CH641153A5

CH641153A5 - Thymosin alpha-1 fragments and their preparation

Info

Publication number: CH641153A5
Application number: CH645082A
Authority: CH
Inventors: Su-Sun Wang
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-04-22
Filing date: 1982-11-05
Publication date: 1984-02-15
Also published as: IT7822629A0; NL7804364A; SE447262B; FR2405926A1; FR2401134A1; PT67937B; FR2405926B1; NO821608L; ES469016A1; GB1590668A; NO148924C; DK169478A; ATA286178A; CA1113088A; DE2817082A1; JPS53137914A; CH641152A5; IT1113134B; FI781241A; PT67937A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft daher Thymosin a^ Fragmente der allgemeinen Formel

R^Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (I)

worin

R1 Wasserstoff, H-Glu-Lys-Lys- oder H-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys- darstellt,

und deren pharmazeutisch verträgliche Salze, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Schutzgruppen eines geschützten Peptids der allgemeinen Formel

R2-Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl (II)

worin

R2 Boc, Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)- oder

Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-, •

Bzl Benzyl und

Z Benzyloxycarbonyl darstellen,

abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Salz überführt.

Die allgemeine Formel I fasst die Verbindungen H-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu--Asn-OH,

A-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH und H-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH zusammen.

Die Entfernung der Schutzgruppen aus einem geschützten Peptid der Formel II kann leicht nach an sich bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch Behandlung mit wasserfreier Säure wie Fluorwasserstoff, vorzugsweise in Gegenwart von Anisol.

Die geschützten Peptide der Formel II können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Im vorliegenden Fall wurde nach folgender Strategie gearbeitet:

Zunächst wurde H-Glu(OBzl)-OH an Boc-Ala-OSu zu dem Dipeptidfragment Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH gekoppelt, das dann mit HCl. H-Asn-OBzl nach dem DCC/HOSu-Verfahren von Wünsch und Drees, Chem. Ber. 99, 110 (1966) kondensiert wurde. Das Hydrochloridsalz des Aspara-ginbenzylesters wurde aus Boc-Asn-OBzl hergestellt, das wiederum aus kommerziell erhältlichem Boc-Asn-OH und Benzylbromid nach der Cäsiumsalzmethode synthetisiert wurde. Die Boc-Schutzgruppe wurde durch 30minütige Behandlung mit 4N HCl in trockenem Tetrahydrofuran abgespalten.

Die Umsetzung von H-GIu(OBzl)-OH mit Boc-Glu(OBzl)--OSu lieferte Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH in Form eines farblosen klaren Öles, das anschliessend für die Synthese des geschützten Pentapeptids Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl verwendet wurde, wobei die Umsetzung in Gegenwart von DCC/HOSu mit HCl. H-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl stattfand, das aus Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl durch Behandlung mit 4N HC1/THF gewonnen wurde. Das geschützte Pentapeptid wurde in reiner, kristalliner Form in guter Ausbeute erhalten.

Zur Herstellung des geschützten Octapeptids Boc-Glu-(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl wurde zunächst das geschützte Tripeptid Boc-Glu-(OBzI)-VaI-Val-OH hergestellt. Boc-Val-OSu wurde mit freiem Valin umgesetzt zu Boc-Val-Val-OH, das nach De-blockierung mit 4N HCl in THF und anschliessende Reaktion mit Boc-Glu(OBzl)-OSu das gewünschte Tripeptid in kristalliner Form als Cyclohexylaminsalz Boc-Glu(OBzl)-Val--Val-OH . CHA lieferte. Das Cyclohexylaminsalz wurde in die freie Säure übergeführt und dann mittels DCC in Gegenwart von HOSu mit HCl. H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu-(OBzl)-Asn-OBzl, das aus Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu-(OBzl)-Asn-OBzl durch Behandlung mit HCl in THF erhalten wurde, gekoppelt. Das geschützte Octapeptid Boc-Glu-(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl wurde in gereinigter Form als amorpher Feststoff erhalten und durch Hydrogenolyse sowie anschliessende Behandlung mit Trifluoressigsäure in der üblichen Weise in das freie Octapeptid Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn übergeführt. Es wurde gereinigt durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und lieferte ein dünnschichtchromatographisch und papierelektrophoretisch einheitliches Material.

Für die Herstellung des geschützten Undecapeptids Boc--Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurde zunächst ein Tripeptid synthetisiert aus Boc-Lys(Z)-OSu und H-Lys(Z)-OH. Das erhaltene Dipeptid Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH wurde mit 4N

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HCl in THF behandelt und das erhaltene Salz HCl. H-Lys-(Z)-Lys(Z)-OH wurde dann mit Boc-Glu(OBzl)-OSu umgesetzt. Das so erhaltene Tripeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys-(Z)-OH wurde mit DCC u. HOSu aktiviert nach Weygand et al, Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966) und die Lösung des in situ gebildeten aktivierten Tripeptidesters Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)--Lys(Z)-OSu wurde kombiniert mit dem Trifluoracetat von H-Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl, das aus dem entsprechenden geschützten Octapeptid durch 30minütige Behandlung mit TFA erhalten wurde. Nach Zusatz einer geringen Menge einer Base wurde das gewünschte geschützte Undecapeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)--Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu-(OBzl)-Asn-OBzl erhalten. Abspaltung der Schutzgruppen aus dem geschützten Undecapeptid mit wasserfreier Flusssäure lieferte das freie Undecapeptid Glu-Lys-Lys-Glu-Val--Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, das nach Ionenaustausch-Säulenchromatographie papierelektrophoretisch einheitlich war.

Nach einem ähnlichen Schema erfolgte die Synthese des geschützten Tetradecapeptids Boc-Leu-OSu wurde an H-Lys-(Z)-OH gekoppelt und lieferte Boc-Leu-Lys(Z)-OH. Nach Entfernung der Na-Boc-Gruppe mit 4N HCl in THF und Umsetzung mit Boc-Asp(OBzl)-OSu wurde das geschützte Tripeptid Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH in kristalliner Form erhalten. Es wurde in den aktivierten Ester Boc-Asp(OBzl)--Leu-Lys(Z)-OSu übergeführt und mit dem Trifluoracetat von H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, erhalten durch Behandlung des entsprechenden geschützten Undecapeptids mit TFA, kondensiert. Das gewünschte Produkt, Boc-Asp-(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, wurde in guter Ausbeute erhalten und war dünnschichtchromato-graphisch einheitlich. Das freie Tetradecapeptid Asp-Leu--Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn wurde aus der geschützten Verbindung durch Behandlung mit wasserfreier Flusssäure und Reinigung an einer Ionenaustauschersäule erhalten.

Die neuen Octa-, Undeca- und Tetradecapeptide und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze, können an warmblütige Säuger parenteral verabreicht werden, das heisst intravenös, subcutan oder intramuskulär. Diese Verbindungen wirken stark immunopotenzierend bei einer täglichen Dosierung von etwa 1-100 mg pro kg Körpergewicht bei intravenöser Verabreichung. Natürlich hängt die erforderliche Dosis ab von der speziellen Verfassung in der sich das zu behandelnde Individuum befindet, dem Grad der Erkrankung oder der Behandlungsdauer. Eine geeignete Dosierungseinheit zur pharmazeutischen Verwendung ist 1 mg der vorstehend genannten Peptide. Unmittelbar vor der Verabreichung kann das lyophilisierte Präparat durch Zusatz von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung rekonstituiert werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorstehend genannten Peptide. Geeignete Salze sind das Natrium- und Kaliumsalz oder Salze mit einer starken organischen Base wie Guanidin. Ausserdem können die Präparate die Gegenionen zu den genannten Kationen enthalten, wie beispielsweise Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat oder Ascorbat.

Von den im Text verwendeten Abkürzungen bedeuten: Boc = tert.-Butyloxycarbonyl; Bzl = Benzyl; DCC = Di-cyclohexylcarbodiimid; DMF = Dimethylformamid; THF = Tetrahydrofuran; HOSu = N-Hydroxysuccinimid; Triton B = 40% methanolische Lösung von Trimethylbenzylam-moniumhydroxid; NMM = N-Methylmorpholin; CHA = Cyclohexylamin; DCHA = Dicyclohexylamin; Z = Benzyloxycarbonyl; DMSO = Dimethylsulfoxid: TFA = Trifluor-

essigsäure; DC = Dünnschichtchromatographie; Et3N = Triäthylamin; HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Synthese der erfindungsgemässen Peptide im Detail.

Beispiel 1

a) 11,0 g Boc-Asn-OH wurden in 200 ml Methanol und 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit einer 20% igen io wässrigen Lösung von Cäsiumcarbonat (ca. 55 ml) auf ein pH von 7,0 eingestellt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand noch zweimal bei 45°C aus je 120 ml DMF eingeengt und der so erhaltene weisse Rückstand mit 8,9 g Benzylbromid in 120 ml DMF 6 Stunden 15 gerührt. Nach Einengen zur Trockene und Behandlung mit einer grossen Menge Wasser verfestigte sich das Produkt. Es wurde abfiltriert, in Äthylacetat aufgelöst, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene gebracht und aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Aus-20 beute: 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl, F. 120-122°C, [a]D26 = -17,29° (c = 1, DMF).

13,7 g Boc-Asn-OBzl wurden in 80 ml THF gelöst und mit 500 ml 4N HCl in THF behandelt. Das Gemisch wurde 45 Minuten stehengelassen, während welcher Zeit sich ein 25 Niederschlag zu bilden begann. Behandlung mit 1000 ml Äther lieferte ein weisses festes Material, das abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute: 10,3 g (94%) HCl. H-Asn-OBzl, F. 122-126°C, [a]D25 = +6,82°.

30 b) 7,0 g fein zerriebenes H-Glu(OBzl)-OH und 8,8 g Boc-Ala-OSu wurden 48 Stunden in 250 ml DMF und 6 ml NMM gerührt. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand zwischen 300 ml Äthyl-35 acetat und 500 ml Wasser mit einem Gehalt von 2 ml 10%-iger Schwefelsäure verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene gebracht. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Äther aufgenommen und mit einem grossen 40 Volumen Petroläther behandelt. Es bildete sich ein weisser amorpher Niederschlag, der dünnschichtchromatographisch einheitlich war. Ausbeute: 11,0 g (91,5%) Boc-Ala-Glu-(OBzl)-OH, F. 84-88°C, [a]D25 = 8,08° (c = 1, DMF).

10,4 g Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, 6,56 g HCl. H-Asn-OBzl 45 und 5,9 g HOSu wurden in 250 ml DMF bei 0°C gelöst. Es wurden 5,7 g DCC und 3,5 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei 0°C und 40 Stunden bei 25°C gerührt, unter weiterem Zusatz von Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Neben-50 produkte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trockene eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Wasser. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ein sich bilden-55 der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit Petroläther behandelt. Es wurde ein kristallines Produkt erhalten. Ausbeute: 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl, F. 102-105°C, [a]D25 = 12,5° (c = 1, DMF).

c) 4,74 g fein verriebenes H-Glu(OBzl)-OH und 0,7 g 60 Boc-Glu(OBzl)-OSu wurden in DMF in Gegenwart von 3,6 ml MMM 36 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde eingeengt und der zähflüssige Rückstand mit Wasser behandelt. Der Niederschlag wurde in Äthylacetat aufgenommen, mit 5%iger Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, über 65 Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 14,03 g eines klaren Öles erhalten, das unter Petroläther stehengelassen wurde. Schliesslich wurden 10,2 g (90%) öliges Boc-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-OH erhalten, [a]D25 = —7,59° (c = 1,

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DMF). Das Produkt war dünnschichtchromatographisch einheitlich.

d) 28,2 g Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden 1 Stunde lang mit 1,1 Liter 4N HCl in THF behandelt. Durch Einengen wurde ein Öl erhalten, das noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Bei Behandlung mit einer grossen Menge Äther ging das Öl in festes HCl .H--Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl über, das mit 25,6 g Boc-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-OH, 10,6 g HOSu und 10,9 g DCC in 540 ml DMF eine Stunde bei 0°C und dann 48 Stunden bei 25°C gerührt wurde. Es wurde Triäthylamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trok-kene eingeengt wurde. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Bei Behandlung mit Petroläther verfestigte sich das Produkt. Umkristallisation aus Isopropanol lieferte 28,9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)-Glu-(OBzD-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 169-175°C, [a]D25 =

— 11,78° (c = 1, DMF).

3,9 g Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden 30 Minuten lang mit 15 ml 4N HCl in THF behandelt. Dann wurden 210 ml Äther zugesetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Äthanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 2,58 g (75,1%) HCl .H--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 148 bis 151°C, [a]D25 = -3,65° (c = 1, DMF).

e) 12,6 g Boc-Val-OSu und 4,68 g Valin wurden 96 Stunden lang in 250 ml DMF in Gegenwart von 2 ml Triäthylamin miteinander umgesetzt. Es wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Das unlösliche Material wurde abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äther und verdünnter Schwefelsäure (ca. 1 %) verteilt und die organische Phase dreimal mit Wasser gewaschen,

über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das erhaltene Produkt wurde aus Äther und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 12,2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH, F. 155-158°C, [a]D25 = +1,10° (c = 1, DMF).

40,5 g Boc-Val-Val-OH wurden eine Stunde lang mit 1,8 Liter 4N HCl in THF behandelt. Einengen und Behandlung mit Äther lieferte 34,5 g HCl. H-Val-Val-OH in Form eines weissen amorphen Pulvers, das mit 55,6 g Boc-Glu-(OBzl)-OSu in 1 Liter DMF während 24 Stunden in Gegenwart von 54 ml Triäthylamin umgesetzt wurde. Das Gemisch wurde von unlöslichem Material befreit und zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 1,5 1 Äthylacetat aufgenommen, die Lösung zweimal mit 5 %iger Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Es wurde ein farbloses klares Öl erhalten, das nicht kristallisierte. Es wurde in 3,2 1 Äther gelöst und mit 17 ml CHA auf pH 7,5 eingestellt. Der erhaltene feste Rückstand wurde abfiltriert und aus Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 58,9 g (72,7%) Boc-GIu(OBzI)-VaI-VaI-OH . CHA, F. 158-160°C, [a]D25 = 33,41° (c = 1, MeOH).

Zu einer Suspension von 1,69 g Boc-Glu(OBzl)-Val-Val--OH . CHA in 40 ml Wasser und 40 ml Äthylacetat wurden in einem Schütteltrichter 4 ml 1 M Schwefelsäure gegeben. Nach starkem Schütteln löste sich das Produkt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das so erhaltene freie Tripeptid wurde mit 2,58 g HCl. H-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl in 15 ml DMF in Gegenwart von 0,012 g HOSu, 0,3 ml NMM und 0,63 g DCC kondensiert, wobei das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 0°C und 60 Stunden bei 25°C gehalten wurde. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unlösliche Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Zusatz von Wasser. Das Rohprodukt wurde in 50 ml DMF gelöst und mit 300 ml Metha-5 noi wieder ausgefällt. Ausbeute: 2,25 g (58,7 %) Boc-Glu-(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl, F. 277-280°C, [a]D25 = -12,43° (c = 1, DMF).

0,72 g dieses Produktes wurden über 0,5 g eines 5%igen Pd/BaS04-Katalysators 3 Stunden bei 3,4 Atmosphären in io einem Gemisch aus 40 ml DMF, 30 ml Methanol und 2 ml Wasser hydriert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeeengt. Anschliessend wurde während 30 Minuten mit 5 ml TFA behandelt und der nach Einengen erhaltene Rückstand wurde mehrere Male mit Äther be-15 handelt. Der resultierende weisse Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgenommen und lieferte nach Lyophilisation 0,47 g eines Rohprodukts, das auf eine Säule (3 X 32 cm) eines stark basischen Polystyrolharzes (Bio-Rad AG1-X 2), equili-briert mit Ammonacetatpuffer vom pH 8,1 (2% ige Essig-20 säure, die mit Ammoniak auf pH 8,1 eingestellt wurde) gegeben wurde. Die Säule wurde sukzessive mit jeweils 200 ml 0,025 M Ammoniumacetat (pH 5,5), 0,025 M HOAc, 0,05 m HOAc, 0,1 M HOAc, 0,25 M HOAc, 0,5 M HOAc, 0,75 M HOAc und 1 M HOAc eluiert. Es wurden Fraktionen von 25 jeweils 12 ml gesammelt und jede Fraktion wurde dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten (Fraktionen 225-229) wurden vereinigt und lieferten nach zweimaliger Lyophilisation 0,223 g (48,1%) reines Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, 30 das dünnschichtchromatographisch lind papierelektrophore-tisch einheitlich war.

Beispiel 2

35 15 g Boc-Lys(Z)-OH wurden mit 5,8 g HOSu und 8,66 g DCC in 200 ml THF 3 Stunden gerührt. Ein unlösliches Nebenprodukt wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trok-kene eingeengt. Der zurückbleibende Sirup (24,2 g) wurde mit 150 ml Isopropanol und 150 ml Petroläther behandelt 40 und lieferte 21g Boc-Lys(Z)-OSu in öliger Form. Es wurde mit 10,6 g H-Lys(Z)-OH in 250 ml DMF in Gegenwart von 5,5 ml Triäthylamin 72 Stunden lang umgesetzt. Während der Reaktion wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um das Reaktionsgemisch leicht basisch zu halten. Das Gemisch 45 wurde dann filtriert und das Filtrat bei 45°C eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand wurde mit einem Liter 5%iger Essigsäure behandelt. Der gebildete Niederschlag wurde mit Äthylacetat extrahiert und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und einge-50 engt zu einem Öl, das aus 300 ml Äthylacetat und 10 ml DCHA kristallisiert wurde. Umkristallisation aus Methanol und Äther lieferte 22,7 g (72,5%) Boc-Lys(Z)-Lys-(Z)-OH . DCHA, F. 160-162°C, [a]D25 = -2,21° (c = 1, MeOH).

10 g Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH . DCHA wurden zwischen 55 einem Liter Äthylacetat und einem Liter 0,1 N H2S04 verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Die erhaltene freie Säure, Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, wurde während 30 Minuten mit frisch bereiteter 4N HCl 6o in THF behandelt. Das Lösungsmittel und überschüssige Säure wurden durch Einengen bei 30°C abgezogen, während der Rückstand zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Der erhaltene Rückstand, HCl. H-Lys(Z)--Lys(Z)-OH, verfestigte sich bei Behandlung mit Äther, wur-65 de abfiltriert und mehrere Male mit Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt, 6,7 g, wurde in 70 ml DMF gelöst, in einem Eisbad abgekühlt, mit 1,63 ml Triäthylamin und 5,54 g Boc-Glu(OBzl)-OSu versetzt. Das Gemisch wurde

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1 Stunde bei 0°C und 24 Stunden bei 25°C gerührt. Es wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um ein pH von 7,5 aufrecht zu erhalten. Schliesslich wurde mit einigen ml Essigsäure angesäuert (pH 3,5) und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Nach Behandlung mit Äther und Umkristallisation aus Äthylacetat wurden 7,26 g (69,5%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys-Z)-OH,

F. 153-155°C, [a]D25 = -2,71° (c = 1, THF), erhalten.

1,7 g Boc-Glu(OBzl)-VaI-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden während 30 Minuten mit 24 ml TFA behandelt. Nach Entfernung der überschüssigen Säure durch Eindampfen bei 30°C wurde der Rückstand mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wurde sorgfältig mit Äther und Petroläther gewaschen, im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet und lieferte 1,71 g des Trifluoroacetats des Octapeptids. Dann wurde der aktivierte Ester Boc-Glu-(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu in situ durch Umsetzung von 0,995 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH mit 0,16 g HOSu und 0,274 g DCC in 15 ml DMF während 3 Stunden bei 0°C erzeugt. Dieser Lösung wurden 1,71 g des Octapeptid-salzes CFjCOOH. H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl zusammen mit 0,2 ml Triäthylamin zugesetzt. Nach Zusatz einiger weiterer Tropfen Triäthylamin und 15 ml DMF wurde das Gemisch 3 Tage bei 25°C gerührt, mit Essigsäure angesäuert und dann mit Wasser behandelt. Der weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen, so dass 2,25 g eines Rohproduktes mit dem Schmelzpunkt 310-313°C erhalten wurden, das in DMF gelöst und mit Methanol wieder ausgefällt wurde. Ausbeute: 1,75 g (68,3%) Boc-Glu(OBzl)--Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 314-316°C, [a]D25 = 13,68° (c = 1, DMSO). Das Material war dünnschichtchromatographisch einheitlich.

0,5 g Boc-Ghi(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu-(OBzl)-Val-Val--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden in

2 ml TFA gelöst und während 15 Minuten mit 15 ml Flusssäure bei 0°C gerührt. Nach Verdampfen überflüssiger Säure bei 0°C wurde der Rückstand in 5%iger wässriger Essigsäure gelöst, die Lösung dreimal mit Äther gewaschen, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 0,34 g rohes Glu-Lys--Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn erhalten, das durch Chromatographie an einer Ionenaustauschersäule gereinigt wurde. Ausbeute: 0,13 g (42,1%), [a]D25 = —85,65° (c = 1, H20).

Beispiel 3

4,0 g Boc-Leu-OSu und 3,42 g H-Lys(Z)-OH wurden in 75 ml DMF in Gegenwart von 1,7 ml Triäthylamin während 48 Stunden kondensiert. Durch periodischen Zusatz von Triäthylamin wurde das pH auf 7,5 gehalten. Unlösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Äther gelöst, die Lösung mit 3 ml DCHA behandelt, der kristalline Niederschlag mit Äther gewaschen und aus Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute: 5,7 g (69,5%) Boc-Leu-Lys(Z)-

-OH . DCHA, F. 140-142°C, [a]D25 = -7,20° (c = 1, MeOH).

2,97 g Boc-Leu-Lys(Z)-OH . DCHA wurden in die freie Säure überführt (verteilt zwischen Äthylacetat und 0,1 N 5 H2S04) und das erhaltene farblose Öl (2,2 g) wurde während 30 Minuten mit 4N HCl in 40 ml THF behandelt. Überschüssige Säure und Lösungsmittel wurden durch- Erwärmen auf 30°C abgezogen und der Rückstand wurde mit Äther behandelt. Das verbleibende öl wurde in Äther gelöst, ein-io geengt und noch zweimal jeweils nach Zusatz von Äther eingeengt. Der Rückstand wurde schliesslich mit 1,85 g Boc--Asp(OBzl)-OSu in Gegenwart von 1,85 ml Triäthylamin über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt und lieferte einen öligen Rückstand, der in Äthyl-15 acetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde aus Äthylacetat und Petroläther kristallisiert und lieferte 1,52 g (49,6%) reines Boc--Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH, F. 109-111°C, [a]D25 = -16,4° 20 (c = 1, DMF).

1,2 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl wurden während 30 Minuten mit 35 ml TFA behandelt. Überschüssige Säure wurde schnell abgezogen und der Rest mehrere Male 25 mit Äther behandelt, so dass 1,2 g des Undecapeptid TFA-Salzes in Form eines weissen Pulvers erhalten wurde. Das Salz wurde in einem Gemisch aus 5 ml DMF und 2 ml DMSO gelöst und mit in situ durch Rühren von 0,381 g Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH während 3 Stunden bei 0°C 30 mit 0,126 g HOSu und 0,124 g DCC in 3 ml DMF erzeugtem Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSu behandelt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C und dann 3 Tage bei 25°C gerührt, während welcher Zeit periodisch Triäthylamin zugesetzt wurde, um ein leicht basisches Milieu aufrecht zu erhalten. 35 Die sich bildende gelatinöse Substanz wurde mit 5%iger Essigsäure behandelt und der resultierende weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen und lieferte 1,28 g rohes Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys-(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-40 -Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, F. 325-326°C. Umfäl-lung aus DMF/DMSO (10 ml/5 ml) und Methanol (230 ml) lieferte 1,22 g (80,2%) reines Material, F. 326-327°C, Md25 = -15,71° (c = 1, DMF/DMSO).

1,128 g dieses Produkts wurden mit 7 ml Anisol gemischt 45 und 15 Minuten mit 25 ml wasserfreier Flusssäure bei 0°C behandelt. Überschüssige Säure wurde bei 0°C abgezogen und der verbleibende Rückstand zwischen Wasser und Äther verteilt. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Äther gewaschen, auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt so und lyophilisiert. Es wurden 0,69 g Rohmaterial erhalten das in der oben für das Octapeptide beschriebenen Weise chromatographiert wurde. Das in den Fraktionen 101-120 eluierte Material wurde vereinigt, lyophilisiert und lieferte 0,25 g eines Produkts, das noch leicht verunreinigt war. Es 55 wurde daher an der gleichen Säule rechromatographiert und lieferte 0,155 g (22%) reines Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu--V al-V al-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, [a]D25 = -86,27° (c = 1, 0,1 N HCl). Das Material war papierelektrophoretisch einheitlich.

v

Claims

641153

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Thymosin o^-Fragmente der allgemeinen Formel

R^Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (I)

worin

R1 Wasserstoff, H-Glu-Lys-Lys- oder H-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys- darstellt,

und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
2. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1, der Formel H-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu--Ala-Glu-Asn-OH.
3. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1, der Formel H-Glu-Lys-Lys-Glu-V al-V al-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
4. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1, der Formel H-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
5. Verfahren zur Herstellung der Thymosin (^-Fragmente gemäss Anspruch 1 und deren pharmazeutisch verträglichen Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen eines geschützten Peptids der allgemeinen Formel

R2-Glu(OBzl)-V al-V al-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala--Glu(OBzl)-Asn-OBzl . (II)

worin

R2 Boc, Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)- oder Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z), Bzl Benzyl und

Z Benzyloxycarbonyl darstellen,

abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Salz überführt.

Thymosin a1 ist ein hitzestabiles, stark saures Polypeptid aus 28 Aminosäureeinheiten der folgenden Sequenz:

5 10

H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-

15 20

-Ue-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-25

-V al-V al-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH. (I)

Dieses Peptid, das ein starkes immunpotenzierendes Mittel ist, wurde aus der Thymosinfraktion 5 durch Goldstein et al. durch eine Kombination von Ionenaustauschchromato-graphie und Gelfiltration isoliert [Proc. Nati. Acad. Sei. USA 74, 725-729 (1977)].

Es hat sich nun überraschenderweise herausgestellt, dass auch die carboxylendständigen Octa-, Undeca- und Tetra-decapeptide des Thymosin äj eine immunpotenzierende Aktivität aufweisen, d.h. die Regulierung, Differenzierung und Funktion der T-Zellen beeinflussen.