CN1008535B - 固定微生物用的载体及其制备方法和应用 - Google Patents

固定微生物用的载体及其制备方法和应用

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Abstract

本发明有关微生物和动物细胞在多孔性无机载体上的固定化方法，特别是用于厌氧过程，其特征是采用一种具有双重孔隙结构的多孔烧结体作为载体，该载体具有能允许载体内部与外面自由进行液体和气体交换的，由孔隙率所确定的贯通式粗孔隙，以及与粗孔隙壁相连通的微孔隙，微孔隙大小处于微生物或者细胞大小的范围内。

Description

本发明涉及微生物和动物细胞在多孔无机载体上的固定方法，特别是用于厌氧过程，和用此方法获得的有微生物生长的载体，以及适用于固定的载体。
将微生物和细胞材料固定到固体载体上是用来使这些材料在所需要的空间位点上繁殖的一种手段。这对生物工艺过程具有非常重要的意义。
无论是需氧的，还是厌氧的生物工艺过程都应当以尽可能高的时空产率（在单位体积和时间里作用物的转换）进行。活细胞的浓度越高，上述要求就越容易满足，因为活细胞同时起着产品和催化剂的作用。
在需氧系统中，细胞的生长实际上可以毫无阻碍地进行，所以能毫无困难地达到高的细胞浓度。然而，在厌氧系统中却相反，细胞的生长从一开始就要受到限制，因此只能达到相对低的生物物质浓度。但是，由于厌氧系统有利于能量平衡（一方面是生物气的生成，另一方面是需氧系统因供应氧气而不需要能量），因此近些年来，人们给予它以特别的关注。人们认识到，厌氧系统的能量消耗不多，就能从便宜的物质中生产出大量有价值的无法按比例计算的产品。一个突出的例子是，用厌氧法处理的高浓度废水，废水中被转变成为生物气的有机污物高达95%，仅有3%～4%的有机物转化成生物物质。
厌氧系统微生物的低生长率提出了对生物物质保留和浓缩的要求，这对于解决需氧系统的分离等问题也是有意义的。
因此，长期以来就有人进行将微生物固定在固体载体上的试验。特 别还试验了各种天然的或者便宜的载体材料，例如：沙子，火山石，陶制品，活性炭，硬煤，玻璃等等。用这些材料多少可以做到微生物的固定。
最近又发现了许多有机载体材料，例如：I.Karube等人（见Biotechnol.Bioeng.，1980年第22卷847～857页）试验过将产生甲烷的细菌固定在聚丙烯酰胺凝胶，琼脂凝胶和胶原薄膜上，并发现其中只有琼脂凝胶合适，当然也指出了营养物质和甲烷通过琼脂凝胶的扩散能力微弱。
P.Scherer等人（见Biotechnol.Bioeng.，1981年第23卷，1057～1067页）曾报导过巴氏甲烷八叠球菌固定在Ca2+交联的藻酸盐网络上的试验，其中的藻酸盐网络为1.2至3.7mm的不同直径的小球形状。这和P.S.J.Cheetham等人（见Biotechnol.Bioeng.，1979年第21卷，2155页及以下各页）的报告不一致，按照他们的报告，作用物应该迟延转移到藻酸盐小球内，但并没有发现微生物活性的差别与球形直径有关。
B.Kressdorf等人于1982年9月在柏林召开的第五届工业微生物学讨论会上曾报告过关于酵母和细菌通过Ca-藻酸盐凝胶固定的试验。在对比试验中使用了不同类型的载体，并且认为特别适用的载体是能负载生物量的、直径小于1mm的有较高强度的交联藻酸盐凝胶。
后来P.Huysman等人（Biotechn    Letters，1983年第5卷，第9期643-648页）又做了对比试验。试验中采用了一种被称为“非孔隙材料”的由海泡石，沸石，澎润土（表面孔隙度为0.1-7.5μm的焙烧膨胀粘土）和玻璃珠作成的大约5mm大小的颗粒作为载体材料。其它的载体是被称为“孔隙材料”的孔隙率大约为50%、孔隙大小从微米级到厘米级的天然海绵和孔隙率大约为30%、孔隙大小从微米级到毫米级的未交联聚氨酯泡沫塑料，最后还有各种不同的孔隙率为97%、孔隙平均直径为（a）2.21mm，（b）430μm和（c）270μm的交联聚氨酯泡沫塑料。在 试验中还使用了孔隙度为430μm的有斑脱土涂层的聚氨酯泡沫塑料。
在试验中发现，在“非孔隙材料”中只有海泡石可以让有用的菌落形成，在检查海泡石的晶体结构时发现，它具有长度为2μm的细针束，针束中有大量象细菌那样大小的裂隙。
被认为比较合适的载体是孔隙材料，主要因为它们具有较大的孔隙率和孔隙度，其中具有430μm微孔和97%孔隙率的没有斑脱土涂层的材料被认为有很好的效果。用这种交联聚氨酯泡沫塑料在两星期内，平均每升反应器体积一天能产生大约25升生物气体（含有65%甲烷）。
在联邦德国公开专利说明书DE-OS2839580中，也介绍了一系列有孔隙载体材料，特别是用于微生物固定的玻璃料，其中≥70的孔隙应当至少与最小的微生物一样大，但又比最大的微生物（例如酵母菌或者细菌）小4至5倍。因此不论是无孔隙的硼硅玻璃，还是玻璃料，孔隙＞20μm的材料显然不如孔隙＜20μm的材料。
尽管做了大量不同的载体材料的试验，并且研究出了部分确实能够使用的载体，然而微生物固定的问题还远没有令人满意地解决，在密度、耐磨度、稳定性，长期使用性、润湿性等各方面还存在着问题，并且还没有达到具有很高效率水平的生物量固定的总目标。
因此，本发明的任务是寻找达到固定微生物和细胞材料的途径，以便能在获得较高生物活性的同时，达到高浓度的生物量。
该任务通过一种前面所述类型的固定方法得到解决。该方法采用一种具有双重孔隙结构的多孔烧结体作为载体，该载体具有能允许载体内部与外部自由进行液体和气体交换的、由孔隙率所确定的贯通式粗孔隙，以及与粗孔隙壁相连通的微孔隙，微孔隙的大小处于微生物或者细胞大小的范围内。
令人意外的是采用了上述多孔烧结体后，能显著提高生物过程的效率。其中起决定性作用的是载体材料的结构。由于该材料有贯通式的粗 孔隙，所以周围的液体可以自由地流入，不致阻碍待分解物料的输入和代谢产物的输出。而烧结材料孔隙壁上的微孔形裂痕构型则有利于生物体或者微生物的固定。
材料在有尽可能高的孔隙率的同时，应当能保证有足够的机械强度。由于这个原因，载体孔隙率超过85%以后，一般就不能使用。孔隙率若低于35%，也没有什么意义。因此孔隙率应该＞40%，特别是在50%～70%之间，最好在大约55%～65%之间。
粗孔隙的孔隙直径可以根据使用条件选择，通常不超过500μm。比较合适的粗孔隙在20至250μm之间，最好在50～150μm之间。微孔隙直径一般大约在1～10μm之间。微孔隙占全部孔隙体积的百分比，根据微孔隙和粗孔隙尺寸之间的比例和总的孔隙率来确定，通常大约在5%～15%之间。当孔隙率较高时，由于机械强度的原因，只允许有很少的微孔隙存在。
载体材料不要求均匀一致，但要有足够的烧结性。优先选用的材料是玻璃、陶制品或者玻璃陶瓷，最好是硅酸盐材料。
载体大小为20-500μm的粗孔隙是通过从可烧结产物中熔化出一种粒度为20-600μm的物质获得的;而载体大小为1-10μm的微孔隙是通过使用一种粒度＜40μm，优先＜20μm的可烧结材料获得的。
所附玻璃结构的电子显微镜放大图显示出材料的有利结构。图1a是一个腊希格环烧结玻璃体的表面（放大19倍）;
图1b是上述烧结玻璃体的横断面，其孔隙率为60%，粗孔隙度为60～100μm（放大104倍）;
图1c是将上述烧结玻璃体的横断面放大512倍。
图1d是将上述烧结玻璃体的横断面放大2000倍;
图2a和图2b为反应器操作了四个月后的负载微生物生长的烧结玻璃体（放大200倍和5040倍）;
图3为固定床连续流动反应器示意图;
图4为废水通过量和操作时间的关系曲线图;
图5为生物气体产量和操作时间的关系曲线图。
多孔载体材料是用一种粉末混合物经烧结、冷却并将可溶成份分离后获得的;粉末混合物由细颗粒的可烧结材料和粗颗粒的在高于烧结温度中熔化并从烧结产物中分离熔化出来的物质组成。
孔隙体积和粗孔隙的平均孔隙直径基本上是由可熔出物质的数量和粒度决定的。微孔隙是在可溶物质分离除去之后（硅酸盐）烧结组织壁穿通形成的，其孔隙直径由可烧结材料的粒度决定。
该生物反应器载体材料生产方法的优点在于能同时产生很细和很粗的孔隙。虽然微孔隙由于孔隙细，使液体流通不畅，但可以为微生物的固定提供良好的条件;而粗孔隙则能保证营养物质迅速地输入和代谢产物的连续输出。
联邦德国公开专利说明书DE-OS2839580中介绍的用普通方法生产的玻璃料，或者只有粗孔隙，或者只有细孔隙。所使用的玻璃料和烧结材料的孔隙直径和孔隙体积只能由所用的烧结材料的粒度决定。因此烧结体的粗孔隙壁上不能出现微孔形状的裂痕。
载体具有非常好的固定性质外，还能使在高浓度的生物体能达到较高的活性（这是由于内表面积很大，菌落可以自由进入空腔固定，并在载体的保护之下，无损失地生长，因此也能用于培养难于粘附的种群），也可以通过生产条件有目的地进行结构调节（以适应待固定的不同种类的微生物和待应用液体的性质及流动条件）。除此之外，多孔烧结体还具有足够的机械强度，良好的润湿性以及热稳定性，因此容易消毒。这种载体价值便宜，并且也容易改变成分。
多孔烧结体能用任意的材料，特别是用玻璃，并且可用价格低廉的废品玻璃制造。玻璃对于本发明的应用领域非常合适，因为其中含有对 生物很重要的微量元素。例如：元素镍、钼、铜、钴等。众所周知，尽管玻璃具有普遍的惰性性质，但还是能和周围环境进行一定的离子交换，因此载体材料中含有的微量元素能够作用到微生物上。
本发明所述的微生物和动物细胞的固定是采用具有优良性能的、负荷固定生物材料生长的多孔烧结体进行的，可用于所有这样生物材料同时要利用生物活性和要固定的生物工艺过程。
目前这种多孔烧结体特别适用于厌氧性废水净化，尤其是一些特种废水，例如纤维素工业或者奶酪加工工业的废水，或者淀粉工业和酿造工业的废水。另外本发明所述固定的微生物，还可以用来进行水的脱氮。
食物和药物用物质的生物工艺法制取是本发明的另一个应当例举的应用领域，还可以通过发酵制取初级代谢物。这些固定在多孔烧结玻璃上的微生物可用于生物转化，生物转化可以用在工业规模的生产，例如甾类化合物的转化等等。
固定在多孔烧结体上的微生物的优良性能，首先在烧结玻璃的有从下往上垂直流动的固定床反应器中显示出来。该反应器带有“高位”液体环流（通过被PH值控制的部分再环流）。在制造纤维素中，处理蒸发器中的冷凝液时，将过去一直使用的粗颗粒硬煤换成孔隙率约为60%、孔隙直径为60～120μm的多孔烧结玻璃腊希格环、腊希格环的壁厚2mm，高7mm，其它的条件相同。测定结果效率提高了大约5倍（在同样的净化度下，平均停留时间缩短）。
用具有双重孔隙结构的多孔烧结体固定微生物，不仅可以用于带有能提高液体流动速度的部分再循环固定床反应器，当然也可以用于其他类型的反应器，例如不带部分再循环固定床反应器，或者水平流动式固定床反应器，并可根据流动条件选择合适的粗孔隙;随着液体对载体相对速度的降低，要相应增加粗孔隙的孔隙度。
固定微生物的多孔烧结体也适用于流化床反应器，这时应当选择较 小的粒度（＜1mm）。在所谓“淤浆反应器”（具有位于过滤器壁间的微粒催化剂悬浮液）中要使用孔隙度更小的烧结材料。
具有大内表面的多孔烧结体，有许多液体能自由通过的空腔（空腔壁上有微孔状痕），通过这些空腔使细胞获得足够的营养物质，并能排除分解产物;而且具有微孔的壁结构则能为微生物提供足够粘附机会，这样就能在固定床上使用具有较大外形的载体，并可以减少流动阻力。例如腊希格环的形状就比较合适，它有助于生物气体自反应器中排出。
在使用中应将处于干燥状态的多孔烧结体与细胞悬浮液相接触，使微生物和液体一起被吸入到孔隙内，并固定在里面的微孔壁上。在厌氧过程中，要先将玻璃载体孔隙中的空气通过抽真空或者通过注入惰性气体除掉，以防止氧气将细胞毒化。
连续反应时，在烧结体开始很干净的表面上会生长出微生物层，有时可通过颜色的变化从中辨别出来。
例1，在一个高1.2m，直径为0.12m，工作容积为12升的固定床连续流动反应器（图3）中，填入7.4升立方体形状的烧结玻璃载体（边长各为0.5cm）。载体的孔隙率为60%，粗孔隙的孔隙度为60～100μm，微孔隙的孔隙度平均为1至2μm。
为了开始进行反应，要先流入氩气，使之通过填料层，以便将玻璃载体孔隙内部的空气除掉。然后向反应器内注入微生物悬浮液，该悬浮液适合于纤维素工业中经蒸发冷凝得到的高度污染的废蒸汽冷凝液，每升含有干物质700mg，其量足以充填反应器，然后开始输入废水。在操作时，应随时监视反应器下部和上部的PH值，使循环系统自动地将最高PH值的最大差值控制在0.3PH单位值，这和联邦德国专利说明书P334569/7所介绍的一样。
这种工作方式只允许废水以刚好能被微生物加工的速度通过，其优点是操作过程平稳（没有过度酸化的危险），并且微生物有足够的装载 数量。
开始操作时，停留时间为180小时。以后反应器中废水停留时间的迭代缩短是由PH值调节完成。
图4表示反应器开始工作后，废水通过量与操作时间之间呈线性增长的关系。图5表示生物气体产生量与时间呈函数关系。在该图中同样可以看到生物气体生成的线性增长（约5.5天增加一倍）;当停留时间为12小时时，生物气体产量达51m3/m3反应器容积·天。此时，当体积负荷88kg-CSB/（m3·天）时，消失量为74kg-CSB/（m3·天）。
试验结果见说明书后面的附表1
例2：在同例1一样大小的反应器中填入近8升的腊希格环状的多孔烧结玻璃载体（环的壁厚为2mm，高度为7mm），载体的粗孔隙的孔隙度为60至100μm，微孔隙的孔隙度为1至2μm。按所述方法准备反应器，并按例1所述方法向反应器内加入处理废蒸汽冷凝用的活性很高的微生物悬浮液，在与例1其它条件相同的情况下，废水通过和生物气体生成的增长均较慢。这是因为腊希格环和立方体相比具有较低的装填密度。当然，在工作了大约六个星期以后，腊希格环填料也能相应地达到较高的时空产率。总之，使用腊希格环状载体材料比使用立方形载体优越，因为环形料对固定床内液体的流通和气体的排出更为合适。
例3：在本例中采用了例2中所述的试验设备，并向其中填入7升腊希格环状的玻璃载体材料。试验用的废水是来自酿造厂的清洗完贮罐的废水（“洗罐水”）。这种废水中主要含有糖、醋酸和乙醇。用预先对这些污染物适应过的细菌混合培养物进行细菌接种。
这种“洗罐水”是一种比较“瘦”的废水，其化学需氧量为2.5-3.5kg/m3。
按照前面介绍的操作方法（通过PH值调节装置）启动反应器，停留时间迭代缩短的过程根据醋酸和CSB的测定。
在操作了五个星期之后，停留时间达到7小时，同时减少了94%的化学需氧量。
下表中综合了本例中的一些主要的分解数据。
“洗罐水”的厌氧分解
停留时间（t）    ：    7.6小时
CSBo（输入） ： 2.74kg/m3
CSBe（输出） ： 0.21kg/m3
体积负荷 ： 10.53kgCSB/（m3天）
CSB转换率    ：    93.5%
△CSB ： 9.85kg/（m3·天）
生物气体产量 ： 7.0m3/（m3·天）
在反应器中相对较短的停留时间7.6小时实质上意味获得高的时空产率和93.5%的CSB转换率。通过上述厌氧分解“瘦”型废水的良好结果可以清楚地看到固定在多孔烧结玻璃载体中的生物体的有效作用。
表1：废蒸汽冷凝液在填有烧结玻璃
载体的固定床连续流动反应器中的厌氧分解
（载体各边长为0.5cm的立方体）
反应器体积    ：    12升
载体体积    ：    7.4升
CSB入（物料输入） ： 44.0kg/m3
CSB出（物料输出） ： 7.0kg/m3
停留时间    ：    12小时
生物物质浓度    ：    12.44G/升（按氮分析计）
CSB转换率    ：    84%
体积负荷 ： 88.0kg-CSB/（m3·天）
淤浆负荷    ：    7.0kg-CSB/（kg·天）
CSB-消失量 ： 74.0kg（m3·天）
淤浆活性    ：    5.9kg-CSB/（kg·天）
生物气体产量 ： 51.0m3/（m3·天）

Claims (10)

1、适宜于固定微生物和具有多孔无机烧结体的载体，其特征在于该载体具有双重孔隙结构，在载体内部与外部周围能够进行液体和气体自由交换的由孔隙率限定的贯通式粗孔隙以及与粗孔隙壁内相连通的具有微生物或细胞大小的孔径的微孔隙，该载体的开孔总体积为35%至85%，其中20%至80%的粗孔隙具有第一平均孔径20至500μm，15%至5%的微孔隙具有第二平均孔径1至10μm。
2、按权利要求1的载体，其特征在于开孔总体积为50%至70%，以55%至65%为佳，≤10μm的微孔隙占10%至5%。
3、按权利要求1的载体，其特征在于粗孔隙的第一平均孔径为50至150μm。
4、按权利要求1的载体，其特征在于该载体具有腊希环的形状。
5、按权利要求1的载体，其特征在于该载体上覆盖着微生物或细胞材料。
6、制备权利要求1至5所述载体的方法，该载体具有适用于固定微生物的20-500μm的粗孔隙和1-10μm的微孔隙，其特征在于该方法的步骤为：
将粒度为≤40μm，优择粒度为≤20μm可烧结的细颗粒材料和粒度为20-600μm可溶解的粗颗粒物质的粉末混合物进行烧结，所述可溶解的粗颗粒物质在高于烧结温度下融熔并且是从烧结制品中通过溶解提取得到的;
将可溶解的物质与冷却的烧结产品进行分离。
7、按权利要求6的方法，其特征在于用作所述由烧结产品中提取的可溶解粗颗粒物质是盐类。
8、按权利要求6的方法，其特征在于该可烧结材料尤其以硅酸盐材料为佳。
9、按权利要求6的方法，其特征在于该可烧结材料是玻璃。
10、权利要求1至5的载体应用于固定微生物和动物细胞，尤其是固定厌氧过程中的微生物或动物细胞，固定床连续流动反应器或流化床反应器，造纸或纤维素工业废水的净化处理，含有淀粉的废水和酿造厂废水的降解处理，物质的生物工艺的生产，食物和药物的生物工艺的生产，或发酵产品的生产。
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