KR19990048645A - 가습기용 레지오넬라 살균소독제 조성물 - Google Patents

Abstract

본원에는 레지오신을 함유하여 가습기수에서 증식하는 레지오넬라균을 효과적으로 살균할 수 있는 소독제 조성물이 기술되어 있다. 또한, 본원에는 레지오신과 자몽씨엑기스가 혼합 함유되어 가습기수내에 존재하는 레지오넬라를 포함한 모든 일반적인 균을 효과적으로 살균할 수 있는 소독제 조성물이 기술되어 있다.

Description

가습기용 레지오넬라 살균소독제 조성물(Anti-Legionella Composition for Humidifier)

본 발명은 레지오넬라균이 대량으로 증식하거나 증식할 가능성이 있는 가습기수에 유용한 살균소독제 조성물에 관한 것이다. 좀더 자세하게는, 본 발명은 레지오넬라균에 대해 특이적인 억제활성을 나타내는 레지오신(Legiocin)을 함유하는 가습기의 레지오넬라 살균소독제용 조성물에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 레지오신과 함께 일반적으로 알려져있는 천연 향균제가 혼합된 가습기용 향균처리 조성물에 관한 것이다.

레지오넬라 감염증의 원인균인 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)는 레지오넬라 속에 속하는 세균으로 레지오네어스 디지스(Legionnaire's disease)혹은 폰티악피퍼(Pontiac fever)를 일으키며 1976년 미국 필라델피아에서 처음 분리, 보고된 이후 미국을 비롯한 전 세계의 자연계와 환자로부터 이의 분리가 많이 보고되어져 왔으며, 현재는 10종 이상이 밝혀져 있다. 이균은 폐렴 원인균의 하나로 현재 폐렴발생 원인 중 약 15내지 20%가 이로 인한 것으로 판단되어지고 있으며 주로 냉각탑수, 가습기, 병원 및 일반 가정이 수도배관, 온수탱크, 물탱크, 샤워꼭지, 온천, 배수관 등에서 서식하며 미세한 물방울 입자와 함꼐 공기 중을 떠다니다가 호흡기로 감염이 된다.

외국의 경우 꾸준한 역학조사를 통해 레지오넬라균의 서식지에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있는 이들 서식지에 대한 살균소독에 정부가 적극 나서고 있는 실정이다. 상기 서술한 서식지등 냉각탑이 주요 감염경로로 밝혀지고 있지만, 병원 및 일반가정의 수도배곤, 온수탱크, 물탱크도 주용 감염원이 될 수 있다는 보고가 많다. 최근 1996년에는 일본 게이오대학병원 신생아실에서 가습기를 통한 레지오넬라감염증에 의해 신생아가 사망하는 사건이 있었다. 이와같이 일반가정이나 노약자가 많이 상주하는 병원에서 사용하는 가습기는 레지오넬라균의 대량 증식처가 될 수 있으며 이로 인한 집단감염이 발생할 여지가 충분히 있다.

현재 레지오넬라균종에 항균역가를 나타내는 항생물질은 에리스로마이신(Erythromycin), 리팜핀(Rifampin) 등 매크로라이드(Macrolide)계나 퀴놀론(Quinolone)계 등의 항생제가 알려져 있으며 이들이 역시 실제 감염증 치료에 사용되고 있다. 그러나 이 항생제들은 일반 미생물에도 동시에 작용하는 광범위 항생제로 이들 장기간 사용시 항생제 과다사용으로 인한 내성균의 발생 및 인체내 공존세균의 균형파괴 등의 부작용을 나타낼수 있다.

따라서 본 발명자들은 레지오넬라균종에만 선택적으로 작용하여 다른 세균의 내성증대와 같은 부작용을 최소화할 수 있는 신규 항레지오넬라 항생물질을 개발하기 위해 토양 미생물을 탐색하였으며, 그 결과 상기 요건을 만족시키는 항레지오넬라 항생물질을 생산하는 방선균을 발견하고 이로부터 레지오넬라 특이성 항생물질 AL-072를 추출해 내었다. 현재 항생물질 자체, 이항생물질은 생성하는 미생물 및 그 항생물질의 제조방법은 이미 각각 한국특허공개 제96 10867호, 한국특허 제120098호 및 한국특허 제125134호로 계류중 이거나 등록되었다.

항생물질 AL072는 이의 특이적 활성관점에서 여러분야에서 광범위하게 레지오넬라균만을 선택적으로 사멸시키키 위해 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적은 레지오넬라균들이 서식하는 곳 또는 서식 잠재성이 있는 가습기에 투여하여 면역력이 저하되어 있는 환자가 상주하는 병원이나 일반가정의 보건이생용으로 적합한 살균소독제 조성물을 개발하는데 있다.

가습기용 레지오넬라 살균소독제 조성물을 만드는 데는 다음과 같은 요건들이 구비되어야 한다.

1) 소량의 항균제로서 큰 항균 활성이 있어야 한다.

2) 레지오넬라균에 선택적이어야 좋다.

3) 독성이 없어야 한다.

4) 피부에 대한 자극성이 없어야 한다.

5) 눈 자극성이 없어야 한다.

6) 환경 잔류 활성이 강하여야 한다.

7) 경제적이어야 한다.

본 발명자들은 한국 특허 제125134에 기재되어 있는 바와 같이 항생물질 AL-072는 스트렙토마이세스 종 에이엘91(Streptomyces sp. AL91)(한국미생물보존센터에 KCCM 10055로 기탁되어 있음)을 배양한 후 다음과 같은 절차에 따라 추출 정제하였다.

배양액과 동일량의 아이소프로필알콜을 혼합하여 교반하는 하룻밤이 경과후 원심분리하여 상등액을 위하였다. 상등액은 규조토로 여과한후 감압 농축기를 사용하여 아이소프로필알콜을 회수하고 잔류액을 에틸아세데이트로 3회 추출하였다. 추출한 에틸아세테이트를 감압농축기로 회수하고 남은 잔류물을 50% 아이소프로필알콜로 녹여낸후 아이소프로필알콜만 회수하고 나머지 수용액을 오디에스(ODS, 옥타데실 실리카 겔) 수지가 충진된 칼럼에 통과시켜 통과액은 버렸다. 오디에스 수지에 부탁된 항레지오넬라 항생물질은 70% 에틸알콜로 용출한 다음 감압 농축하여 건조시킨후 80% 아이소프로필알콜에 녹여 분취고속액체크로마토그래피로 항레지오넬라 항생물질을 분취하였다.

본 발명자들은 상기 항생물질 AL-072의 추출 및 정제과정중에서 항생제 AL-072를 비롯한 그의 유도체들의 혼합물로서 다이아이온 에이취피 20(Diaion HP-20) 흡착물중 에탄올 또는 이소프로필 알코올 등의 용매에 용리시켜 얻은 조성물[이하 레지오신(Legioncin)dlfik 함]이 상기한 가습기용 레지오넬라 살균소독제로서 갖추어야할 구비 조건에 완벽하게 부합한다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 레지오신을 함유함을 특징으로 하는 가습기의 레지오넬라 살균소독제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 함유된 레지오신은 필요에 따라 가습기에 통상적으로 사용되고 있거나 사용될 수 있는 것으로 알려져 있는 천연 항균제와 함께 혼합하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 천연항균제를 혼합한 레지오신을 함유함을 특징으로하는 가습기의 살균소독제용 조성물을 제공한다.

또한, 상기한 본 발명의 조성물은 둘 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 레지오넬라 살균소독제 조성물, 천연항균제 조성물로 이루어진 그룹중에서 둘 이상이 혼합된 가습기용 살균소독제 조성물을 제공하다.

또한, 본 발명자들은 놀랍게도 천연항균제로서 현재 시판중에 있는 자몽씨엑기스(Grapefruit Seed Extract)와 50% 에탄올을 함께 레지오신이 함유된 조성물에 첨가하여 사용하였을 때 가습기에 서식하고 있던 레지오넬라균을 포함한 모든 일반적인 균이 상승적으로 살균됨을 발견하였다. 이와 같은 사실은 달리 말해서 자옴씨 엑기스의 농도를 낮추어 사용하여도 본래 사용되어오던 농도와 거의 동일한 소독효과를 제공함을 의미한다.

따라서, 본 발명은 레지오신과 함께 자몽씨엑기스 및 50% 에탄올을 함유함을 특징으로 하는 가습기수의 살균소독제용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 레지오신 농도가 가습기수의 1내지 2ppm이고 자몽씨엑기스의 농도가 가습기수의 50내지 100ppm임을 특징으로하는 가습기수의 살균소독제용 조성물을 제공한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 예시한다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

레지오신의 가습기수내 레지오넬라균에 대한 살균 효과 시험

30곳의 병원 및 일반가정의 수도수를 채취하여 레지오넬라균이 검출된 7곳의 수도수를 사용하여 레지오신의 레지오넬라 살균 효과 시험을 실시하였고 4리터 용량의 가습기통에 수도수를 채운 후 레지오신을 가습기수량의 최소지지농도인 2mg/ℓ로 투여하였다. 대조구는 레지오신을 처리하지 않은 가습기수로 하였고, 레지오신 투여전 가습기수 10㎖을 채취하고 가습기를 작동시킨후 가습기수를 2시간 간격으로 10㎖씩 채취하였으며 채취한 가습기수 원액 1㎖을 멸균된 인산완충용액(pH 7.2)으로 10배 희석한후 잘 섞는다. 희석한 가습기수 1㎖을 멸균된 인산완충용액(pH 7.2)으로 다시 10배 희석한후 잘 섞어서 각각의 0.1㎖을 레지오넬라용 선택배지에 도말하여 36±1℃에서 습도를 유지하면서 10일에서 14일 동안 배양하여 자란 클로니수를 측정하여 레지오넬라균 수를 측정하였다. 레지오넬라용 선택배지는 레지오넬라균의의 다른 생물의 생육을 억제하는 배지로서 GVPC(목탄 1.5g/ℓ, 효모분말 11.5g/ℓ, ACES 6g/ℓ,α-케토글루타레이트 1g/ℓ, 시스테인 0.2g/ℓ, 피로인산제이철 0.125g/ℓ, 글라이신 3g/ℓ, 폴리믹신 100,000TU/ℓ, 밴코마이신 5㎎/ℓ, 사이클로헥사마이드 80㎎/ℓ)배지를 사용하였다. 배양후 선택배지에서 자란균이 레지오넬라균인지의 여부는 재차 항혈청을 이용한 방법(SAT, Slide Agglutination Test)으로 확인하였다.

레지오신의 투여후 레지오넬라 살균 측정 결과

결과는 하기 표 1에 나타내었다. 레지오신을 투여하지 않은 대구조에서는 시간이 지날수록 레지오넬라균이 증가하였으며 레지오신을 첨가한 실험구에서는 살균제 투여 후 2시간째부터 레지오넬라균수가 급격히 감소하기 시작하였고 4시간부터는 거의 모든 가습기에서 레지오넬라균이 검출되지 않았다. 이는 본 실험에서 사용한 살균제가 효과적으로 레지오넬라균의 성장을 억제하거나 사멸시키는 효과를 보인다는 것을 입증해주고 있다.

[표 1]

레지오신 투여 후 레지오넬라 살균 측정 결과

실시예 2

레지오신의 급성독성 시험

시험물질 항레지오넬라 살균소독제 레지오신(Legiocin)의 급성독성을 조사하기 위하여 암수 아이씨알(ICR) 마우스에 경구로 단회투여하여 14일간의 사망률, 일반중상, 체중의 변화 및 부겸소견을 곤찰하였다. 시험군은 암수 모두 0, 2500 및 5000mg/kg으로 설정하였으며, 각 군당 사용동물수는 암수 각각 5마리씩이었다. 이와 같이 시험한 결과는 다음과 같다.

(1) 시험물질의 투영에 의한 사망동물은 암수 모든 투여군에서 관찰되지 않았다.

(2) 시험물질의 투여에 의한 일반증상의 변화는 암수 모든 투여군에서 관찰되지 않았다.

(3) 시험물질의 투여에 의한 체중의 변화는 암수 모든 투여군에서 관찰되지 않았다.

(4) 시험물질의 투여에 의한 부검소견의 이상은 암수 모든 투여군에서 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 보아 레지오신의 ICR 마우스에 있어서 급성경구투여에 의한 독성증상은 전혀 관찰되지 않았으며 LD₅₀값은 암수 모두 5000mg/kg 이상이라고 사료된다.

실시예 3

레지오신의 돌연변이 유발 시험

시험물질 레지오신의 돌연변이 유발성 여부를 검색하기 위하여 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 영양요구성 균주 TA1535, T1537, TA100을 이용, 복귀돌연변이시험을 실시하였다. 대사활성계 부재 (직접법,-S) 및 존재 (대사활성법, +S) 하에 1, 2, 3, 37.0, 111.1, 333.3 및 1000mg/평판의 다섯가지 농도와 음성, 양성대조군으로 시험군을 설정하여 본 시험을 실시한 결과 4개 균주 모두에서 음성의 결과를 얻었다. 따라서 레지오신은 본 시험조건 하에서 시험균주에 대해 His^-→His⁺로의 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료된다.

실시예 4

레지오신의 변이원성 시험

레지오신의 변이원성 여부를 검색하기 위해 차이니즈 햄스터 유래 폐선유아세포(CHL)를 이용하여 대사활성계 존재(+S) 및 부재(-S)하에 염색체 이상시험을 수행하였다. 시험물질 농도를 0, 80, 320mg/㎖(+S, 6시간 처리) 및 0, 7.5, 15, 30mg/㎖ 처리군에서 염색체의 구조적 및 숫적 이상 빈도에서 통계학적으로 유의한 증가를 나타내었다. 그러나 이상핵판의 백분율은 8.0, 염색체이상의 빈도는 9.0으로 비교적 낮았으며, 이 경향은 확인시험에서도 다시 나타났다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 레지오신은 본 시험조건 하에서 CHL 세포에 대해 염색체의 구조적 이상 및 숫적 이상을 유발하는 물질로 판단되나 그 정도는 미약한 것으로 사료된다.

실시예 5

레지오신의 피부 자극성 시험

기존의 항생제인, 에리스로마이신, 사이프로플록삭신 및 본 발명에 이용되는 레지오신의 피부에 대한 자극성을 소사하였다. 시험방법으로는 사람피부 첩포 테스트를 사용하였다. 우선 피검사를 여성 및 남성 구분없이 20-30세 사이에 각각 15명을 선별하여 총 30명을 시험대상으로 하였다.

각 항생제를 100mg/㎖되게 용해시킨 다음 디스크여지(paper disc : 직경 0.8㎜)에 각 용액을 흡수시키고, 흰 챔버(Finn chamber : Norgesplaster A/S, Norway)에 얹어 피검자의 팔의 하박부에 48시간 부착하여 다음과 같은 기준으로 판정하였다.

판정기준

++ : 발적(redness)이 심한 경우 (2점)

+ : 발적이 조금 있는 경우 (1점)

± : 발적이 미약한 경우 (0.5)

- : 발적이 없는 경우 (0점)

시험결과는 다음 표 2에 나타내었다.

[표 2]

사람 피부 첩포 시험결과

실시예 6

레지오신의 눈 자극성 시험

실시예 5의 피부 자극성 시험에서와 같은 농도(100㎎/㎖)를 전후로 농도별(50, 100, 150, 200ppm)로 눈 자극성에 대한 시험을 실시하였으며 시험방법으로는 아이텍스 시스템(Eytex system, Ropak사)에 따라 아이텍스(Eytex) 시약 UM을 이용하여 실시하였으며 Ropak사에서 제공하는 소프트웨어(Sotfware)를 이용하여 최종 판정하였다. 판정기준은 다음과 같다.

아이텍스 판정기준

아이텍스 점수 분류

0∼10 무자극

8∼12 무자극/최소자극

13∼15 최소자극

15∼18 최소/온화한 자극

19∼22 온화자극

22∼25 온화/보통자극

26∼33 보통자극

33∼35 보통/심한자극

36∼45 심한자극

45∼55 심한/최대자극

>55 최대자극

[표 3]

아이텍스 판정 결과

시험 결과는 표 3에 나타난 바와 같이 레지오신은 200ppm 이하에서 <최소 자극>으로 판정되었고 에리스로마이신 및 사이프로플록사신은 <약간의 자극>으로 판정되어 레지오신이 종래의 항생제보다 눈에 대한 자극성이 훨씬 적음을 알 수 있다.

실시예 7

레지오신의 안정성 시험

Legiocin의 환경에서 안정성을 위하여 다음 항목을 중점적으로 조사하였다.

(1) 산성 pH 및 알카리성 pH에서의 Legiocin의 안정성을 조사하기 위하여 0.2M 시트레이트포스페이트 완충액)ph 3, 5, 7, 9, 10)에 각각 100ppm 되게 레지오신을 첨가하여 30℃에서 2, 4, 6, 8주 간격으로 항균 활성을 조사하였다. 시험 방법은 레지오넬라 뉴모필라 에이티시시 33152(Legionella pneumophila ATCC 33152)균의 농도를 10⁴cells/㎖로 맞춘 후 100㎖씩을 밀러힌톤 한천 배지(Mueller-Hinton agarmedium : Beef, infusion from 300.0gr : Bacto Casamino Acids, Technical 17.5 : Starch 1,5gr : Bacto Agar 17.0gr)에 도말하고, 그 위에 레지오신 20㎖를 흡입시킨 직경 6㎜의 디스크여지(paper disc)를 올려 놓고 37℃, 48시간 배양 후 저지환을 관찰 측정하였다.

그 결과 8주후 산성(pH 4)에서 1005의 활성을 유지하였고, 알카리성 pH에서는 80%이상의 활성이 잔존하였다.

(2)Legiocin의 고온 안정성을 알아보기 위하여 50% 에탄올(pH 7)에 100ppm 되게 용해시켜 시험한 결과 60℃에서 10일간 보존하여도 항균활성이 그대로 유지되나 100℃에서 120분간 처리하면 항균활성이 5%가 감소되었다.

실시예 8

레지오신과 자몽씨엑기스 혼합물의 가습기수 살균효과

[표 4]

가스기용 살균소독제의 조성

표 4와 같은 조성물로서 4리터의 가습기수를 갖는 가습기에 살균제를 하루 1회 5㎖씩 투여하여(가습기수 4리터, 8시간 가동 기준) 레지오신과 자몽씨추출물을 혼합한 조성물의 살균 효과를 실시하였으며 30곳의 병원 및 일반가정의 수도수를 채취하여 레지오넬라균이 검출된 6곳의 수도수를 사용하여 시험을 실시하였다. 가습기용 살균소독제 투여전 가습기수 10㎖을 채취하고 가습기를 작동시킨후 8시간 후에 가습기수 10㎖을 채취하여 레지오넬라균 및 일반세균의 균수를 비교하였다. 레지오넬라균수의 측정을 위해서 채취한 가습기수 원액 1㎖을 멸균된 인산완충용액(pH 7.2)으로 10배 희석한후 잘 섞는다. 희석한 가습기수 원액 1㎖을 멸균된 인산완충용액(pH 7.2)으로 다시 10배 희석한후 잘 섞는다. 희석한 가습기수 1㎖을 레지오넬라용 선택배지에 도말하여 36±1℃에서 습도를 유지하면서 10일에서 14일 동안 배양하여 자란 콜로니수를 측정하여 레지오넬라균 수를 측정하였다. 레지오넬라용 선택배지는 레지오넬라균외의 다른 미생물의 생육을 억제하는 배지로서 GVPC(목탄 1.5g/ℓ, 효모분말 11.5g/ℓ, ACES 6g/ℓ,α-케토글루타레이트 1g/ℓ, 시스테인 0.2g/ℓ, 피로인산제이철 0.125g/ℓ, 글라이신 3g/ℓ, 폴리믹신100,000IU/ℓ, 밴코마이신 5㎎/ℓ, 사이클로헥사마이드 0.125g/ℓ)배지를 사용하였다. 배양후 선택배지에서 자란균이 레지오넬라균인지의 여부는 재차 항혈청을 이용한 방법(SAT, Slide Agglutination Test)으로 확인하였다. 일반세균수의 측정을 위해서는 채취한 가습기수 원액 1㎖을 멸균된 0.1% 펩톤용액(pH 7.0)으로 10배 희석한후 잘 섞는다. 희석한 가습기수 1㎖을 멸균된 0.1% 펩톱용액(pH 7.0)으로 10배 희석한 후 잘 섞어서 각각 0.1㎖을 평판에 점적한 후 멸균한 총균수 측정용배지인 TGY 배지(트립톤 5g/ℓ, 효모분말 2.5g/ℓ, 포도당 1g/ℓ, 박토 한천 15g/ℓ)를 42℃로 식힌 후 20㎖씩 분주하여 잘 섞은 후 굳힌다. 굳힌 후 32℃에서 3일간 배양 후 나타난 콜로니의 수를 측정하여 일반세균으로 균수를 측정한다.

가습기용 살균소독제 투여 후 결과

표 5에서 보듯이 살균소독제 처리 8시간 후 레지오넬라균은 전혀 발견되지 않았으며 일반세균의 경우에는 그 수가 99% 이상 현저히 감소한 것을 볼 수 있었다. 이는 표 4와 같은 조성물의 소독제가 가습기수의 살균소독제로 매우 효과적임을 지시하고 있다.

[표 5]

레지오신과 자몽씨엑기스 혼합물의 가습기수 살균효과

상기 시험의 결과에 의거, 본 발명에 따른 레지오신을 함유한 조성물은 환경 및 위생상 아무런 위험 또는 부작용을 유발하지 않으면서 가습기수의 살균소독제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 레지오신을 함유함을 특징으로 하는 레지오넬라균 살균 소독제용 조성물.
2. 제1항에 있어서 가습기수에 사용되는 조성물.
3. 레지오신과 자몽씨엑기스 및 505 에탄올이 함께 혼합되어 함유함을 특징으로 하는 살균소독제용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 가습기수에 사용되는 조성물.
5. 제3항 또는 4항에 있어서, 레지오신의 농도가 가습기수의 1 내지 2ppm이고, 자몽씨엑기스의 농도가 50 내지 100ppm인 소독제 조성물.