CN100593410C - 全灵芝孢子油的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种全灵芝孢子油的制备方法，属生物技术领域。本发明选用灵芝孢子粉、灵芝粉为原料，经酶法破壁、湿法制粒，超临界CO2萃取、离心精制后得到淡黄色油状物，具有增强免疫力功能、对肝损伤具有辅助保护作用、抑制肿瘤细胞生长等多种生理功能。本发明制得的全灵芝孢子油，除了含有灵芝孢子萃取物，还增加了灵芝子实体、灵芝菌丝体的超临界CO2萃取物，其有效成分三萜类化合物的种类更加齐全。与常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油相比，全灵芝孢子油抑制肿瘤细胞生长效果提高一倍，并且明显降低了过氧化值，解决灵芝孢子油容易氧化的问题，提高产品品质。
Description
[所属技术领域]
本发明涉及一种全灵芝孢子油的萃取工艺，特别涉及一种以灵芝孢子粉、灵芝粉为原料经酶法破壁、超临界CO2萃取全灵芝孢子油的方法，属于生物技术领域。
[背景技术]
灵芝[Ganoderma lucidum(Curtis：Fr)P.Karst.]，是担子菌纲非褶菌目灵芝科灵芝属药用真菌，是我国传统的名贵药材。灵芝孢子是灵芝的种子，在灵芝生长成熟期时从灵芝菌盖背面弹射而出，具有灵芝的全部遗传活性物质，是灵芝的精华。大量文献报导，灵芝孢子具有增强免疫力、护肝、抗病毒、调节血脂以及对神经、心血管和呼吸系统具有调节改善作用。在光学显微镜下，灵芝孢子呈卵圆形，大小为5～8μm，孢内有1～2个油滴。灵芝孢子具有双层细胞壁，其主要成份为几丁质、木质素和纤维素、Si、Ca、Fe、Mg、Al等，使得孢壁十分结实坚硬，可耐酸、耐碱、耐压、耐温，对消化酶也非常稳定，孢内有效物质被包覆而不易提取。为了提高对灵芝孢子的生物利用率，对灵芝孢子进行有效破壁，而后萃取孢子内含物十分必要。目前最常见的灵芝孢子破壁方法是机械方法及酶法，主要是机械方法。通过碾压、挤压、喷射粉碎、气流粉碎、撞击等机械作用可以破坏灵芝孢子壁，使用的超微粉碎设备有球磨机、高速气流机、碾压机、喷射机等。机械破壁方法简单易行、破壁率高，易于规模化生产，可是机械设备结构复杂、价格及运行成本较高，而且后处理不当时容易氧化变质。另一种破壁方法是酶法，王存雪等人(2002)报导了“一种灵芝孢子酶破壁方法”：灵芝孢子在35℃用水浸泡12小时，使孢子吸水膨胀，外部组织软化后加入1.5％的破壁酶液(纤维素酶、蜗牛酶等)，35℃浸泡酶解3小时、晾干，最后用细砂磨研磨10～12分钟，可达到95％的破壁率。夏志兰等(2005)报导的“灵芝孢子粉生物酶破壁方法技术的研究”，单独使用超声波处理灵芝孢子5分钟后，破壁率为40％左右；在3％溶壁酶浓度下38℃处理4小时后再经超声波处理5分钟，破壁率可达98％。ZL 00130883.1公开了一种激活灵芝孢子产生生理活性物质的方法，使用水或生物培养液浸泡灵芝孢子0.5～8h；接着在相对湿度65％～98％、温度20～48℃条件下培养0.5～24h；然后采用几丁质酶、纤维素酶的酶降解作用使孢子壁失去韧性并脆化；或采用工业超微粉碎、碾压、磨碎机械进行破壁破壁率可达99％。
破壁灵芝孢子中的主要成分为三萜类化合物及脂肪酸等，均为亲脂性的碳氢化合物和类脂有机化合物，能溶于CHCl3、CH3OH等有机溶剂，在超临界CO2流体中有较佳溶解性。运用超临界CO2流体萃取工艺，因为CO2无色、无味、无毒，不易燃易爆，避免了有机溶剂提取的危险，使用较安全，而且萃取结束后无溶剂残留问题；另外萃取温度较低，可避免常规提取过程可能产生的分解、形成未知化合物沉淀等反应，适合于灵芝孢子有效成分的萃取。专利CN1194079C公开了一种灵芝孢子油超临界CO2萃取制备方法，将灵芝孢子膨化、制粒后经超临界CO2萃取孢子油，该方法采用了灵芝孢子膨化过程，其中膨化温度较高(达80～140℃)，加速了破壁后灵芝孢子内油脂类物质的氧化及酸败过程，影响了孢子油产品的品质。专利CN1114446C也公开了一种灵芝孢子有效活性物质的萃取方法，涉及将灵芝孢子破壁、超临界CO2萃取过程。但超临界CO2流体萃取压力为5MPa～60MPa、萃取温度为32～85℃，CO2流体流量为5kg/h～80kg/h，在实际生产中难以在如此宽泛的工艺条件下得到高纯度和高出油率的孢子油产品。专利CN 1094766C公开了一种灵芝孢子油的超临界萃取加工方法，涉及将灵芝孢子与水、明胶或淀粉的混合物为粘合剂制粒成型后进行超临界萃取。涉及的超临界萃取温度、压力较宽，生产时难以掌握好工艺条件制得高纯度孢子油产品，同时萃取时间也长达35小时，难以真正实施工业化。专利CN 1239100C也公开了一种灵芝孢子油及其制备方法和用途，涉及以破壁孢子为原料，用乙醇溶液制粒干燥后经超临界CO2萃取孢子油。
目前，超临界CO2萃取孢子油均以机械破壁灵芝孢子为原料，或采用未破壁孢子经高温膨化后再制粒、萃取，灵芝孢子机械破壁过程就已部分氧化或酸败，影响萃取后的孢子油的品质，降低其生理活性。
[发明内容]
本发明的目的是提供一种具有生理活性的全灵芝孢子油的制备方法。
本发明采用的技术方案是：按重量百分比取50～100％的灵芝孢子与0～50％的灵芝粉为原料，经酶法破壁、一步制粒、超临界CO2萃取、离心精制后，得到淡黄色油状物。
具体的制备过程是：
1.酶法破壁过程。按重量百分比取50～100％灵芝孢子、0～50％灵芝粉、0～10％小米、0～10％高梁、0～5％CaCO3、0～5％蔗糖、0～1％维生素B1混合，加入1.0～1.5倍水，混合均匀，用HCl或NaOH调节pH至5.0～6.5后，置高压消毒锅以0.15MP压力消毒1.5～2.5小时。然后取出待冷却后在无菌室操作，接入灵芝固体菌种或液体菌种，在15-35℃条件下培养，至菌丝长满培养料。利用菌丝生长过程中不断分泌的纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等多种复合酶温和酶解灵芝孢子壁。待灵芝菌丝长满培养料后0～60天，取出培养产物，烘干、粉碎。为了进一步提高破壁率，粉碎设备可采用球磨机、研磨混炼机、碾压机、高速气流机等超微粉碎设备，使灵芝孢子破壁率达95％以上。
2.制粒。制粒的目的是使物料在超临界CO2流体萃取过程中不易跑进管道，以防造成设备超压。以纯水作为润湿剂，用一步制粒机将酶法破壁后灵芝孢子湿法制粒，控制干燥温度在30～50℃，干燥时间2～4h，获得水分小于5％颗粒。
3.超临界CO2萃取。将制粒后的灵芝孢子放入超临界CO2萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为20～40MPa、萃取温度为20～50℃、CO2流体流量为60～150L/h、萃取时间0.5～6h；一级分离压力为8～10MPa、分离温度为25～45℃；二级分离压力为5～8MPa、分离温度为30～50℃；萃取过程还可以加入夹带剂，如无水乙醇、乙酸乙酯等，加入量为投料量的5～100％。
4.精制。收集萃取物，过滤，除去混入萃取物中的少量孢子粉杂质，并进一步经5000～20000r/min高速离心机离心去除水分，得到澄清、透亮的淡黄色油状物，出油率10～25％。
将本发明的全灵芝孢子油与常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油进行抑制肿瘤细胞生长效果比较和过氧化值比较。样品：(1)全灵芝孢子油：按上述方法制备；(2)常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油：灵芝孢子用研磨混炼机粉碎30～40分钟，制粒、萃取、精制过程与全灵芝孢子油相同。
1.全灵芝孢子油与常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油抑制肿瘤细胞生长效果比较：
样品处理：全灵芝孢子油及从机械破壁孢子萃取的孢子油分别用甘油溶液乳化至浓度为8uL/mL。人恶性乳腺癌细胞株(MT-1)由加拿大多伦多大学杨柏华教授实验室提供。肿瘤细胞培养液：在DMEM培养基中加入10％已灭活的胎牛血清FBS，以及100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素。
实验方法：(1)选用12孔细胞培养板，MT-1细胞用上述肿瘤细胞培养液制成悬液，肿瘤细胞浓度为1.0×105/mL，接种量1mL，于37℃5％CO2浓度培养箱培养5h。(2)将全灵芝孢子油样品溶液加入MT-1培养板的量为0、40、80、120、160uL，接着37℃5％CO2浓度培养箱培养2天。将普通灵芝孢子油样品溶液加入MT-1培养板的量为0、40、80、120、160、200、240、280uL，接着37℃5％CO2浓度培养箱培养2天。(3)从CO2培养箱取出培养板，吸去培养液，用Diff-Quik Differential Stainning Set试剂染色，在200倍显微镜下观察活的贴壁肿瘤细胞数量，并进行细胞计数和显微拍照。
实验结果：见附图1及附图2，随着灵芝孢子油实验浓度的升高，肿瘤细胞的生长受抑制，存活肿瘤细胞数量逐渐减少。全灵芝孢子油在160uL实验量时的抑制肿瘤细胞生长效果与机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油在280uL实验量时的效果相当，可见，本发明的全灵芝孢子油抑制肿瘤细胞生长效果明显高于常规灵芝孢子油。
2、过氧化值比较：
过氧化值按GB/T5009.37规定的方法测定。本发明的全灵芝孢子油过氧化值在0.08～0.10(g/100g)，而常规灵芝孢子油过氧化值在0.13(g/100g)以上。全灵芝孢子油过氧化值明显低于常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油，显示：本发明的全灵芝孢子油具有更强抗氧化能力。
本发明的全灵芝孢子油还具有增强免疫、护肝作用，可作为保健、药用、高档化妆品的原料。下面通过药效实验证明本发明所提供的全灵芝孢子油的用途。
样品：以上述工艺获得的全灵芝孢子油，在符合GMP条件下制备全灵芝孢子油软胶囊。为了检测全灵芝孢子油的功效，以成人体重60kg计，推荐量为0.033g/kg BW。
组别与剂量：设玉米油对照组和低、中、高三个剂量组，剂量如下：低剂量组0.17g/kg BW，相当于推荐日服量的5倍；中剂量组0.33g/kg BW，相当于推荐日服量的10倍；高剂量组1.0g/kgBW，相当于推荐日服量的30倍。
动物：SPF级昆明种雌性小白鼠，6～8周龄(体重18～22g)
给药途径：每天按0.1ml/10g BW量灌胃动物给予受试物。
实验结果：
1.全灵芝孢子油软胶囊对小鼠的迟发型变态反应的影响(见表1)
表1 全灵芝孢子油软胶囊对小鼠的迟发型变态反应的影响
2.全灵芝孢子油软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应(见表2)
表2 全灵芝孢子油软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应
3.全灵芝孢子油软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响(见表3)
表3 全灵芝孢子油软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响
4.全灵芝孢子油软胶囊对受试动物血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的影响(见表4、5)
表4 全灵芝孢子油软胶囊对血清谷丙转氨酶水平的影响
注：1.空白对照组和CCl4对照组血清谷丙转氨酶水平经对数转换后，采用T检验，t值＝-27.750，P＜0.01。
2.各剂量组与CCl4对照组血清谷丙转氨酶水平经对数转换后，采用方差分析，F值＝21.126，P＜0.01。
3.ΔΔ表示CCl4对照组与空白对照比较P＜0.01；**表示各剂量组与CCl4对照组比较P＜0.01。
表5 全灵芝孢子油软胶囊对血清谷草转氨酶水平的影响
注：1.空白对照组和CCl4对照组血清谷草转氨酶水平经对数转换后，采用T检验，t值＝-15.561，P＜0.01。
2.各剂量组与CCl4对照组血清谷草转氨酶水平经对数转换后，采用方差分析，F值＝19.876，P＜0.01。
3.ΔΔ表示CCl4对照组与空白对照比较P＜0.01；**表示各剂量组与CCl4对照组比较P＜0.01。
5.全灵芝孢子油软胶囊对受试动物肝脏病变类型评分的影响(见表6)
表6 全灵芝孢子油软胶囊对受试动物肝脏病变类型评分的影响
注：1.肝脏气球样变、脂肪变性、水样变性及细胞坏死得分为等级资料，采用秩和检验。
2.ΔΔ表示CCl4对照组与空白对照比较P＜0.01；*表示各剂量组与CCl4对照组比较P＜0.05，**表示各剂量组与CCl4对照组比较P＜0.01。
6.结论
小鼠经口每日分别给予全灵芝孢子油软胶囊0.17、0.33、1.00g/kg BW，相当于推荐日服量的5、10、30倍，共4周，结果显示：
(1)绵羊红细胞诱导的小鼠迟发性变态反应试验和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化增殖试验阳性，该样品具有增强细胞免疫功能作用；
(2)受试验动物NK细胞活性试验阳性，该样品具有增强NK细胞活性作用；
(3)全灵芝孢子油软胶囊各剂量组血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平与CCl4对照组比较降低，差异有显著性意义，ALT与AST结果阳性。
(4)全灵芝孢子油软胶囊各剂量组肝脏病理组织学变化与CCl4对照组比较减轻，差异有显著性意义，实验动物肝脏病理结果阳性。
依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003版的判定标准判断，全灵芝孢子油软胶囊具有增强免疫力功能，对化学性肝损伤具有辅助保护作用。
灵芝的生长经历了灵芝孢子、灵芝菌丝体及灵芝子实体三个发育阶段，这三个发育阶段所含成分及含量各不相同，具备先天的合理性。本发明制得的全灵芝孢子油，以灵芝孢子、灵芝粉为原料经生物酶法破壁处理后，经超临界CO2萃取技术制得。酶法破壁是通过利用灵芝菌丝生长过程中分泌的多种活性酶酶解灵芝孢子壁，过程温和，对孢内有效成分损失小，不易氧化变质，而且还增加了灵芝子实体及灵芝菌丝体成分，因此，本发明的全灵芝孢子油与常规机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油相比，除了含有灵芝孢子萃取物，还增加了灵芝子实体、灵芝菌丝体的超临界CO2萃取物，其有效成分三萜类化合物的种类更加齐全，强化了灵芝的功能。因此，本发明的全灵芝孢子油具有明显增强免疫力功能、对肝损伤具有辅助保护作用、抑制肿瘤细胞生长等多种生理功能；而且其抑制肿瘤细胞生长效果提高一倍，并且明显降低过氧化值，解决灵芝孢子油容易氧化的问题。
[附图说明]
附图1：本发明的全灵芝孢子油对人恶性乳腺癌细胞MT-1的生长抑制作用。随着全灵芝孢子油实验浓度的升高，肿瘤细胞的生长受抑制，存活肿瘤细胞数量逐渐减少，在160uL实验量时只有极少肿瘤细胞数存活。
附图2：机械破壁孢子萃取的灵芝孢子油对人恶性乳腺癌细胞MT-1的生长抑制作用。随着灵芝孢子油实验浓度的升高，肿瘤细胞的生长受抑制，存活肿瘤细胞数量逐渐减少，在280uL实验量时只有极少肿瘤细胞数存活。
[具体实施方式]
实施例1：全灵芝孢子油的制备方法1
(1)酶法破壁。取50％灵芝孢子、30％灵芝粉、10％小米、10％高梁混合(小米、高梁预先浸泡过夜、洗净)，加入1.2倍纯水，混合均匀，用HCl调节pH至5.5后置高压消毒锅0.15MP压力消毒2小时。待冷却后在无菌室操作，接入赤灵芝菌种，在30℃条件下培养。待灵芝菌丝长满培养料后20天，取出培养产物，烘干、球磨机粉碎10分钟。
(2)制粒。以纯水作为润湿剂，用一步制粒机将酶法破壁后灵芝孢子制粒，控制干燥温度40℃，干燥时间2.5h，获得水分小于5％20目颗粒。
(3)超临界CO2萃取。将制粒后的灵芝孢子放入超临界CO2萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为20MPa、萃取温度为45℃、CO2流体流量为60L/h、萃取时间6h；一级分离压力为10MPa、分离温度为25℃；二级分离压力为8MPa、分离温度为30℃。
(4)精制。收集萃取物，滤纸过滤，除去混入萃取物中的少量孢子粉杂质，并进一步经5000r/min高速离心机离心，得到澄清、透亮的淡黄色油状物。
实施例2：全灵芝孢子油的制备方法2
(1)酶法破壁过程。按重量比将70％灵芝孢子、20％灵芝粉、5％小米(预选浸泡过夜、洗净)、2％CaCO3、2.5％蔗糖、0.5％的复合维生素B1混合，加入1.2倍纯水，混合均匀，用HCl调节pH至5.5后置高压消毒锅0.15MP压力消毒2小时。待冷却后在无菌室操作，接入赤灵芝菌种，在25℃条件下培养。待灵芝菌丝长满培养料后40天，取出培养产物，烘干、研磨混炼机粉碎10分钟，显微镜下血球计数板计数，破壁率95％以上。
(2)制粒。以纯水作为润湿剂，用湿法制粒机将酶法破壁后灵芝孢子制粒，控制干燥温度30℃，干燥时间3.5h，获得水分小于5％60目颗粒。
(3)超临界CO2萃取。将制粒后的灵芝孢子放入超临界CO2萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为25MPa、萃取温度为45℃、CO2流体流量为80L/h、萃取时间3h；一级分离压力为8MPa、分离温度为30℃；二级分离压力为5MPa、分离温度为40℃。
(4)精制。收集萃取物，真空抽滤，除去混入萃取物中的少量孢子粉杂质，并进一步经10000r/min高速离心机离心，得到澄清、透亮的淡黄色油状物。
实施例3：全灵芝孢子油的制备方法3
(1)灵芝孢子酶法破壁。取90％灵芝孢子、10％灵芝粉混合，加入1.2倍纯水，混合均匀，置高压消毒锅0.15MP压力消毒2小时。待冷却后在无菌室操作，接入灵芝颗料菌种，在20℃条件下培养。待灵芝菌丝长满培养料后，取出培养产物，烘干、球磨机粉碎20分钟。
(2)制粒。以纯水作为润湿剂，用湿法制粒机将酶法破壁后灵芝孢子制粒，干燥温度45℃，干燥时间2h，获得水分小于5％20目颗粒。
(3)超临界CO2萃取。将制粒后的灵芝孢子放入超临界CO2萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为40MPa、萃取温度为50℃、CO2流体流量为150L/h、萃取时间2h，加入乙酸乙酯作为夹带剂，加入量为投量料的20％；一级分离压力为8MPa、分离温度为45℃；二级分离压力为8MPa、分离温度为40℃。
(4)精制。收集萃取物，真空抽滤，除去混入萃取物中的少量孢子粉杂质，并进一步经20000r/min高速离心机离心，得到澄清、透亮的淡黄色油状物。
实施例4：全灵芝孢子油的制备方法4
(1)酶法破壁过程。取100％灵芝孢子加入1.15倍纯水，混合均匀，用HCl调节pH至6.0，置高压消毒锅0.15MP压力消毒2小时。待冷却后在无菌室操作，接入赤灵芝液体菌种，在28℃条件下培养。待灵芝菌丝长满培养料后60天，取出培养产物，烘干、粉碎。
(2)制粒。以纯水作为润湿剂，用湿法制粒机将酶法破壁后灵芝孢子制粒，控制干燥温度35℃，干燥时间3h，获得水分小于5％40目颗粒。
(3)超临界CO2萃取。将制粒后的灵芝孢子放入超临界CO2萃取装置的萃取釜中，使其与超临界流体充分接触、溶解、萃取、分离，其工艺条件设定如下：萃取压力为28MPa、萃取温度为40℃、CO2流体流量为90L/h、萃取时间4h；一级分离压力为9MPa、分离温度为35℃；二级分离压力为7MPa、分离温度为45℃。
(4)精制。收集萃取物，滤纸过滤，除去混入萃取物中的少量孢子粉杂质，并进一步经8000r/min高速离心机离心，得到澄清、透亮的淡黄色油状物。
Claims (5)
1、一种全灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：按重量百分比以50～100％灵芝孢子粉、0～50％灵芝粉、0～10％小米、0～10％高梁、0～5％CaCO3、0～5％蔗糖、0～1％维生素B1为原料，向原料中加入1.0～1.5倍水，混合均匀，置高压消毒锅消毒灭菌，待冷却后在无菌室操作，接入灵芝菌种，在15-35℃条件下培养，待灵芝菌丝长满培养料后0-60天，取出培养产物，烘干、粉碎后以水为溶剂湿法制粒，超临界CO2萃取、离心精制后，得到淡黄色油状物。
2、权利要求1所述的全灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：粉碎设备可采用球磨机、研磨混炼机、碾压机、高速气流机超微粉碎设备。
3、权利要求1所述的全灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：制粒时采用一步制粒法，以纯水作为润湿剂，用湿法制粒机将酶法破壁后灵芝孢子制粒，控制干燥温度在30～50℃，干燥时间2～4h，获得水分小于5％颗粒。
4、权利要求1所述的全灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：超临界CO2萃取压力为20～40MPa、萃取温度为20～50℃、CO2流体流量为60～150L/h、萃取时间0.5～6h；一级分离压力为8～10MPa、分离温度为25～45℃；二级分离压力为5～8MPa、分离温度为30～50℃。
5、权利要求1所述的全灵芝孢子油的制备方法，其特征在于：超临界CO2萃取过程中加入无水乙醇、乙酸乙酯夹带剂，加入量为投料量的5～100％。
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