DE102006049241B4

DE102006049241B4 - Ionenquelle für Elektronentransfer-Dissoziation und Deprotonierung

Info

Publication number: DE102006049241B4
Application number: DE102006049241A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hartmer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2011-04-21
Anticipated expiration: 2026-10-19
Also published as: US20080093546A1; GB2443066B; US7582862B2; GB2443066A; DE102006049241A1; GB0719599D0

Abstract

Verfahren zur Messung von Fragmentionenspektren unter Anwendung sowohl einer Elektronentransfer-Dissoziation von Analytionen durch Reaktionen mit Radikalanionen als auch einer teilweisen Deprotonierung der Analyt- oder der Fragmentionen durch Reaktionen mit nichtradikalen Anionen, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation als auch die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in einer einzigen Elektronenanlagerungs-Ionenquelle aus einer einzigen Substanz erzeugt werden, wobei für die Thermalisierung der Elektronen ein Gas verwendet wird, das bei Elektronenbeschuss atomaren Wasserstoff liefert, und wobei die Spannung zum Extrahieren der Anionen aus der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle verändert wird, um das Lieferungsverhältnis beider Arten von Anionen zu ändern.

Description

Die Erfindung betrifft die Deprotonierung hoch geladener Fragmentionen, die durch Elektronentransfer-Dissoziation hoch geladener Analytionen gewonnen wurden.
Die Erfindung besteht darin, mit derselben Ionenquelle aus derselben Substanz oder derselben Substanzmischung sowohl die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) positiv geladener Analytionen wie auch die nichtradikalen Anionen für eine Verminderung der Ladungen an den Dissoziationsprodukten durch Protonentransferreaktionen (PTR) zu liefern.
Stand der Technik
Eine für die massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen gängige Art der Erzeugung von Molekülionen ist die Elektrosprüh-Ionisierung (ESI = „electro spray ionization”), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme bekannter Art in das Vakuumsystem des Massenspektrometers und weiter zum Massenanalysator geleitet. Dort werden die Ionen nach Massen aufgelöst gemessen und ergeben ein Massenspektrum der Biomolekül-Ionen.
Die Ionisierung durch Elektrosprühen erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des protonierten Moleküls; wegen ihrer Protonierung werden sie häufig als „Pseudomolekülionen” bezeichnet. Wohl aber treten bei Elektrosprühen in der Regel auch durch mehrfache Protonierung mehrfach geladene Ionen der Moleküle auf: doppelt und dreifach geladene Ionen für kleiner Moleküle wie etwa Peptide, bis zu zehn- oder sogar dreißigfach geladene Ionen für größere Biomoleküle wie Proteine im Bereich der Molekülmassen von 5000 bis 20 000 atomaren Masseneinheiten.
Durch das Fehlen fast jeder Fragmentierung durch den Ionisierungsprozess beschränkt sich die Information aus dem Massenspektrum auf die Molekülmasse, die in aller Regel bei der übergroßen Vielfalt der Biomoleküle für eine Identifizierung der Substanz nicht ausreicht. Es fehlen in den Massenspektren weitere Informationen über interne Molekülstrukturen, die zur Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können. Diese Informationen können nur in besonderen Tandem-Massenspektrometern über die Aufnahme von Massenspektren der Bruchstückionen erhalten werden, wobei die Bruchstückionen aus einer Fragmentierung der Molekülionen stammen. Für die Fragmentierung gibt es verschiedene Verfahren, die stark vom Typ des Massenspektrometers abhängen.
Wenn möglich, geht man für die Fragmentierung von doppelt oder dreifach geladenen Elternionen aus, da diese eine sehr hohe Ausbeute an Fragmentionen haben und sehr einfach auswertbare Fragmentionenspektren liefern. Die Spektren dieser Fragmentionen werden auch ”Tochterionenspektren” der betreffenden ausgewählten Elternionen genannt. Es können auch „Enkelionenspektren” als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden. Aus diesen Tochterionenspektren (und Enkelionenspektren) lassen sich Strukturen der fragmentierten Ionen ablesen; so ist es beispielsweise möglich (wenn auch schwierig), aus diesen Spektren zumindest Teile der Sequenz der Aminosäuren eines Peptids zu bestimmen.
Massenspektrometer mit Hochfrequenz-Ionenfallen haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant machen. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (so genannte „Elternionen”) in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Unter der Isolierung einer Ionensorten versteht man, dass alle nicht interessierenden Ionensorten durch starke resonante Anregungen oder anderen Maßnahmen aus der Ionenfalle entfernt werden, so dass nur die Elternionen übrig bleiben. Die Fragmentierung dieser Elternionen, also der interessierenden Analytionen, erfolgt in klassischer Weise durch eine schwache resonante Anregung der so genannt „sekularen” Ionenoszillationen mit einer dipolaren Wechselspannung, die zu vielen Stößen mit dem Stoßgas führt, ohne die Ionen aus der Ionenfalle zu entfernen. Die Ionen können in den Stößen Energie aufsammeln, die schließlich zum Zerfall der Ionen und zur Entstehung der Bruchstückionen (auch Fragmentionen oder Tochterionen genannt) führt. Bis vor wenigen Jahren war diese Stoßfragmentierung (CD = „collision induced dissociation”) die einzige bekannte Art der Fragmentierung in Ionenfallen.
Dreidimensionale Ionenfallen (3D-Ionenfallen) nach Wolfgang Paul bestehen aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Hochfrequenzspannung versorgt wird, es sind jedoch auch andere Betriebsarten möglich. Im Inneren der Ionenfalle können für massenspektrometrische Analysen entweder positive oder auch negative Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll.
Lineare Ionenfallen (auch 2D-Ionenfallen genannt, weil sich die elektrischen Felder im Inneren nur in zwei Dimensionsrichtungen ändern) bestehen aus mehreren Polstabpaaren unter Hochfrequenzspannung mit Endelektroden, deren Potentiale die Ionen zurückweisen können. Für die Möglichkeit, gleichzeitig positive und negative Ionen speichern zu können, muss man besondere Maßnahmen ergreifen, beispielsweise kann man durch Hochfrequenzspannungen Pseudopotentiale erzeugen, die Ionen beider Polaritäten zurückweisen. Zweidimensionale Ionenfallen mit vier Polstäben formen im Inneren ein Quadrupolfeld und können wie 3D-Ionenfallen als Massenanalysatoren verwendet werden, wobei es auch hier verschiedene Scanverfahren gibt, beispielsweise solche des massenselektiven Auswurfs der Ionen durch Schlitze in den Polstäben oder durch Blenden am Ende der Stabsysteme.
Es ist nun jüngst ein Verfahren zur Fragmentierung von Ionen in Ionenfallen bekannt geworden, das zur inzwischen weithin bekannten Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) gleichartige Fragmentierungen durch andersartige Reaktionen liefert: die „Elektronentransfer-Dissoziation” (ETD). Diese kann in Ionenfallen durchgeführt werden, indem geeignete negative Ionen zu den gespeicherten Analytionen hinzu eingeführt werden. Verfahren dieser Art sind in den Offenlegungsschriften DE 10 2005 004 324 A1 (R. Hartmer und A. Brekenfeld) und US 2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) beschrieben worden. Die Bruchstückionen gehören dabei (wie bei Elektroneneinfang) den so genannten c- und z-Reihen an, und sind somit sehr verschieden von den Bruchstückionen der b- und y-Reihen, die durch Stoßfragmentierung gewonnen werden. Die Bruchstücke der c- und z-Reihen haben deutliche Vorteile für die Identifizierung der Proteine und für die Bestimmung der Aminosäuresequenz aus den massenspektrometrischen Daten, nicht zuletzt dadurch, dass die ETD-Fragmentionenspektren zu kleineren Massen hinunterreichen können als die Stoßfragmentionenspektren.
Am günstigsten ist es, sowohl Stoßfragmentionenspektren wie auch ETD-Fragmentionenspektren aufzunehmen, weil durch den Vergleich beider Spektren sofort die Zuordnung der Ionensignale zu den c/b-Reihen oder z/y-Reihen entnommen werden kann, weil zwischen c-Ionen und b-Ionen wie auch zwischen z-Ionen und y-Ionen feste Massendifferenzen herrschen, an denen die Zugehörigkeit leicht abzulesen ist.
Diese Fragmentierung durch Elektronentransfer in Reaktionen zwischen mehrfach geladenen Analyt-Kationen und geeigneten Anionen ist eine günstige Alternative zur Elektroneneinfang-Fragmentierung (ECD), die in Ionenfallen nur sehr schwer durchzuführen ist, da die Hochfrequenzfelder kaum den Zutritt von niederenergetischen Elektronen erlauben. Hochfrequenz-Ionenfallen können aber in ihrem Pseudopotentialtopf sehr wohl positive wie auch negative Ionen für die notwendigen Elektronentransfer-Reaktionen speichern.
Ein Stoßgas in der Ionenfalle sorgt dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Bewegungsschwingungen (die so genannten sekularen Oszillationen) der Ionen im Topf des Pseudopotentials abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann nach wenigen Millisekunden als kleine Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Der Durchmesser der Wolke beträgt in üblichen Ionenfallen bei üblichen Ionenfüllungen mit einigen Zehntausend Ionen etwa einen Millimeter; er bestimmt sich durch ein Gleichgewicht zwischen der rücktreibenden Kraft des Pseudopotentials und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen den Ionen. Die inneren Abmessungen der 3D-Ionenfallen sind meist durch einen Abstand von etwa 14 Millimeter zwischen den Endkappen charakterisiert, der Ringdurchmesser beträgt etwa 14 bis 20 Millimeter. Bei linearen quadrupolaren Ionenfallen beträgt der Abstand zwischen gegenüberliegenden Polstäben meist etwa acht Millimeter; aber auch andere Abstände können gute 2D-Ionenfallen ergeben, insbesondere bei linearen Hexapol- oder Oktopol-Ionenfallen.
Die Fragmentierung von Ionen durch Elektronentransfer in einer Hochfrequenz-Ionenfalle wird nun in sehr einfacher Weise durch Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Ionen und geeigneten negativen Ionen erzeugt. Geeignete negative Ionen sind regelmäßig radikale Anionen, beispielsweise solche von Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder anderen polyaromatischen Verbindungen. Bei radikalen Anionen sind die chemischen Valenzen nicht abgesättigt, was sie zur leichten Abgabe von Elektronen befähigt. Sie werden in NCI-Ionenquellen (NCI = „negative chemical ionization”) erzeugt, höchstwahrscheinlich durch einfachen Elektroneneinfang oder durch Elektronenübertragung. NCI-Ionenquellen sind im Prinzip wie Ionenquellen für chemische Ionisierung (CI-Ionenquellen) aufgebaut, werden aber anders betrieben, um zu großen Mengen niederenergetischer Elektronen zu kommen. Die NCI-Ionenquellen werden auch als Elektronenanlagerungs-Ionenquellen bezeichnet.
Die Elektronentransfer-Reaktionen führen entweder sofort zu der gewünschten Fragmentierung oder aber in prinzipiell nicht erwünschter Weise zur Bildung von Radikal-Kationen der Analytmoleküle, die zwar ein Elektron aufgenommen haben, deren Protonenzahl aber nicht verringert ist und die deshalb auch nicht zerfallen sind. Diese Radikal-Kationen sind an sich metastabil, zerfallen also im Laufe genügend langer Zeit und verbleiben somit über längere Zeit unzerfallen in der Ionenfalle. Sie können sehr leicht durch zarte resonante Anregung ihrer sekularen Schwingungen weiter stoßfragmentiert werden, wobei die für Elektronentransfer-Dissoziation charakteristischen ETD-Fragmentionen gebildet werden, nicht die für Stoßfragmentierung charakteristischen CID-Fragmentionen.
Die Auswertung der ETD-Fragmentionenspektren ist sehr einfach, wenn sie aus zweifach geladenen Elternionen produziert wurden. Auch die Auswertung von ETD-Fragmentionenspektren aus dreifach geladenen Elternionen ist noch relativ einfach, da sich doppelt geladene Fragmentionen relativ einfach an den Massenabständen ihres Isotopenmusters erkennen lassen. Das ist anders, wenn hoch geladene Elternionen, beispielsweise zehn- bis zwanzigfach geladene Elternionen dieser Fragmentierungsprozedur unterworfen werden. Die Ausbeute an Fragmentionen ist dann sehr hoch, aber das Fragmentionenspektrum ist dermaßen komplex, dass eine Auswertung kaum mehr möglich ist, zumal sich die Isotopenmuster in Ionenfallen nicht mehr nach Massen auflösen lassen und daher die Ladungsstufe nicht mehr feststellbar ist.
Größere Moleküle, vor allem Proteine, liefern in Elektrosprüh-Ionenquellen vielfach geladene Ionen, wobei als grobe Faustregel angenommen werden kann, dass bei jeweils 1500 atomaren Masseneinheiten Erhöhung der Masse im Mittel die Ladung um etwa eine Elementarladung zunimmt. Ein Protein der Masse 10 000 atomare Masseneinheiten hat damit im Maximum der Ladungsverteilung etwa 15 Protonen aufgenommen, aber es herrscht meist eine breite Verteilung der Ionen mit verschiedenen Anzahlen von Ladungen. Zweifach oder dreifach geladene Ionen haben dabei verschwindend geringe Häufigkeiten und können daher praktisch nicht zur Erzeugung der Fragmentionen verwendet werden; eine Anwendung der Fragmentierung durch Elektronentransfer stößt aus diesen Gründen bei Proteinmolekülen des Molekülmassenbereichs zwischen 5000 und 50 000 atomaren Masseneinheiten auf größere Schwieigkeiten, obwohl sich die hochgeladenen Analytionen hervorragend durch Elektronentransfer dissoziieren lassen. Die so entstehenden Fragmentionen, vor allem die schweren Fragmentionen, sind überwiegend wieder selbst hoch geladen.
Es ist nun seit längerem bekannt, dass man vielfach geladene Ionen durch fortgesetzte Deprotonierung („charge stripping”) in einfach oder niedrig geladene Ionen wandeln kann. Das geschieht recht einfach durch Protonentransfer von den vielfach positiv geladenen Ionen auf besondere Arten von negativ geladenen Ionen, und zwar insbesondere auf nichtradikale Anionen, die dadurch neutralisiert werden. Die Wirkungsquerschnitte für diese Protonentransferreaktionen sind proportional zur Anzahl der Protonenladungen an einem Ion; die Deprotonierungen verlaufen daher für hoch geladene Ionen sehr schnell und bremsen bei Erreichen niedrig geladener Ionen stark ab. Stoppt man beispielsweise die Zufuhr von negativen Reaktantionen für die Deprotonierung beim Erreichen einfach geladener Ionen ab, so erhält man durch Messung im Massenanalysator relativ einfache Massenspektren, da diese praktisch nur noch die Signale einfach geladener Ionen enthalten. Aber auch ein früheres Abstoppen der Deprotonierungsreaktionen, wenn beispielsweise nur noch Gemische aus Fragmentionen mit bis zu vier Protonen übrig sind, führt zu interpretierbaren Massenspektren, wenn dadurch für die Spektrenaufnahme eine Isotopenauflösung erreicht wird.
Diesen Effekt kann man auch bei der Anwendung der Elektronentransfer-Dissoziation auf Proteine verwenden: Nach der Speicherung von hochgeladenen Ionen der Proteinmoleküle wendet man durch resonante Anregung der sekularen Schwingungen eine Stoßfragmentierung oder, durch Einspeisen von geeigneten Radikal-Anionen, eine ETD-Fragmentierung an; danach speist man nichtradikale Anionen zur Deprotonierung ein, bis eine gewünschte Reduzierung der Ladungszustände der Fragmentionen eingetreten ist. Dadurch erhält man einfach zu interpretierende Massenspektren der Fragmentionen.
Wird dieses Verfahren für die Deprotonierung von ETD-Fragmentionen angewendet, so ist nachteilig, dass man im Prinzip drei verschiedene Ionenquellen benötigt: eine Ionenquelle für die mehrfach positiv geladenen Analyt-Kationen (meist Elektrosprühen), eine Ionenquelle für die Erzeugung der Radikal-Anionen für die ETD-Reaktionen, und eine Ionenquelle für die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung. Wird nur eine Ionenquelle für die Erzeugung der beiden verschiedenen Arten von Anionen verwendet, so ist diese nach bisheriger Technik, wie sie ausführlich in der Offenlegungsschrift WO 2006/0421187 A2 beschrieben wird, mit zwei verschiedenen Arten von Substanzen zu beschicken. Dieses Beschicken kann zeitlich nacheinander geschehen, was grundsätzlich zeitaufwendig ist und einer raschen Messfolge entgegensteht, oder es kann gleichzeitig geschehen, was dann aber eine zusätzlich Selektion der gewünschten Sorte von Anionen mit zusätzlichen Maßnahmen und Mitteln erfordert.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Lieferung sowohl der Radikal-Anionen für die Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) wie auch der nichtradikalen Anionen zur Deprotonierung vielfach geladener Fragmentionen zu finden, wobei eine einzige Ionenquelle beide Arten von Anionen aus einer einzigen Substanz oder Substanzmischung herstellen soll.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung besteht darin, ein Verfahren für den Betrieb einer Elektronenanlagerungs-Ionenquelle bereitzustellen, mit dem sich nur durch Änderung der elektrischen Betriebsparameter der Ionenquelle erreichen lässt, die Radikal-Anionen für eine ETD-Fragmentierung der Analytionen wie auch die andersartigen nichtradikalen Anionen für eine Deprotonierung aus der gleichen Substanz oder dem gleichen Substanzgemisch zu erzeugen. Des Weiteren wird ein einfaches Verfahren zum Betrieb eines Massenspektrometers zur Messung von ETD-Fragmentionenspektren unter Verwendung dieses Betriebsverfahrens der NCI-Ionenquelle bereitgestellt.
Die bevorzugte Lieferung der einen oder der anderen Art von Anionen wird überraschenderweise in einer einfachen Elektroneneinfang-Ionenquelle (NCI-Ionenquelle), der neben Fluoranthen auch Methan als Thermalisierungsgas zugeführt wird, durch eine Änderung der elektrischen Betriebsspannungen möglich, insbesondere durch eine Änderung der Spannung für die Extraktion der Ionen aus der Ionenquelle. Damit können entweder die Radikal-Anionen für die Elektronentransfer-Dissoziation oder aber die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung oder beide gleichzeitig geliefert werden. Vorzugsweise wird dabei mit nur einer einzigen Substanz gearbeitet (beispielsweise Fluoranthen); es kann aber auch eine Mischung von Substanzen verwendet werden. Statt des Methans können auch andere Gase, die bei ihrer Ionisierung Wasserstoff-Radikale abgeben, zur Thermalisierung der Elektronen (und zur möglichen Lieferung von radikalem Wasserstoff) verwendet werden.
Es ist nach unseren Untersuchungen in dieser Weise möglich, mit einer Ionenquelle zur Elektronenanlagerung, also einer Ionenquelle für negative chemische Ionisierung, aus einer Substanz M alternativ die Radikal-Anionen M^.– oder die nichtradikalen Anionen (M + H)^– zu liefern, wobei die beiden Sorten von Anionen jeweils praktisch rein oder jedenfalls mit ganz überwiegenden Anteilen geliefert werden. Gelingt die Herstellung oder Extraktion der beiden Ionensorten nicht jeweils vollkommen rein, so können geringe Reste der anderen Ionensorte entweder vom Verfahren toleriert werden, oder es kann die nicht erwünschte Art der Anionen auch im Ionenleitsystem oder beim Prozess des Einspeicherns in die Ionenfalle durch bekannte Maßnahmen entfernt werden.
Das Verfahren zur Messung leicht interpretierbarer ETD-Fragmentionenspektren von größeren Biomolekülen kann beispielsweise aus folgender Abfolge bestehen: Zunächst wird die Mischung hoch geladener positiver Analytionen in die Hochfrequenz-Ionenfalle eingebracht; erforderlichenfalls werden die gewünschten Elternionen aus dieser Mischung isoliert. Die Elternionen können dabei eine einzelne Ionensorte mit einheitlicher Ladungsstufe sein, beispielsweise nur genau zehnfach geladene Ionen, oder auch eine Mischung von Ionen mehrerer Ladungsstufen der gleichen Analytmoleküle. Mittels gezielter Protonentransferreaktion kann ein einheitlicher Ladungszustand des Elternions aus einer Mischung von Ionen mehrerer Ladungsstufen „gezüchtet” werden. Danach werden, meist in hohem Überschuss, die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation eingeführt. Sind nach etwa fünf bis 30 Millisekunden genügend viele der Elternionen fragmentiert (beispielsweise 30 oder 50 Prozent), so bricht man diesen Vorgang ab, um die Bildung interner Fragmente durch doppelte Fragmentierungen möglichst gering zu halten. Die Elektronentransfer-Reaktionen werden abgebrochen, indem man die restlichen Radikalanionen schnell entfernt. Das kann durch eine starke resonante Anregung, oder aber durch Veränderung der Hochfrequenzamplitude zum Auswurf durch Instabilität geschehen. Danach stellt man die Elektroneneinfang-Ionenquelle auf die Lieferung von nichtradikalen Anionen um und füllt diese Ionen in die Ionenfalle ein. Ist die gewünschte Mischung aus niedrig geladenen oder sogar einfach geladenen Ionen erreicht, ohne alle nichtradikalen Anionen verbraucht zu haben, so sind die überschüssigen nichtradikalen Anionen zu entfernen. Die massenspektrometrische Messung der verbliebenen Ionen ergibt ein leicht interpretierbares Massenspektrum der Fragmentionen.
Es können aber auch die Prozesse der Elektronentransfer-Dissoziation und der Deprotonierung zeitlich umgekehrt werden, oder synchron verlaufen, wobei im letzteren Fall die Elektronenanlagerungs-Ionenquelle beide Sorten von Anionen in einem vorgewählten Mischungsverhältnis liefert.
Die Messung des Fragmentionenspektrums kann unter Verwendung der Ionenfalle als Massenanalysator geschehen, aber auch in andersartigen Massenanalysatoren, wenn die Ionenfalle mit diesen zu einem Massenspektrometer gekoppelt ist.
Beschreibung der Abbildungen
stellt ein Schema eines Ionenfallenmassenspektrometers für die Durchführung eines Verfahrens nach dieser Erfindung dar, mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2), einer Elektronenanlagerungs-Ionenquelle (8) für die Erzeugung negativer Ionen und einer 3D-Ionenfalle mit zwei Endkappenelektroden (11, 13) und einer Ringelektrode (12). Das Ionenleitsystem (9), vorzugsweise als Oktopol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten.
zeigt eine Elektronenanlagerungs-Ionenquelle, in der ein von der Glühkathode (24) ausgehender Elektronenstrahl von zwei Magneten (21) und (37) geführt in der Kammer (27) das durch die Zuführung (28) eintretende gasförmige Fluoranthen in Anwesenheit von Methan ionisiert. Die entstehenden Anionen werden mit Hilfe der Extraktionsblende (30) aus der Öffnung (29) herausgezogen und in das Hexapol-Ionenleitsystem (31) eingeführt. Mit geringer Extraktionsspannung werden praktisch nur Radikalanionen extrahiert, bei höherer Extraktionsspannung ganz überwiegend nur nichtradikale Anionen.
In sind die Analytionen aus dem Versprühen von Ubiquitin (Molekülmasse 8560 atomare Masseneinheiten gezeigt. Die Ionen haben Ladungsstufen von 7 bis 14, wobei die 12-fach geladenen Analytionen am häufigsten vorkommen.
Die zeigt ein Massenspektrum der isolierten 12-fach geladenen Ionen des Ubiquitin, die als Elternionen ausgesucht wurden.
zeigt das Fragmentionenspektrum, das aus den 12-fach geladenen Analytionen des Ubiquitin durch Elektronentransfer-Dissoziation in Reaktionen mit Radikal-Anionen des Fluoranthen gewonnen wurde, wobei die Radikal-Anionen des Fluoranthen in der Elektronenanlagerungsionenquelle (8) erzeugt wurden. Die Fragmentionen häufen sich im Gebiet von 500 Dalton bis 1500 atomaren Masseneinheiten.
gibt ein Massenspektrum der weitgehend ladungsverminderten Fragmentionen des Ubiquitin aus wieder, wobei die hoch geladenen Fragmentionen durch nichtradikale Anionen des Fluoranthen bis zu einer Mischung der Ladungsstufen eins bis vier deprotoniert wurden. Das Massenspektrum ist weitgehend entzerrt und überdeckt jetzt relativ gleichmäßig den m/z-Bereich von 150 bis 3000 atomaren Masseneinheiten. Die nichtradikalen Anionen des Fluoranthen wurden erfindungsgemäß durch Änderung der Betriebsspannungen in der gleichen Ionenquelle (8) gewonnen, in der auch die Radikal-Anionen erzeugt wurden.
zeigt ein virtuelles Massenspektrum von Ubiquitin, das aus dem ladungsverminderten Massenspektrum der berechnet wurde und die Annotationen der Aminosäuren des Ubiquitin enthält. Die Annotationen wurden von einem automatisch arbeitenden Rechenprogramm hinzugefügt, das zunächst eine Identifizierung mit einer Suchmaschine für Proteinsequenzdatenbanken vornahm.
Günstige Ausführungsformen
Für die Messung interpretierbarer Fragmentionenspektren hochmolekularer Substanzionen, die in entsprechenden Ionenquellen wie beispielsweise Elektrosprühen nur vielfach geladen erzeugt werden, ist eine mehrstufige Deprotonierung der hoch geladenen Analytionen oder der ebenfalls hoch geladenen Fragmentionen zu niedrig geladenen Ionen notwendig.
Bei Anwendung der Elektronentransfer-Dissoziation zur Erzeugung der Fragmentionen kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Deprotonierung der vielfach positiv geladenen Analytionen vor der Dissoziation oder der hoch geladenen Fragmentionen nach der Dissoziation durch Reaktionen mit nichtradikalen Anionen dadurch charakterisiert werden, dass sowohl die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation wie auch die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in derselben Ionenquelle aus derselben Substanz oder demselben Substanzgemisch erzeugt werden.
Für die Erzeugung der beiden Sorten von Anionen wird eine übliche Elektronenanlagerungs-Ionenquelle verwendet. Dabei ist es notwendig, für die Thermalisierung der eingeschossenen Elektronen, um langsame Elektronen für eine Anlagerung zu liefern, ein Gas zu verwenden, das bei Elektronenbeschuss auch Wasserstoff-Radikale liefert, wie beispielsweise Methan oder ein anderes, wasserstoffreiches organisches Gas. Nach unseren Untersuchungen genügt es dann, die Spannung zum Extrahieren der Anionen zu verändern, um die eine oder andere Art von Anionen zu liefern. Der Mechanismus, der zur Lieferung der einen oder anderen Sorte von Anionen führt, ist bisher nicht aufgeklärt.
Ein möglicher Mechanismus für die bevorzugte Bildung eines nichtradikalen Anions (M + H)^– und dessen Extraktion aus einer Ionenquelle für negative chemische Ionisierung ist die Reaktion zwischen atomarem Wasserstoff, der als Nebenprodukt in der Ionenquelle für negative chemische Ionisierung unter Verwendung von Methan als Thermalisierungsgas gebildet wird, und dem Radikal-Anion M^.–. Die Aktivierungsenergie für eine solche Stoßreaktion zwischen zwei gasförmigen radikale Teilchen, dem Radikal-Anion auf der einen Seite und dem Wasserstoffatom auf der anderen Seite, kann nach unserer Auffassung durch die Erhöhung des Spannungsabfalls zwischen dem Austritt aus der Ionisierungsquelle und dem Eintritt in die Extraktionsblende geliefert werden. Durch diesen Stoßprozess zwischen den beiden radikalischen Teilchen wird das in der Ionenquelle gebildete Radikalanion von beispielsweise Fluoranthen in ein nichtradikales Anion überführt.
Die chemischen Valenzen des entstandenen nichtradikalen Anions (M + H)^– sind abgesättigt. Der Elektrontransfer, der bei radikalen Anionen aufgrund deren nicht abgesättigten Valenzen besonders begünstig ist, findet bei der Verwendung von nichtradikalen Anionen nicht statt. Das nichtradikale Anion besitzt allerdings eine hohe Protonenaffinität welche sich für die Deprotonierung von mehrfach geladenen Kationen besonders eignet.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Messung leicht interpretierbarer Fragmentionenspektren hoch geladener Analytionen einer hochmolekularen Analytsubstanz kann in folgende Schritte aufgelöst werden:

a) Erzeugung der positiv geladenen Analytionen der Analytsubstanz und Einspeichern von Analytionen in die Ionenfalle,
b) Einbringen von Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation und von nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in die Ionenfalle, wobei beide Sorten von Anionen aus derselben Reaktantsubstanz oder derselben Mischung von Reaktantsubstanzen von derselben Elektronenanlagerungs-Ionenquelle geliefert werden, und
c) Messung des Fragmentionenspektrums.

Bei richtiger Wahl der Mengen der jeweils eingespeicherten Ionensorten in den Schritten a) und b) ergibt sich in Schritt c) ein leicht interpretierbares Fragmentionenspektrum, da dann praktisch nur noch Fragmentionen der Analytsubstanz mit einer Mischung aus gewünscht niedrigen Ladungsstufen in der Ionenfalle vorhanden sind, mit nur wenigen und wenig intensiven Ionen innerer Fragmente.
Die Erzeugung der Ionen in Schritt a) geschieht bevorzugt durch Elektrosprühen, da dadurch mehrfach geladene Ionen erzeugt werden, wie sie für die Elektronentransfer-Dissoziation gebraucht werden. Dabei entstehen aber aus hochmolekularen Biomolekülen unvermeidlich hoch geladene Analytionen, die wiederum hoch geladene Fragmentionen ergeben.
Würde nur eine Elektronentransfer-Dissoziation ohne eine Deprotonierung durchgeführt, so ließe sich das Isotopenmuster dieser hoch geladenen Fragmentionen mit Ionenfallen als Massenanalysatoren nicht mehr auflösen. Es wäre daher nicht mehr festzustellen, zu welcher Ladungsstufe die Fragmentionen gehören. Da insbesondere die großen Fragmentionen vielfach geladen sind, würden sich alle Fragmentionen im m/z-Bereich von etwa 500 bis 1500 atomaren Masseneinheiten zusammendrängen, wie aus ersichtlich ist. Es wäre die Auswertung der Fragmentspektren außerordentlich erschwert, da die gehäuften Überlagerungen der nicht aufgelösten Isotopenmuster nicht auseinandergerechnet werden könnten.
Selbst wenn höchstauflösende Massenanalysatoren eingesetzt würden, läge wegen der hohen Anzahl verschiedenartiger Fragmentionen verschiedenartiger Ladungsstufen im kleinen m/z-Bereich eine so dichte Überlagerung der Isotopenmuster vor, dass eine Entfaltung der Isotopengruppen sehr erschwert sein würde oder sogar unmöglich wäre. Die Elektronentransfer-Dissoziation allein liefert eben keine einfach zu interpretierenden Fragmentionenspektren.
Eine Auswertung der Massenspektren wird dagegen unabhängig von der Art des Massenanalysators dann relativ leicht möglich, wenn entweder die Analytionen vor der Fragmentierung oder die Fragmentionen durch mehrstufige Deprotonierung in Ionen wesentlich niedrigerer Ladungsstufe umgewandelt werden, die sich dann in ihrer Anzahl reduzieren und gleichzeitig über einen wesentlich höheren m/z-Bereich erstrecken. Diese Entzerrung des Massenspektrums durch teilweise Deprotonierung ist in gut sichtbar. Das Massenspektrum reicht jetzt sowohl zu kleinen m/z-Werten (150 atomaren Masseneinheiten) wo sich fast ausschließlich einfach geladene Fragmentionen finden, wie auch bis zur Grenze des m/z-Bereichs des hier verwendeten Ionenfallen-Massenspektrometers bei 3000 atomaren Masseneinheiten, wo drei bis vierfach geladene Fragmentionen vorherrschen.
Es können für die Ionisierung statt des Elektrosprühens auch andere Ionisierungsarten Verwendung finden, wenn diese mehrfach geladene Ionen erzeugen, wie beispielsweise die Ionisierung von oberflächengebundenen Analytproben durch den Beschuss mit hoch geladenen Molekülclustern. Auch hier werden von großen Biomolekülen vielfach geladene Ionen erzeugt.
Die in Schritt a) eingespeicherten Analytionen können nur dann ohne weitere Maßnahmen für eine Fragmentierung verwendet werden, wenn sich nicht auch Ionen anderer Substanzen in der Ionenfalle befinden. Ist das der Fall, so können nach Schritt a) ausgewählte Elternionensorten der Analytionen in der Ionenfalle durch bekannte Maßnahmen isoliert werden. Dabei können bevorzugt die Analytionen einer einzigen Ladungsstufe, beispielsweise nur die zehnfach geladenen Ionen, oder aber auch die Analytionen verschiedener Ladungsstufen, beispielsweise die zehn- bis fünfzehnfach geladenen Analytionen, in der Ionenfalle isoliert werden. In ist eine Isolation der 12-fach geladenen Ubiquitin-Ionen dargestellt, die aus dem Gemisch von Ubiquitin-Ionen der Ladungsstufen 7 bis 14 in mit bekannten Mitteln isoliert wurden.
Es ist möglich, eine Deprotonierung der hoch geladenen Analytionen verschiedener Ladungsstufen vorzunehmen, aber bei einer bestimmten Ladungsstufe anzuhalten, so dass bei dieser Ladungsstufe alle Analytionen höherer Ladungsstufen gesammelt werden. Dazu ist es nur erforderlich, bei dem ladungsbezogenen Massenwert m/z dieser Ladungsstufe der Analytionen eine leichte resonante Anregung durch eine Dipolwechselspannung zu setzen. Die angeregt schwingenden Ionen sind dann zu weiteren Reaktionen mit deprotonierenden Reaktant-Anionen nicht mehr fähig da zur Deprotonierung ein bestimmter Ruhezustand notwendig ist. Eine solche Umwandlung von hoch geladenen Analytionen verschiedener Ladungsstufen in eine vorbestimmte, für eine Fragmentierung günstige Ladungsstufe sorgt gleichzeitig auch für eine hohe Empfindlichkeit, da sich die Analytionen aller höheren Ladungsstufen während der Deprotonierung bei der ausgewählten Ladungsstufe sammeln. Außerdem ist es so möglich, bei Vorhandensein der hoch geladenen Ionen mehrerer Substanzen die Analytionen auszuwählen, da die Ionen der fremden Substanzen nicht gesammelt, sondern bis zum Ende deprotoniert werden.
Bei der Isolation ist es wichtig, alle Ionen des Isotopenmusters in der Ionenfalle zu halten, da das Isotopenmuster der Fragmentionen Auskunft über die Ladungsstufe und über die Masse der mono-isotopischen Ionen gibt, deren Kenntnis für die weitere Verarbeitung der Massenspektren wichtig ist. Das mono-isotopische Signal gehört zu demjenigen Ion eines Isotopenmusters, das nur aus den Hauptisotopen ¹H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ³¹P und ³²S besteht. Dieses mono-isotopische Signal ist für große Proteine von verschwindender Intensität und kann nur aus den anderen Signalen der Isotopengruppe erschlossen werden.
In Schritt b) werden geeignete Radikalanionen M^.– für die Elektronentransfer-Dissoziation wie auch nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in die Ionenfalle eingeführt. Dabei können die beiden Anionen-Sorten als Mischung, aber auch einzeln nacheinander eingeführt werden. Es kann also durchaus zweckmäßig sein, erst die Elektronentransfer-Dissoziation und dann die Deprotonierung durchzuführen, es kann aber auch erst eine Deprotonierung der hoch geladenen Analytionen erfolgen, bevor dann die teilweise deprotonierten Analytionen durch Elektronentransfer-Reaktionen dissoziiert werden. Beide Arten von Prozessen können aber auch nebeneinander her laufen. Das Ergebnis ist weitgehend gleich.
Die nichtradikalen Anionen können beispielsweise die Form (M + H)^–, aber auch die Form (M – H)^– haben. Die von uns verwendete Elektronenanlagerungs-Ionenquelle liefert Ionen der Form (M + H)^–.
Geeignete Radikalanionen M^.– für die Elektronentransfer-Dissoziation werden durch Elektronenanlagerung an geeignete Reaktantsubstanzen hergestellt, wobei bekanntermaßen verschiedenartige Reaktantsubstanzen verwendet werden können, wie beispielsweise Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder andere polyaromatische Verbindungen. Im Prinzip kann auch eine Mischung von Reaktantsubstanzen verwendet werden um eine Mischung aus Radikalanionen zu erzeugen. Für die Fragmentierung des Ubiquitins, dessen Fragmentionenspektrum in gezeigt wird, wurde das Radikalanion des Fluoranthens verwendet.
Die Überführung einer vorgewählten Menge an Radikalanionen in die Ionenfalle in Schritt b) kann auch mit einer Selektion bestimmter Ionen verbunden werden, beispielsweise, wenn das gewünschte Mischungsverhältnis nicht in der Ionenquelle erreicht werden kann, oder wenn andere unerwünschte Ionensorten zugemischt sind. Diese Filterung kann beispielsweise durch ein Quadrupolfilter geschehen, das zwischen der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle und der Ionenfalle eingebaut ist. Unerwünschte Ionen können aber auch bei der Einspeicherung entfernt werden, beispielsweise indem die unerwünschte Ionensorte durch eine resonante Anregung ihrer sekularen Schwingungsfrequenz an der Einspeicherung gehindert wird.
Nach unseren Untersuchungen mit der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle können aber die Radikalanionen des Fluoranthen sehr rein, ohne messbare Beimengungen von nichtradikalen Anionen, geliefert werden. Doch selbst wenn das nicht der Fall wäre: Leichte Beimengungen von nichtradikalen Anionen könnten durchaus toleriert werden, da sie einen kleinen Teil der Fragment- und Elternionen bereits deprotonierten, was hier nicht schädlich wäre.
Sind in Schritt b) zu viele Radikalanionen in die Ionenfalle eingeführt worden, so können die überschüssigen Radikalanionen nach Ablauf einer vorgewählten Reaktionszeit wieder aus der Ionenfalle entfernt werden. Die Radikalanionen werden häufig in hohem Überschuss gegenüber den Analytionen in die Ionenfalle eingebracht, um die Reaktionszeit für die Elektronentransfer-Dissoziation zu verkürzen. Daher befinden sich so viele Radikalanionen in der Ionenfalle, dass auch in hohem Maße Elektronentransfer-Dissoziationen von mehrfach geladenen Fragmentionen eintreten könnten, wenn erst einmal hohe Anzahlen an Fragmentionen gebildet worden wären. Dadurch entstünden Ionen so genannter „inneren Fragmente”, die aber die Auswertung der Fragmentionenspektren erschweren. Es ist daher notwendig, die Reaktionen zur Elektronentransfer-Dissoziation nach einer vorgewählten Reaktionszeit durch Entfernen der Radikalanionen abzubrechen. Die Reaktionszeit ist dabei so zu wählen, dass ein bestimmter Prozentsatz an fragmentierten Elternionen nicht überschritten wird, beispielsweise 30 bis 50 Prozent. Je nach Menge der eingefüllten Radikalanionen kann die Elektronentransfer-Dissoziation nach 5 bis 30 Millisekunden abgebrochen werden.
Die Radikalanionen können auf verschiedene, an sich bekannte Weisen aus der Ionenfalle entfernt werden, beispielsweise durch einen resonanten Auswurf, der hier bevorzugt verwendet wird. Es ist aber auch möglich, die Radikalanionen durch Änderung der Hochfrequenzspannung an der Ionenfalle zu entfernen, womit Bedingungen instabiler Speicherung der Radikalanionen erreicht werden und diese die Ionenfalle verlassen. Letzteres ist aber nur möglich, wenn sich keine interessierenden Fragmentionen in der Ionenfalle befinden, die leichter als die Radikalanionen sind.
Ähnliches gilt für die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierungs-Prozesse. Auch sie können im Überschuss eingeführt und nach einer vorgewählten Reaktionszeit wieder entfernt werden, um zu der richtigen Mischung aus Fragmentionen niedriger Ladungsstufen zu kommen.
Eine günstige Elektronenanlagerungs-Ionenquelle ist in gezeigt. Ein von der Glühkathode (24) an Haltepfosten (22) ausgehender Elektronenstrahl von etwa 70 Elektronenvolt Energie wird von zwei Magneten (21) und (37) durch die Kammer (27) geführt. In der Kammer (27) wird das durch die Zuführung (28) eintretende gasförmige Fluoranthen in Anwesenheit von Methan, das ebenfalls durch die Zuführung (28) eintrat, ionisiert. Die entstehenden Anionen werden mit Hilfe der Extraktionsblende (30) aus der Öffnung (29) der Kammer (27) herausgezogen und in ein Hexapol-Ionenleitsystem (31) eingeführt. Mit geringer Extraktionsspannung werden praktisch nur Radikalanionen extrahiert, bei höherer Extraktionsspannung ganz überwiegend nur nichtradikale Anionen. Elektronenanlagerungs-Ionenquelle und Hexapol-Ionenleitsystem (31) entsprechen der Ionenquelle (8) und dem Ionenleitsystem (7) der .
Diese Elektronenanlagerungs-Ionenquelle wird in Schritt b) so eingestellt, dass sie die gewünschte Sorte von Anionen liefert, also entweder die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation, die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung oder eine Mischung aus beiden. In der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle, die mit Methan als Thermalisierungsgas und Fluoranthen als Ausgangssubstanz für die Anionen arbeitet, kann das nach Erfahrungen mit der von uns entwickelten Ionenquelle durch eine Einstellung der Spannung an der Ionisierungsquelle zur Extraktion der Anionen geschehen. Während bei eine Spannung zur Extraktion von etwa –6 Volt praktisch nur Radikalanionen extrahiert werden, treten bei Erniedrigung dieser Spannung auf –15 Volt zu etwa 90 Prozent nichtradikale Anionen aus. Dazwischen kann jedes gewünschte Mischungsverhältnis eingestellt werden. Bei der Lieferung der nichtradikalen Anionen geht insgesamt die Ausbeute an Anionen zurück, das kann aber durch eine längere Zeit zur Einspeicherung in die Ionenfalle leicht ausgeglichen werden.
Die Deprotonierung der hoch geladenen Analyt- oder Fragmentionen verläuft zunächst außerordentlich schnell, da der Reaktionsquerschnitt etwa proportional zur Anzahl der Ladungen eines Ions ist. Zehnfach geladene Ionen werden also etwa hundertmal schneller deprotoniert als einfach geladene Ionen; selbst zweifach geladene Ionen werden immer noch viermal schneller deprotoniert als einfach geladene Ionen. Wurden genügend nichtradikale Anionen in die Ionenfalle eingeführt, so befinden sich nach einer bestimmten Reaktionszeit praktisch nur noch einfach geladene Ionen in der Ionenfalle. Es sind zwar inzwischen auch einfach geladene Ionen deprotoniert und damit verloren worden, doch hält sich der Verlust in Grenzen und kann durch eine anfänglich starke Überfüllung der Ionenquelle mit Analytionen ausgeglichen werden.
Die Deprotonierung bis zu einfach geladenen Ionen ist aber hier gar nicht optimal, weil, beispielsweise bei Proteinen, eine wesentlich bessere Sequenzabdeckung erreicht werden kann, wenn die Deprotonierung nur bis zu einer Mischung von Ionen niedriger Ladungsstufen durchgeführt wird. Eine Deprotonierung ist nur so weit erforderlich, bis einerseits eine Isotopenauflösung der massenspektrometrischen Messung erreicht wird und bis andererseits eine solche Entzerrung des Fragmentionenspektrums vorliegt, dass eine Entfaltung der sich überlagernden Isotopenmusters der Fragmentionen möglich wird. Diese Entzerrung eines Fragmentionenspektrums durch Deprotonierung ist im Vergleich der und am Beispiel des Ubiquitins zu sehen.
zeigt ein Fragmentionenspektrum des Ubiquitins, das aus dem Spektrum der dadurch gewonnen wurde, dass rechnerisch nur die einfach geladenen, mono-isotopischen Ionen ermittelt wurden. Ein solches Spektrum ist ideal für eine Weiterverarbeitung, beispielsweise für eine Identifizierung durch eine Suchmaschine in einer Proteinsequenzdatenbank, oder für Zwecke der Annotation der Aminosäurensequenz, wie in gezeigt.
Es kann nach Schritt b) auch vorteilhaft sein, einen Teil der restlichen Elternionen, die jetzt ebenfalls in niedrigen Ladungsstufen vorliegen und immer noch einen weit überragenden Bestandteil des Inhalts der Ionenfalle bilden, zu entfernen. Dadurch wird der dynamische Messbereich der Ionenfalle erhöht und das Spektrum der Fragmentionen tritt stärker hervor. Der Verlust an Ionen in der Ionenfalle kann auch hier durch anfängliches Überfüllen der Ionenfalle mit Analytionen ausgeglichen werden.
Im letzten Schritt c) wird dann das Massenspektrum der jetzt nur noch niedrig geladenen Fragmentionen der Analytsubstanz massenspektrometrisch gemessen. Diese Messung kann durch übliche Scanverfahren der Ionenfalle selbst vorgenommen werden, wobei also die Ionenfalle als Massenanalysator verwendet wird. Sie kann aber auch in anderen Arten von Analysatoren vorgenommen werden, mit denen die Ionenfalle zu einem Massenspektrometer gekoppelt ist.
Wird die Ionenfalle als Massenanalysator genutzt, so kann diese Messung des Fragmentionenspektrums durch die Anzahl der Ionen in der Ionenfalle beeinflusst werden: ist die Anzahl der Ionen zu hoch, so leidet das Auflösungsvermögen der Ionenfalle, ist die Anzahl zu niedrig, so leidet die Qualität des Spektrums durch ein zu niedriges Verhältnis von Signal zu Rauschen. Es ist daher darauf zu achten, dass die Ionenfalle zu Beginn des Verfahrens mit genügend vielen Analytionen gefüllt wurde. Die Zwischenschritte leiden nicht an der Überfüllung, eine solche ist nur im letzten Schritt c) der Spektrenaufnahme schädlich.
Eine günstige Ausführungsform eines Ionenfallenmassenspektrometers nach dieser Erfindung und zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist in schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine Elektrosprüh-Ionenquelle (1) mit einer Sprühkapillare (2) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen verwendet. Es werde hier angenommen, dass ein mittelschweres Protein, beispielsweise Ubiquitin, untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare (3) und einen Abstreifer (4) mit den Ionenleitsystemen (5) und (9) durch die Druckstufen (15), (16), (17) in zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11 und 13) und Ringelektrode (12) geführt und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme (5) und (9) bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie können als Quadrupol-, als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt sein.
Ein erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit massenselektivem Auswurf mit Messung im Ionendetektor (14) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über die verschiedenen Ladungsstufen der Analytionen. Sollen jetzt eine oder mehrere Sorten von Analytionen mit verschiedenen Ladungsstufen auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert man mit üblichen Mitteln die Ionen der gewünschten Ladungsstufen. In sind die Ubiquitin-Ionen verschiedener Ladungsstufen von 7 bis 14 gezeigt, in die daraus isolierten Ubiquitin-Ionen der Ladungsstufe 12. Das heißt, man überfüllt zunächst die Ionenfalle und wirft dann alle Ionen außer den gewünschten Elternionen aus der Ionenfalle heraus.
Diese 12-fach geladenen Ionen des Ubiquitins werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sie bilden dort eine kleine Wolke von etwa einem Millimeter Durchmesser.
Sodann werden die negativ geladenen Ionen hinzugefügt. Diese Ionen werden hier in einer gesonderten Elektronenanlagerungs-Ionenquelle (8) für negative chemische Ionisierung erzeugt und über ein kleines Ionenleitsystem (7) zu einer Ionenweiche geführt, wo sie in das Ionenleitsystem (9) zur Ionenfalle (11, 12, 13) eingefädelt werden. Die Ionenweiche besteht in der hier gezeigten Ausführung einfach aus einer Lochblende (6), an der ein geeignetes Gleichspannungspotential angelegt wird, und aus einer Verkürzung zweier Stäbe des stabförmigen Ionenleitsystems (9). Besonders günstig für diese sehr einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn das Ionenleitsystem als Oktopolsystem ausgeführt ist. Diese Ionenweiche kann die Ionen der Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) bei geeigneten Spannungen an der Blende ungehindert durchlassen, mit anderen Spannungen werden die negativen Ionen aus der Ionenquelle (8) in das Ionenleitsystem (9) hinein reflektiert. Über dieses Ionenleitsystem (9) gelangen sie zur Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise durch eine Einschussoptik (10) eingespeichert. Sie reagieren dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven Ionen.
Manchmal bilden sich durch Transfer eines Elektrons auch stabile Radikal-Kationen, die nicht sofort zerfallen. Diese Gefahr ist zwar bei hoch geladenen Analytionen nicht besonders groß, ihr kann aber, wenn eine einzige Elternionensorte ausgesucht wurde, begegnet werden. Dazu wird eine schwache dipolare Anregungswechselspannung für eine resonante Anregung dieser Radikal-Kationen an die beiden Endkappen (11, 13) der Ionenfalle gelegt. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass die Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorte erhöht wird.
Die erfindungsgemäße Herstellung beider Sorten von Anionen für Dissoziation und Deprotonierung aus derselben Substanz in derselben Ionenquelle hat den Vorteil, dass bereits im Handel befindliche Ionenfallen-Massenspektrometer, die mit einer solchen Ionenquelle ausgestattet sind, ohne technische Änderungen, nur durch Nachlieferung einer entsprechenden Steuersoftware, für den erfindungsgemäßen Betrieb verwendet werden können.
Für die Berechnung der Zeiten einer optimalen Befüllung der Ionenfalle mit hoch geladenen Analytionen am Anfang der Prozesskette gibt es verschiedene bekannte Verfahren, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Die Füllzeiten bewirken eine optimale Füllung, bei der die Raumladung gerade noch nicht die letztendliche Spektrenaufnahme der Fragmentionen stört. Dabei wird im Wesentlichen die Zahl der Ladungen innerhalb der Ionenfalle gesteuert; für ein optimales Verhalten bei der Spektrennahme spielen auch noch andere Parameter eine Rolle, doch soll hier auf Einzelheiten nicht eingegangen werden. Für die Befüllung mit negativen Ionen ist dagegen nur ein einziges Mal eine optimale Befüllungszeit zu ermitteln, da immer etwa die gleiche Menge an negativen Ionen gebraucht wird, um mit der feststehenden Anzahl von positiven Ionen optimal zu reagieren.
Es lassen sich durch den Fachmann in Kenntnis dieser Erfindung auch weitere Verfahren erstellen, die die Kenntnis über Strukturen der untersuchten Substanzen vergrößern und vervollständigen. Beispielsweise können von den so hergestellten Fragmentionen auch wieder Enkelionen durch Stoßfragmentierung oder Elektronentransfer-Dissoziation erzeugt werden. Alle diese Lösungen sollen vom Erfindungsgedanken mit umfasst sein.

Claims

Verfahren zur Messung von Fragmentionenspektren unter Anwendung sowohl einer Elektronentransfer-Dissoziation von Analytionen durch Reaktionen mit Radikalanionen als auch einer teilweisen Deprotonierung der Analyt- oder der Fragmentionen durch Reaktionen mit nichtradikalen Anionen, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation als auch die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in einer einzigen Elektronenanlagerungs-Ionenquelle aus einer einzigen Substanz erzeugt werden, wobei für die Thermalisierung der Elektronen ein Gas verwendet wird, das bei Elektronenbeschuss atomaren Wasserstoff liefert, und wobei die Spannung zum Extrahieren der Anionen aus der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle verändert wird, um das Lieferungsverhältnis beider Arten von Anionen zu ändern.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Methan als Gas zur Thermalisierung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder eine andere polyaromatische Verbindung ist.
Verfahren zur Messung eines Fragmentionenspektrums von vielfach positiv geladenen Analytionen einer Analytsubstanz in einem Massenspektrometer mit einer Hochfrequenz-Ionenfalle, mit folgenden Schritten: a) Erzeugung positiv geladener Analytionen der Analytsubstanz und Einspeichern von Analytionen in die Ionenfalle, b) Einbringen von Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation und von nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in die Ionenfalle, wobei beide Sorten von Anionen aus einer einzigen Reaktantsubstanz von einer einzigen Elektronenanlagerungs-Ionenquelle geliefert werden, in der für die Thermalisierung der Elektronen ein Gas verwendet wird, das bei Elektronenbeschuss atomaren Wasserstoff liefert, und in der die Spannung zum Extrahieren der Anionen verändert wird, um das Lieferungsverhältnis beider Arten von Anionen zu ändern, und c) Messung des Fragmentionenspektrums.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytionen in Schritt a) durch Elektrosprühen erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytionen zwischen den Schritten a) und b) einer Deprotonierung unterworfen werden, die bei einer vorgewählten Ladungsstufe angehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten a) und b) ausgewählte Elternionen für die Fragmentierung isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation und die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung nacheinander in die Ionenfalle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) erst die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation und dann die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung in die Ionenfalle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) erst die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung und dann die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation in die Ionenfalle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation und die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung gleichzeitig als Mischung in die Ionenfalle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine oder beide Sorten von Anionen im Überschuss gegenüber der Analytionen in die Ionenfalle eingebracht und jeweils nach Ablauf einer vorgewählten Reaktionszeit wieder entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Deprotonierung nur so weit erfolgt, dass einerseits eine Isotopenauflösung in der Messung des Fragmentionenspektrums und andererseits eine Entzerrung des Fragmentionenspektrums vorliegt, bei der eine Entfaltung der Isotopenmuster der Fragmentionen möglich ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochfrequenz-Ionenfalle eine 2D- oder eine 3D-Ionenfalle ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass aus Analytionen durch Übertragung eines Elektrons entstehende Radikal-Kationen durch Stöße mit Stoßgas fragmentiert werden, um die Ausbeute an Elektronentransfer-Fragmentionen zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoßfragmentierung der Radikal-Kationen durch eine Anregung mit einer dipolar eingestrahlten Wechselspannung bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung des Fragmentionenspektrums in der 2D- oder der 3D-Ionenfalle selber erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmentionen in Schritt b) bis zu einer Mischung der Ladungsstufen eins bis vier deprotoniert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten b) und c) nicht fragmentierte Analytionen aus der Ionenfalle entfernt werden.