CH646995A5

CH646995A5 - Verfahren zur herstellung von 12beta-hydroxycardenolidderivaten auf mikrobiologischem wege.

Info

Publication number: CH646995A5
Application number: CH962579A
Authority: CH
Inventors: Karoly Albrecht; Zoltan Prof Dr Szeleczky; Eva-Cserei-Pechan Udvardy-Nagy; Maria Prof Herpay; Istvan Prof Dr Szabo
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1978-10-30
Filing date: 1979-10-26
Publication date: 1984-12-28
Also published as: DD147113A5; DE2943817C2; NL7907937A; GB2034716B; HU176250B; DE2943817A1; GB2034716A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von eine 12ß-Hydroxylgruppe und gegebenenfalls eine 7ß-Hydroxylgruppe enthaltenden Cardeno-liden der Formel I oder deren Gemischen

R—O

worin Y ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel IV

0derV CH.

3 646995

bedeuten.

Es ist bekannt, dass einige Cardenolide pflanzlichen Ursprungs, z.B. das Lanatosid-C und das Digoxin unmittelbar als Arzneimittel verwendet werden können, während andere, 5 wie das Lanatosid-A, das Acetyldigitoxin und das Digitoxin, nur durch vorherige chemische oder mikrobiologische Umsetzung in therapeutisch verwendbare Form gebracht werden können. Diese Umsetzungen bezwecken die Abspaltung der Glucose- bzw. Acetylgruppe der primären Glykosiden, be-io sonders aber die Hydroxylierung der 12-Desoxy-glykosiden.

Derartige Umsetzungsverfahren sind bereits bekannt. Ein Hydrolyseverfahren ist z.B. in der ungarischen Patentschrift Nr. 175 601 beschrieben; nach diesem Verfahren kann das Lanatosid-A auf mikrobiologischem Weg, durch die Anwen-15 dung von Streptomyces griseolus in Digitoxin übergeführt werden.

Nach den japanischen Patentschriften 42 24 498, bzw. 42 22 611 bis 42 22 614 kann Digitoxin durch Hydroxylierung mit Hilfe von Streptomyces diastatochromogenes, 20 Streptomyces owasiensis, Trichocladium asperum, Mortierel-la isabellina bzw. Circinelle muscae Stämmen in Digoxin übergeführt werden.

Nach der ungarischen Patentschrift Nr. 175 474 werden aus Digitoxin bzw. Acetyldigitoxin mit Hilfe einer submersen 25 Kultur von Streptomyces praecox Digoxin und Acetyldigoxin hergestellt.

Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Schaffung eines neuen Verfahrens, nach welchem Cardenolide der primären und sekundären Reihen in einem einzigen 30 Fermentationsschritt in 12ß-Hydroxylgruppen enthaltende Cardenolide der sekundären Reihe übergeführt werden können.

Die Erfindung stammt aus der Erkenntnis, dass einige aus verschiedenen Böden isolierte Strahlenpilzkulturen, und zwar 35 die Stämme KA-26, KA-43, KA-82, KC-157 und AB-318-ST neben der 12-Oxygenase-Aktivität auch ß-Glykosidase- und Desacetylase-Aktivität besitzen.

Die wichtigsten diagnostischen Merkmale dieser Stämme wurden - auch im Vergleich mit der Beschreibung von typi-40 sehen Stämmen nahe verwandter Pilzarten - auf Grund der nachstehend ausführlich beschriebenen Untersuchungen bestimmt.

Die Beschreibung des Stammes AB-318 ST Morphologie

Die Sporenträger sind vom Typ Rectus flexibilis, lang, gerade, mit mehr als 50 Sporen je Sporenkette. Diese morphologischen Eigenschaften sind an Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Haferflocken-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar und an anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar beobachtbar, so Nach elektronenmikroskopischen Beobachtungen haben die Sporen glatte Oberfläche. Die Farbe der Luftmyzelien gehört nach den vergleichenden Untersuchungen mit dem Tresner-Backus'sehen Farbenrad zur Serie «White» (W). An sämtlichen oben erwähnten Standard-Nährböden ist diese Farbe 55 identifizierbar. Das Substrat-Myzel zeigt an verschiedenen Nährböden die folgenden Farben: Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: graugelb (Co 81): Yb, Haferflocken-Agar: nicht bestimmbar, Glycerin-Asparagin-Agar: gelb (Co 68; Co 70) Y-b, Stärke-Agar mit anorganischen Salzen: gelb (Co 37; Co 67) 60 Y-b. Das Pigment des Substrat-Myzels hat keinen Indikator-Charakter. An den oben erwähnten Nährböden kann keine Exopigmentbildung beobachtet werden. An Pepton-Eisen-Agar und an Tyrosin-Agar wird kein Pigment vom Melanin-Typ gebildet; die Melanoidpigment-Reaktion ist negativ. 65 Die folgenden Kohlenhydrate wurden gut verwertet: d-Glucose, 1-Arabinose, d-Xylose, i-Inosit, Mannit, d-Fructose und Raffinose; Saccharose und Rhamnose werden nicht verwertet.

646 995

4

Die wichtigsten diagnostischen Merkmale des Stammes AB-318-ST wurden in der nachstehenden Tabelle 1 zusam-mengefasst und mit den entsprechenden Merkmalen eines

Tabelle 1

Stammes vom Streptomyces alboniger Typ (ISP 5043) verglichen.

Sporenträger-Morphologie

Sporenoberfläche-Morphologie

Farbe des Luftmyzels

Farbe des Substratmyzels

Indikator-Charakter des

Substratmyzels

Lösliches Pigment

Indikator-Charakter des löslichen Pigments

Melanoidpigment M6

Melanoidpigment M7

Kohlenhydratverwertung:

d-Glucose

1-Arabinose d-Xylose i-Inosit Mannit d-Fructose

Saccharose Rhamnose Raffinose

Streptomyces AB-318-ST

Streptomyces alboniger ISP 5043

RF glatt W Y-b

+ + + + + +

+

abweichende

Resultate +

H-

abweichende Resultate

+

abweichende Resultate

Die in der obigen und in den nachfolgenden Tabellen verwendeten Zeichen bzw. Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

RF: Sporenträger vom Rectus-flexibilis Typ

RA: Sporenträger vom Retinaculum-apertum Typ

S: Sporenträger vom Spira

M2: Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

M3: Haferflocken-Agar

M4: Stärke-Agar mit anorganischen Salzen

M5: Glycerin-Asparagin-Agar

M6: Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar

M7: Tyrosin-Agar

Die Daten der Farbenserie sind nach den Bezeichnungen der Tresner-Backus'schen Farbenbestimmung angegeben [Tresner u. Backus: Appi. Microbiol. 11,335 (1963) );E Küster: Int. Bull. Bact, Nom. Tax. 14,1 (1964)].

40 Auf Grund der obigen Daten wurde der Stamm AB-318-ST als Streptomyces alboniger bestimmt und am 26.09.1978 in der Hungarian National Collection of Medicai Bacteria, National Institute of Hygiene, Gyâli ut 2-6, H-1966 Budapest unter Nr. MNG 180 deponiert.

45 In der nachfolgenden Tabelle 2 sind die charakteristischen Eigenschaften der Stämme Streptomyces sp. KA-26, Streptomyces sp. KA-43, Streptomyces sp. KA-82 und Streptomyces sp. KC-157 zusammengefasst.

Tabelle 2

KA-26

KA-43

KA-82

KC-157

Sporen

M2

S

RA

S

RA

träger

M3

S

(Morpho

M4

S

logie)

M5

RA

S

RA

Sporen

oberfläche

stachelig stachelig stachelig stachelig

Farbe des

M2

R(7ca):

R(7ca)

R(7ca):

R(7ca)

Luftmyzels

V(llca)

M3

R(5ca)

M4

R(7ca; 3ca)

R(5ca; 7ca)

M5

W(13ba)

5

646 995

(Fortsetzung Tabelle 2)

KA-26

KA-43

KA-82

KC-157

Farbe des

Y-b+blue

Y-b + blue

Substratmyzels

-red

— red

-red

— red

Indikator-

HCl von purpur von purpur von purpur von purpur

-Charakter

in rot in rot in rot in rot des Substrat

myzels

NaOH

von purpur von purpur von purpur von purpur

in blau in blau in violett in blau

Lösliches

M2

violett blass violett violett

Pigment

violett

M3

blau blau blau blau

M4

violett violett violett violett

M5

blass blass blass blass

violett violett violett violett

Indikator-

HCl von violett von violett von violett von violett

Charakter des

in orange in orange in orange in orange löslichen

NaOH

von violett von violett vonviolett von violett

Pigments

in blau in blau in blau in blau

Melanoides

M6

+

Pigment

M7

—

Verwertung d-Glucose

+

von

1-Arabinose

+

Kohlenstoff d-Xylose

+

quellen i-Inosit

+

d-Mannit

+

d-Fructose

+

Saccharose

+

Rhamnose

+

■ +

+

Raffinose

+

35

Wie es aus den obigen Daten ersichtlich ist, zeigen die in der Tabelle 2 beschriebenen Stämme völlige taxonomische Identität unter einander. Die Sporenträger gehören morphologisch zu dem «Spira» Typ, nur an den Nährböden M2 bzw. M 5 zeigt sich gelegentlich der Typ «Retinaculum-apertum». Sowohl das Substratmyzel als auch das lösliche Pigment haben Indikator-Charakter.

In der nachstehenden Tabelle 3 sind die Standard-Beschreibungen der Stämme KA-28, KA-43, KA-82 und KC-157, sowie eines Stammes von Streptomyces purpurascens Typ (ISP 5310) zusammengefasst.

40

Tabelle 3

Sporenträger (Morphologie) Sporenoberfläche Farbe des Luftmyzels

Streptomyces sp. KA-28, KA-43 KA-82, KC-157

S

Stachelig R(3ca; 5ca; 7ca) V(1 Ica)

Streptomyces purpurascens ISP 5310

S

stachelig R:W

Farbe des Substratmyzels

Y-b + blue — red

Indikator-Charakter

HCl von violett in purpur von purpur in rot

NaOH von rot in violett von purpur in blau

Lösliches Pigment Indikator-Charakter des löslichen Pigments Melanoides Pigment

M6 M7

rot: blau violett wie bei dem Substratmyzel + +

646995

(Fortsetzung Tabelle 3)

d-Glucose

+

1-Arabinose

+

d-Xylose

+

i-Inosit

+

Mannit

+

d-Fructose

+

Saccharose

+

Rhamnose

+

Raffinose

+

Auf Grund der Übereinstimmung der wichtigsten diagnostischen Merkmale wurden die obigen Stämme als Streptomyces purpurascens identifiziert; der Stamm Streptomyces purpurascens KA-26 wurde unter Nr. MNG179, der Stamm Streptomyces purpurascens KA-43 unter Nr. MNG 178, der Stamm Streptomyces purpurascens KA-82 unter Nr. MNG 177 und der Stamm Streptomyces purpurascens KC-157 unter Nr. MNG 176 am 26.09.1978 bei der Hungarian National Collection of Medicai Bacteria, National Institute of Hygiene, Gyäli ut 2-6, H-1966 Budapest deponiert. Proben der obigen Mikroorganismen können vom genannten Institut bezogen werden.

Die Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von Cardenoliden der oben definierten Formel I auf mikrobiologischem Weg aus Cardenolidverbindungen der Formel IA

15

20

R

25

worin X Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe und R1 ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel II, III, IV 30 oder V

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(V)

bedeuten, mit der Einschränkung, dass, falls X für eine Hydroxylgruppe steht, R1 nur eine Gruppe der Formel II bedeuten kann, und in dem Endprodukt der Formel IR nur für eine Gruppe der Formel IV oder V stehen kann, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Cardenolidverbindungen der Formel IA mit einer submersen Kultur der Stämme Streptomyces purpurascens KA-26, Streptomyces purpurascens KA-43, Streptomyces purpurascens KA-82, Streptomyces purpurascens KC-157 oder Streptomyces alboniger AB-318-ST fermentiert und das erhaltene Cardenolid oder die erhaltenen Cardenolide der Formel I von der Fementationsbrühe isoliert.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäs-sen Verfahrens ist die wichtigste Bedingung, dass man unter aseptischen Bedingungen arbeiten sollte. Die genannten Streptomyces-Stämme können übrigens unter den bei der Züchtung von Strahlenpilzen allgemein üblichen Bedingungen gezüchtet werden.

Kraftvolles Wachstum wird erreicht, wenn man als Köhlen- und Energiequelle diejenigen oben erwähnten Zucker verwendet, welche von diesen Stämmen gut verwendet werden können, wie z.B. Glucose, Arabinose, Xylose, Mannit, Fructose, Saccharose oder Raffinose. Als Stickstoffquelle können Haselnussmehl, Maisquellwasser, Pepton, ferner vorteilhaft Sojamehl, Casein oder Hydrolysate davon, Aminosäuren oder anorganische Ammoniumsalze verwendet werden.

Der pH-Wert des Nährbodens wird zwischen 6 und 8, vorteilhaft auf 7 eingestellt; zum Erhöhen der Pufferkapazität kann Calciumcarbonat zugesetzt werden.

Zur Vermeidung eines etwaigen Schäumens wird zum Nährboden, zweckmässig schon vor dem Sterilisieren, ein pflanzliches Öl, vorteilhaft Palmenöl oder Sonnenblumenöl, oder ein synthetisches Schaumverhütungsmittel zugegeben. Der Nährboden wird bei 120 °C 30 bis 60 Minuten sterlisiert.

Das Züchten der Kultur und die Umsetzung werden zweckmässig bei der für die Streptomyceten günstige Temperatur zwischen 30° und 40 °C, besonders bei 32 °C, durchgeführt; man kann aber auch bei der Züchtung der Kultur 32 °C und bei der Umsetzung 37 °C anwenden. Es ist wichtig, dass die submerse Kultur während des gesamten Vorgangs eine entsprechende Luftzufuhr erhalten soll, was durch das Schütteln des Kolbens bzw. durch ein entsprechendes Rühren der in den Fermentar eingeleiteten sterilen Luft erreicht werden kann.

Die Umsetzung des Substrats wird zweckmässig mit einer schon kraftvoll entwickelten Kultur, etwa bei 1% Trockensubstanzgehalt des Fermentationsmediums begonnen; man kann aber die Zugabe des Substrats auch schon während des Wachstums der Kultur anfangen.

Die Zugabe des Substrats zum Fermentationsmedium geschieht in der Form einer mit einem mit Wasser vermischbaren und die Umsetzung nicht hemmenden Lösungsmittel hergestellten Lösung, welche vor der Zugabe durch Filtrieren oder Erwärmen sterilisiert wird. Bei der Zugabe des Substrats kann vorteilhaft das in der ungarischen Patentschrift Nr. 176 249 beschriebene Verfahren angewendet werden; so kann durch eine entsprechende Wahl des zu verwendenden Lösungsmittels die Konzentration des Substrats im Fermentationsmedium erheblich gesteigert werden.

Das Fortschreiten der Umsetzung kann mit Hilfe von ent-25 nommenen Mustern verfolgt werden; nach dünnschichtchro-matographischer Trennung wird der Cardenolidgehalt der Muster durch photometrische Messung der mit Dixanthyl-harnstoff erhaltenen Farbe ermittelt. Die praktische Ausführungsweise dieser Methode ist ebenfalls in der oben zitierten 30 ungarischen Patentschrift Nr. 176 249 sowie auch im nachstehenden Beispiel 1 ausführlich beschrieben.

Die Fermentation kann beendet werden, wenn die erwähnte analytische Prüfung den völligen Verbrauch des Substrats und das maximale Anwachsen der Menge des ge-35 wünschten Produkts zeigt. Dann wird die Fermentationsflüssigkeit abfiltriert und das erhaltene Produkt mit einem organischen Lösungsmittel aus der Zellenmasse bzw. aus der Fermentationsflüssigkeit extrahiert. Der trockene Rückstand des Extrakts kann durch Chromatographieren bzw. durch Um-40 kristallisieren gereinigt werden. (Bei der Reinigung können die entstandenen Nebenprodukte vorteilhaft durch die Anwendung des in der ungarischen Patentschrift Nr. 181 880 beschriebenen Verfahrens abgetrennt werden.)

Der wichtigste Vorteil des erfindungsgemässen Verfah-45 rens besteht darin, dass man die Überführung von primären 12-Desoxycardenoliden in die entsprechenden sekundären, in der 12ß-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden Cardenolide anstatt der bisher erforderlichen zwei auf einander folgenden mikrobiologischen Umsetzungen in einem einzigen so Fermentationsschritt durchführen kann. Der Wegfall von einem Fermentationsschritt bedeutet auch das Ersparen eines kostspieligen und Materialverluste verursachenden Extraktions- und Aufarbeitungsschrittes, so dass durch die Erfindung eine wesentlich einfachere und höhere Ausbeuten lie-55 fernde Herstellungsweise von 12ß-Hydroxy-cardenoliden ermöglicht wird.

Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass das energiekonsumierende Trocknungs-Fermentieren bei der Aufarbeitung der Droge - durch welches die Überführung der primären Glyko-60 side in sekundäre Glykoside erleichtet werden soll - bei der Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens ebenfalls wegfällt.

Durch die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens kann ferner die Herstellung des vom therapeutischen Gees sichtspunkt wichtigsten Digoxins unabhängig von der schwankenden Glykosidzusammensetzung der Droge (also von dem Wert des Verhältnisses Gesamtglykoside/Lanato-sid-C) immer gesichert werden.

646 995

Als weiterer Vorteil ist es noch zu erwähnen, dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren nicht nur die Lanatoside, sondern auch die Purpurea-Glykoside in therapeutisch hochwertige Produkte übergeführt werden können.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht.

Beispiel 1

Aus einer auf schrägem Kartoffel-Dextrose-Agar gezüchteten, 3 bis 4 Wochen alten Kultur des Stammes Streptomyces purpurascens KA-43 (MNG 178) wird mit 10 ml sterilem Wasser eine Suspension hergestellt. In einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben wird 100 ml «PS» Nährboden sterilisiert. Zusammensetzung des PS Nährbodens:

0,8% Sojapulver

3,0% Glucose pH-Wert vor der Sterilisierung: 7,0

Sterilisierung 45 Minuten bei 120 °C. Die Glucose wird in 50%iger wässriger Lösung separat sterilisiert, 30 Minuten bei 120 °C. Das Sojapulver wird auf die folgende Weise hergestellt: Aus einem durch ein Sieb von 0,4 mm Maschenweite durchgesiebten extrahierten Sojagries wird mit Leitungswasser eine 10%ige Suspension hergestellt und diese zuerst durch Erhitzen unter 1 Atü eine Stunde lang, dann auf 37 °C abgekühlt mit 0,4% Pankreatin 2 Stunden lang hydrolysiert, wobei der pH-Wert durch die Zugabe von Natronlauge zwischen 7,5 und 8,0 gehalten wird. Die Suspension wird dann zentrifu-giert und die supernatante Flüssigkeit unter Zerstäubung zur Trockne eingedampft. Das auf diese Weise erhaltene, 9% Stickstoff enthaltende Produkt ist das Sojapulver.

Der auf obige Weise hergestellte und sterilisierte Nährboden wird in dem Erlenmeyer-Kolben mit 1 ml der Mikroorga-nismen-Suspension eingeimpft und auf einer Flachschüttel-maschine mit 2,5 cm Ausschlag und 300 U/min bei 32 °C zwei Tage lang geschüttelt. Dann wird die Lösung von 50 mg Lanatosid-A in 0,5 ml Dioxan, welche vorher durch Filtrieren sterilisiert wurde, zugesetzt, der Kolben anschliessend weitere 4 Tage bei 32 °C geschüttelt, und dann wird die auf diese Weise erhaltene Fermentationsflüssigkeit mit je 50 ml Chloroform zweimal extrahiert. Der Glykosidgehalt des Extrakts wird nach dünnschichtchromatographisches Separierung durch photometrische Messung der mit Dixanthylharnstoff erhaltenen Farbe auf die folgende Weise ermittelt:

Dünnschichtchromatographische Separierung: Auf einer 0,25 mm dicken Schicht von Kieselgel Merck H254 (E. Merck, Darmstadt, BRD), in einer Wanne mit gesättigtem Dampfraum; Laufmittel bei primären Glykosiden Chloroform-Me-thanol 90:10, bei sekundären Glykosiden Äthylacetat-Cyclo-hexan-Abs. Äthanol 55:35:10, mit je drei Läufen.

Die zu untersuchenden Muster werden in solchen Mengen auf die Kieselgelschicht aufgetropft, dass in dem aufgetragenen Volumen 10 bis 50 [ig der einzelnen Glykoside anwesend sein sollen.

Nach der drei Läufen wird die Schicht sorgfaltig getrocknet, und das Chromatogramm in Joddampf entwickelt. Die Flecke werden entsprechend den Standardmustern markiert und das Jod in Luftstrom wegsublimiert.

Farbenreaktion: Die markierten Flecke werden abgekratzt und in Eprouvetten mit eingeschliffenen Glasstopfen gebracht. Je 3 ml Dixanthylharnstoff-Reagens (s. unten) werden zugesetzt, die Eprouvetten werden abgeschlossen, gründlich aufgeschüttelt und drei Minuten lang in einem siedenden Wasserbad gehalten. Anschliessend werden die Eprouvetten in einem kalten Wasserbad abgekühlt und nach Aufschütteln scharf zentrifugiert. Die Farbintensität der klaren superna-tanten Flüssigkeit wird bei 535 nm gemessen im Vergleich mit einer glykosidfreien Lösung.

Die glykosidfreie Lösung wird durch Abkratzen eines

10

15

«leeren» (keine Glykoside enthaltenden), in der selben Höhe wie das betreffende Glykosid befindlichen Flecks von gleich grosser Fläche der Kieselgelschicht auf die oben beschriebene Weise hergestellt.

5 Aus den gemessenen Extinktionswerten können, unter Berücksichtigung der eventuellen Verdünnung und des aufgetragenen Volume, mit Hilfe des aus der Standard-Konzentra-tionskurve gewonnenen Faktors die Konzentrationen der einzelnen Glykoside berechnet werden.

Dixanthylharnstoff-Reagens: 10 mg Dixanthylharnstoff werden im Gemisch von 50 ml Essigsäure und 1 ml konz. Salzsäure gelöst und die Lösung mit Essigsäure auf 100 ml ergänzt. Das Reagens wird vor der Messung jeweils frisch hergestellt.

Der nach der oben beschriebenen Methode bestimmte Digoxingehalt des auf obige Weise erhaltene Extrakts ist 12 mg.

Beispiel 2

20 Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A 50 mg Acetyldigitoxin in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst der Kultur zugegeben werden. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt enthält 9 mg Digoxin.

25 Beispiel 3

Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A 50 mg Purpureaglykosid-A in 1 ml Tetrahydrofurfurylalkohol gelöst der Kultur zugegeben werden. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt enthält 8 mg

30 Digoxin.

Beispiel 4

Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A 50 mg Digitoxin in 1 ml Di-

35 methylsulfoxyd gelöst der Kultur zugegeben werden. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt enthält 8 mg Digoxin, während 15 mg Digitoxin unverändert geblieben sind.

Beispiel 5

40 Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, mit dem Unterschied, dass die Mikroorganismen-Suspensionen anstatt von Streptomyces purpurascens KA-43 (MNG 178) aus Kulturen folgender Mikroorganismenstämme hergestellt werden:

Kolben 1: Streptomyces purpurascens KA-26 (MNG

45 179),

Kolben 2: Streptomyces purpurascens KA-82 (MNG 177),

Kolben 3: Streptomyces purpurascens KC-157 (MNG 176),

so Kolben 4: Streptomyces alboniger AB-318-ST (MNG 180).

Die in den auf diese Weise erhaltenen Extrakten gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengestellt.

55

Tabelle 4

Kolben

Lana-

Ac-Digit-

Digitoxin

Digoxin

60

tosid-A

oxin (mg)

1

2,1

3,0

15,4

4,2

2

1,8

5,5

12,4

7,3

3

3,6

4,1

11,3

6,1

4

-

1,7

16,4

3,8

65

Beispiel 6

Es wird nach Beispiel 5 gearbeitet, mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A die Lösung von 50 mg Purpu-

9

646 995

reaglykosid-A in 1 ml Tetrahydrofurfurylalkohol den Kulturen zugegeben wird.

Die in den auf diese Weise erhaltenen Extrakten gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der nachstehenden Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Kolben

Purpurea-glykosid

Digitoxin (mg)

Digoxin

1

1,7

18,2

4

2

-

14,3

6,8

3

2,8

12,7

7,2

4

3,5

15,8

4,1

Beispiel 7

Es wird nach Beispiel 5 gearbeitet, aber mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A die Lösung von 50 mg Acetyldigitoxin in 1 ml Dimethylsulfoxyd den Kulturen zugegeben wird. Die erhaltenen Mengen von Glykosiden sind in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabelle 6

Kolben

Acetyl

Digitoxin

Digoxin

digitoxin

(mg)

1

5,2

15,8

4,6

2

4,5

14,3

6,4

3

6,1

15,5

4,8

4

7,3

16,0

3,7

Beispiel 8

Es wird nach Beispiel 5 gearbeitet, aber mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A die Lösung von 50 mg Digitoxin in 1 ml Dimethylsulfoxyd den Kulturen zugesetzt wird. Die auf diese Weise gebildeten Mengen von Glykosiden sind in der nachstehenden Tabelle 7 zusammengestellt.

Tabelle 7

Kolben

Digitoxin

Digoxin

(mg)

IL

24,6

3,7

2

21,5

4,9

3

26,1

3,1

4

28,6

2,5

Beispiel 9

Es wird nach Beispiel 1 gearbeitet, aber mit dem Unterschied, dass die Fermentation 2 Tage nach der Zugabe des Substrats beendet wird. Die Fermentationsflüssigkeit wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf einer Kieselgelschicht (Kieselgel HF254, Merck, Darmstadt; Dicek: _ 0,25 mm) chromatographiert; Laufmittel: Cyclohexan-Äthyl-acetat-abs. Äthanol 35:55:10). Die Flecke wurden mit Essig-säure-Anisaldehyd-Reagens entwickelt. Auf dem erhaltenen Chromatogramm wurden neben wenig unreagiertem Lanatosid-A erhebliche Mengen von Acetyldigitoxin, Acetyldigoxin und Digitoxin sowie wenig Digoxin identifiziert.

Beispiel 10

Aus einer an schrägem Kartoffel-Dextrose-Agar gezüchteten, 3 bis 4 Wochen alten Kultur des Stammes Streptomyces purpurascens KA-43 (MNG 178) wurde mit 10 ml sterilem Wasser eine Suspension hergestellt. In 500 ml Erlenmeyer-Kolben werden je 100 ml «PS» Nährboden sterilisiert und dann mit je 1 ml der Mikroorganismen-Suspension eingeimpft. Die Kolben werden bei 32 °C zwei Tage geschüttelt.

In einem Labor-Fermentor werden 5 Liter 0,2% Palmen-öl enthaltender «PS» Nährboden bei 120 °C 60 Minuten lang sterilisiert und nach dem Abkühlen mit dem vereinigten Inhalt von 4 Kolben eingeimpft.

Der Inhalt des in einem auf 32 °C erwärmten Wasserbad gehaltenen Fermentors wird unter Belüftung mit 51/min steriler Luft und Rühren mit 350 U/min einen Tag inkubiert und dann wird die durch Filtrieren sterilisierte Lösung von 5 g Lanatosid-A in 25 ml Dioxan zugesetzt. Nach weiterem 5 Tage langem Inkubieren wird die Fermentationsflüssigkeit abfiltriert;

Das zellenfreie Filtrat wird mit je !/3 Vol. Benzol zweimal extrahiert. Der mit Benzol erhaltene Extrakt enthält das eventuell unregierte Substrat (Lanatosid-A) sowie das als Zwischenprodukt entstandene Digitoxin und einen Teil der Nebenprodukte.

Anschliessend wird die mit Benzol schon extrahierte Fermentationsflüssigkeit dreimal mit je Vol. Chloroform extrahiert, der Extrakt mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum, bei höchstens 50 °C zur Trockne eingedampft. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand enthält 40% Digoxin, 14% 7ß-Hydroxy-digoxin sowie weitere 20% andere Glykoside mit nicht identifizierter Struktur. Lanatosid-A, Acetyldigitoxin bzw. Acetyldigoxin konnten im Rückstand nicht nachgewiesen werden.

Dieser Rückstand des mit Chloroform erhaltenen Extrakts wurde im Gemisch von 60 ml Methanol und 60 ml Benzol gelöst, die Lösung mit 400 mg Phenylborsäure versetzt und 5 Minuten stehen gelassen. Dann wurde das Reaktionsgemisch unter ständigem Rühren mit 60 ml Wasser versetzt. Nach der Trennung der Phasen wurde die untere,wäss-rig-methanolische Schicht abgetrennt und mit 60 ml Benzol extrahiert. Die untere Schicht wurde abgetrennt, das Methanol im Vakuum, bei höchstens 50 °C entfernt, das sich ausscheidende kristalline Produkt abfiltriert, mit 60 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden auf diese Weise 0,75 g

20

kristallines Digoxin erhalten; [a]-,, = +13,6 (c= 10%, in Pyridin). 0

Beispiel 11

Es wird nach Beispiel 5 gearbeitet mit dem Unterschied, dass anstatt von Lanatosid-A 50 mg Lanatosid-C in 1 ml Di-methylsulfoxid gelöst der Kultur zugegeben werden.

Die in den auf diese Weise erhaltenen Extrakten gefundenen Glykosiden sind in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

Kolben

Lanatosid-C (mg)

Digoxin

1

5,2

12,0

2

6,0

17,1

3

2,1

18,1

4

4,3

14,2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

c

Claims

646 995

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von eine 12ß-Hydroxylgrup-

CH.

O

\

c = o oder 35 wor*n X Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe und R1 ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel II oder III

CH

CH.

(II)

und

(III)

OH

oder der obigen Formel IV oder V bedeuten, mit der Einschränkung,dass, falls X für eine Hydroxylgruppe steht, R1 nur eine Gruppe der Formel II bedeuten kann, durch mikrobiologische Hydroxylierung und/oder Desacetylierung und/ oder Glykose-Abspaltung, dadurch gekennzeichnet, dass man Cardenolidverbindungen der Formel IA mit einer sub-mersen Kultur der Stämme Streptomyces purpurascens KA-26, Streptomyces purpurascens KA-43, Streptomyces purpurascens KA-82, Streptomyces purpurascens K-157 oder Streptomyces alboniger AB-318-ST fermentiert und das erhaltene Cardenolid oder die erhaltenen Cardenolide der Formel I von der Fermentationsbrühe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Cardenolid oder die erhaltenen Cardenolide durch Chromatographieren oder Umkristallisieren reinigt.