CN100428939C

CN100428939C - 外用组成物

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Publication number: CN100428939C
Application number: CNB2004800176910A
Authority: CN
Inventors: 前田满; 中尾正宏; 深见治一
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2024-06-25
Also published as: KR20060033736A; HK1083074A1; WO2005000319A1; AU2004251549B2; EP1640025A1; JPWO2005000319A1; CA2531017A1; ATE491480T1; AU2004251549A1; US20070269454A1; CN1812795A; DE602004030568D1; EP1640025A4; JP4881004B2; TW200503773A; EP1640025B1; TWI329024B; US7781409B2

Abstract

本发明目的为提供皮肤渗透性好的皮肤外用组成物，其含有稳定性好、在生物体内被持续利用、抗氧化作用强、皮肤刺激性小的抗坏血酸衍生物。其特征在于，它含有式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯和曲霉或其处理物。

Description

外用组成物

技术领域

本发明涉及皮肤外用剂，更详细地说，涉及对皮肤具有显著美白效果如可防止日晒后产生色素沉着等的化妆品、医药外用品等皮肤外用剂。

背景技术

在医药品、医药外用品(如软膏剂)及化妆品(如乳液、雪花膏、化妆水、面膜、凝胶、粉底)等皮肤外用剂中，为了赋予其特定的药效，通常添加药效成分。

例如，为了防止日晒等引起的皮肤变黑和黑色素沉积过多产生的褐斑、雀斑等现象，可添加诸如异极矿等或L-抗坏血酸类、对苯二酚糖苷、肉桂醛、胎盘素等美白成分。

其中，抗坏血酸类作为稳定性高、可促进胶原蛋白合成、清除活性氧、抑制端粒基因缩短、诱生皮肤组织的极佳美白因子，被广泛地应用于医药品、化妆品、食品、饲料等中。另一方面，由于一般的L-抗坏血酸衍生物易氧化分解，在制剂中不稳定，因此不能直接使用。以其稳定化为目的的提案有：至少含有一种碱离子水中的抗坏血酸衍生物或其盐的组成物(专利文献1)、L-抗坏血酸-2-磷酸盐(专利文献2)、α-糖基-L-抗坏血酸(专利文献3、专利文献4)。但其作用、效果并不另人满意。

即存在这样的问题：虽然确保了其稳定性，但尤其当仅使用这些抗坏血酸类及其衍生物的盐类时，其吸收性不好。

还存在这样的问题：虽然采用诸如通过电排斥力使离子性物质向皮肤深部渗透的离子导入法(离子导入仪)、空穴抑制型超声波导入法(超声波导入仪)、IPL(闪频可见光)等使抗坏血酸衍生物易于渗透进入皮肤的方法，但需要特殊的仪器。

另一方面，外用剂组成物中含有的经皮吸收促进剂已知有：如专利文献5中所示的二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、甲基癸基亚砜等，其他还有如专利文献6中所示的与低级烷基酰胺形成的组合物(如二甲基乙酰胺与乙醇、异丙醇、棕榈酸异丙酯形成的组合物)、如专利文献7中所示的2-吡咯烷酮与适当的油性物质形成的组合物，上述油性物质如直链脂肪酸与碳原子数为2～6的醇形成的酯。但这些公知的经皮吸收促进剂均对皮肤有刺激性，有可能引起皮肤发红和水肿等。

专利文献1：日本特开2000-351905号公报

专利文献2：日本特开2000-143485号公报

专利文献3：日本特开2002-53450号公报

专利文献4：日本特开2002-121115号公报

专利文献5：美国专利第3551554号说明书

专利文献6：美国专利第3472431号说明书

专利文献7：美国专利第4017641号说明书

发明内容

本发明提供皮肤渗透性好的皮肤外用组成物，其含有稳定性好、在生物体内可被持续利用、抗氧化作用强、皮肤刺激性小的抗坏血酸衍生物。

本发明者们对上述以往的技术问题进行了种种研究后，成功研制出新型化合物2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸、其盐及其酯(以下也简称为本发明的抗坏血酸衍生物)，发现其稳定性好、在生物体内可被持续利用、抗氧化作用强、皮肤刺激性小。本发明者们还发现本发明抗坏血酸衍生物可用作化妆品或医药外用品等皮肤外用剂。此外，为了改善本发明抗坏血酸衍生物作为皮肤外用剂使用时的皮肤渗透性，本发明者们进行了种种研究，意外发现本发明抗坏血酸衍生物与曲霉或其处理物组合使用时，其皮肤渗透性得到显著改善。即发现了曲霉或其处理物可提高本发明抗坏血酸的皮肤渗透性。皮肤由最外层约0.01mm的角质层、角质层下约0.1mm的表皮及表皮下约0.1mm～1.3mm的真皮构成，即使将抗坏血酸或抗坏血酸衍生物用于皮肤，其向皮肤组织的渗透转移也不一定好。但是，如果将本发明抗坏血酸衍生物与曲霉或其处理物的组合用于皮肤表面时，本发明抗坏血酸衍生物被迅速吸收至真皮层，在真皮层被缓慢分解成维生素C并长时间释放出维生素C，生物体内的利用率高。本发明者们还研究了本发明新型化合物2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的活性，结果发现与2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸相比其稳定性提高了，且在生物体内可被持续利用等，作为前体维生素C极为有用。

即，本发明涉及：

(1)一种外用组成物，其特征在于，它含有式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯和曲霉或其处理物；

[化1]

(2)上述(1)所述的组成物，其特征在于，其为化妆品或医药外用品；

(3)上述(1)或(2)所述的组成物，其特征在于，上述(1)中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸是从植物体提取出来的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸；

(4)上述(3)所述的组成物，其特征在于，植物体为茄科植物；

(5)上述(3)或(4)所述的组成物，其植物体为枸杞、枸杞的鲜果或干燥果实；

(6)上述(1)～(5)中任意一项所述的组成物，其特征在于，曲霉属于曲霉属(Aspergillus)；

(7)上述(1)～(6)中任意一项所述的组成物，其特征在于，曲霉属于米曲霉(Aspergillus oryzae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus awamori)；

(8)一种配套组合物，其特征在于，含有上述(1)中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯的组成物与含有曲霉或其处理物的组成物的配套组合物；

(9)一种组成物，其特征在于，含有上述(8)所述配套组合物用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯的组成物；

(10)一种皮肤渗透增强剂，其特征在于，其为以含有曲霉或其处理物为特征的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯皮肤渗透增强剂。

本发明可提供皮肤渗透性好的皮肤外用组成物，其含有稳定性好、在生物体内可被持续利用、抗氧化作用强、皮肤刺激性小的抗坏血酸衍生物。

附图说明

图1显示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对紫外线B波(UVB)照射引起的人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)死亡的保护作用。

图2显示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对人皮肤角质形成细胞的细胞内抗坏血酸浓度的影响。

图3显示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对人真皮成纤维细胞(NHDF)胶原蛋白合成的促进作用。

具体实施方式

本发明中使用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的制造方法有从植物或其处理物提取的方法、化学合成或酶法等。从植物提取的方法是从茄科植物或其处理物，特别是从枸杞、枸杞的鲜果或干燥果实提取。下面举例说明本发明抗坏血酸衍生物及含有本发明抗坏血酸衍生物的组成物的优选制造方法。

本发明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的合成中间体为2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。该中间体为2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸可按下述步骤合成。即，按文献已知的方法(J.Med.Chem.，31，793，1988)，将市售5，6-O-异亚丙基抗坏血酸的3位羟基选择性苄醚化，得到3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸。将该3-O-苄基化合物作为配基，按一般的糖基化反应使其β-糖苷化，可得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸。例如，将(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)碳酸酯(小村啓，东京工业大学博士论文，1977年)与3-O-苄基化合物同时在非极性溶剂中或无溶剂存在下于100℃～200℃温度下加热制得。碳酸酯如烷基、卤代烷基、或可取代的芳基碳酸酯。或者，可通过(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)卤化物在三氯甲烷、二氯甲烷等卤代烷溶剂或苯、甲苯等芳香烃溶剂中，在汞盐或银盐等存在下，加脱水剂反应制得。(Lodd’s Chemistry of CarbonCompounds IF，320，1967，Elsvier)

2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸的异亚丙基可在酸催化剂下水解除去。例如，在30％～80％的乙酸水溶液中，于40℃～100℃下加热。或在丙酮、甲乙酮等中，在对甲苯磺酸的存在下，以室温至回流温度加热。或其中加入水使其进行同样的反应。

2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-苄基抗坏血酸的苄基可通过一般的氢解作用除去。例如，在乙酸、乙醇等质子性极性溶剂中，或在苯、甲苯、乙酸乙酯等非极性溶剂中，以载钯炭或钯黑、铂炭、铂黑等为催化剂，在氢存在下可进行脱苄基化。

上述脱保护基反应的顺序也可以倒过来。即，可先将2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸脱苄基后，再在酸催化剂的存在下将得到的2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸脱异亚丙基。

这样，就可制得上述中间体2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。

下面说明通过上述中间体来化学合成2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的方法。

将2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的酰基进行碱水解，可得到2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。碱可用苛性钠、苛性钾等的水溶液，或碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠等碳酸盐水溶液，或甲醇钠等金属醇化物。上述这些溶液中，为了使原料2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸溶解，也可采用甲醇、乙醇等醇类混合溶液。最适反应温度为0℃至室温。反应液用盐酸、硫酸或阳离子交换树脂等中和。用盐酸或硫酸等中和时需要除去生成的盐，用阳离子交换树脂中和时为了吸附钠离子和钾离子等不需要进行脱盐操作。中和后的反应液经冷冻干燥或减压浓缩，可制得目标化合物。还可以根据目的，用柱色谱精制。

下面说明从枸杞中提取含2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的提取物的制造方法。

将枸杞的鲜果或干燥果实(枸杞子)直接或粉碎后浸渍在热水或有水乙醇中，经固液分离得到的提取液通过减压浓缩或冷冻干燥或喷雾干燥，可得到含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的提取物。作为优选，浸渍时乙醇浓度为10％～95％，浸渍天数为3～7天。枸杞子提取物中2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的含量为0.86％～1.2％，若按下述方法制造，可得到含量更高的组成物。即，将枸杞子提取物溶于蒸馏水或，以原料的5～50倍量，优选为原料的8～10倍量的蒸馏水将浸渍液稀释后，使其通过Dow化学公司生产的商品名为Dowex1-X8或Rhom&Hass公司生产的商品名为Amberlite IRA-400等强碱性阴离子交换树脂后，将该物质吸附。充分水洗后，用乙酸进行阶段洗脱或浓度梯度洗脱，得到含该物质的组分。该组分经减压浓缩或冷冻干燥除去乙酸，可制得2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的含量约为30％～50％的组成物。

下面说明通过酶法制造含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的组成物的方法。

对市售酶制剂的生成进行了努力研究，结果发现纤维素酶「小野塚」、泛纤维素酶BR(养乐多药品工业)、纤落新(阪急共荣物产)、纤维素酶(Sigma)、β-葡萄糖苷酶(东洋纺)、β-葡萄糖苷酶(Nakalai tesc)酶制剂具有β-葡萄糖基转移活性。本发明中使用的糖转移酶只要是作用于含有β-葡萄糖基的化合物和含有抗坏血酸的溶液，通过糖转移反应合成2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的糖转移酶即可，其来源、种类不受限定，但从收率上看，优选为来自Trichoderma属的纤维素酶、来自杏仁的β-葡萄糖苷酶。

在转移酶反应中，纤维素二糖及抗坏血酸的浓度尽量高，优选为0.3M及0.2M。纤维素二糖作为酶基质，也可将其他含有β-葡萄糖基的化合物如纤维素、羧甲基纤维素等高分子葡聚糖与适当的水解酶组合后作为酶基质使用。若将各酶固定化形成酶反应器，可高效生产2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。另一方面，作为转移反应受体的抗坏血酸，从反应中的稳定性、转移收率上看，以游离的抗坏血酸作为优选，但抗坏血酸的碱金属盐或碱土金属盐等抗坏血酸盐或其混合物也可以。还发现游离异抗坏血酸及异抗坏血酸盐也同样可作为转移反应的受体。因此，糖转移反应中的抗坏血酸及抗坏血酸衍生物可根据目的来使用，但通常不仅使用游离抗坏血酸，根据需要可采用抗坏血酸钠、抗坏血酸钙等。

酶反应在p H值为2～8下进行，考虑到酶的最适pH值，优选为pH值保持在4～6。反应温度为20℃～60℃，考虑到酶的稳定性及最适温度，优选为温度控制在30℃～40℃。酶添加量优选为每克纤维素二糖20～400个酶单位(1个单位是指1分钟内使1μmol对硝基苯酚游离所需要的酶量)。酶可以一次性添加，也可用高效液相色谱法等一边监测反应，一边分多次添加。还可通过合适的树脂载体如离子交换树脂、疏水树脂等将酶固定化形成酶反应器。反应时间1～4天就足够，但也可一边监测反应，一边决定反应终止的时间。

反应终止后，生成的抗坏血酸衍生物可通过膜分离、离子交换柱色谱法、活性炭柱色谱法等一般的分离方法分离。例如可用键合了磺酸基的苯乙烯-二乙烯交联共聚物树脂的碱金属盐型、碱土金属盐型、H+型等强酸性阳离子交换树脂。市售品有Dow化学公司生产的商品名为Dowex50W×8、Rhom&Hass公司生产的商品名为Amberlite CG-120、三菱化学公司生产的商品名为Diaion SKi04等。此时分离出来的未反应抗坏血酸和含有β-葡萄糖基的化合物可再次作为酶反应的原料利用。

此外，为了得到高纯度品，可用高效液相色谱法精制。即，通过组合使用糖·有机酸分析用色谱柱和乙酸、三氟乙酸等挥发性酸，或组合使用ODS色谱柱和升华性甲酸铵、酸性物质分析用挥发性离子对试剂、Di-n-butylamine Acetate(二正丁胺乙酸酯)，可得到该物质的纯品。天然产物的该物质鉴定通过与化学合成的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的质量分析或核磁共振光谱等的比较分析来进行。

本发明抗坏血酸衍生物不仅包括游离的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸，还包括其对人体安全的盐或酯。盐的例子具体有钠盐、钾盐等，酯的例子有乙酸酯、丙酸酯等。盐或酯可通过各自的游离酸与碱(如氢氧化钠、氢氧化钾)反应合成或酰化反应合成，上述均为同领域技术人员所熟知的化学反应。

下面说明本发明抗坏血酸衍生物的生理活性。

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸抑制紫外线照射引起的损伤

根据上述方法得到的或化学合成得到的纯2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸，与抗坏血酸或2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸相比，在相同浓度下，可显著抑制因紫外线B波(UVB)照射引起的人皮肤表皮角质形成细胞的细胞死亡(HaCaT)。

给无毛小鼠皮肤的一部分照射接近太阳光波长光谱的光(290nm～400nm)，发现小鼠皮肤含有的各种抗氧化因子中，抗坏血酸(维生素C)减少最多。(Photodermatol Photoimmunol Photomed.，10(5)，183，1994)。而且，豚鼠背部剃毛后，通过涂布外用抗坏血酸或2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸等，可抑制由UVB照射引起的皮肤炎症，其效果以2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸较好(香料杂志，第25卷，3月版，55页，1997年)。此外，有报道指出给猪皮肤连日涂布10％抗坏血酸水溶液3天至1周，可减轻紫外线损害(Br.J.Dermatol.，121，247，1992)。

因此，明显显示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对紫外线照射引起的皮肤炎症或其他由紫外线损害等的抑制效果比抗坏血酸及2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸等还要好。

此外，在人皮肤角质形成细胞的细胞内抗坏血酸浓度中，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的浓度最高且维持时间最长。该2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸使细胞内抗坏血酸的浓度维持在高水平，对UVB照射具有细胞保护作用。当然，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸在细胞内转化为抗坏血酸，作为前体维生素C发挥作用。

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸预防皮肤皱纹和松弛

在人皮肤真皮成纤维细胞(NHDF)的胶原蛋白合成中，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的活性比2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或抗坏血酸等的活性高。这也可认为是因为细胞内抗坏血酸浓度持续维持在高水平。即，可认为抗坏血酸促进胶原蛋白合成的作用也发生在皮肤成纤维细胞中，并促进皮肤的再生和修复等。实际上，有报道指出给烫伤患者涂布稳定型抗坏血酸之一的抗坏血酸-2-磷酸，可治愈不留疤痕(日本香妆品学会演讲摘要，第50页，1998年)。另一方面，还发现抗坏血酸可抑制胶原蛋白分解酶或皮肤弹性所必须的弹性蛋白酶的分解酶等(生物抗氧化剂前体维生素C，第63页，1999年，香料杂志出版社)。上述事实表明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸具有预防皮肤皱纹和松弛等效果。

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸活性的美白效果

此外，抗坏血酸可阻碍酪氨酸酶来抑制黑色素合成，调配了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的雪花膏涂布于人身上后，可抑制紫外线照射引起的色素沉着(香料杂志，第25卷，3月版，第55页，1997年)，上述事实明显显示2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸也同样具有美白效果，且比2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的美白效果更好。

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸经口摄取时的体内动态

使大鼠口服摄取2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸后，在血中检测出2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸原型，说明其以原型在肠道吸收。另一方面，按上述方法使大鼠口服摄取2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸后，在血中未检测出原型，说明其吸收时在肠道被完全分解，以抗坏血酸的形式存在于血中(J.Pharmacobio-Dyn.，13，688，1990)。即口服摄取后2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸以抗坏血酸的形式被吸收，在血中有可能被迅速分解。而2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸在血中以原型存在，且以原型向组织转移，其在组织或细胞内被活化成抗坏血酸的可能性很高。

从上述的实验结果及相关知识可知，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸及含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的组成物是极好的前体维生素C，在皮肤的保护和维持健康的皮肤等方面很有用，可用作皮肤化妆品原料及皮肤保护剂等，还可作为食品，可用作使抗坏血酸高效地向体内及组织转移的前体维生素C。

本发明中使用的曲霉只要是属于曲霉属(Aspergillus)的菌就可以，这样的菌有例如属于米曲霉(Aspergillus oryzae)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus awamori)的菌、属于上述菌属的菌株及其变异株等。曲霉可以是活菌也可以是死菌，但优选为活菌。任何曲霉只要是酶没有失活的就可以。曲霉可以是其本身，也可以是使其营养繁殖的含有曲霉的培养液，还可以是利用曲霉的强淀粉糖化能力制成的曲子。这样的曲子可以是酿造日本酒中使用的曲子。任何曲霉的处理物只要是曲霉中含有的酶没失活的就可以。例如，可以是曲霉的干燥物。干燥可以是喷雾干燥也可以是冷冻干燥。将曲霉的液体培养液离心分离，其上清液冷冻干燥，加入水后得到曲霉处理物也可在本发明中使用。曲霉的处理物还可以是曲霉的提取物。提取物可以是将菌体例如经浸渍、粉碎等熟知的方法处理后得到的菌体提取物。将曲霉的菌体用乙醇浸渍灭菌后，向离心分离得到的沉淀部分加入5倍量Mili-Q超纯水，粉碎·提取，提取液经浓缩可制得曲霉的提取物。上述曲霉或其处理物，可以是市售品，如来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酶制剂(天野酶制品株式会社生产，商品名为Biozyme A)、或由(株)Bioch生产的米曲用曲霉干燥粉末等。

下面说明本发明的组成物。可作为化妆品或医药外用品使用的本发明外用组成物用于皮肤时，其含有2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或酯(以下有时简称为成分(1))和曲霉或其处理物(以下有时简称为成分(2))。但是，上述成分(1)和成分(2)在混合状态下长期保存时，成分(1)有时会发生分解反应，因此，含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物可以分开保存，用于皮肤时再将两组成物抹在皮肤表面。因此，本发明不仅包括同时含有成分(1)和成分(2)的组成物，还包括含有成分(1)的组成物与含有成分(2)的组成物的配套组合物或组合物。本发明还包括促进成分(1)皮肤渗透的含有成分(2)的组成物。使用时，本发明的制剂可以是含有成分(1)和成分(2)的制剂，也可以是在含有成分(2)的组成物中调配成分(1)或含有成分(1)的组成物而制成的制剂。本发明的制剂即含有成分(1)和成分(2)的制剂，或含有成分(1)的组成物与含有成分(2)的组成物的配套组合物，或含有成分(1)的组成物，一般为外用组成物，可以是化妆品、医药外用品，也可以是医药品。作为化妆品的例子有：化妆水、乳液、精华素等基础化妆品、粉底等粉饰类化妆品、头发用化妆品、清洁用化妆品、口唇用化妆品、口腔用化妆品、指甲用化妆品、眼线用化妆品、浴用化妆品、防晒化妆品等。作为医药品或医药外用品的例子有干眼用滴眼剂，其他还有药用化妆品、育发剂等

下面说明本发明的优选方式。

本发明的组成物，即含有成分(1)和成分(2)的组成物或含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物在使用时混合得到的组成物中，对2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的含量无特别限定，范围较广，但一般为组成物总重量的0.1重量％～30重量％，优选为0.5重量％～10重量％。组成物中曲霉或其处理物的含量不能一概而论，一般为0.2重量％～100重量％。

在本发明含有成分(1)的组成物中，除成分(1)外，还可以含有调配于一般化妆品原料中的各种着色剂、油质原料、氟化物、树脂、粘度调节剂、防腐杀菌剂、香料、其他保湿剂、盐类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、中和剂、pH调节剂、驱虫剂等成分。

作为着色剂，在一般化妆品原料中使用的着色剂均可使用，与其形状(球状、棒状、针状、板状、不规则状、鳞片状、纺锤状等)、粒径(烟雾状、微粒子、颜料级等)、粒子结构(多孔性、无孔性等)等无关，着色剂的例子有无机粉体、有机粉体、表面活性剂金属盐粉体、有色颜料、珠光颜料、金属粉末颜料、天然色素等，具体地说，无机粉体的例子有颜料级氧化钛、氧化锆、颜料级氧化锌、氧化铈、氧化镁、硫酸钡、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙、碳酸镁、滑石粉、云母、高岭土、绢云母、白云母、合成云母、金云母、红云母、黑云母、锂云母、硅酸、硅酸酐、硅酸铝、硅酸镁、硅酸铝镁、硅酸钙、硅酸钡、硅酸锶、钨酸金属盐、羟基磷灰石、蛭石、氢氧化铝(Higilite)、膨润土、蒙脱石、锂蒙脱石、沸石、陶瓷粉、磷酸氢钙、氧化铝、氢氧化铝、氮化硼、氮化硼、二氧化硅、微粒子氧化钛、微粒子氧化锌、微粒子氧化铈等，有机粉体的例子有聚酰胺粉、聚酯粉、聚乙烯粉、聚丙烯粉、聚苯乙烯粉、聚氨酯粉、苯代三聚氰二胺粉、聚甲基苯代三聚氰二胺粉、聚四氟乙烯粉、聚甲基丙烯酸甲酯粉、纤维素、丝粉、尼龙粉、尼龙-12、尼龙-6、聚硅氧烷粉、聚硅胶粉、硅胶橡胶球状粉体、苯乙烯-丙烯酸共聚物、二乙烯苯-苯乙烯共聚物、乙烯树脂、尿素树脂、酚树脂、氟树脂、硅树脂、丙烯酸树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、聚碳酸酯树脂、微晶纤维粉体、淀粉粉末、月桂基离胺酸等，表面活性剂金属盐粉体(金属皂)的例子有硬脂酸锌、硬脂酸铝、硬脂酸钙、硬脂酸镁、肉豆蔻酸锌、肉豆蔻酸镁、十六烷基磷酸锌、十六烷基磷酸钙、十六烷基磷酸锌钠等，有色颜料的例子有氧化铁、氢氧化铁、钛酸铁的无机红色颜料、γ-氧化铁等无机褐色颜料；黄氧化铁、黄土等无机黄色颜料；黑氧化铁、碳黑等无机黑色颜料；锰紫、钴紫等无机紫色颜料；氢氧化铬、氧化铬、氧化钴、钛酸钴等无机绿色颜料；普鲁士蓝、群青等无机蓝色颜料，焦油色素色淀、天然色素色淀、及其粉体复合后制成的合成树脂粉体等，珠光颜料的例子有氧化钛被覆云母、氧化钛被覆云母、氧氯化铋、氧化钛被覆氧氯化铋、氧化钛被覆滑石、鱼鳞箔、氧化钛被覆着色云母等，焦油色素的例子有红色3号、红色104号、红色106号、红色201号、红色202号、红色204号、红色205号、红色220号、红色226号、红色227号、红色228号、红色230号、红色401号、红色505号、黄色4号、黄色5号、黄色202号、黄色203号、黄色204号、黄色401号、蓝色1号、蓝色2号、蓝色201号、蓝色404号、绿色3号、绿色201号、绿色204号、绿色205号、橙色201号、橙色203号、橙色204号、橙色206号、橙色207号等，天然色素的例子有洋红酸、虫胶红酸、番红素、巴西木素、藏红花原色素等粉体，在不影响本发明效果的范围内，上述粉体可复合或经一般油剂、硅油、氟化物、表面活性剂等处理后使用。例如，可事先经过或不经过诸如氟化物处理、硅树脂处理、接侧链处理、硅烷偶合剂处理、钛偶合剂处理、油剂处理、N-酰化离胺酸处理、聚丙烯酸处理、金属皂处理、氨基酸处理、无机化合物处理、等离子体处理、机械化学处理等表面处理，根据需要可使用一种或并用两种、两种以上表面处理方法。在本发明中，上述粉体可一种或一种以上组合使用。

油质原料的例子有鳄梨油、亚麻籽油、杏仁油、白蜡、苏子油、橄榄油、可可油、木棉蜡、香榧油、卡那巴蜡、鱼肝油、小烛树蜡、牛油、牛脚油、牛骨脂、硬化牛油、杏仁油、鲸蜡、硬化油、小麦胚芽油、芝麻油、大米胚芽油、米糠油、甘蔗蜡、山茶花油、红花油、乳果木油、中国桐油、肉桂油、荷荷巴蜡、虫胶蜡、龟油、大豆油、茶仔油、山茶油、月见草油、玉米油、猪油、菜籽油、日本桐油、米糠腊、胚芽油、马脂、抗坏血酸四异棕榈酸酯、棕榈油、棕榈核油、蓖麻子油、硬化蓖麻子油、蓖麻子油脂肪酸甲酯、向日葵油、葡萄油、月桂子蜡、荷荷巴油、澳洲胡桃油、蜂蜡、貂油、棉籽油、棉蜡、木蜡、日本木蜡、褐煤蜡、椰子油、硬化椰子油、椰子油脂肪酸甘油三酯、羊脂、花生油、羊毛脂、液体羊毛脂、还原羊毛脂、羊毛脂醇、硬质羊毛脂、乙酸羊毛脂、羊毛脂脂肪酸异丙酯、月桂酸己酯、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇酯、POE氢化羊毛脂醇醚、蛋黄油等；烃油的例子有地蜡、三十碳烷、三十碳六烯、白地蜡、石蜡(paraffin)、固体石蜡(paraffin wax)、液体石蜡、十八碳烷、聚异丁烯、微晶蜡、凡士林等；高级脂肪酸的例子有月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、十一碳烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、异硬脂酸、12-羟基硬脂酸等；高级醇的例子有月桂醇、肉豆蔻醇、棕榈醇、硬脂醇、山嵛醇、十六烷醇、油醇、异硬脂醇、己基十二烷醇、辛基十二烷醇、十八醇十六醇混合物、2-癸基十四烷醇、胆甾醇、植物甾醇、POE胆甾醇醚、单硬脂基甘油醚(鲨肝醇)、单油基甘油醚(鲨油醇)等；酯油的例子有己二酸二异丁酯、己二酸-2-十六烷酯、己二酸二-2-庚基十一烷酯、单异硬脂酸-N-烷基醇酯、异硬脂酸异十六烷酯、三异硬脂酸三羟甲基丙烷、二-2-乙基己酸乙二醇酯、2-乙基己酸十六烷酯、三-2-乙基己酸三羟甲基丙烷、四-2-乙基己酸季戊四醇酯、辛酸十六烷酯、辛基十二烷树胶酯、油酸油酯、油酸辛基十二烷酯、油酸癸酯、二癸酸新戊二醇酯、枸橼酸三乙酯、琥珀酸-2-乙基己酯、乙酸戊酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、硬脂酸异十六烷酯、硬脂酸丁酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、乳酸十六烷酯、乳酸肉豆蔻酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸-2-乙基己酯、棕榈酸-2-己基癸酯、棕榈酸-2-庚基十一烷酯、12-羟基硬脂酸胆甾醇酯、二季戊四醇脂肪酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、肉豆蔻酸-2-己基癸酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、二甲基辛酸己基癸酯、月桂酸乙酯、月桂酸己酯、N-月桂酰基-L-谷氨酸-2-辛基十二烷酯、苹果酸二异硬脂酸酯等；甘油酯油如乙酰甘油酯、三异辛酸甘油酯、三异硬脂酸甘油酯、三异棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、二-2-庚基十一烷酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸异硬脂酸二甘油酯等。

防腐剂的例子有对羟基苯甲酸烷酯、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、苯氧基乙醇等；杀菌剂的例子有苯甲酸、水杨酸、石炭酸、山梨酸、对羟基苯甲酸烷酯、对氯间甲酚、六氯双酚基甲烷、洁而灭、氯己啶、三氯均二苯脲、三氯羟基二苯醚、感光素、苯氧基乙醇等。

保湿剂的例子有乙二醇、丙二醇、丁二醇、二乙二醇、二丙二醇、甘油、双甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、棉子糖、木糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、聚甘油等甘醇类等的多元醇类以及多糖类等。在本发明中，上述物质最好单独使用或2种、2种以上混合后使用。

粘度调节剂的例子有阿拉伯胶、西黄蓍胶、阿拉伯半乳糖胶、刺槐豆胶(角豆胶)、瓜尔胶、刺槐树胶、角叉菜胶、果胶、琼脂、榅桲种子(木瓜)、淀粉(大米、玉米、马铃薯、小麦)、藻胶、西黄蓍胶、刺槐豆胶等植物高分子；黄原胶、葡聚糖、琥珀酸葡聚糖、支链淀粉等微生物高分子；胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、明胶等动物高分子；羧甲基淀粉、甲基羟丙基淀粉等淀粉类高分子；甲基纤维素、乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、硝酸纤维素、纤维素硫酸钠、羧甲基纤维素纳、结晶纤维素、纤维素粉等纤维素类高分子；藻酸钠、藻酸丙二醇酯等藻酸类高分子；聚乙烯甲醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物等乙烯类高分子；聚乙二醇等聚氧乙烯类高分子；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类高分子；聚丙烯酸钠、聚乙基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺等丙烯类高分子；聚乙烯亚胺、阳离子聚合物、膨润土、硅酸铝镁、人造硅酸镁锂(Laponite)、蒙脱石、皂石、锂蒙脱石、硅酸酐等无机增粘剂等。其他增粘剂还有油溶性胶凝剂，如硬脂酸铝、硬脂酸镁、肉豆蔻酸锌等金属皂；N-月桂酰基-L-谷氨酸、α，γ-二正丁胺等氨基酸衍生物；糊精棕榈酸酯、糊精硬脂酸酯、糊精-2-乙基己酸棕榈酸酯等糊精脂肪酸酯；蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯；单亚苄基山梨糖醇、二亚苄基山梨糖醇等山梨糖醇的亚苄基衍生物；二甲基苯甲基十二烷铵蒙脱石土、二甲基二-十八烷铵蒙脱石、十八烷基二甲基苯甲基铵蒙脱石等有机变性粘土矿物等。

上述含成分(1)组成物不仅可单独作为外用组成物使用，还可以与上述成分混合，作为化妆水、乳液、雪花膏、面膜、肥皂等化妆品和医药外用品的药用化妆原料，或作为化妆水、乳液、雪花膏、软膏等医药品的皮肤外用剂。

含成分(2)的组成物，可以只是曲霉或其处理物，也可用水、醇等液体稀释剂、或石蜡等固体稀释剂、液体石蜡等半固体稀释剂稀释。还可以用成分(2)取代上述含有成分(1)的组成物中的成分(1)，制成含成分(2)的组成物来使用。

含有成分(1)和成分(2)的组成物通过混合成分(1)和成分(2)以及上述含有成分(1)的组成物中所述的各种成分制得，也可通过混合上述含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物制得。

作为皮肤外用剂用于皮肤表面时，将含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物混合。混合后，将混合物用于皮肤表面。两组成物混合时，成分(1)和成分(2)的使用比例一般约是重量比1∶0.001～0.1，优选约为1∶0.005～0.05。

可通过熟知的方法将含有成分(1)的组成物与含有成分(2)的组成物混合。

下面说明本发明组成物为化妆品时的优选方式。上述化妆品为化妆水时，其通过将含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物溶解或分散于溶剂中制得。

上述化妆品为乳液时，例如通过匀质机等将含有成分(1)的组成物和含有成分(2)的组成物调配于不含上述成分(1)及成分(2)的原料经乳化后的混合液中制得。

按上述那样制成使用时本发明的组成物，可用于如化妆水、乳液、精华素等基础化妆品、粉底等粉饰用化妆品、头发用化妆品、清洁用化妆品、口唇用化妆品、口腔用化妆品、指甲用化妆品、眼线用化妆品、浴用化妆品、日晒·防晒化妆品等。在医药品或医药外用品中使用的例子有干眼用滴眼剂，其他还有药用化妆品、育发剂等。

实施例

下面，通过实施例进一步具体说明本发明，当然，本发明的范围并不限于这些实施例。

实施例1

2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的合成：

将5，6-O-异亚丙基抗坏血酸(2g，9.3mmol)溶于DMSO(20mL)中，加入碳酸钾(1.3g，9.4mmol)及苄基溴(1.1mL，9.3mmol)，50℃下搅拌4小时。在反应液中加水，用1N-HCL调至酸性，经乙酸乙酯萃取、水洗、饱和食盐水洗后，用无水MgSO₄干燥，再减压浓缩，用硅胶柱(AcOEt/n-Hexane＝3∶1)精制，制得3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸1.1g(收率为39％)。

将上述苄基衍生物(0.6g，2.0mmol)与2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-(2，2，2-三氯乙氧基羰基)-β-D-吡喃葡萄糖(2.1g，4.0mmol)的混合物在120℃～130℃下加热熔融。反应3小时后，反应液用柱色谱(25％AcOEt/n-Hexane至50％梯度)精制，制得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-3-O-苄基-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸850mg(收率为67％)。

将上述糖苷(850mg，1.3mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)，加入10％Pd-C(200mg)进行氢解。2小时后，滤去催化剂，浓缩，制得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-5，6-O-异亚丙基抗坏血酸约750mg。

将上述脱苄基后的化合物(500mg，0.9mmol)溶于乙酸(5mL)，加水(5mL)，在50℃～60℃下加热搅拌1.5小时。将反应液浓缩，经水洗、饱和食盐水洗后，用无水MgSO₄干燥，再减压浓缩，得到的残渣用乙酸乙酯-己烷结晶，得2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸320mg(收率为48％)。

PMR(δppm，DMSO-d₆)；1.94-2.01(12H)，3.42(3H，m)，3.7-4.3(4H，m)，4.7-5.1(4H，m)，5.3-5.4(2H，m)，12.00(1H，br)。FABMS(+)m/z：507。

实施例2

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的合成：

将2-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸(300mg，0.6mmol)溶于甲醇(10mL)，加入由碳酸钾(600mg)溶于水(9ml)配成的溶液，搅拌30分钟。反应液用IR-120(H⁺)中和，滤去树脂，再用甲醇及50％甲醇水溶液洗净。合并滤液和洗液，浓缩，加水，冷冻干燥，制得2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的无定形结晶(190mg，收率为100％)。

PMR(δppm，D₂O)：3.1-3.3(4H，m)，3.4-3.5(3H，m)，3.58(1H，d)，3.80(1H，t)，4.61(1H，d)，4.66(1H，d)。FABMS(-)m/z：337。

实施例3

枸杞中2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的含量测定

以2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的化学合成品在高效液相色谱中的保留时间2.63分钟为对照(岛津制作所(株)制造的LC-10Ai体系，色谱柱：Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造)，4.6×150mm，5μm)，流动相：20％MeOH-20mM磷酸-5mM溴化四正戊铵，流速：1.0mL/min，柱温：35℃，检测波长：254nm)，将3g干燥植物浸渍在其10倍量的70％乙醇中，室温下浸渍7天，得到的提取液用1.5％偏磷酸/5M KOH(pH3.5)稀释10倍，作为被测样品，检测天然存在的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。结果在宁夏产及河北产枸杞子的提取液中检测出与2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的峰相当的峰。另外，在100g宁夏产枸杞鲜果中加入其2倍量的70％乙醇，在相同处理后的样品中也检测出与2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的峰相当的峰。此外，取上述提取液5mL，减压浓缩后经冷冻干燥重量测定求得固体成分的含量。综合考虑提取物固体成分、化学合成品的校正曲线、提取液中的浓度以及稀释倍数后，求得固体成分在提取物中的含量为0.86％～1.2％。

实施例4

枸杞子中含有的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的精制

将100g宁夏产枸杞子在(株)东正制造的片剂粉碎机TS-10M中粉碎，加入30％乙醇800mL，室温下浸渍6天，过滤后减压浓缩并冷冻干燥，制得65.7g提取物。取1.94g该提取物(2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的含量为0.86％)溶于蒸馏水，制成40mL样品(pH4.5，电导率为1.7mS/cm)。将该样品以SV＝1通过Dowex 1-X8柱(乙酸型，1.5×12cm)。通过后，用约10倍于柱体积(200mL)的蒸馏水洗净，以0-0.1M乙酸线性浓度梯度洗脱(100mL×2)，接着以0.1-1.0M乙酸线性浓度梯度洗脱(100mL×2)，再以1.0M乙酸洗脱。在280nm下测定吸光度，并参照化学合成品的保留时间，通过高效液相色谱观测2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的洗脱情况。装置、柱温与实施例1相同，其他条件变为：色谱柱：Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造，3.0×150mm，5μm)，流速：0.3mL/min，检测波长：245nm，流动相：2％MeOH-0.2M KH₂PO₄/H₃PO₄(pH3.0)-0.2mM EDTA-0.5mM十二烷基三甲基氯化铵，2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的化学合成品的保留时间为6.5分钟。高效液相色谱法的检测结果显示，吸附在柱子上的该物质在0.1-1.0M乙酸线性浓度梯度洗脱中，在组分19～25中洗脱出来(26mg，组分19～25的总回收率为78％，纯度为50％)。

实施例5

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的酶法合成

以2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的化学合成品在GILSON公司制造的LC体系(305Master Pump，116型UV检测器)，色谱柱：Inertsil ODS-3(GLScience(株)制造，4.6×150mm，5μm)，流动相：20％MeOH-20mM磷酸-5mM溴化四正戊铵，流速：0.5mL/min，检测波长：254nm的保留时间5.2分钟为对照，检测市售纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶。将纤维二糖与抗坏血酸溶于10mM乙酸缓冲液(pH5.0)，制成纤维二糖0.3M及抗坏血酸0.2M的1mL酶反应体系。在该酶反应体系中加入50μL酶液，37℃下开始反应。于100℃下加热5分钟终止反应，再高效液相色谱分析生成的β-D-吡喃型葡萄糖基-抗坏血酸。结果发现，纤维素酶(Sigma公司生产)、β-葡萄糖苷酶(东洋纺，nakalaitesc)、纤落辛T2(阪急共荣物产)、纤维素酶「小野塚」RS、「小野塚」FA及泛纤维素酶BR(养乐多药品工业)具有β-葡萄糖基转移活性。游离抗坏血酸在4.0分钟时出峰，其前后的3.6分钟和5.2分钟处也有峰，分别作为物质X、物质Y。物质X的转移率为15.7％，物质Y的转移率为0.8％。该物质X与物质Y通过与化学合成品的混合色谱分析，得知物质X的保留时间与6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的保留时间一致，物质Y的保留时间与2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸相的保留一致。

用分子量为1万Kd的UF膜将共存的蛋白质除去，为了除去游离抗坏血酸，用高效液相色谱法分取{GILSON公司制造的LC体系(305MasterPump，116型UV检测器)，色谱柱：SUGAR SH1011(昭和电工(株)制造)，流动相：0.1M乙酸，流速：0.5mL/min，柱温：30℃，检测：示差折射计，0.25mL分画}。含有物质X与物质Y的组分在29～31中洗脱出来，得24.7μg样品，收率为96％。

再经高效液相色谱法制得高纯度品。条件为：GILSON公司生产的LC体系(305Master Pump，116型UV检测器)，色谱柱：ODS-UG-5(野村化学(株)制造，4.6×250mm，5μm)，流动相：5％甲醇-20mM甲酸铵-5mM二正丁铵乙酸酯(Di-n-butylamine Acetate)，流速：0.5mL/min，检测波长：254nm，每隔0.5分钟用FC-203B型(GILSON公司生产)馏分收集器分取。相当于物质X与物质Y的组分经减压浓缩、冷冻干燥后，溶于重水，用核磁共振光谱测定，与化学合成品2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸比较。在HSQC谱中，化学合成品抗坏血酸结构中4位、5位、6位碳原子的化学位移分别为73ppm、73ppm、66ppm，而物质X中4位、5位、6位碳原子的化学位移均为73ppm，且只有6位碳原子为低磁场位移，从中可知物质X为6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。

物质Y与化学合成品2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的一维PMR谱一致，从中可知物质Y为2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。

实施例6

(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的精制

将20m g纤维素酶制剂(Sigma)溶于20mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)1mL中，再使其通过经上述缓冲溶液平衡后的Marathon WBA(树脂0.5mL，Dow化学公司生产)，得到组分-酶液。将该酶液添加到溶有0.35g抗坏血酸和1g纤维二糖的20mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)10mL中，37℃下反应2天，制得含6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸11.8％和2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸0.8％的反应液。该溶液经UF膜过滤，将回收除去酶后的溶液(pH4.3，电导率1.6mS/cm)以SV＝2.5通过Dowex 1-X8柱(乙酸型，1.5×12cm)。通过后，以约10倍于柱体积(200mL)的蒸馏水洗净，以0-0.1M乙酸线性浓度梯度洗脱(80mL×2)，接着以0.1-1.0M乙酸线性浓度梯度洗脱(80mL×2)。依次分离出6-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的高含量组分(馏分65～68)、未反应抗坏血酸的高含量组分、2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的高含量组分(馏分101～108)。收集上述馏分101～108，以其作为2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸的高含量组分(2.4mg，回收率为45％)。

实施例7

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对由紫外线B波(UVB)照射引起的人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)的细胞死亡的保护作用

将人皮肤角质形成细胞HaCaT(来自海得堡大学Fusenig博士所提供的细胞株)以10000细胞/孔置于含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)的24孔板中，18小时后，照射35微焦耳/平方厘米(mJ/cm²)的UVB(最大波长312nm)。在照射前2小时，预先添加20μM～100μM的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸，在照射时除去并淋洗。照射在无药剂存在PBS中进行，照射后在含有10％FBS的DMEM培养基中继续培养，照射24小时后，通过使用了2-(4-碘化苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸基苯基)-2H-四唑、-钠盐(WST-1)的线粒体脱氢酶活性测定法，测定细胞存活率。结果在图1中显示。同样地，作为比较例，还测定了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸和抗坏血酸，其结果也在图1中显示。

实施例8

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对人皮肤角质形成细胞的细胞内抗坏血酸浓度的影响

将370000个人皮肤角质形成细胞HaCaT置于直径100mm的培养皿中。培养16小时后，在添加了40％HaCaT 24小时无血清培养液的含有10％FBS的DMEM培养基中，加入2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸100μM。在添加3～24小时后，除去培养基，用冰冷却后的PBS淋洗2次，用胰蛋白酶处理使细胞层剥脱，分散成单个细胞。将其悬浮于含有50μM二硫苏糖醇(DTT)的PBS，以离心处理淋洗3次。细胞悬浮液经柱塞式铁夫龙(注册商标)匀质机粉碎后，接着在液氮中冷冻、解冻2次。其上清液经Molcut(日本密理博(株)生产，加压式限外过滤器，截留分子量为10000，聚醚砜膜)处理，用高效液相色谱法(东曹(株)制造的AS-8020体系，色谱柱：Shodex ODSpak(昭和电工(株)制造，4.6×150mm)，流动相：0.1M KH₂PO₄-H₃PO₄(pH2.35)-0.1mM EDTA-2Na，流速：1.5mL/min)，通过库仑电化学检测器(ESA Co.，Bedford，MA，200mV)分析细胞内抗坏血酸含量。其结果在图2中显示。同样地，作为比较例，还检测了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸和抗坏血酸，其结果也在图2中显示。

实施例9

2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸对人真皮成纤维细胞(NHDF)胶原蛋白合成的促进作用

将370000个人真皮成纤维细胞NHDF置于直径100mm的培养皿中。培养16小时后，在添加了40％NHDF 24小时无血清培养液的含有10％FBS的DMEM培养基中，加入2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸100μM。1小时后，再加入L-[2，3-³H]脯氨酸0.12mL(120μCi)，培养48小时。培养后，除去培养基，用PBS淋洗细胞层4次。然后用胰蛋白酶处理使细胞剥离，用碱溶解细胞，中和，即得细胞内蛋白质组分。将其经Clostridium的胶原蛋白酶分解得到的蛋白质组分，通过使用了Scintisol EX-H的液体闪烁计数器测定放射活性。未经胶原蛋白酶处理的细胞内蛋白质组分也同样通过液体闪烁计数器来测定放射活性。求出各放射活性的差值，作为胶原蛋白合成活性。结果在图3中显示。同样地，作为比较例，还测定了2-O-(α-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸和抗坏血酸，其结果也在图3中显示。

实施例10

将经知情同意后从人皮肤所摘取的皮肤片(51岁女性耳后下皮肤)沿垂直方向分割成短片型小片，将上述小片嵌入改良式卜诺夫扩散细胞池中。使皮下侧浸于DMEM培养基(2mL)中并持续供给营养，向角质层侧通以5％CO₂使培养基的pH值维持在7.25。在角质层上覆上边长约5mm的四方形双层纱布，该双层纱布吸有1mL 100mM的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸(以下也简称为AβG){3.38％w/w，PBS(-)溶液(不含金属盐类氯化钙和氯化镁的磷酸缓冲生理盐水(PhosphateBuffered Saline))}，同时将来自米曲霉(Aspergillus oryzae)酶制剂(天野酶制品株式会社，商品名为Biozyme A)的25％w/wPBS(-)溶液过滤灭菌后，以每片1/200(5μL)、1/500(2μL)、1/1000(1μL)的液体量将其添加于纱布上(以下也简称Bz)。

在上述方法中，在1g(株)Bioch生产的米曲用曲霉干燥粉末中加入5m L的Mili-Q超纯水制成悬浮液，该悬浮液经冷冻解冻和柱塞式铁夫龙(注册商标)匀质机进行粉碎，离心分离，得到的上清液过滤灭菌后，将其以每片1/20(50μL)、1/50(20μL)的液体量取代Bz添加于纱布上(以下也简称Kj)。另外，在上述方法中，不使用Bz和Kj的添加物，只投与AβG。

投与5小时后，从改良式卜诺夫扩散细胞池中切下皮肤小片，加入10倍量0.1％胰蛋白酶PBS(-)溶液，37℃下处理3小时后，温和地搅拌使表皮与真皮分离。在无气泡下分别通过柱塞式铁夫龙(注册商标)匀质机粉碎和在液氮中的冷冻解冻，使细胞破碎。将破碎液离心分离得到的上清液限外过滤后，用UV法测定AβG，且用电化学检测法测定总维生素C(还原型和氧化型的总和)以及还原型维生素C量，测定方法与实施例8相同。求出在总维生素C中所占比例。表1显示给人皮肤片单独投与AβG或同时投与添加物5小时后表皮以及真皮中含有的总维生素C量。表2显示给人皮肤片单独投与AβG或同时投与添加物5小时后表皮以及真皮中还原型维生素C在总维生素C中所占比例。表3显示给人皮肤片单独投与AβG或同时投与添加物5小时后表皮以及真皮的AβG吸收量。

[表1]

[表2]

[表3]

如表1和表2所示，通过添加Kj或Bz，使皮肤组织中特别是维生素C难以渗透到的皮肤表面下0.1mm至1.3mm处真皮中的维生素C量增加。维生素C量增加又可促进真皮成纤维细胞的胶原蛋白合成从而达到预防皱纹的双重效果。另外，如表3所示，通过添加Bz或Kj，使前体维生素C的AβG从皮肤表面向深部的渗透转移性增加。

从上述结果可知，本发明2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸在霉菌或其处理物的存在下可显著改善皮肤渗透性，且向维生素C的转换也很好。

Claims

1.一种外用组成物，其特征在于，它含有

式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐、乙酸酯或丙酸酯，和

曲霉、曲霉的干燥物或曲霉的提取物

[化1]

2.根据权利要求1所述的组成物，其特征在于，其为化妆品或医药外用品。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组成物，其特征在于，权利要求1中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸是从植物体中提取出来的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸。

4.根据权利要求3所述的组成物，其特征在于，其植物体为茄科植物。

5.根据权利要求3所述的组成物，其植物体为枸杞、枸杞的鲜果或干燥果实。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的组成物，其特征在于，曲霉属于曲霉属。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的组成物，其特征在于，曲霉属于米曲霉、白曲霉或黑曲霉。

8.一种配套组合物，其特征在于，其为含有权利要求1中式(I)所示的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或乙酸酯或丙酸酯的组成物与含有曲霉或曲霉的干燥物或曲霉的提取物的组成物的配套组合物。

9.一种组成物，其特征在于，其为含有权利要求8所述配套组合物用的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或乙酸酯或丙酸酯的组成物。

10.一种皮肤渗透增强剂，其特征在于，其为以含有曲霉或曲霉的干燥物或曲霉的提取物为特征的2-O-(β-D-吡喃型葡萄糖基)抗坏血酸或其对人体安全的盐或乙酸酯或丙酸酯皮肤渗透增强剂。