KR0125134B1 - 레지오넬라특이성 항생물질의 제조방법 - Google Patents

레지오넬라특이성 항생물질의 제조방법

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Abstract

1. 청구범위에 기재되어 있는 발명이 속하는 기술분야
항레지오넬라물질의 제조방법
2. 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제
레지오넬라균 종에만 선택적으로 작용할 수 있는 항생물질의 분리
3. 기술적 과제의 해결방법의 요지
스트렙토마이세스속에 속하는 미생물로서 탄소원으로 수크로스, D-만니톨, D-프럭토스만을 주로 이용하고 젤라틴을 액화하지 못하지만 전분을 분해하며 나선형 분절포자사슬과 매끄러운 포자표면을 가짐을 특징으로 하는 미생물 스트렙토마이세스 에스피 에이엘91(Streptomyces sp. AL91 KCCM 10055)을 배양한 배양액을 아이소프로필, 에틸아세테이트 추출후 오디에스 수지가 충진된 컬럼과 고속액체크로마토그래피를 차례로 통과시켜 특이성 항레지오넬라 활성을 갖는 유효물질을 정제함을 특징으로 하는 특이적 항레지오넬라물질의 제조방법.
4. 발명의 중요한 용도
의약

Description

레지오넬라특이성 항생물질의 제조방법
본 발명은 항레지오넬라 항생물질을 생산하는 미생물 스트렙토마이세스 종 에이엘91(Streptomyces sp. AL91 KCCM 10055)을 이용하여, 하기 구조식의 항레지오넬라 항생물질을 생산하는 방법에 관한 것이다:
레지오넬라 감염증의 원인균인 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)는 레지오넬라 속에 속하는 세균으로 레지오넬라질병(Legionella's disease) 혹은 폰티악열병(Pontiac fever)를 일으키며 1976년 미국 필라델피아에서 처음 분리, 보고된 이후 미국을 비롯한 전 세계의 자연계와 환자로부터 이의 분리가 많이 보고 되어져 왔으며, 현재는 10종 이상이 밝혀져 있다.
이 균은 폐렴 원인균이 하나로 현재 폐렴발생 원인중 약 5%가 이로 인한 것으로 판단되어 지고 있으며 주로 냉각탑수, 음료수용 수도배관, 배수관 등에서 서식하며 미세한 물방울 입자와 함께 공기중을 떠다니다가 호흡기로 감염이 된다. 또한 우리 나라에서도 지난 1984년 7월 서울 고려병원 중환자실의 의료진과 입원환자에게서 집단발생한 원인불명의 폐렴증세가 레지오넬라균에 의한 것으로 밝혀져 사회적으로 큰 물의를 일으킨 일이 있다.
1985년 국립보건원에서 냉각탑수 내의 레지오넬라균 분포를 조사한 결과, 서울시내 냉각탑수의 90% 이상이 이 균에 오염된 것으로 밝혀졌으며, 분리된 레지오넬라균의 93%가 레지오넬라 뉴모필라로 동정된 바 있다. 또한 1988년 6월에서 9월까지 서울, 부산, 대전 등 전국 주요도시에서 행해진 냉각탑수 조사 결과 약 60%가 레지오넬라균에 오염되어 있었으며 분리균 중 83%가 레지오넬라 뉴모필라 혈청군 1(serogroup 1)로 밝혀졌다.
현재 레지오넬라균종에 항균역가를 나타내는 항생물질은 에리스로마이신(Erythromycine), 리팜핀(Rifampin) 등 마크로라이드(Macrolide)계나 퀴놀론(Quinolone)계의 항생제가 알려져 있으며 이들이 역시 실제 감염증 치료에 사용되고 있다. 그러나, 이 항생제들은 일반 미생물에도 동시에 작용하는 광범위 항생제로 장기간 사용시 항생제 과다사용으로 인한 내성균의 발생 및 인체내 공존세균의 균형파괴 등의 부작용을 나타낼 수 있다. 또한 레지오넬라균의 오염원인 냉각탑수의 소독도 화학약품에 의존하고 있어 환경오염 및 냉각장치의 부식 등의 심각한 문제점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명자들은 레지오넬라균종에만 선택적으로 작용하여 다른 세균의 내성증대와 같은 부작용을 최소화할 수 있는 신규 항레지오넬라 항생물질을 개발하기 위해 토양미생물을 탐색한 결과 이러한 요건을 만족시키는 항레지오넬라 항생물질을 생산하는 방선균을 분리할 수 있었다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[실시예 1]
토양미생물의 분리는 건조된 토양샘플 1.0g을 10ml의 멸균 증류수에 현탁, 희석하여 방선균 분리용 배지에 0.1ml씩 분주, 도말한 평판배지를 28℃에서 14~21일 동안 배양함으로써 수행되었다. 방선균 분리용 배지는 항진균제 사이클로헥시미드(Cycloheximide, 50㎍/ml)와 항균제 날리딕식산(Nalidixic acid, 200㎍/ml)을 포함하는 휴믹산-바이타민 한천배지(Humicacid-Vitamine agar)를 사용하였으며 121℃에서 15분간 멸균한 후 별도로 여과살균한 항진균제와 항균제를 첨가하였다. 휴믹산-바이타민 한천배지의 조성은 표 1과 같다.
[표 1]
휴믹산-바이타민 한천배지 조성물
이러한 방법으로 얻어진 토양방선균 집락을 순수 분리하여 검정균으로 사용된 대장균(Escherichia coli ATCC 25922), 고초균(Bacillus subtilis ATCC 6633), 스테필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 스테필로코커스 오레우스 ATCC 1269, 스테필로코커스 오레우스 ATCC 1198, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus ATCC 9341), 세라티아 종(Serratia sp.), 마이코박테리움 플라이(Mycobacteriumphlei IFO 3158) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등에는 항생역가를 보이지 않으면서 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila ATCC 33152)에 대해서만 강한 항균력을 보이는 항생물질을 생산하는 방선균을 분리한 것이 본 발명의 미생물인 스트렙토마이세스 종. AL91 KCCM 10055이다.
이 미생물의 생육은 전반적으로 양호하였으며 기균사는 주로 황색, 갈색이었으며 배면색은 주로 갈색이었다. 이 미생물의 전자현미경 관찰 결과 포자 사슬은 나선형이었으며 포자 표면은 매끄러웠고 포자 사슬은 분절된 형태를 나타내었다. 이 미생물은 배지내의 수크로스, 디-만니톨, 디-프럭토스는 이용하지만 기타의 당류는 거의 이용하지 못하는 것으로 나타났으며 젤라틴 액화력은 음성, 전분 분해력은 양성으로 나타났다.
이러한 분리주의 형태학적, 배양학적 특성 및 생리학적 특성을 종합하여 기존의 방선균과 비교하여 본 결과 스트렙토마이세스속의 새로운 종으로 판단되어 이 분리주를 스트렙토마이세스 종 AL91로 명명하고 부다페스트조약하에 한국미생물보존센터에 1994년 6월 2일자로 기탁하였으며 그 수탁번호는 KCCM 10055이다.
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 배양학적 특성은 표 2와 같다.
[표 2]
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 배양학적 특성
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 탄소원 이용특성은 표 3와 같다.
[표 3]
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 탄소원 이용특성
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 여러가지 항생물질에 대한 내성시험 결과는 표 4와 같다.
[표 4]
스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055의 항생물질 감수성
[실시예 2]
본 발명의 미생물을 배양하여 생산된 항레지오넬라 항생물질을 분리,정제하였으며, 이 물질의 항레지오넬라 항생효과를 측정하였다. 표 5의 한천배지에 접종하여 3일간 배양한 스트렙토마이세스 종 AL91 KCCM 10055균을 표 6의 액체배지 200ml에 접종하여 28℃에서 3일간 호기적(Aerobic)으로 종배양하였다. 종배양된 배양액을 표 7의 액체배지 6ℓ에 접종하여 28℃에서 5일간 호기적(Aerobic)으로 배양하였고 이렇게 얻어진 미생물 배양액으로부터 항레지오넬라 항생물질을 분리,정제하였다.
[표 5]
항레지오넬라 항생물질 생산균 배양용 한천배지 조성
[표 6]
항레지오넬라 항생물질 생산균 종배양용 액체배지 조성
[표 7]
항레지오넬라 항생물질 생산균 생산용 액체배지 조성
배양이 완료되면 배양액 6ℓ와 동일량의 아이소프로필알콜(Isopropyl Alcohol)을 혼합하여 교반하고 하룻밤이 경과 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액은 규조토로 여과한 후 감압 농축기를 사용하여 아이소프로필알콜을 회수하고 잔류액을 에틸아세테이트(Ethylacetate)로 3회 추출하였다. 추출한 에틸아세테이트를 감압농축기로 회수하고 남은 잔류물을 50% 아이소프로필알콜로 녹여낸 후 감압농축하여 아이소프로필알콜만 회수하고 나머지 수용액을 오디에스(ODS, Octadecyl Silica Gel) 수지가 충진된 컬럼(Column)에 통과시켜 통과액은 버렸다. 오디에스수지에 부착된 항레지오넬라 항생물질은 70% 에틸알콜(Ethyl Alcohol)로 용출한 다음 감압농축하여 건조시킨 후 80% 아이소프로필알콜에 녹여 분취고속액체크로마토그래피(Preparative HPLC)로 항레지오넬라 항생물질을 분취하였다. 분취고속액체크로마토그래피의 운전조건은 표 8과 같다. 분취된 항레지오넬라 항생물질은 감압농축하여 건조시키고 50% 아이소프로필알콜로 녹여낸 후 다시 감압농축하여 아이소프로필알콜만 회수하고 클로로포름(Chloroform)으로 3회 추출하였다. 추출한 클로로포름을 감압농축기로 회수하고 남은 잔류물은 80% 아이소프로필알콜로 녹여낸 후 고속액체크로마토그래피를 재실시하여 항레지오넬라 항생물질을 최종 분취하였다. 재실시한 고속액체크로마토그래피 운전조건은 표 8과 동일하였다. 분취된 항레지오넬라 항생물질은 감압농축하여 건조시키고 80% 아이소프로필알콜로 녹여내어 항레지오넬라 항생효과를 측정하는 재료로 사용하였다.
[표 8]
항레지오넬라 항생물질 분리를 위한 분취고속액체크로마트그래피 운전조건
상기의 방법으로 얻어진 항레지오넬라 항생물질의 항레지오넬라 항생효과는 표 9와 같이 나타났다. 표 9에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 미생물에 의하여 생산된 항레지오넬라 항생물질은 레지오넬라균에는 강한 항생활성을 나타내지만 기타의 미생물에는 항생활성을 크게 나타내지 못하는 항레지오넬라 특이성 항생효과를 보였다.
[표 9]
항레지오넬라 항생물질의 항생효과
[참고예 1]
실시예 1의 정제과정을 통하여 수득된 무색 내지 옅은 노란색 점성용액 상태의 AL072를 머크(Merck)사 제품 No. 5642 HPTLC 실리카젤판과 클로로포름과 메틸알콜(혼합비 19 : 1)의 혼합용매를 사용하여 박층크로마토그래피한 결과 AL072는 단일 물질임을 확인하였다.
(1) 박층크로마토그래피(TLC)상의 특성
박층크로마토그래피용 실리카젤판은 머크(Merck)사 제품 No. 5642 HPTLC판을 사용하였으며, 전개용매로는 클로로포름과 메틸알콜(혼합비 19 : 1)의 혼합용매를 사용하였다. AL072 시료를 실리카젤판에 점적하여 상온의 밀폐된 용기에서 전개시켰다. 전개후 5% 몰리브덴산 암모늄(Ammonium Molybdate)과 0.1% 황산세릭 암모늄(Ceric Ammonium Sulfate)이 함유된 10% 황산 수용액을 실리카젤판에 분무한 다음 100℃에서 10분간 가열하여 발생시켰다. 이 조건에서 AL072의 Rf치는 0.58이었다.
(2) 용해성
AL072는 메틸알콜, 에틸알콜, 아이소프로필알콜 등의 알콜류와 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 유기용매에는 잘 녹지만 물에는 거의 녹지 않는다.
(3) 안정성
pH 2와 pH 12 사이의 수용액 상태에서도 매우 안정하며 95℃에서 1시간 가열한 후에도 역가의 손실이 없었다.
(4) 자외선 흡수 스펙트럼
AL072를 메틸알콜에 용해하여 적외선 흡수스펙트럼을 조사한 결과 242㎚에서 최대 흡광도를 나타내었다. 자외선 흡수스펙트럼은 제 1도에서 보는 바와 같다.
(5) 적외선 흡수 스펙트럼
측정계기 : Bruker FT-IR
방법 : 포타슘브로마이드(KBr) 펠렛
(6) 질량분석
측정계기: JEOL SX-102A
용매 : 글리세롤
질량(m/z) : 648
(7) 핵자기공명 스펙트럼
측정계기 : Bruker ARX400
용매 : CDCl3
가) 양성자 핵자기공명 스펙트럼
1H-NMR(400MHz)의 ppm단위의 화학적 이동, ( )는 양성자 갯수와 다중도를 표시(s) : 단일선, (d) : 이중선, (t) : 삼중선, (m) : 다중선
나) 탄소 핵자기공명 스펙트럼
13H-NMR(100MHz)의 ppm단위의 화학적 이동, ( )는 양성자 갯수와 다중도를 표시(s) : 단일선, (d) : 이중선, (t) : 삼중선, (m) : 다중선

Claims (1)

  1. 미생물 스트렙토마이세스 종 에이엘91(Streptomyces sp. AL91 KCCM 10055)을 배양한 배양액을 아이소프로필알콜 및 에틸아세테이트로 추출 후 오디에스 수지가 충전된 컬럼과 고속액체크로마토그래피를 차례로 통과시켜 특이성 항레지오넬라 활성을 갖는 유효물질을 정제함을 특징으로 하여, 하기 구조식의 특이성 항레지오넬라 물질을 제조하는 방법 :
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