CN101001609A - 含脂质体制剂的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在生物体内的稳定性优异，并且含有药物的包封率高的脂质体的含有脂质体的制剂的制造方法，以及通过该方法得到的含有脂质体的制剂。本发明涉及的含有脂质体的制剂的制造方法是，通过在压力容器内将超临界或亚临界状态的二氧化碳和至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成物质以及水容性药物混合后，将该压力容器内减压，排出二氧化碳，制备包封了水溶性药剂的脂质体水性分散液。

Description

含脂质体制剂的制造方法

技术领域

本发明涉及含脂质体制剂的制造方法，以及通过该方法得到的含脂质体制剂，所述制剂在生物体内的稳定性优异、并且含有药物包封率高的脂质体。

背景技术

脂质体是主要由磷脂形成的双分子膜(脂质体膜)的封闭小泡体，由于具有与生物体膜类似的结构和功能，以往作为各种制剂材料使用。由于脂质体可以构筑起在内部所具有的水相中保持水溶性药物，而在双分子膜的内部保持油溶性药物的所谓胶囊结构，因此，可以使用在诊断、治疗、化妆等各个领域。另外，近年来，广泛研究其在药物递送系统(DDS)中的应用。

为了制备这样的包封药物的脂质体，以往采用Bangham法或反相蒸发法(REV法)等。在这些方法中，尽管将药物包封在作为原材料的安全性高、并在生物体内具有适当的分解性的脂质体中，但在制造过程中，作为构成脂质体膜的磷脂的溶剂必须使用有机溶剂。因此，在采用上述方法得到的含脂质体制剂中，存在不能完全除去的有机溶剂残留在制剂中的问题，并且存在对人体产生副作用的问题。

再有，在以往的方法中，不能将药物充分地包封在脂质体内，由于给予大量含有脂质体的制剂，因此，对患者来说存在成为过度的负担的问题。因此，考虑到在应用与治疗用药剂相比给药量多的诊断用造影剂时，寻求造影物质的保持效率(包封率)高的含有脂质体的制剂。

另一方面，在专利文献1中公开了使用超临界二氧化碳制造包封了水溶性电解质的药物的脂质体的方法。由于该方法可以设定各种制造条件，因此，与以往的脂质体悬浮液的制造方法相比，可以比较容易地提高水溶性药物的包封率。但是，专利文献1记载的使用超临界二氧化碳的方法虽然与以往的方法相比可以制备提高了水溶性药物的包封率的的脂质体，但其包封率还有改良的余地。

另外，如果在包含诊断或治疗用药物的用途中使用的脂质体在生物体内不稳定，则脂质体膜被破坏，包封的药物在早期流出。因此，药物不能递送到期望的部位，另外，存在难以控制作为脂质体的功能之一的缓释性的问题。因此，寻求在生物体内优异的脂质体。

作为解决这样的问题的方法，公开了以下方法，通过在分散液中含有15℃ pH为9.5以下且含有氨或水溶性胺的缓冲液，使脂质体的稳定性提高(参照专利文献2)。但是，即使是通过该方法得到的脂质体，依然存在生物体内的稳定性的问题。

本发明的目的在于，解决以往技术中的问题，并提供含有脂质体的制剂的制造方法，以及通过该方法得到的含有脂质体的制剂，所述制剂在生物体内的稳定性优异、并且含有药物包封率高的脂质体。

专利文献1：特开2003-119120号公报

专利文献2：特表2000-515487号公报

发明内容

本发明的上述目的通过以下各种组成而达到。

本发明涉及含有脂质体的制剂的制造方法，其特征在于，将超临界或亚临界状态的二氧化碳、至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成物质以及药物混合。

上述磷脂的转变温度优选22～60℃的范围。

优选通过在强搅拌下将上述超临界或亚临界状态的二氧化碳、上述脂质体膜构成物质和上述药物混合，使药物在脂质体中的包封率提高。

上述具有转变温度的磷脂优选选自二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱以及二硬脂酰磷脂酰胆碱中的至少一种，特别优选二肉豆寇酰磷脂酰胆碱和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

上述药物优选造影化合物或抗癌性物质。

本发明涉及含有脂质体的制剂，其特征在于，通过上述方法制造。

具体实施方式

本发明涉及的含有脂质体的制剂的制造方法是通过将超临界或亚临界状态的二氧化碳(以下称为“超临界二氧化碳”)、至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成物质以及药物混合来制备脂质体的方法。

(脂质体膜的构成成分)

作为本发明中使用的脂质体膜构成成分，通常优选使用磷脂和/或糖脂，至少含有具有转变温度的磷脂。

作为磷脂，可以举出，以磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰纤维醇、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂等为代表的磷脂。可以使用来自蛋黄、大豆以及其他动植物材料的磷脂、它们的氢化物、氢氧化物的衍生物等半合成的磷脂或合成加工品等，而不特别限定。磷脂的构成脂肪酸也不特别限定，可以是饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸中的任意一种。

作为具体的中性磷脂的例子，可以举出，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油烯基酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆寇酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等。

除上述中性磷脂以外，还包括阴离子性磷脂、阳离子性磷脂等带电磷脂、以及聚合性磷脂、阳离子(正电荷)磷脂。

作为带负电的磷脂，可以举出，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆寇酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二棕榈酰磷脂酰纤维醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰纤维醇(DSPI)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆寇酰磷脂酸等。

作为阳离子性磷脂，可以举出，磷脂酸与氨基醇的酯，例如，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)和羟基亚乙基二胺的酯等。

在本发明中使用的磷脂中至少含有具有转变温度的磷脂。所谓的磷脂的“(相)转变温度”是磷脂发生凝胶和液晶两状态之间的相转变的温度。通过使用差示扫描热量计(DSC)的差示热分析对其进行测定。磷脂的转变温度为22～60℃，优选30～60℃，更加优选40～55℃。

作为具有相转变温度的磷脂，可以举出，二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(相转变温度(下同)：23～24℃)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(41.0～41.5℃)、氢化大豆卵磷脂(53℃)、氢化大豆磷脂酰胆碱(54℃)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(54.1～58.0℃)等，优选使用二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰酰磷脂酰胆碱，特别优选使用二棕榈酰磷脂酰胆碱。在本发明中，可以使用选自它们的1种或2种以上的组合。

这些具有相转变温度的磷脂的使用量，相对于磷脂总质量为40～100质量％，优选50～80质量％。通过使用上述量的该具有相转变温度的磷脂，可以在后述的混合温度下制备在生物体内的稳定性优异的脂质体。

在本发明中使用的磷脂通常至少含有具有转变温度的磷脂，但也可以同时使用1种或2种以上其他磷脂。但是，在使用2种以上的带电磷脂时，从防止脂质体凝聚的观点来看，优选使用均为负电荷的磷脂或均为正电荷的磷脂。

作为阳离子性磷脂的例子，可以举出，1，2-二油酰氧基-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、N，N-二(十八烷基)酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙烷]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺-羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)以及N-[1-(2，3-二肉豆寇氧基)丙烷]-N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)溴化铵(DMRIE)等。

作为糖脂，可以举出，二半乳糖二甘油酯、半乳糖二甘油硫酸酯等甘油脂质、半乳糖神经酰胺、半乳糖神经酰胺硫酸酯、半乳糖神经酰胺、神经节苷脂G7、神经节苷脂G6、神经节苷脂G4等鞘糖脂等。

作为脂质体膜的构成成分，除上述脂质以外，还可以视需要添加其他物质。例如，可以举出，发挥膜稳定剂作用的固醇类，例如，胆固醇、二氢化胆固醇、胆固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、或羊毛甾醇等。另外，公开了1-O-固醇糖苷、1-O-固醇麦芽糖苷或1-O固醇半乳糖苷这些胆固醇衍生物也具有使脂质体稳定化的效果(特开平5-245357号公报)。特别优选胆固醇。

作为固醇类的使用量，相对于1重量份磷脂为0.05～1.5重量份，优选0.2～1重量份，更为优选0.3～0.8重量的比例。不足0.05重量份时，不能发挥出使混合脂质的分散性提高的固醇类产生的稳定化，超过1.5重量份时，脂质体的形成被阻碍，或者即使可以形成也不稳定。

脂质体膜中的胆固醇可以成为用于导入聚氧化烯烃的锚位(anchor)。在特开平09-3093号公报中公开了新型的胆固醇衍生物，其可以通过共价键将各种功能性物质固定在聚氧化烯烃链的前端，并作为用于形成脂质体的成分而被利用。

除了上述固醇类以外，作为脂质体膜的构成成分，还可以添加二醇类。作为二醇类，可以举出，乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、丙二醇、二丙二醇、三亚甲基二醇、1，4-丁二醇等。作为二醇类的使用量，相对于脂质体总量，优选0.01～20质量％，优选0.5～10质量％的比例。

在本发明中，作为脂质体膜的成分之一，希望使用具有聚乙二醇(PEG)基的化合物，优选使用具有聚乙二醇基的磷脂或胆固醇。被衍生化的磷脂可以从上述列举的磷脂中适当选择。具有聚乙二醇(PEG)基的化合物可以通过适当改变用-(CH₂CH₂O)_n-H表示的PEG基的氧化烯单元的长度和导入的比例来调整其功能。作为PEG基，优选氧化烯单元(n)为10～3500，优选100～2000的聚乙二醇。使用聚乙二醇时的使用量相对于构成该脂质体的脂质为0.1～30质量％，优选1～15质量％左右。具有聚乙二醇基的化合物，可以通过特开平7-165770号所述的方法制造。

使用这样的具有聚乙二醇基的化合物作为向超临界二氧化碳中溶解的溶解助剂来制备脂质体时，可以不使用有机溶剂而制备出包封率高的脂质体。

(药物)

本发明中使用的药物，是包封在脂质膜内或其内部水相内的药物类，具体地，可以举出，造影物质、抗癌性物质、抗真菌物质、抗氧化物质、抗菌性物质、抗炎性物质、血液循环促进物质、美白物质、防止皮肤皲裂的物质、生发促进物质、保湿性物质、激素药物、维生素类、色素以及蛋白质类等药物。

本发明中使用的药物为水溶性时，可以通过以往已知的方法溶解到规定量的水性介质中制成水溶液来使用。水性药物的浓度可以根据药物的溶解度、制造条件适当选择。水性介质除蒸馏水、处方注射用水、纯水等水以外，还可以使用生理盐水、各种缓冲液、盐类等的水溶液等。

本发明的含有脂质体的制剂优选使用造影性物质或抗癌性物质作为水溶性药物。

作为造影物质，可以使用水溶性碘化合物。水溶性碘化合物只要具有造影性即可，可以是离子性，也可以是非离子性，并没有特别的规定。通常，非离子性碘化合物比离子性碘化合物的渗透压低，对给药的人体的负担小，因此优选。作为水溶性非离子性碘化合物，优选含有碘代苯基，例如，优选至少具有一个2，4，6-三碘代苯基的非离子性碘化合物。

作为这样的非离子性碘化合物，具体地，可以举出，碘帕醇、碘美普尔、碘海醇、碘喷托、碘普胺、碘西胺、碘佛醇、碘曲伦、碘酞硫、碘克沙醇、碘西醇、(1，3-双-(N-3，5-双[2，3-二羟丙基氨基羰基]-2，4，6-三碘基苯基)-N-羟基乙酰基氨基)丙烷等。这些化合物可以单独使用，也可以组合2种以上使用。

使用本发明的含有脂质体的制剂作为X射线检查用造影剂时，在合适的碘化合物中，作为具有高度的亲水性，并且即使是高浓度，渗透压也不会变高的非离子性碘化合物，优选碘美普尔、碘帕醇、碘曲伦、碘克沙醇。这样的非电解质物质也可以采用超临界二氧化碳法高效地包封在脂质体内。

本发明的含有脂质体的制剂中的水溶性碘化合物的浓度，可以根据该造影化合物的性质、需要的制剂的给药途径以及临床上的指标这些主要因素任意选择。密封在脂质体内的碘化合物的量希望为X射线造影剂中的总碘化合物量的5～40质量％，优选5～35质量％，更加优选10～25质量％。该包封率由于低于脂质体粒子的细密充填的界限，因此，不会损害脂质体中造影物质的保持稳定性。

作为抗癌化合物，具体地，可以举出，甲氨蝶呤、阿霉素、ebirubicin、柔红霉素(daunoruvicin)、长春新碱、长春碱、依托泊苷、erypsitine、captodecin、pacritaxecel、多西紫杉醇(docetaxecel)、顺氯氨铂(cisplatin)、强的松等。这些化合物可以单独使用，或也可以组合2种以上使用。

另外，在本发明说明书中，上述化合物除游离形态以外，还包括其盐、水合物等。

以下，详细说明使用这样的成分的本发明所涉及的含有脂质体制剂的制造方法。

具体地，本发明涉及的含有脂质体的制剂的制造方法通过以下工序进行：

在压力容器内，将至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成成分、液化二氧化碳以及视需要的亲油性的药物搅拌混合(工序1)；

接着，通过对压力容器内加温到32～55℃，同时进行加压，将液化二氧化碳调整为超临界或亚临界状态(工序2)；

边搅拌混合脂质体膜构成成分和超临界二氧化碳，边供给水溶性药物的水溶液，制备混合溶液(工序3)；

得到上述混合溶液后，将压力容器内减压，从混合溶液中排出二氧化碳，制备包封有药物的脂质体的水性分散液(工序4)。

另外，优选将脂质体的水性分散液用具有0.1～0.45μm的孔径的过滤膜进行过滤(第5工序)。

以下，按各工序进行说明。

工序1

在工序1中，在压力容器内，将至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成成分、液化二氧化碳以及视需要的亲油性的药物搅拌混合。它们的添加顺序没有特别的规定，另外，搅拌条件只要可以将它们混合即可，没有特别的限定。

作为压力容器，优选使用可以耐受500个大气压的压力、并且具有可以通过玻璃窗目视观察其内部的结构的不锈钢制造的高压釜。

脂质体膜的构成成分的添加量根据药物的种类、制剂规模等适当决定，另一方面，视需要使用的亲油性药物的添加量可以根据亲油性药物的活性或脂质体的包封率等适当决定。

在本发明中，在各工序中，压力容器内或投入到压力容器的药物、液化二氧化碳、气体等优选被保管为无菌状态，更加优选在投入压力容器内时，通过过滤装置等进行灭菌。

工序2

在工序2中，将压力容器内加热到32～55℃，并进行加压，将液化二氧化碳调整为超临界状态。在本发明中，包括亚临界状态都称为超临界状态。

在本发明的制造方法中使用的超临界状态的二氧化碳的温度希望为32～55℃，优选32～50℃，更加优选35～50℃。另外，超临界状态的二氧化碳的优选压力可以从上述温度范围内适当选择，但通常为50～500kg/cm²，优选100～400kg/cm²。

在本发明中，由于在接近体温的温度下将二氧化碳调整为超临界状态，由磷脂形成脂质体，因此，脂质体的形成温度和制成制剂给药后脂质体在生物体内受到的温度(体温)大致相等。因此，本发明的脂质体制剂给药到生物体内后，即使在生物体内被体温加热，由于该温度与脂质体形成时的温度大致相等，因此认为，磷脂的排列也几乎不会受到温度的影响，脂质体在生物体内的稳定性提高。

通过将超临界状态的二氧化碳的温度设定为具有上述温度范围转变温度的磷脂的转变温度+10℃以下，优选转变温度+5℃以下，更加优选转变温度以下，这样的效果会变得更加明显。以往，加热到磷脂的转变温度+20℃左右时，具有转变温度的磷脂成为液晶状态，流动性提高，磷脂可以与超临界二氧化碳高效混合，脂质体的制备变得容易，因此优选。但是，如上所述，本发明者们发现，通过将超临界状态的二氧化碳的温度调整为磷脂的转移温度附近或其以下，由于不需要对磷脂施加过度的热量，因此，不会改性，另外，磷脂会规则地排列，并生成脂质体膜，从而完成了本发明。由于这样得到的脂质体的膜结构稳定，因此可以容易地控制脂质体的缓释性，另外，由于在生物体内的稳定性得以提高，因此，可以将药物选择性地送到期望的部位。

工序3

在工序3中，通过规定的搅拌装置搅拌混合脂质体膜构成成分和超临界二氧化碳，并供给药物水溶液，制备混合溶液。上述搅拌条件优选强搅拌。

所谓“强搅拌”由于混合溶液的容量或搅拌装置的不同其优选的范围也不同，是指例如在混合溶液的容量为10～100ml左右的程度的情况下，使用长15mm、直径5mm的大致圆柱状的搅拌棒，在电磁式搅拌器中，以400～4000rpm，优选1000～1500rpm的转速进行搅拌。另外，即使是混合溶液的容量或搅拌装置与上述不同的情况，也可以参考在上述搅拌条件下对混合溶液施加的剪切力等，设定适当的条件。具体地，搅拌条件特别优选满足下式：

式：C＝N×V^-0.15

C：转速(rpm)

V：混合溶液的容量(L)

N：300～3000

另外，强搅拌的时间希望为1～120分钟，优选5～60分钟。另外，上述强搅拌的时间也包括供给药物水溶液的时间。

在满足这样的条件的强搅拌下，通过将脂质体膜构成成分和超临界二氧化碳混合规定的时间，可以得到脂质体的生成率更高，药物的包封率更高的含有脂质体的制剂。即，通过在这样的条件下进行强搅拌，可以促进脂质体的生成，药物的包封率也得以提高。

因此，在本发明中，特别优选在上述温度下将二氧化碳调整为超临界或亚临界状态，再以规定的时间在强搅拌下混合超临界二氧化碳和脂质体膜构成成分，由此，可以得到含有在生物体内的稳定性提高，并且药物的包封率更高的脂质体的制剂。另外发现，即使在该范围中，维持更长时间的超临界状态继续进行强搅拌，由此，药物对脂质体的包封率有提高的倾向。

另外，以规定的时间在强搅拌下混合超临界二氧化碳和脂质体膜构成成分时，优选施加超声波。通过施加超声波，可以将脂质体膜构成成分(脂质)制成微细的粒子分散在超临界二氧化碳中，并且可以制备脂质体的生成率和药物的包封率更高的含有脂质体的制剂。

在本发明的含有脂质体的制剂的制造方法中，通过以下实施方式进行说明，所述实施方式包括(1)在压力容器内，搅拌混合脂质体膜构成成分、液化二氧化碳和视需要的亲油性药物；(2)接着，对压力容器内进行加热加压，将液化二氧化碳调整为超临界或亚临界状态；(3)混合搅拌脂质体膜构成成分和超临界二氧化碳，同时供给药物水溶液，制备混合溶液。

优选(1)在压力容器内，搅拌混合脂质体膜构成成分、液化二氧化碳和视需要的亲油性药物；(2)接着，将液化二氧化碳供给到该压力容器中，对压力容器内进行加热加压，将液化二氧化碳调整为超临界状态；(3)以规定的时间混合脂质体膜构成成分、药物以及超临界二氧化碳，制备混合溶液。按照这样的制造工序，在生成超临界二氧化碳后，没有必要再添加水溶性药物，因此，容易控制压力容器内的温度和压力，脂质体的生成率和药物的包封率进一步提高。

悬浮液可以在脂质体膜构成成分和药剂水溶液投入到压力容器中之后混合进行制备，但在工序1的优选实施方式中，预先混合制成悬浮液，再将该悬浮液供给到压力容器内。通过预选制成悬浮液，可以将脂质体膜构成成分和药剂水溶液容易地供给到压力容器内，同时，可以提高脂质体的生成率和药剂的包封率。

另外，在本发明中的工序1的其他优选实施方式中，通过混合药剂水溶液和溶解助剂，再混合脂质体膜构成成分来制备悬浮液。通过预先在药剂水溶液中分散溶解助剂，可以将脂质体膜构成成分溶解在药剂水溶液中，因此，上述效果优异。

在本发明的工序1的再一个优选的实施方式中，在混合脂质体膜构成成分和药剂水溶液时，或者混合药剂水溶液和溶解助剂后，再混合脂质体膜构成成分来制备悬浮液时，采用超声波制备悬浮液，将该悬浮液供给到压力容器内。

超声波的实施条件可以根据脂质体的悬浮液中所含的脂质体的形态、粒子径分布、包封率等适当选择，但希望采用1～600w/ml/分，优选5～500w/ml/分的10～100kHz，优选15～45kHz的超声波。施用量可以由使用的超声波分散机的额定输出功率、被施用的分散液的量、施用时间计算出来。

通过在这样的施用条件下制备悬浮液可以将脂质体膜构成成分(脂质)制成微细的粒子分散到药剂水溶液中，在实际生产规模的制造装置中，也可以制备脂质体的生成率和药剂的包封率高的含有脂质体的制剂。认为这样的效果是因为，通过在上述条件下施予超声波来制备悬浮液，可以使磷脂在悬浮液中开始排列，然后，在混合悬浮液和超临界二氧化碳形成脂质体时，促进其形成。

另外，更加优选的是，在混合脂质体膜构成成分和药剂水溶液时，在上述条件下施用超声波，同时，加热到磷脂的转变温度～转变温度+50℃(但不超过100℃)，制备悬浮液。

在工序1中，将液化二氧化碳供给到收纳了上述悬浮液的压力容器中。

液化二氧化碳通过采用以往公知的方法对气体的二氧化碳进行冷却、加压来制备。将得到的液化二氧化碳维持液体状态，同时将其供给到压力容器内。对压力容器内的供给没有特别的限定，可以一次添加，也可以间歇添加。另外，液化二氧化碳的供给量可以通过脂质体膜构成成分或水溶性药剂的种类、制造等级等适当选择。

工序4

在工序4中，将脂质体构成成分、超临界二氧化碳和药物的水溶液在第3工序中混合后，将压力容器内减压，从该混合溶液中排出二氧化碳，制备包封了药物的脂质体的水性分散液。

在工序3中，推测脂质体变为水相，因此，将体系内减压排出二氧化碳时，生成分散了包封有药物的脂质体的水性分散液。制造造影剂时，该脂质体的内部以外的水相中可以含有药物。上述水溶液也可以被包封在脂质体内部，因此，造影物质除脂质体的外部水相外，主要存在于脂质体内部的水相，并处于所谓的“包封”状态。

第5工序

在第5工序中，用具有0.1～1.0μm的孔径的过滤膜过滤由第4工序得到的脂质体的水性分散体。

具体地，在压力容器内为负压时，向压力容器内供给过滤器灭均的气体。作为该气体，可以举出大气、二氧化碳、氮、氦、氩等。

像这样供给气体，将压力容器内调整为大气压，用具有0.1～1.0μm的孔径的过滤膜过滤脂质体的水性分散液。通过过滤操作，可以容易地调整脂质体的粒径，并得到含有均匀粒径的脂质体的制剂。

具体地，采用通过安装了0.1～1.0μm孔径的过滤器的静压式挤出装置的方式进行。具体地，可以使用各种静压式挤出装置，例如，“エクストル一ダ一”(商品名：日油脂质体制造)、“リポナイザ一”(商品名：野村マイクロサイエンス制造)，使之强制通过过滤器。过滤器可以合适地使用聚碳酸酯类、纤维素类等类型，对于挤出过滤法，例如，在Biochim.Biophys.Acta557卷，9页(1979)有记载。

通过安插这样的“挤出”操作工序，除了上述筛分(sizing)以外，还具有脂质体分散液的交换、除去不需要的物质、过滤灭菌等优点。另外，在用上述孔径的过滤膜进行过滤前，用0.1～2.0μm左右的过滤膜过滤，预先进行精加工或除去不需要的物质。

如上所述，本发明的含有脂质体的制剂通过用过滤膜过滤脂质的水性分散液，以及视需要进行离心分离、超滤、凝胶过滤等方法，可以除去脂质体内未保持的药物并进行精制，另外，可以浓缩为规定的浓度，再有，可以适当混合通常使用的稀释剂等制剂辅助剂进行制造。

另外，本发明的含有脂质体的制剂也可以通过按照常规方法由脂质体的水性分散溶液冷冻干燥脂质体而得到。冷冻干燥脂质体时，使用之前用水性介质等进行再悬浮来使用。

按照本发明的含有脂质体的制造方法，不必使用有机溶剂，就可以将药物高效地包封于脂质体中，另外，可以得到含有在生物体内的稳定性优异的脂质体的含脂质体制剂。

这样制造的本发明的含有脂质体的制剂包含包封有药物的脂质体，该脂质体的平均粒径通常为0.05～2.0μm，优选0.05～1.0μm，更加优选0.05～0.5μm。平均粒径优选根据治疗、诊断、X射线摄像的目的适当设定，例如，为选择性地递送肿瘤部分，希望将脂质体的粒径制成0.10～0.20μm，优选0.11～0.13μm。由此，可以选择性地将药效物质或造影剂集中在癌组织。即，位于固体癌组织的新生血管壁的孔比正常组织的毛细血管壁窗(fenestra)的孔大小(0.03～0.08μm左右)异常地大，即使0.1～0.2μm左右的大小的分子也可以从血管壁上漏出，因此，只要是上述范围的脂质体，就可以选择性地集中在癌组织中。已知这是“EPR效果”，其利用了位于癌组织的新生血管与正常组织的微血管壁相比透过性高。

粒径通过以下方法测定，将含有包封有药物的脂质体的分散液冷冻，然后，对破碎的表面进行碳蒸镀，用电子显微镜观察该碳(冷冻破碎TEM法)。这里，作为“中心粒径”是指粒子分布中出现频率最高的粒径。、

另外，如上所述得到的脂质体基本上是由一片膜或多片膜构成的脂质体。所谓一片膜的脂质体，是以磷脂双层为单层的膜(unilamellar vesicle)形成的脂质体，在通过采用冻裂复制法的透射型电子显微镜(TEM)进行的观察中，复制层(replica)是由基本上被确认为1层的磷脂二重层的脂质体构成的层。即，观察残留在碳膜的粒子的痕迹时，判定为是没有高低不均的一片膜。另外，所谓“基本上”，是指在本发明的脂质体制剂中，这样的一片膜的脂质体或由多片膜构成的脂质体在制剂中所含的全部脂质体中含有至少80％，优选90％以上。

上述一片膜的脂质体或由多片膜形成的脂质体可以使用上述超临界二氧化碳或亚临界二氧化碳作为脂质类的溶剂，透过采用水的相分离方法高效地制作。一片膜或多片膜的脂质体与由多重层膜(multilamellar vesicles；MLV)构成的脂质体相比较，存在脂质体的给药量即给药的脂质量不会增大的优点。与此相反，采用以往的脂质体制造方法时，多数情况下，各种大小、形态的MLV·以相当的比例存在，为了提高一片膜或多片膜的脂质体的比例，必须还要进行施予超声波或者多次通过一定孔径的过滤器等操作。但是，如本发明所述，透过使用超临界二氧化碳制备脂质体，可以高效地制备一片膜脂质体或由多片膜构成的脂质体，另外，还可以提高药物在脂质体内的包封率。

像本发明的含有脂质体的制剂那样，将造影剂或抗癌性化合物等药物封入脂质体中时，除了抗癌性化合物等的递送效率和保持稳定性以外，还必须考虑脂质体的膜构成成分的重量。具体地，按照药物在脂质体内的包封量相对于脂质体膜构成成分的重量比为1～8，优选3～8，更为优选5～8，来包封药物。

包封在脂质体内的药物的重量比不足1时，需要投入比较大量的制剂，结果，药物的递送效率变差。另外，制剂的粘度增大，在注入时需要增加施加的力，因此，给患者带来的痛苦加大。另一方面，包封在脂质体内的药物的重量比超过8时，脂质体的结构变得不稳定，在贮藏中或注入到生物体内后，药物从脂质体中扩散、漏出。

如上所述，本发明的含有脂质体的制剂是将各种药物类包封在其脂质体内而得到的，可以考虑药物的作用效果或保存稳定性来决定制剂形态。造影剂或抗癌性化合物等药物封入脂质体使用时，含有脂质体的制剂制成注射剂或点滴注入剂使用，该制剂可以非经口地给药到具体患者的血管内。

实施例

以下，基于实施例更为具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

在不锈钢制造的压力容器内加入300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，日本油脂株式会社制造)、100mg的PEG-磷脂(SUNBRIGHT DSPE-020CN，日本油脂株式会社制造)，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为50℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，并混合10g碘海醇溶液(碘含有率为240mg/mL)，使用电磁式搅拌器(搅拌棒：长15mm，直径5mm的大致圆柱状)，在转数1000rpm下剧烈搅拌10分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘海醇的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表1。

实施例2

在不锈钢制造的压力容器内加入900mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，日本油脂株式会社制造)，接着，注入40g液体二氧化碳后，将容器内调整为40℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，并混合40g碘帕醇溶液(碘含有率为200mg/mL)，使用具有搅拌翼(蝶型4片叶片，约φ50mm)的三一马达(three-one motor)，在转数2000rpm下剧烈搅拌20分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘帕醇的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表1。

实施例3

在不锈钢制造的压力容器内加入300mg二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC，日本油脂株式会社制造)、40mg的胆固醇HP(日本油脂株式会社制造)、50mg的作为二醇磷脂的二棕榈酰磷脂酰胆碱(COATSOMEMG-6060LS，日本油脂株式会社制造)，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为48℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，并混合10g碘海醇溶液(碘含有率为200mg/mL)，使用电磁式搅拌器(搅拌棒：长15mm，直径5mm的大致圆柱状)，在转数1200rpm下剧烈搅拌3分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，分散液从容器内排出回收，得到含有碘海醇的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表1。

测定方法

(1)脂质体的包封率测定

将0.5g含有脂质体的制剂放入透析膜中，在生理盐水中进行3次透析之后，放入3/1的乙醇/水中，将脂质体破坏，用分光光度剂测定吸光度，求出脂质体内的碘化合物量。

(2)平均粒径、粒径分布(1μm以上的比例：％)

通过大塚电子制造的电泳光散射光度计(ELS-800型)测定并求出。

[表1]

	磷脂		容器内温度(℃)	包封率(％)	平均粒径(μm)	1μm以上的比例(％)
							种类	转变温度(℃)
	实施例1	DPPC							42	50	17	0.33	＜5
实施例2			DPPC	42	40	17	0.36	7
	实施例3	DMPC							23	48	16	0.27	＜5

实施例4

将300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、10g的碘海醇溶液(碘含有率为200mg/mL)混合，用小型均化器(产品名：ULTRATALAX IKA Japan公司制造)，在转速6000rpm左右下分散5分钟，得到悬浮液，将该悬浮液装入不锈钢制造的压力容器中，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为60℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，搅拌10分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘海醇的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表2。

实施例5

不锈钢制造的压力容器内将300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、100mg的PEG-磷脂(SUNBRIGHT DSPE-020CN，日本油脂株式会社制造)、10g碘帕醇溶液(碘含有率为250mg/mL)混合后，使用电磁式搅拌器(搅拌棒：长15mm，直径5mm的大致圆柱状)，在转数1200rpm下剧烈搅拌5分钟，得到悬浮液。将该悬浮液装入不锈钢制造的压力容器内，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为60℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，搅拌5分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘帕醇的脂质体分散液。再用1μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表2。

实施例6

将300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、40mg的胆固醇HP(日本油脂株式会社制造)、50mg的作为二醇磷脂的二棕榈酰磷脂酰胆碱(COATSOMEMG-6060LS，日本油脂株式会社制造)、10g碘帕醇溶液(碘含有率为250mg/mL)混合后，用小型均化器(产品名：ULTRATALAX IKA Japan公司制造)，在转速6000rpm左右下分散3分钟，得到悬浮液，将该悬浮液装入不锈钢制造的压力容器中，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为55℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，搅拌5分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘海醇的脂质体分散液。再用1μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表2。

实施例7

将300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、40mg的胆固醇HP(日本油脂株式会社制造)、100mg的PEG-磷脂(SUNBRIGHT DSPE-020CN，日本油脂株式会社制造)、将10mg阿霉素溶解在10ml生理盐水中得到的药剂溶液混合后，用小型均化器(产品名：ULTRATALAX IKA Japan公司制造)，在转速6000rpm左右下分散3分钟，得到悬浮液，将该悬浮液装入不锈钢制造的压力容器中，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为60℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，搅拌5分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有阿霉素的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表2。

实施例8

将300mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、60mg的胆固醇HP(日本油脂株式会社制造)、20mg的作为二醇磷脂的二棕榈酰磷脂酰胆碱(COATSOMEMG-6060LS，日本油脂株式会社制造)、10g碘帕醇溶液(碘含有率为250mg/mL)混合后，边施予20kHz的超声波，边使用电磁式搅拌器(搅拌棒：长15mm，直径5mm的大致圆柱状)，在1200rpm左右下剧烈搅拌5分钟，得到悬浮液。将该悬浮液装入不锈钢制造的压力容器内，接着，注入13g液体二氧化碳后，将容器内调整为55℃、120kg/cm²，将二氧化碳调整为超临界状态，维持其状态，搅拌20分钟。然后，将压力容器内减压，将压力降至约10kg/cm²，排出二氧化碳。利用容器内的压力，将分散液从容器内排出回收，得到含有碘帕醇的脂质体分散液。再用0.45μm的纤维素类过滤器对得到的分散液进行加压过滤。过滤后，将脂质体的分散液装入玻璃安瓿中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜杀菌，得到的含有脂质体的制剂。

制剂中所含的脂质体的药剂包封率、平均粒径、粒度分布(1μm以上的比例：％)的测定结果示于表2。

[表2]

	添加顺序1→2→3	混合方法	包封率(％)	平均粒径(μm)	1μm以上的比例(％)
						实施例4	膜成分→药剂→CO2	均化器	17	0.31	＜5
实施例5	膜成分→药剂→CO2	搅拌棒	16	0.35	9
						实施例6	膜成分→药剂→CO2	均化器	17	0.26	8
实施例7	膜成分→药剂→CO2	均化器	19	0.29	＜5
						实施例8	膜成分→药剂→CO2	超声波+搅拌棒	17	0.22	＜5

Claims (17)

1.含脂质体制剂的制造方法，其中，将超临界或亚临界状态的二氧化碳、至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成物质以及药物混合。

2.权利要求1所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述磷脂的转变温度处于22～60℃的范围。

3.权利要求1或2所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述具有转变温度的磷脂是选自二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱以及二硬脂酰磷脂酰胆碱中的至少一种。

4.权利要求1～3中任意一项所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述具有转变温度的磷脂是二肉豆寇酰磷脂酰胆碱和/或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

5.权利要求1～4中任意一项所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述药物是造影化合物或抗癌性物质。

6.权利要求5所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述造影化合物是水溶性碘化合物。

7.权利要求1～6中任意一项所述的含脂质体制剂的制造方法，该方法通过以下工序实施：

在压力容器内，将至少含有具有转变温度的磷脂的脂质体膜构成成分和液化二氧化碳搅拌混合(工序1)；

接着，通过对压力容器内加温到32～55℃，同时进行加压，将液化二氧化碳调整为超临界或亚临界状态(工序2)；

边搅拌混合脂质体膜构成成分和超临界二氧化碳，边供给水溶性药物的水溶液，制备混合溶液(工序3)；

得到上述混合溶液后，将压力容器内减压，从混合溶液中排出二氧化碳，制备包封有药物的脂质体的水性分散液(工序4)。

8.权利要求7所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，在强搅拌下将上述超临界或亚临界状态的二氧化碳、上述脂质体膜构成物质和上述药物混合。

9.权利要求7所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，在强搅拌下将上述超临界或亚临界状态的二氧化碳、上述脂质体膜构成物质和上述药物混合(工序3)。

10.权利要求7所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，进一步将脂质体的水性分散液用具有0.1～1.0μm的孔径的过滤膜进行过滤(第5工序)。

11.权利要求1～6中任意一项所述的含脂质体制剂的制造方法，该方法通过以下工序实施：

在压力容器内，将脂质体膜构成成分和药物水溶液搅拌混合(工序1)；

接着，将液化二氧化碳供给到该压力容器中，对该压力容器内进行加热加压，将液化二氧化碳调整为超临界状态(工序2)；

以规定的时间混合脂质体膜构成成分、药物以及超临界二氧化碳，制备混合溶液(工序3)；

得到上述混合溶液后，将压力容器内减压，从混合溶液中排出二氧化碳，制备包封有药物的脂质体的水性分散液(工序4)。

12.权利要求11所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，混合上述脂质体膜构成成分和含有水溶性药剂的水溶液，调制悬浮液，接着供给到压力容器内。

13.权利要求12所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，边施予超声波，边制备上述悬浮液。

14.权利要求11所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，再将脂质体的水性分散液用具有0.1～1.0μm的孔径的过滤膜进行过滤(第5工序)。

15.权利要求1所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述脂质体膜构成物质还含有胆固醇。

16.权利要求1所述的含脂质体制剂的制造方法，其中，上述脂质体膜构成物质还含有具有聚乙二醇基的化合物。

17.含脂质体制剂，该制剂通过权利要求1～16中任意一项所述的含脂质体制剂的制造方法制造。