Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Legionella-spezifisches Antibiotikum AL072, einen neuen Streptomyces-Stamm AL91, der dieses produziert, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums.
Von Legionella pneumophila, dem Erreger von Legionella-Infektionen, ist bekannt, dass es die Legionärskrankheit, oder Veteranenkrankheit, verursacht. Seitdem das Bakterium zum ersten Mal in Philadelphia, USA, isoliert wurde, wurde berichtet, dass Legionella-Arten mehrfach aus verschiedenen Patienten und Gegenden überall auf der Welt, darunter auch den USA, isoliert, und 10 oder mehr Arten bestimmt wurden. Bei Legionella pneumophila handelt es sich um einen der Erreger, der Lungenentzündung (Pneumonie) zu verursachen vermag, und es wird angenommen, dass 5% aller auftretenden Lungenentzündungen auf Legionella pneumophila zurückzuführen sind. Legionella pneumophila vermehrt sich in Klimanlagenkühltürmen, Wasserleitungen, Abflussleitungen usw., und es wird angenommen, dass die Atemorgane durch Einatmen von kontaminierten Aerosolen infiziert werden.
Im Juli 1984 wurde aufgrund der überraschenden Tatsache, dass unscharfe Lungenentzündungs-Symptome, die bei Patienten sowie medizinischem Personal in Intensivstationen des Koryo-Krankenhauses in Seoul offenbar von Legionella-Arten verursacht wurden, Kritik laut. Laut Ergebnissen einer 1985 vom staatlichen Gesundheitsamt abgeschlossenen Untersuchung waren mindestens 90% der Klimaanlagenkühltürme in Seoul mit Legionella-Arten kontaminiert, und 93% der isolierten Legionella wurden als Legionella pneumophila identifiziert. Aus einer weiteren, zwischen Juli und September 1988 abgeschlossenen, landesweit in grösseren Städ ten, z.B. Seoul, Pusan, Daejeon usw. durchgeführten Untersuchung des staatlichen Gesundheitsamts ging hervor, dass 83% der isolierten Legionella zum Legionella pneumophila Serotyp 1 gehörten.
Macrolid-Antibiotika, wie Erythromycin und Chinolon-Antibiotika, wie Rifampin sind bekanntlich gegen Legionella-Arten wirksam und wurden zur Behandlung von Legionella-Infektionen verwendet. Diese Antibiotika verfügen jedoch über ein breites Wirkungsspektrum, nicht nur gegenüber Legionella-Arten, sondern auch gegen verschiedenste andere Mikroorganismen. Diesbezüglich kann ein längerer Missbrauch solcher Antibiotika nicht nur zu Resistenz von verschiedenen Mikroorganismen, sondern auch zu unangenehmen Problemen, wie z.B. dem Zusammenbruch des mikrobiellen Gleichgewichts im Körper, führen.
Weitere ernsthafte Probleme bestanden darin, dass Chemikalien für die Desinfektion von Klimaanlagenkühltürmen, die Infektionsquellen für Legionella-Arten darstellen, zur Kontaminierung der Umgebung sowie zur Korrosion der Klimaanlage führen können.
Die Entwicklung neuer Legionella-spezifischer Antibiotika, die ausschliesslich spezifisch gegen Legionella-Arten wirksam sind, ist daher erforderlich und kann möglicherweise die unerwünschten Probleme auf ein Minimum zurückdrängen. Die Autoren haben sich zwecks Entwicklung solcher Antibiotika mehrere Jahre lang intensiv mit der Untersuchung von Bodenmikroorganismen befasst. Schliesslich gelang es den Autoren, einen Streptomyces-Stamm, der Legionella-spezifische Antibiotika produziert, zu isolieren und ein neues Antibiotikum, das spezifisch ausschliesslich gegen Legionella-Arten wirkt und mit der Bezeichnung Antibiotikum AL072 versehen ist, rein zu gewinnen.
Es zeigen:
Fig. 1 das Absorptionsspektrum der antibiotischen Substanz AL072 im Ultraviolettbereich;
Fig. 2 das Absorptionsspektrum der antibiotischen Substanz AL072 im Infrarotbereich;
Fig. 3 das mittels FAB/MS erhaltene Massenspektrum der antibiotischen Substanz AL072;
Fig. 4 das Protonen-NMR-Spektrum der antibiotischen Substanz AL072 bei 400 MHz;
Fig. 5 das Kohlenstoff-NMR-Spektrum der antibiotischen Substanz AL072 bei 100 MHz.
Der Mikroorganismus
Bei dem für die Produktion der Legionella-spezifischen antibiotischen Substanz AL072 verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um Streptomyces sp. AL91. Der Mikroorganismus wurde bei der ständigen Sammlung des Koreanischen Zentrums für Mikroorganismenkulturen, Seoul, Korea, am 2. Juni 1994 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bezüglich der internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt, und eine Subkultur des Organismus ist bei der Hinterlegungsstelle unter der Eingangsnummer KCCM 10055 erhältlich. Es ist zu betonen, dass zusätzlich zu dem in der vorliegenden Druckschrift beschriebenen und charakterisierten Mikroorganismus auch Mutanten des Mikroorganismus (z.B.
Mutanten, produziert durch Verwendung von Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen oder Stickstofflosten) können ebenfalls zur Produktion der antibiotischen Substanz AL072 gezüchtet werden.
Streptomyces sp. AL91 wurde folgendermassen isoliert: Man schüttelte 1,0 g einer getrockneten Bodenprobe in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser, strich 0,1 ml Verdünnungen der Bodensuspension auf einem mit Cycloheximid (50 mu g/ml) und Nalidixinsäure (200 mu g/ml) versetzten Huminsäure-Vitamin-Agar aus und bebrütete die Platte 14-21 Tage bei einer Temperatur von 28 DEG C. Vor der Zugabe des pilzhemmenden Mittels Cycloheximid und des bakterienhemmenden Mittels Nalidixinsäure, welche getrennt steril filtriert worden waren, wurde das Medium 15 Minuten bei 121 DEG C sterilisiert.
Tabelle I zeigt die Zusammensetzung des Huminsäure-Vitamin-Agars.
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle I
<tb><SEP>Huminsäure (gelöst in 10 ml 0,2 N NaOH)<SEP>1,0 g
<tb><SEP>Na2HPO4<SEP>0,5 g
<tb><CEL AL=L>KCl<SEP>1,71 g
<tb><SEP>MgSO4 . 7H2O<SEP>0,05 g
<tb><SEP>FeSO4 . 7H2O<SEP>0,01 g
<tb><CEL AL=L>Thiamin-HCl<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Vitamin B2<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Niacin<SEP>0,5 g
<tb><CEL AL=L>Pyridoxin-HCl<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Inosit<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Calciumpantothenat<SEP>0,5 g
<tb><CEL AL=L>P-Aminobenzoesäure<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Biotin<SEP>0,25 mg
<tb><SEP>Cycloheximid<SEP>50 mg
<tb><CEL AL=L>Nalidixinsäure<SEP>200 g/ml
<tb><SEP>Agar<SEP>20 g
<tb><SEP>Destilliertes Wasser (pH 7,0)<SEP>11
<tb></TABLE>
Eigenschaften von Streptomyces sp. AL91 KCCM 10055:
Morphologie: Sporen aus spiralförmigen, verzweigten Ketten. Sporenoberfläche glatt.
Biochemische Eigenschaften: Fähigkeit zu Gelatineverflüssigung ist negativ und die Fähigkeit zum Stärkeabbau ist positiv.
Kultureigenschaften:
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 1: Medium
<tb>Head Col 2: Wachstum
<tb>Head Col 3: Farbe des
<tb>Head Col 4: Luftmycels
<tb>Head Col 5: Umkehrfarbe
<tb>Head Col 6:
Lösliche Farbstoffe
<tb><SEP>Trypton-Hefeextrakt-Agar<SEP>gut<SEP>braun<SEP>braun<CEL AL=L>braun
<tb><SEP>Hefeextrakt Malzextrakt-Agar<SEP>gut<SEP>weiss<SEP>braun (SEP)<->(TB><CEL AL=L>Hafermehlextrakt-Agar<SEP>gut<SEP>blassorange oder weiss<SEP>- (SEP)<->(TB><CEL AL=L>Mineralsalz-Stärke-Agar<SEP>gut<SEP>weiss<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>Glycerin-Asparagin-Agar<CEL AL=L>gut<SEP>stark gelb<SEP>stark gelb (SEP)<->(TB><SEP>Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar<SEP>schlecht<CEL AL=L>stark braun<SEP>braun<SEP>stark braun
<tb><SEP>Tyrosin-Agar<SEP>gut<SEP>weisslich braun<CEL AL=L>stark braun (SEP)<->(TB><SEP>Bennett's Medium<SEP>gut<SEP>weiss<SEP>gelbbraun<SEP>-
<tb></TABLE>
Kohlenstoffverwertung:
Positiv: D-Glucose, Saccharose, D-Xylose, D-Mannit, D-Fruktose, Rhamnose, Raffinose, Cellulose
Negativ: L-Arabinose, I-Inosit.
Antibiotikaempfindlichkeit:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 1: Antibiotikum
<tb>Head Col 2: Konzentration ( mu g/ml)
<tb>Head Col 3: Hemmhofdurchmesser (mm)
<tb><SEP>Carbenicillin<SEP>100 (SEP)<->(TB><SEP>Chloramphenicol<CEL AL=L>30<CEL AL=L>27,7
<tb><SEP>Neomycin<SEP>30<SEP>12,0
<tb><SEP>Nalidixinsäure<SEP>30 (SEP)<->(TB><CEL AL=L>Vancomycin<SEP>30<SEP>22,0
<tb><SEP>Clindamycin<SEP>2 (SEP)<->(TB><SEP>Ampicillin<SEP>10<CEL AL=L>12,0
<tb><SEP>Kanamycin<SEP>30<SEP>17,0
<tb><SEP>Tetracyclin<SEP>30<SEP>17,0
<tb><CEL AL=L>Cephalothin<SEP>30<SEP>24,0
<tb><SEP>Erythromycin<SEP>15<SEP>40,0
<tb><SEP>Rifampin<CEL AL=L>5 (SEP)<->(TB><SEP>Gentamycin<SEP>10<SEP>10,0
<tb><SEP>Streptomycin<SEP>10<SEP>17,0
<tb></TABLE>
Produktion der antibiotischen Substanz AL072
Streptomyces sp. AL91 KCCM 10055 wurde 3 Tage auf einem, die in Tabelle II angegebenen Bestandteile enthaltenden, Nähragar gezüchtet. Mit den Kulturen wurden 200 ml eines, die in Tabelle III angegebenen Bestandteile enthaltenden, flüssigen Mediums beimpft und das Material wurde 3 Tage unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 28 DEG C kultiviert. Mit dieser Kulturlösung wurden dann 6 l eines, die in Tabelle IV angegebenen Bestandteile enthaltenden Flüssigmediums beimpft und die Kultur wurde 5 Tage unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 28 DEG C kultiviert.
Das Antibiotikum AL072 wurde aus der letzten Kulturlösung wie unten beschrieben isoliert und gereinigt.
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle II
<tb><SEP>Saccharose<SEP>20,0 g
<tb><SEP>Glucose<SEP>10,0 g
<tb><SEP>Maisquellwasser<CEL AL=L>5 mg
<tb><SEP>Hefeextrakte<SEP>4,9 g
<tb><SEP>Sojamehl<SEP>20,0 g
<tb><SEP>CaCO3<SEP>4,0 g
<tb><CEL AL=L>NaCl<SEP>2,0 g
<tb><SEP>K2HPO4<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Agar<SEP>15 g
<tb><SEP>Destilliertes Wasser (pH 7,3)<SEP>1 l
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle III
<tb><SEP>Glucose<SEP>1 g
<tb><SEP>Lösliche Stärke<SEP>24 g
<tb><SEP>Pepton<SEP>3 g
<tb><SEP>Malzextrakt<SEP>5 g
<tb><SEP>CaCO3<SEP>4 g
<tb><SEP>Destilliertes Wasser (pH 7,0)<SEP>1 l
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle IV
<tb><SEP>Saccharose<SEP>20,0 g
<tb><SEP>Glucose<SEP>10,0 g
<tb><SEP>Maisquellwasser<CEL AL=L>5 ml
<tb><SEP>Hefeextrakt<SEP>4,9 g
<tb><SEP>Sojamehl<SEP>20,
0 g
<tb><SEP>CaCO3<SEP>4,0 g
<tb><CEL AL=L>NaCl<SEP>2,0 g
<tb><SEP>K2HPO4<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Destilliertes Wasser (pH 7,3)<SEP>1 l
<tb></TABLE>
Nach Abschluss der Kultivierung wurden 6 l Kulturlösung mit einer entsprechenden Menge Isopropylalkohol durch Rühren vermischt. Die Mischung wurde über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert, und der entstandene Überstand wurde abgenommen. Der Überstand wurde durch Diatomeenerde filtriert, und das Filtrat wurde zur Entfernung des Isopropylalkohols unter verringertem Druck eingeengt. Das entstandene Konzentrat wurde dreimal mit Essigester extrahiert, welcher anschliessend unter verringertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde in 50%igem Isopropylalkohol gelöst, und die entstandene Lösung wurde dann zur Entfernung des Isopropylalkohols unter verringertem Druck eingeengt. Die zurückbleibende wässrige Lösung wurde auf eine mit Octadecylsilicagel gepackte Säule aufgetragen, und die austretende Lösung wurde verworfen.
Legionella-spezifische Antibiotika, die am ODS-Harz adsorbiert waren, wurden mit 70%igem Ethylalkohol eluiert, und die Eluate wurden anschliessend unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Nachdem die getrockneten Konzentrate in 80%igem Isopropylalkohol gelöst worden waren, erhielt man durch präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie (206 nm) mit Silicagel, Elution mit Acetonitrildestilliertem Wasser, 68:32, bei einer Durchflussrate von 30 ml/min, die Legionella-spezifische antibiotische Substanz AL072 als Rohprodukt. Die Rohantibiotika wurden anschliessend unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt, die getrockneten Konzentrate wurden in 50%igem Isopropylalkohol gelöst, und die entstandene Lösung wurde wieder unter verringertem Druck eingeengt. Der Isopropylalkohol wurde entfernt und der Rückstand dreimal mit Chloroform extrahiert.
Man entfernte das Chloroform und löste den Rückstand in 80%igem Isopropylalkohol. Mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie - unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Lauf - erhielt man das reine Antibiotikum AL072.
Physikalisch-chemische Eigenschaften der antibiotischen Substanz AL072:
1. Für die Dünnschichtchromatographie wurde eine Merck & Company Nr. 5642 HPTLC-Silicagelplatte mit Chloroform-Methylalkohol, 19:1, entwickelt, und die Proben des Antibiotikums AL072 wurden auf der Silicagelplatte punktweise aufgetragen und in einem verschlossenen Behälter entwickelt. Nach dem Entwickeln wurde eine 10%ige wässrige Schwefelsäurelösung mit 5% Ammoniummolybdat und Cerammoniumsulfat auf die Silicagelplatte aufgesprüht, die anschliessend 10 Minuten auf 100 DEG C erhitzt wurde, um eine Farbentwicklung zu gestatten. Als Ergebnis wurde für Antibiotikum AL072 ein Rf-Wert von 0,58 ermittelt.
2. Antibiotikum AL072 ist in Alkoholen, wie z.B. Methylalkohol, Ethylalkohol, Isopropylalkohol usw., sowie in organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Essigester, Chloroform usw., löslich, während es nicht oder nur wenig wasserlöslich ist.
3. Antibiotikum AL072 ist in wässrigen Lösungen mit pH-Werten zwischen pH 2 und pH 12 sehr stabil. Einstündiges Erhitzen auf 95 DEG C hat keine Auswirkungen auf die Aktivität von Antibiotikum AL072.
4. Ultraviolett-Spektroskopie zeigt, dass Antibiotikum AL072 in Methylalkohol ein Absorptionsmaximum bei 242 nm aufweist (Fig. 1).
5. Fig. 2 stellt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Antibiotikum AL072 in Kaliumbromid unter Verwendung eines Bruker FT-IR-Spektrometers dar.
6. Fig. 4 stellt das Protonen-NMR-Spektrum von Antibiotikum AL072 in CDCl3 unter Verwendung eines Bruker ARX400 -Spektrometers dar.
<1>H-NMR delta (400 MHz): 0,86 (3H, m); 0,87 (3H, m); 0,88 (3H, m); 0,91 (3H, m); 1,29 (43H, m); 1,61 (4H, m); 2,03 (2H, m); 2,31 (4H, m); 2,75 (1H, m); 3,62 (1H, dd, 12Hz, 6Hz); 3,72 (1H, dd, 4Hz, 12Hz); 3,96 (1H, m); 4,14 (2H, m); 5,35 (4H, m) ppm.
7. In Fig. 5 ist das Kohlenstoff-NMR-Spektrum von Antibiotikum AL072 in CDCl3 unter Verwendung eines Bruker ARX400-Spektrometers dargestellt.
<1><3>C-NMR delta (100 MHz): 12,01 (q); 14,67 (q); 19,85 (q); 23,23 (q); 23,28 (q); 25,34 (t); 25,36 (t); 26,29 (t); 27,78 (t); 27,84 (t); 27,87 (t); 28,10 (t); 28,63 (d); 29,72 (t); 29,75 (t); 29,82 (t); 29,93 (t); 30,02 (t); 30,17 (t); 30,26 (t); 30,29 (t); 30,33 (t); 30,36 (t); 30,38 (t); 30,62 (t); 30,69 (t); 32,20 (t); 34,79 (t); 34,81 (t); 35,08 (d); 37,33 (t); 39,75 (t); 63,90 (t); 65,95 (t); 70,96 (d); 128,50 (d); 128,70 (d); 130,60 (d); 130,70 (d); 174,9 (s); 181,00 (s) ppm.
Biologische Wirkung der antibiotischen Substanz AL072:
Die Auswirkungen der gemäss den obigen Vorschriften gewonnenen antibiotischen Substanz AL072 auf das Wachstum verschiedener Mikroorganismen sind in Tabelle V unten dargestellt. Daraus geht hervor, dass die antibiotische Substanz AL072 zwar gut gegen Legionella pneumophila wirkt, jedoch nicht oder nur unwesentlich gegen die anderen untersuchten Mikroorganismen.
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle V
<tb>Head Col 1: Mikroorganismus
<tb>Head Col 2:
Hemmhofdurchmesser (mm)
<tb><SEP>Legionella pneumophila ATCC 33152<SEP>108
<tb><CEL AL=L>Staphylococcus aureus<SEP>11
<tb><SEP>Streptococcus pyogenes (SEP)<->(TB><SEP>Streptococcus<SEP>20
<tb><CEL AL=L>Streptococcus agalactiae (SEP)<->(TB><SEP>Streptococcus equi<SEP>21
<tb><SEP>Streptococcus durans<CEL AL=L>24
<tb><SEP>Listeria monocytogenes<SEP>12
<tb><SEP>Corynebacterium diphtheriae<SEP>9
<tb><CEL AL=L>Bacillus subtilis<SEP>8
<tb><SEP>Bacillus megaterium<SEP>6
<tb><SEP>Escherichia coli<SEP>6
<tb><CEL AL=L>Citrobacter freundii (SEP)<->(TB><SEP>Salmonella typhimurium<SEP>14
<tb><SEP>Shigella flexneri (SEP)<->(TB><CEL AL=L>Klebsiella pneumoniae (SEP)<->(TB><SEP>Klebsiella oxytoca (SEP)<->(TB><SEP>Klebsiella aerogenes<CEL AL=L>-
<tb><SEP>Enterobacter cloacae (SEP)<->(TB><SEP>Enterobacter aerogenes<SEP>9
<tb><SEP>Serratia marcescens (SEP)<->(TB><SEP>Proteus mirabilis (SEP)
<->(TB><SEP>Proteus vulgaris<SEP>12
<tb><SEP>Proteus rettgeri (SEP)<->(TB><SEP>Proteus morgani (SEP)<->(TB><SEP>Pseudomonas aeruginosa (SEP)<->(TB><CEL AL=L>Pseudomonas cepacia<SEP>-
<tb></TABLE>
Die Empfindlichkeit von Legionella sp. gegen Antibiotikum AL072 wird im bekannten Scheibchentest geprüft. Die Vorkultur von Legionella sp. wird auf übliche Weise unter Verwen dung eines BCYE-Mediums hergestellt, das die folgende Zusammensetzung aufweist:
<tb><TABLE> Columns=2 a. Platte
<tb><SEP>Hefeextrakt<SEP>11,5 g
<tb><SEP>Aktivkohle<SEP>1,5 g
<tb><SEP>ACES<SEP>6,0 g
<tb><SEP> alpha -Ketoglutarsäure<SEP>1,0 g
<tb><SEP>Bacto-Agar<SEP>17,0 g
<tb><SEP>Destilliertes Wasser<CEL AL=L>1,0 l
<tb><SEP>pH<SEP>7,1-7,2 (mit 10M KOH)
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 b. Anreicherung
<tb><SEP>L-Cystein-HCl<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Eisen(III)-pyrophosphat<SEP>0,125 g/5ml Trockengew.
<tb></TABLE>
Das BCYE-Medium wird während 15 Minuten bei 121 DEG C und 1 Atmosphäre sterilisiert und dann auf 50-55 DEG C abgekühlt. Die Legionella sp. Vorkultur wird mit 0,9%iger Kochsalzlösung (NaCl 9,0 g + dest. Wasser 1 l) auf eine Endkonzentration von 5 x 10<6>-10<7> KBE/ml verdünnt. Die Verdünnung wird abgefüllt und in Portionen zu je 10 ml in Petrischalen gegossen, um Testplatten zu erhalten. Papierscheibchen mit einem Durchmesser von 6 mm werden mit 20 mu l Antibiotikum AL072 getränkt und dann gut getrocknet. Das getrocknete Scheibchen wird auf die vorbereitete Platte gelegt, die dann 24 Stunden im Brutschrank bei 37 DEG C inkubiert wird. Der durch Wachstumshemmung entstehende Hof wird mittels eines Messschiebers mit Noniuseinteilung gemessen.
Der Empfindlichkeitstest mit Streptococcus sp. wird gemäss ähnlichen wie oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, und zwar unter Verwendung der folgenden Medien:
<tb><TABLE> Columns=2 a. Mueller-Hinton-Medium (Difco)
<tb><SEP>Rindfleischextrakt<SEP>300,0 g
<tb><SEP>Bacto-Casaminosäuren<CEL AL=L>17,5 g
<tb><SEP>Stärke<SEP>1,5 g
<tb><SEP>Bacto-Agar<SEP>17,0 g
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 b. Sojabouillon, tryptisch (Difco)
<tb><SEP>Bacto-Trypton Sojamehl, Pankreatinverdau<SEP>17,0 g
<tb><CEL AL=L>Bacto-Sojaton Sojamehl, Papainverdau<SEP>3,0 g
<tb><SEP>Bacto-Dextrose<SEP>2,5 g
<tb><CEL AL=L>Natriumchlorid<SEP>5,0 g
<tb><SEP>Kaliummonohydrogenphosphat 10% Pferdeserum<SEP>2,5 g
<tb></TABLE>
Die Empfindlichkeit der anderen aeroben oder anaeroben Mikroben wird auf ähnliche Weise wie bei Streptococcus sp. geprüft, wobei jedoch das Pferdeserum nicht erforderlich ist.