das bei der ergodischen Fragmentierung der
Fall ist. Durch Vergleich der ergodisch mit den elektroneninduziert
gewonnenen Fragmentionenspektren können sowohl die Sequenzen wie
auch die Modifikationen abgelesen werden.
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Das
einfachste elektroneninduzierte Verfahren ist die Elektronentransfer-Dissoziation,
die als Reaktion von positiven und negativen Ionen bestimmter Arten
abläuft. So können bestimmte Arten negativer Reaktant-Ionen
verwendet werden, um mehrfach positiv geladene Biopolymerionen,
insbesondere Peptid- oder Proteinionen, durch einen Transfer eines
Elektrons zu spalten („ETD” = electron transfer
dissociation). Die Reaktant-Ionen sind regelmäßig
Radikal-Anionen der Form M
.–, die
leicht Elektronen abgeben. Der Stand der Technik ist im Patent
DE 10 2005 004 324
B4 (R. Hartmer und A. Brekenfeld) und in der Offenlegungsschrift
US 2005/0199804 A1 (D.
F. Hunt et al.) beschrieben. Es werden in beiden Schriften mehrfach
geladene positive Peptid- oder Protein-Ionen durch Reaktant-Anionen
mit diesem Verfahren fragmentiert.
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Für
das Verfahren der Elektronentransfer-Dissoziation ist die Kenntnis
von Ausgangssubstanzen zur Erzeugung geeigneter radikaler Reaktant-Anionen
entscheidend. Diese Ausgangssubstanzen müssen in der Lage
sein, in besonderen Elektronenanlagerungsionenquellen Elektronen
schnell und mit guter Effizienz stabil, aber nur schwach zu binden.
Die bisher bekannten ETD-effektiven Ausgangssubstanzen haben niedrige,
aber immer noch positive Elektronenaffinitäten in der Gegend
von etwa 0,55 ± 0,25 eV. Die somit an diese Ausgangssubstanzen
schwach gebundenen Elektronen können durch positiv geladene
Ionen leicht abgelöst und auf sich selbst transferiert
werden.
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Die
grundsätzlichen Zusammenhänge zwischen Elektronenaffinität
und Elektronentransfer sind in dem ausführlichen Übersichtsartikel
von P. Kebarle und S, Chowdhury, Chem. Rev. 1987, 7, 513–534, „Electron
Affinities and Electron-Transfer Reactions" dargelegt.
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In
der oben bereits zitierten Offenlegungsschrift von D. F. Hunt et
al. wird dargelegt, dass solche Substanzen in der Gruppe
der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (polyaromatic
hydrocarbons) zu finden sind. Im Einzelnen werden die Substanzen
Anthracen, Naphtalen, Fluoren, Phenanthren, Pyren, Fluoranthen,
Chrysen, Triphenylen, Perylen, 2,2'-Biquinolin, Acridin und weitere
aufgeführt. Diese Substanzen haben laut NIST-Datenbank (NIST
chemistry webbook), soweit verzeichnet, Elektronenaffinitäten
(EA) zwischen 0,3 und 0,8 Elektronenvolt. Unter diesen Substanzen
werden Fluoranthen (EA = 6,7 eV) und 2,2'-Biquinolin als besonders geeignet
für eine saubere Elektronentransfer-Dissoziation mit hoher
Ausbeute an Fragmentionen und ohne wesentliche Anteile an Protonentransfer-Reaktionen
herausgestellt. Aus den anderen Substanzen (außer Perylen)
werden, wie aus Tabelle 1 der zitierten Offenlegungsschrift hervorgeht,
aus der Elektronenanlagerungsionenquelle stets auch nichtradikale Anionen
der Form (M-1)– mitgeliefert, die
hier unerwünschte Protonentransfer-Reaktionen erzeugen. Es
sind also nicht alle dieser polyzyklischen Aromaten gleich günstig
für ETD.
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Unter
einer hohen ETD-Effektivität der Anionen einer Substanz
soll hier verstanden werden, dass einerseits eine hohe Ausbeute
an Fragmentionen von mehr als 50% der zu dissoziierenden Ionen erzielt
wird und andererseits die Anteile von Protonentransfer-Reaktionen
unter 30%, vorzugsweise unter 10% liegen. In diesem Sinne sind Fluoranthen und
2,2'-Biquinolin besonders ETD-effektiv.
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Diese
polyzyklischen Aromaten, darunter auch die bisher als sehr ETD-effektiv
bekannte Substanz Fluoranthen, haben aber einen sehr niedrigen Dampfdruck
in der Größenordnung von 1 Pascal bei 20° Celsius
oder sogar weit darunter. In Elektronenanlagerungsionenquellen müssen
die Substanzen mit Partialdrucken von etwa 100 bis 1000 Pascal vorliegen;
die polyzyklischen Aromaten müssen daher in ihrem Behälter
auf 50° bis 250° Celsius geheizt und über
geheizte Leitungen einer geheizten Elektronenanlagerungsquelle zugeführt
werden. Das erfordert konstruktiv schwierige Maßnahmen,
wenn der Substanzbehälter außerhalb des Vakuumsystems
angebracht werden soll. Die Schwierigkeiten betreffen insbesondere
die Durchführung der geheizten Gasleitung durch die ungeheizte
Wand des Vakuumsystems, ohne dass hier eine Kondensationsfalle für
den Substanzdampf entsteht.
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Es
wird daher im heutigen Stand der Technik regelmäßig
eine weit einfachere Lösung verfolgt. Diese besteht darin,
den geheizten Substanzbehälter im Vakuumsystem in der Nähe
der Elektronenanlagerungsquelle anzubringen oder sogar den Substanzbehälter
durch die Elektronenanlagerungsionenquelle selbst heizen zu lassen,
die durch die Glühkathode für die Elektronenemission
automatisch genügend geheizt wird. Nachteilig ist dann
aber, dass für ein Nachfüllen nicht nur Behälter
und Elektronenanlagerungsquelle abgekühlt werden müssen,
sondern es muss auch das Vakuumsystem belüftet und geöffnet werden.
In der Massenspektrometrie scheut man jedoch das Belüften
des Vakuumsystems, weil die Wiederinbetriebnahme eines Massenspektrometers
aufwändig und langwierig ist und meist eine erneute Kalibrierung
der Massenskala und anderer Einstellungen erfordert. Nachteilig
ist auch, dass es konstruktiv schwierig ist, die Substanzzufuhr
zur Elektronenanlagerungsquelle in Messpausen oder bei Messungen ohne
ETD zu unterbrechen, so dass man meist auf die Möglichkeit
zur Unterbrechung verzichtet, was aber einen ständigen
Verbrauch der Substanzen und somit häufigeres Auffüllen
bedeutet.
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Neben
der Elektronentransfer-Dissoziation können durch andersartige
Reaktionen zwischen vielfach positiv geladenen Analyt-Ionen und
besonderen Arten negativ geladener Ionen auch die Anzahlen der jeweiligen
Ladungen an den positiven Analyt-Ionen vermindert werden („PTR” =
Proton transfer reactions, auch „charge stripping” genannt).
Dazu sind andersartige, in der Regel nichtradikale Anionen erforderlich,
die aber in günstigen Fällen in besonderen, umschaltbaren
Elektronenanlagerungsionenquellen aus den gleichen Substanzen gewonnen werden
können (Offenlegungsschrift
DE 10 2006 049 241 A1 ;
R. Hartmer). Durch die Ladungsverminderung können sehr
schwere, hoch geladene Analyt-Ionen in weniger hoch geladene Ionen
umgewandelt werden, um die Komplexität der Massenspektren
aus Gemischen vieler schwerer, verschieden hoch geladener Analyt-Ionen
zu vermindern. Im Grenzfall lassen sich die Analyt-Ionen oder die
Fragment-Ionen bis herunter zu den einfach geladenen Ionen umwandeln,
die dann viel einfacher zu interpretierende Massenspektren ergeben.
In einigen Arten von Massenspektrometern wird es überhaupt
nur durch diese Ladungsverminderung möglich, die Isotopengruppen aller
Ionensignale nach einzelnen ladungsbezogenen Massen m/z aufzulösen,
um so, wie jedem Fachmann bekannt, aus dem Abstand der Ionensignale die
Anzahl z der Ladungen der Ionen dieser Isotopengruppe und damit
ihre physikalische Masse m bestimmen zu können.
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Für
die Erzeugung der beiden Sorten von Anionen, sowohl der Radikal-Anionen
für eine Elektronentransfer-Dissoziation wie auch der nichtradikalen
Anionen für eine Ladungsverminderung, kann unter günstigen
Umständen dieselbe Elektronenanlagerungsionenquelle verwendet
werden. Diese ist weitgehend identisch mit üblichen Ionenquellen
für negative chemische Ionisierung (NCI), wird aber mit einem
besonderen Gas betrieben, mit dem die eingeschossenen Elektronen
schnell thermalisiert werden. Als Thermalisierungsgas wird häufig
Methan verwendet. Dabei werden bei Elektronenbeschuss auch Wasserstoff-Radikale
geliefert. Wie in der zitierten Offenlegungsschrift
DE 10 2006 049 241 A1 dargelegt,
genügt es, wenn die Ausgangssubstanz dafür geeignet
ist, die Spannung zum Extrahieren der Anionen zu verändern,
um die eine oder andere Art von Anionen zu liefern.
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Die
Reaktionen zur Elektronentransfer-Dissoziation wie auch zur Ladungsverminderung
finden überwiegend in Reaktionszellen statt, in denen sowohl
positive wie auch negative Ionen gespeichert werden können.
Auch Reaktionen in Ionenleitsystemen sind bekannt. Die Reaktionszellen
sind regelmäßig mit einem Dämpfungsgas
befüllt, in dem die Ionenbewegungen thermalisiert werden.
Reaktionszellen können beispielsweise zweidimensionale
Hochfrequenz-Ionenfallen mit besonderen Pseudopotentialschwellen
an den Enden, aber auch dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen
sein. Es sind Geräte mit beiden Sorten von Reaktionszellen
auf dem Markt und dem einschlägigen Fachmann bekannt. Die
positiven Analyt-Ionen und die negativen Reaktant-Ionen werden in
der Regel zeitlich nacheinander in die Ionenfallen eingebracht und
dort gemischt. Die Reaktionen laufen dann ohne weiteres Zutun ab.
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Es
kann allerdings in einigen Fällen vorkommen, dass die Fragmentierung
nicht vollständig abläuft, weil die durch Dissoziation
gebildeten Fragmentionen assoziiert bleiben. Es ist aber gleichfalls bekannt,
dass man in diesen Fällen die assoziierten Fragmentionen
durch leichte Anregung ihrer sekularen Schwingungen zu Stößen
mit dem Dämpfungsgas bringen kann, wobei sich die Assoziationen
auflösen.
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Quadrupolare
Hochfrequenz-Ionenfallen können auch selbst als Massenanalysatoren
für die entstehenden Produkt-Ionen verwendet werden. Sie müssen
dann eine hyperbolische Form der Elektroden sehr genau einhalten,
um eine präzis resonante Anregung insbesondere für
einen gut nach Massen aufgelösten Auswurf der Ionen für
ihre Messung zu ermöglichen. Die Messung der massensequentiell ausgeworfenen
Ionen ergibt ein Massenspektrum. Die genaue Form der Elektroden
ist notwendig, um durch ein gut harmonisches Pseudopotentialfeld
die Anregungsfrequenzen der zu Schwingungen angeregten Ionen während
einer resonanten Anregung konstant und unabhängig von der
Schwingungsamplitude zu halten. Die Formgebung der Elektroden muss
daher im Inneren ein sehr gut geformtes Quadrupolfeld erzeugen.
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In
einigen Quadrupol-Massenspektrometern ist das Quadrupolfeld aber
auch gezielt mit geringen Anteilen an höheren Multipolfeldern überlagert.
Solche willkürlich erzeugten Abweichungen vom reinen Quadrupolfeld
können einerseits nicht-lineare, sehr starke und scharfe
Resonanzbedingungen einführen und andererseits die Ionen
während eines fortlaufenden Massenscans in Resonanz halten.
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In
dreidimensionalen Ionenfallen mischen sich die Ionen während
des Einführens von selbst. In zweidimensionalen Ionenfallen
verfährt man manchmal etwas anders. Sollen in solchen linearen
Ionenfallen Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionen herbeigeführt
werden, so werden die Wolken mit den positiven Analyt-Ionen und
den negativen Reaktant-Ionen zunächst in getrennten Abschnitten gesammelt,
die Vorfilter und Nachfilter genannt werden, und dann durch eine
besondere Schaltung der Achsenpotentiale einer Durchmischung im
Mittelteil der linearen Ionenfalle zugeführt. Dieses Verfahren ist
in der oben bereits zitierten Offenlegungsschrift
US 2005/0199804 A1 (D.
F. Hunt et al.) sehr detailliert dargelegt.
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Die
Hochfrequenz-Ionenfallen haben stets eine scharfe Speicherschwelle
für leichte Ionen. Ionen unterhalb einer ladungsbezogenen
Schwellenmasse können nicht gespeichert werden. Die Schwellenmasse
ist proportional zur Hochfrequenzamplitude, sie kann durch Veränderung
der Hochfrequenzspannung verändert werden. Dieses Phänomen
verhindert die Speicherung leichter Fragmentionen nach ihrem Entstehen
durch die Fragmentierungsreaktion. Andererseits kann dieses Phänomen verwendet
werden, um nach genügender Reaktionszeit durch kurzzeitige
Erhöhung der Hochfrequenzspannung überschüssige
Reaktant-Ionen sehr schnell in Bruchteilen von Millisekunden auszuwerfen,
wenn diese leicht genug sind. Dieses Verfahren ist günstiger
als ein Auswurf durch resonante Anregung, da letzteres Verfahren
länger dauert, weil immer eine ganze Isotopengruppe ausgeworfen
werden muss, was eine Lücke in das Massenspektrum reißt.
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Die
mehrfach positiv geladenen Analyt-Ionen erzeugt man in der Regel
in Elektrosprüh-Ionenquellen. Dabei entstehen automatisch
Ionen, die pro etwa 700 Dalton Masse der Analytmoleküle
im Mittel etwa eine Ladung tragen, wobei die Anzahl der Ladungen aber
breit streut. Für Analytmoleküle einer physikalischen
Masse von etwa 10 000 Dalton erzeugt man Ionen einer breiten Verteilung
der Ladungsstufen, die von etwa siebenfach bis etwa 20fach geladen
reichen. Für diese Ionengemische ist es zweckmäßig, vor,
während oder nach der Elektronentransfer-Dissoziation durch
Reaktionen mit geeigneten negativen nichtradikalen Reaktant-Ionen
eine Ladungsminderung durch PTR durchzuführen. Es ist daher
günstig, wenn die dafür notwendigen nichtradikalen
Reaktant-Ionen in der gleichen Elektronenanlagerungsionenquelle,
vorzugsweise auch aus derselben Ausgangssubstanz, hergestellt werden
können.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Ausgangssubstanzen mit hoher ETD-Effizienz
zu finden, insbesondere solche Substanzen, die bei normaler Umgebungstemperatur
einen genügend hohen Dampfdruck besitzen, um aus einem
Behälter außerhalb des Vakuumsystems zugeführt
werden zu können. Günstig ist des weiteren ein
niedriges Molekulargewicht und die Eigenschaft, auch aus der Elektronenanlagerungsionenquelle
selektierbare nichtradikale Anionen für eine Ladungsverminderung
der Biopolymerionen oder ihrer Fragmentionen liefern zu können.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht darin, Ausgangssubstanzen aus der Substanzklasse
der Aliphaten mit Elektronenaffinitäten zwischen 0,3 und
0,8 Elektronenvolt zu verwenden. Es gibt in umfangreichen Tabellenwerken
nur wenige Substanzen mit bekannter Elektronenaffinität,
die diesen Bedingungen genügen. Durch Substitutionen mit
Elektronen anziehenden oder Elektronen abstoßenden Gruppen
können aber auch aus solchen Aliphaten, die zunächst
nicht diesen Bedingungen genügen, häufig Ausgangssubstanzen
mit geeigneten Elektronenaffinitäten und solcher Stabilität
hergestellt werden, dass aus ihnen ETD-effektive Radikal-Anionen
gebildet werden können. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe
oder ihre Substitute haben meist weit höhere Dampfdrucke
als die polyzyklischen Aromaten.
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Als
Beispiel einer besonders günstigen Ausgangssubstanz aus
dieser Substanzklasse wird hier das unsubstituierte 1-3-5-7-Cyclooctatetraen
([8]Annulen; C8H8; 1)
vorgestellt. Dieses monozyklische Polyen gilt als nichtaromatisch
und ist somit definitionsgemäß ein Aliphat. Es bietet
neben einer hohen Ausbeute an ETD-Fragmentionen als weitere Vorteile
einen mäßig hohen Dampfdruck von etwa 1000 Pascal
bei 20° Celsius und ein relativ niedriges Molekulargewicht
von 104 Dalton. 1-3-5-7-Cyclooctatetraen ist eine chemisch stabile,
goldgelbe Flüssigkeit mit einem Schmelzpunkt bei 0° Celsius
und einem Siedepunkt bei etwa 140° Celsius. Die Substanz lässt
sich in Massenspektrometern in Behältern außerhalb
des Vakuumsystems bei Raumtemperatur halten. Durchströmt
das Thermalisierungsgas für die Elektronenanlagerungsionenquelle,
beispielsweise Methan, den Gasraum dieses Behälters über
dem Flüssigkeitsspiegel, so nimmt es genügend
Substanzdampf zur Elektronenanlagerungsionenquelle mit, so dass
dort aus diesem Substanzdampf ausreichend Radikal-Anionen für
die Elektronentransfer-Dissoziation gebildet werden können.
Das niedrige Molekulargewicht von 104 Dalton ist günstig,
um in der Reaktionszelle nach masseninstabilem Auswurf der nicht
verbrauchten Reaktant-Anionen auch Fragmentionen mit niedriger Masse
zu sehen, die aus zwei, zum Teil sogar aus nur einer Aminosäure bestehen.
So können beispielsweise die ehemals endständigen
C1-Fragmentionen von 13 der 20 Aminosäuren
detektiert werden.
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Andererseits
lassen sich aus 1-3-5-7-Cyclooctatetraen in einer geeigneten Elektronenanlagerungsionenquelle
auch nichtradikale Anionen der Masse 99 Dalton erzeugen, die für
eine Ladungsverminderung genutzt werden können.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
die Struktur des 1-3-5-7-Cyclooctatetraens ([8]Annulen).
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2 stellt
ein Schema eines Ionenfallenmassenspektrometers für die
Durchführung von ETD dar, mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle
(1, 2) zur Erzeugung der mehrfach positiv geladenen
Analytionen, einer Elektronenanlagerungsionenquelle (8)
für die Erzeugung der negativ geladenen Reaktant-Ionen
(Radikal-Anionen) und Endkappenelektroden (11, 13)
und Ringelektrode (12) einer 3D-Ionenfalle, die als Reaktionszelle
für die ETD dient. Das Ionenleitsystem (9), hier
als Multipol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive
wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten. Nach dem Stand der
Technik befindet sich die Ausgangssubstanz zur Herstellung der Radikal-Anionen
in einem beheizten Behälter (18) nahe an der Ionenquelle
(8); die Verwendung von leichtflüchtigen Ausgangssubstanzen
nach dieser Erfindung ermöglicht es aber, den Substanzbehälter (19),
der von Methangas aus einem Vorratsbehälter (20)
durchströmt wird, ungeheizt außerhalb des Vakuumsystems
zu montieren.
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3 zeigt
das Spektrum der negativen Ionen der Substanz Cyclooctatetraen mit
dem Radikal-Anion bei der Masse 104 Da, das hier bei weitem überwiegt
und zur Durchführung der Elektronentransfer-Dissoziation
dient. Daneben ist hier ein schwaches Signal bei der Masse 99 Da
zu sehen, das von einem nichtradikalen Anion gebildet wird. Es kann
durch Umsteuerung der Elektronenanlagerungsquelle bevorzugt extrahiert
und so für Ladungsverminderungen verwendet werden.
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4 zeigt
ein Massenspektrum der positiv geladenen Fragmentionen, die durch
ETD mit Cyclooctatetraen-Radikal-Anionen aus dreifach geladenen
Ionen des Peptids „Substanz P” (Molekulargewicht
1347,66 Da) hergestellt wurden.
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5 gibt
zum Vergleich ein Massenspektrum der durch Radikal-Anionen von Fluoranthen
erzeugten Fragmentionen der dreifach geladenen Ionen von Substanz
P wieder. Der Vergleich zeigt, dass die Effektivität beider
Ausgangssubstanzen ähnlich groß ist. Es werden
die gleichen Fragmentionen gebildet. Die leichten Variationen der
Intensitäten sind normal für Spektren, die aus
einer einzigen Füllung der Reaktionszelle gewonnen werden.
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Beste Ausführungsformen
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Die
Erfindung besteht darin, Aliphate mit Elektronenaffinitäten
zwischen 0,3 und 0,8 Elektronenvolt zur Herstellung der Radikalanionen
für die Elektronentransfer-Dissoziation zu verwenden.
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Die
Elektronenaffinität ist diejenige Energie, die man aufwenden
muss, um das Elektron aus dem Radikal-Anion wieder zu entfernen,
also die Bindungsenergie des zugefügten Elektrons. Diese
Bindungsenergie darf nicht zu klein sein, da sonst einerseits die
Substanz kaum Elektronen aufnimmt und andererseits die Anionen nach
Aufnahme eines Elektrons auch leicht das Elektron wieder verlieren.
Die Bindungsenergie darf aber auch nicht zu groß sein, da
sonst die positiven Biopolymer-Ionen das Elektron nicht abtrennend
an sich ziehen können, also nicht den Elektronentransfer
bewirken können.
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Der
Begriff „alphatisch” ist in der organischen Chemie
als „nichtaromatisch” definiert. In der sehr umfänglichen
NIST-Datenbank für organische Substanzen (webbook.nist.gov)
sind allerdings in der Tabelle der Substanzen mit bekannten Elektronenaffinitäten
im Bereich von EA = 0,3 bis 0,8 eV unter weit mehr als 200 Einträgen
(unter denen sich aber viele Substanz-Anionen oder Radikale befinden)
nur wenige solcher Aliphate verzeichnet, wohingegen fast alle polyzyklischen
Aromaten aus der oben zitierten Offenlegungsschrift
US 2005/0199804 A1 (D.
F. Hunt et al.) dort zu finden sind. Beschränkt man sich
auf die aliphatischen Substanzen ohne metallische Heteroatome mit
Molekulargewichten zwischen 80 und 200 Dalton, so sind in diesem
Bereich dort nur folgende sechs Substanzen zu finden:
Trichlorethen
(m = 131,39 Da; EA = 0,400 eV);
1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-Propanon
(m = 166,02 Da; EA = 0,442 eV);
Tetrafluorfuran-2,5-dion (Perfluor-Bernsteinsäure-Anhydrid,
m = 172,03 Da; EA = 0,500 eV);
1,3,5,7-Cyclooctatetraen (m
= 104,15 Da, EA = 0,550 eV);
Tetrachlorethen (m = 165,83 Da;
EA = 0,64 eV);
2,3-Butadion (m = 86,09 Da; EA = 0,69 eV).
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Da
es gelegentlich günstig ist, sehr schwere Radikal-Anionen
zu verwenden, soll hier noch das C84-Fulleren
aufgeführt werden, das ein Molekulargewicht von m = 1008,9
Da und eine Elektronenaffinität von EA = 0,41 eV hat.
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Nicht
alle diese Substanzen liefern jedoch geeignete Radikal-Anionen für
die Elektronentransfer-Dissoziation. So zerfällt beispielsweise
das Tetrafluorofuran-2,5-dion nach der Aufnahme eines Elektrons
in der Elektronenanlagerungsionenquelle in ein stabileres Anion,
das sich nicht mehr zur Abgabe von Elektronen eignet.
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Aus
grundsätzlichen Erwägungen scheinen Substanzen
mit Doppelbindungen, insbesondere Polyene, besonders günstige
Ausgangssubstanzen zu sein. Polyene sind organische Verbindungen,
die zwei oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten.
Je nach Anzahl der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen im Molekül
unterscheidet man bei Polyenen zwischen Dienen (mit zwei), Trienen
(mit drei), Tetraenen (mit vier), Pentaenen (mit fünf Doppelbindungen)
usw..
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Monozyklische
Polyene, die nach der Hückel-Regel statt der 4n + 2π-Elektronen
der Aromaten im Ring nur 4n π-Eiektronen besitzen (mit
n = 0, 1, 2, 3...), gehören zu den sogenannten „Antiaromaten”.
Sie sind keine Aromaten, wie auch NMR-Untersuchungen zeigen, und
gehören somit zu den Aliphaten. Antiaromaten besitzen nach
der Hückel-Näherung ungünstige Energieniveaus.
Dadurch sind sie instabiler als die aromatischen Verbindungen.
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In
Ergänzung zu den angegeben Substanzen aus der NIST-Tabelle
können auch weitere Aliphaten hergestellt werden, indem
man aliphatische Kohlenwasserstoffe durch Substitutionen mit entsprechenden
Gruppen in ihrer Elektronenaffinität verändert.
Für die Veränderung der Elektronenaffinität durch
geeignete Substituenten können Heteroatome wie Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel die Kohlenstoffatome ersetzen, oder auch
chemische Gruppen statt der Wasserstoffatome eingesetzt werden.
Elektronen anziehende Gruppen, wie beispielsweise die Cyano-Gruppe
(sie ergeben Nitrile), die Nitro-Gruppe oder die Halogene wie Fluor,
Chlor oder Brom, erhöhen die Elektronenaffinität.
Elektronen drückende Gruppen dagegen, wie beispielsweise
die Nitrite oder auch Äthergruppen (ergeben O-Alkyle),
erniedrigen die Elektronenaffinität.
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Als
Beispiel werde hier das Isoamylnitrit (C5H11NO2) vorgestellt,
das als aliphatisches Ester der salpetrigen Säure mit einem
Molekulargewicht von m = 117,15 Da hergestellt wurde. Die Verwendung
als Ausgangssubstanz für die ETD ergab allerdings, dass
sich in der Elektronenanlagerungsionenquelle als Zerfallsprodukt
ein Anion der Masse m = 85 Da bildete. Dieses konnte zwar Elektronentransfer-Dissoziation
erzeugen; die Effektivität lag allerdings nicht im wünschenswerten
Bereich.
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Als
außerordentlich erfolgreiches Beispiel aus der Substanzklasse
der aliphatischen Polyene werde hier das unsubstituierte 1-3-5-7-Cyclooctatetraen
(COT) vorgestellt, das neben einer hohen Fragmentionenausbeute bei
ETD auch sonst günstige Eigenschaften aufweist. Cyclooctatetraen
mit vier Doppelbindungen im Achterring (siehe 1)
ist eine goldgelbe Flüssigkeit mit etwa 1000 Pascal Dampfdruck
bei 20° Celsius. Es ist nicht giftiger als viele andere
Chemikalien, die in einschlägigen Laboratorien benutzt
werden, und daher leicht handhabbar. Cyclooctatetraen besitzt 8π-Elektronen,
gehört also zu den Antiaromaten. Es liegt nicht planar
vor, so dass die Doppelbindungen nicht konjugiert sind (wie auch NMR-Untersuchungen
zeigen); auch aus diesem Grunde gehört es nicht zu den
Aromaten, ist also ein Aliphat. Die Elektronenaffinität
beträgt 0,55 eV. Es liefert Radikal-Anionen der Masse 104
Dalton, die bei Elektronentransfer-Dissoziation hervorragende Ausbeuten
an Fragmentionen zeigen. Alle Wasserstoffatome sind „vinylisch” und
somit besonders stark an das Kohlenstoffatom gebunden, was nichts
anderes bedeutet, als dass das Radikalanion von COT recht stabil
ist.
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Die 3 und 4 zeigen
die Massenspektren der Radikal-Anionen von 1-3-5-7-Cyclooctatetraen
und die hiermit gewonnenen Dissoziationsprodukte von Substanz P.
In 5 sind die mit Radikal-Anionen von Fluoranthen
gewonnenen Dissoziationsprodukte der Substanz P zum Vergleich wiedergegeben.
Man sieht, dass die ETD-Effektivität der Radikal-Anionen
beider Ausgangssubstanzen ähnlich ist und dass exakt die
gleichen Fragmentionensorten gebildet werden. Die leichten Unterschiede der
Intensitäten liegen im normalen Variationsbereich für
Einzelspektren.
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Auch
einige durch Alkyle substituierte Formen des 1-3-5-7-Cyclooctatetraen
(Alkyl = Methyl, Ethyl, Propyl, Isobutyl) sowie einige Formen des
Cyclooctatetraen mit Heteroatomen sind für die Herstellung
von ETD-Reaktantionen geeignet.
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Es
soll hier nicht unerwähnt bleiben, dass auch in der oben
zitierten Offenlegungsschrift
US 2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) über
Untersuchungen zur Verwendung der Anionen von nichtaromatischen
Substanzen für ETD berichtet wurde. So wurden Perfluortributylamin,
Schwefelhexafluorid und Perfluor-1,3-Dimethylcyclohexan untersucht.
Die Anionen dieser Substanzen bewirkten dabei erwartungsgemäß eine
Elektronentransfer-Dissoziation, aber nur in sehr geringer Menge,
während die gleichzeitig ablaufenden Protonentransfer-Reaktionen ganz
vorherrschend waren, so dass diese Substanzen keine hohe ETD-Effizienz
besitzen. Somit legen diese Untersuchungen die hier dargestellte
Erfindung nicht nahe, sondern weisen genau in die entgegen gesetzte
Richtung, wie auch die Konzentration der weiteren Arbeiten in der
Arbeitsgruppe um D. F. Hunt auf polyzyklische Aromaten zeigen.
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Eine
günstige Ausführungsform eines Ionenfallenmassenspektrometers
nach dieser Erfindung und zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens
ist in 2 schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine
Elektrosprüh-Ionenquelle (1) mit einer Sprühkapillare
(2) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung
der Biopolymere verwendet. Es werde hier angenommen, dass eine Mischung
von Verdaupeptiden eines größeren Proteins untersucht
werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine
Einlasskapillare (3) und einen Abstreifer (4)
mit den Ionenleitsystemen (5) und (9) durch die
Druckstufen (15), (16), (17) zur 3D-Ionenfalle
mit Endkappenelektroden (11 und 13) und Ringelektrode
(12) geführt und dort in üblicher Weise
eingefangen. Die Ionenleitsysteme (5) und (9)
bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen
einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie können als Quadrupol-,
als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt sein.
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Ein
erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit
massenselektivem Auswurf und einer Messung der ausgeworfenen Ionen
im Ionendetektor (14) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über
die Verdaupeptide, da in der Elektrosprüh-Ionenquelle praktisch
nur Molekülionen und keine Fragmentionen gebildet werden,
wenn auch in verschiedenen Ladungsstufen. Sollen jetzt ein oder mehrere
Peptide auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht
werden, so isoliert man beispielsweise mit üblichen Mitteln
die dreifach geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt,
man überfüllt zunächst die Ionenfalle
und wirft dann alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht dreifach
geladene Ionen dieses Peptids sind. Die dreifache Ladung erkennt man
am Abstand der Isotopenlinien voneinander, die für dreifach
geladene Ionen genau 1/3 atomare Masseneinheiten beträgt.
Stehen dreifach geladene Ionen nicht in ausreichendem Maße
zur Verfügung, so können auch Ionen einer anderen
Ladungsstufe verwendet werden.
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Diese
nunmehr isolierten mehrfach geladenen Ionen werden durch eine kurze
Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas
in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sodann werden die negativ
geladenen Ionen hinzugefügt. Diese Ionen werden hier in
einer gesonderten Ionenquelle (8) für negative
chemische Ionisierung (Elektronenanlagerungsionenquelle) erzeugt
und über ein kleines Ionenleitsystem (7) zu einer
Ionenweiche geführt, wo sie in das Ionenleitsystem (9)
zur Ionenfalle (11, 12, 13) eingefädelt
werden. Ionenleitsysteme dieser Art können sowohl positive,
wie auch negative Ionen weiterleiten. Die Ionenweiche besteht in
der hier gezeigten Ausführung einfach aus einer Lochblende
(6), an die geeignete Gleichspannungspotentiale angelegt
werden können, und aus einer Verkürzung eines
oder zweier Stäbe des stabförmigen Ionenleitsystems
(9). Besonders günstig für diese sehr
einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn ein Oktopolsystem als
Ionenleitsystem verwendet wird; günstig ist dann eine Verkürzung
zweier Polstäbe. Diese Ionenweiche kann die Ionen der Elektrosprüh-Ionenquelle
(1, 2) bei geeigneten Spannungen an der Lochblende
(6) ungehindert durchlassen; mit anderen Spannungen werden
die negativen Ionen aus der Ionenquelle (8) in das Ionenleitsystem
(9) hinein reflektiert. Über dieses Ionenleitsystem
(9) gelangen sie zur Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise
durch eine Einschussoptik (10) eingespeichert. Sie reagieren
dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven
Ionen.
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Nach
bisheriger Technik war es notwendig, die Substanzen zur Herstellung
der Radikal-Anionen wegen ihres niedrigen Dampfdrucks in einem auf
50° bis 250° Celsius heizbaren Behälter
(18) zu halten, der nahe zur gleichfalls geheizten Elektronenanlagerungsionenquelle
(8) angebracht war. Dabei wurde meist auf jedes Ventil
verzichtet, so dass ein Absperren des Substanzbehälters
nicht möglich war. Wie schon im einleitenden Teil dargelegt,
ist diese Anordnung nachteilig, weil sich dadurch die Substanzen schnell
verbrauchen und für jedes Nachfüllen der Substanz
das Vakuumsystem des Massenspektrometers belüftet werden
muss. Durch die Erfindung, Substanzen höheren Dampfdrucks
für ETD verwenden zu können, kann die Substanz,
beispielsweise das Cyclooctatetraen, jetzt in einem Behälter
(19) außerhalb des massenspektrometrischen Vakuumsystems
gehalten werden. Das Nachfüllen wird jetzt sehr einfach.
Außerdem kann der Behälter (19) bei Raumtemperatur
gehalten werden. Es entfallt somit die Schwierigkeit, eine geheizte
Gasleitung durch die ungeheizten Wände des Vakuumsystems
führen zu müssen. Dieser Behälter (19)
kann beispielsweise direkt vom Methan aus einem Vorratsbehälter
(20) durchspült werden, das für die Elektronenanlagerungsionenquelle
als Thermalisierungsgas gebraucht wird. Das Methan nimmt dabei genügend
Substanz für die Erzeugung der Radikal-Anionen mit. Die
Gasleitung kann dabei auch leicht durch ein Ventil (21) verschließbar
gehalten werden. Dadurch kann die Zufuhr der Substanz und auch des
Thermalisierungsgases bei Bedarf unterbrochen werden. Es können durch
mehrere Behälter und mehrere Ventile auch mehrere Ausgangssubstanzen
umschaltbar verwendet werden.
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Beim
Prozess der Elektronentransfer-Dissoziation bleiben manchmal die
gebildeten Fragmentionen assoziiert und bilden nicht sehr stabile
Radikal-Kationen, die aber nicht sofort zerfallen. Es ist daher
günstig, eine schwache dipolare Anregungswechselspannung
für eine resonante Anregung dieser Radikal-Kationen an
die beiden Endkappen (11, 13) der Ionenfalle zu
legen. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung
kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten
Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass diese
Radikal-Kationen rasch zerfallen, wozu nur relativ schwache Stöße
notwendig sind, und wodurch die Ausbeute der gewünschten
Fragmentionensorten erhöht wird.
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Die
in der Elektronenanlagerungsionenquelle aus dem Cyclooctatetraen
erzeugten nichtradikalen Anionen der Masse m = 99 Da können
erfolgreich für eine Ladungsverminderung durch Protonentransfer-Reaktionen
eingesetzt werden. Leider ließen sie sich in ersten Versuchen
nicht völlig sauber von den Radikal-Anionen getrennt aus
der Ionenquelle extrahieren. Da aber aus Gründen der Zeitersparnis
meist Ladungsverminderung und Elektronentransfer-Dissoziation gleichzeitig
ausgeführt werden, können auch die nicht sauber
getrennten Ionenarten gut eingesetzt werden. Das Verhältnis
beider Ionenarten lässt sich durch die Extraktionsspannung
an der Ionenquelle in weiten Grenzen einstellen.
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Es
ist wahrscheinlich, dass sich die Extraktionsbedingungen aus der
Ionenquelle für die nichtradikalen Anionen durch konstruktive Änderungen noch
verbessern lassen. Es ist aber durch das erfindungsgemäße
Anbringen des Substanzbehälters bei Umgebungstemperatur
außerhalb des Vakuumsystems mit einem Ventil in der Gasleitung
auch leicht möglich, durch weitere Behälter und
weitere Ventile weitere Substanzen ähnlichen Dampfdrucks
in die Elektronenanlagerungsionenquelle einzuführen, von denen
beispielsweise eine allein der Herstellung nichtradikaler Anionen
dienen kann, wenn eine saubere Protonentransfer-Reaktion ohne gleichzeitig stattfindendes
ETD benötigt wird.
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Der
einschlägige Fachmann kann in Kenntnis darüber,
dass auch Substanzen mit niedrigem Dampfdruck oder niedrigem Molekulargewicht
als Ausgangssubstanzen für die Herstellung von Radikal-Anionen
für ETD verwendet werden können, weitere Maßnahmen
treffen, die eine Handhabung des Massenspektrometers oder eine Durchführung
der Analysenverfahren erleichtern.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102005004324
B4 [0005]
- - US 2005/0199804 A1 [0005, 0018, 0032, 0042]
- - DE 102006049241 A1 [0012, 0013]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - P. Kebarle
und S, Chowdhury, Chem. Rev. 1987, 7, 513–534, „Electron
Affinities and Electron-Transfer Reactions” [0007]
- - et al. wird dargelegt [0008]