DK147918B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af thymosin alfa1 (18 - 28) eller farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents
Analogifremgangsmaade til fremstilling af thymosin alfa1 (18 - 28) eller farmaceutisk acceptable salte deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK147918B DK147918B DK169478AA DK169478A DK147918B DK 147918 B DK147918 B DK 147918B DK 169478A A DK169478A A DK 169478AA DK 169478 A DK169478 A DK 169478A DK 147918 B DK147918 B DK 147918B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- obzl
- glu
- boc
- val
- lys
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06043—Leu-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
147918
Thymosin er en varmestabil, stærkt sur polypeptidforbindelse med 28 aminosyrerester med følgende sekvens: 5 10 H-jC-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr- 15 20 25 -Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
Dette peptid, som er et potent immunopotenserende middel, er isoleret af thymosinfraktion 5 af Goldstein et al. ved en kombination af ionbytterchromatografi og gelfiltrering (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 725 - 729 (1977)).
147918 2
Det har nu vist sig, at visse peptider, der er sekvensfragmenter af thymosin α^, er virksomme over for T-cellers regulering, differentiering og funktion, deriblandt undecapeptidet med formlen H-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
Den foreliggende opfindelse angår derfor en analogifremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte undecapeptid thymosin α1 (18 - 28) med formlen
H-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH I
i eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at beskyttelsesgrupperne fjernes fra et beskyttet peptid med formlen
Boc-Glu (OBzl) -Lys (Z) -Lys (Z) -Glu (OB.zl) -Val-Val-Glu (OBzl) -Glu-(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
II
hvor Boc er tert. butyloxycarbonyl,
Bzl er benzyl og Z er benzyloxycarbonyl, og, om ønsket, den vundne forbindelse omdannes til et farmaceutisk acceptabelt salt.
Fjernelsen af beskyttelsesgrupperne fra det beskyttede peptid med formlen II gennemføres på i og for sig kendte måder, f.eks. ved behandling med vandfri syre såsom hydrogenfluorid, fortrinsvis i nærværelse af anisol.
Den anvendte strategi ved den kemiske syntese af det beskyttede undecapeptid med formlen II var som følger: 3 1479 18 H-Glu(OBzl)-OH kondenseres først med Boc-Ala-OSu til dannelse af det beskyttede dipeptidfragment Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, som derpå kondenseres med HC1.H-Asn-OBzl via DCC/HOSu-fremgangsmåden efter Wiinsch og Drees, Chem. Ber. £9, 110 (1966) . Hydrochloridsaltet af asparaginbenzylesteren fremstilles ud fra Boc-Asn-OBzl, som atter syntetiseres ud fra kommercielt tilgængelig Boc-Asn-OH og benzyl-bromid under anvendelse af aminosyrens cesiumsalt. Boc-beskyttelses-gruppen fjernes ved en 30 minutters behandling med 4N HC1 i tørt THF.
Ved reaktionen mellem H-Glu(OBzl)~OH og Boc-Glu(OBzl)-OSu fås Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH som en farveløs klar olie. Denne anvendes derpå ved syntesen af det beskyttede pentapeptid Boc-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl i en DCC/HOSu-formidlet fragmentkondensation under anvendelse af HCl.H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, som er afledt af Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl ved behandling med 4N HCl/ THF. Det ovenfor nævnte beskyttede pentapeptid fås i godt udbytte i form af et krystallinsk rent materiale.
Til fremstillingen af det beskyttede octapeptid Boc-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl fremstilles først det nødvendige beskyttede tripeptid Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH. Boc-Val-OSu lades først reagere med fri valin til dannelse af Boc-Val-Val-OH, hvorfra ved deblokering med 4N HCl i THF efterfulgt · af omsætning med Boc-Glu(OBzl)-OSu fås det ønskede tripeptid, som krystalliseres som cyclohexylaminsalt Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH.CHA. Cyclohexylaminsaltet omdannes til den fri syre og kondenseres derpå af DCC i nærværelse af HOSu med HCl.H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu-(OBzl)-Asn-OBzl, som er afledt af Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu-(OBzl)-Asn-OBzl ved behandling med HCl i THF. Det beskyttede octapeptid Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl fås i renset form som et amorft fast stof.
Til fremstillingen af det beskyttede undecapeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys-(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn- 4 147918 -OBzl fremstilles det nødvendige tripeptidfragment ud fra Boc-Lys(Z)--OSu og Η-Lys(Z)-OH. Det således vundne dipeptid Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH behandles med 4N HCl i THF, og det resulterende salt HCl.H-Lys(Z)--Lys(Z)-OH lades derpå reagere med Boc-Glu(OBzl)-OSu til dannelse af det ønskede tripeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH. Tripepti-det aktiveres derpå med DCC og HOSu ved fremgangsmåden ifølge Weygand et al., Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966), og opløsningen af den in situ dannede tripeptidester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu forenes med trifluoracetatsaltet af H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, som er afledt af det tilsvarende blokerede octapeptid ved en 30 minutters behandling med trifluor-eddikesyre. Efter tilsætning af en lille mængde base fås således det Ønskede beskyttede undecapeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)--Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl.
Ved afbeskyttelse af det beskyttede undecapeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)--Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl f.eks. med vandfrit hydrogenfluorid fås det fri undecapeptid H-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH, som efter ion-bytterkolonnechromatografi er homogent ved papirelektroforese.
Det hidtil ukendte undecapeptid, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, samt dets farmaceutisk acceptable salte kan administreres til varmblodede pattedyr ved parenteral administration, enten intravenøst, subcutant eller intramus-kulært. Denne forbindelse er et potent immunopotenserende middel ved en daglig dosis i området fra ca. 1 til 100 mg/kg legemsvægt pr. dag ved intravenøs administration. Den nødvendige dosis vil naturligvis variere med den særlige tilstand, som behandles, tilstandens alvorlighed og behandlingens varighed. En egnet dosisform til farmaceutisk anvendelse er 1 mg lyofiliseret peptid, hvilket rekonstitueres før anvendelsen ved tilsætning af sterilt vand eller saltopløsning.
5 147918
Farmaceutisk acceptable salte af det ovenfor nævnte peptid omfatter natrium- og kaliumsalte eller salte med en stærk organisk base såsom guanidin. Desuden kan modionen til disse kationer, f.eks. chlo-ridet, bromidet, sulfatet, phosphatet, maleatet, acetatet, citratet, benzoatet, succinatet, malatet, ascorbatet og lignende være indbefattet i præparatet.
Følgende eksempel beskriver i detaljer syntesen af undecapeptidet.
De her anvendte forkortelser har følgende betydninger:
Boc = tert.butyloxycarbonyl, Bzl = benzyl, DCC = dicyclohexylcar-bodiimid, DMF = dimethylformamid, THF = tetrahydrofuran, HOSu = N--hydroxysuccinimid, Triton B = 40%'s methanolisk opløsning af tri-methylbenzylammoniumhydroxid, NMM = N-methylmorpholin, CHA = cyc-lohexylamin, DCHA = dicyclohexylamin, Z = benzyloxycarbonyl, DMSO = dimethylsulfoxid, TFA = trifluoreddikesyre, TLC = tyndtlagschroma-tografi, Et^N = triethylamin , og HOBT = 1-hydroxybenzotriazol.
Eksempel 15 g (39,5 millimol) Boc-Lys(Z)-OH omrøres sammen med 5,8 g (50,5 millimol) HOSu og 8,66 g (42 millimol) DCC i 250 ml THF i 3 timer. Et uopløseligt biprodukt frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed. Den som remanens vundne sirup (24,2 g) behandles med 150 ml isopropanol og 150 ml petroleumsether, hvorved fås 21 g af et olieagtigt produkt, som ikke krystalliserer. Den rå aktive ester Boc-Lys(Z)-OSu anvendes således til kondensation af 10,6 g (38 millimol) H-Lys(Z)-0H i 250 ml DMF i 72 timer i nærværelse af 5,5 ml EtgN. Der tilsættes fra tid til anden mere Et^N for at bevare den omrørte reaktionsblanding svagt basisk. En lille mængde uopløst materiale frafiltreres derpå, og filtratet inddampes til tørhed (45°C). Den vundne olieagtige remanens behandles med 1 liter 5%'s eddikesyre. Det udfældede produkt ekstraheres i ethylacetat, og den organiske fase vaskes med vand, tørres med natriumsulfat og inddampes til en olie. Denne krystalliseres af 300 ml ethylacetat, ^ 147918 6 som indeholder 10 ml DCHA i form af et salt. Ved omkrystallisation af methanol og ether fås 22,7 g (72,5%) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH.DCHA, smeltepunkt 160 - 162°C, [a]p5 = -2,21° (c = 1, methanol).
10 g (12,14 millimol) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH.DCHA fordeles mellem 1 liter ethylacetat og 1 liter 0,1N svovlsyre. Den organiske fase vaskes derpå tre gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed, hvorved fås 7,9 g. Den således vundne fri syre Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH behandles med frisk fremstillet 4N HC1 i THF i 30 minutter. Opløsningsmidlet og overskydende syre afdampes (30°C), og remanensen geninddampes to gange med THF. Den vundne remanens størkner ved behandling med ether. Saltet HCl.H-Lys-(Z)-Lys(Z)-OH opsamles ved filtrering og vaskes adskillige gange med ether, hvorved fås 6,7 g hvidt pulver. Det opløses i 70 ml DMF, afkøles i et isbad og behandles med 1,63 ml Et^N efterfulgt af 5,54 g (12,76 millimol) Boc-Glu(OBzl)-OSu. Blandingen omrøres ved 0°C i 1 time og derpå ved 25°C i 24 timer. Der tilsættes mere Et^N i løbet af denne periode for at holde reaktionsmiljøet ved en pH-værdi på ca. 7.5. Der tilsættes nogle få ml eddikesyre for at gøre reaktionsblandingen sur (pH-værdi 3,5), og opløsningsmidlet afdampes. Den vundne remanens optages i ethylacetat, vaskes tre gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed, hvor produktet begynder at størkne. Det tritureres i ether og om-krystalliseres af ethylacetat. Udbytte: 7,26 g (69,5%) Boc-Glu-(OBzl)-Lys(Z)rLys(Z)-OH, smeltepunkt 153 - 155°C, [alp5 = -2,71° (c = 1, THF) .
11.0 g (47,5 millimol) Boc-Asn-OH opløses i 200 ml methanol, og der tilsættes 20 ml vand. Opløsningen titreres til pH-værdi 7.0 med en 20%'s vandig opløsning af cesiumcarbonat (ca. 55 ml). Blandingen inddampes til tørhed, og remanensen geninddampes to gange fra dimethylformamid (120 ml hver gang, 45°C). Det vundne hvide faste stof omrøres derpå sammen med 8,9 g (52 millimol) benzyl-bromid i 120 ml dimethylformamid i 6 timer. Efter inddampning til tørhed og behandling med et stort vandvolumen størkner produktet straks. Det frafiltreres og opløses i ethylacetat, vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes, hvorved fås en fast masse, som krystalliseres af ethylacetat med petroleumsether. Herved fås 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl, smeltepunkt 120 - 122°C, [a]p5 = -17,29° (c = 1, DMF).
147918 7 13,7 g (42,4 millimol) Boc-Asn-OBzl opløses i 80 ml tetrahydrofuran og behandles med 500 ml 4N HC1 i THF. Blandingen lades henstå i 45 minutter, hvorunder noget produkt begynder at udfældes. Ved behandling med 1000 ml ether dannes straks et hvidt fast stof. Produktet frafiltreres, vaskes med ether og tørres over natriumhydroxid-perler i vakuum. Udbytte: 10,3 g (94%) HCl.H-Asn-OBzl, smeltepunkt 122 - 126°C, [a]£5 = +6,82°.
7,0 g (29,5 millimol) H-Glu(OBzl)-OH formales fint i en morter og omrøres derpå sammen med 8,88 g (32,3 millimol) Boc-Ala-OSu i 48 timer i 250 ml DMF i nærværelse af 6 ml NMM. Der tilsættes yderligere noget NMM for at bevare reaktionsmiljøet svagt basisk under reaktionen. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen deles mellem 300 ml ethylacetat og 500 ml vand, som indeholder 2 ml 10%'s svovlsyre.
Den organiske fase vaskes derpå tre gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed. Produktet tages op i et lille volumen ether og behandles med et stort volumen petroleums-ether. Derved fås et hvidt amorft fast stof, som er homogent på TLC. Udbytte: 11,0 g (91,5%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, smeltepunkt 84 - 88°C, [ct]J5 = 8,08° (c = 1, DMF).
10,4 g (25,4 millimol) Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, 6,56 g (25,4 millimol) HCl.H-Asn-OBzl og 5,9 g (50,8 millimol) HOSu opløses i 250 ml dimethylformamid ved O^C. Der tilsættes 5,7 g (27,6 millimol) DCC,straks efterfulgt af 3,5 ml Et^N. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og derpå ved 25°C i 40 timer, hvorunder der af og til tilsættes noget mere EtgN for at opretholde et svagt basisk reaktionsmiljø. De dannede uopløselige biprodukter frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed. Det som remanens vundne olieagtige materiale størkner ved behandling med vand. Det rå produkt tages op i chloroform, vaskes tre gange med vand og tørres over natriumsulfat, og der inddampes til et mindre volumen. Noget faststof, som dannes i dette trin, frafiltreres (kraftigt forurenet med dicyclohexylurin-stof), og filtratet behandles med petroleumsether. Der fås et krystallinsk produkt. Udbytte: 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl, smeltepunkt 102 - 105°C, [a]^ = 12,5° (c = 1, DMF).
4,74 g (20 millimol) H-Glu(OBzl)-OH formales i en morter og omrøres sammen med 0,7 g (20 millimol) Boc-Glu(OBzl)-OSu i DMF i 36 timer i nærværelse af 3,6 ml NMM. Den resulterende opløsning 8 147918 inddampes til en sirup og behandles med vand. Det olieagtige bundfald tages op i ethylacetat, vaskes med 5%'s eddikesyre og 3 gange med vand i den nævnte rækkefølge, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed, hvorved fås 14,03 g af en klar olie. Denne lades henstå under petroleumsether. Den som remanens vundne olieagtige Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH vejer 10,2 g (90,0%).
TLC indicerer, at produktet er homogent, [a]^5 = -7,59° (c = 1, DMF) .
28,2 g (46 millimol) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl behandles med 1,1 liter 4N HCl i THF i 1 time. Ved afdampning af opløsningsmidlet og overskydende syre fås en olie, som inddampes to gange mere med frisk THF. Den som remanens vundne olie størkner, når den behandles med et stort volumen ether. Det faste HCl.Η-Ala-Glu(OBzl)--Asn-OBzl omrøres sammen med 25,6 g (46 millimol) Boc-Glu(OBzl)--Glu(0Bzl)-0H, 10,6 g (92 millimol) HOSu og 10,9 g (53 millimol) DCC i 540 ml DMF ved 0°C i 1 time og derpå ved 25°C i 48 timer. Der tilsættes i løbet af hele perioden Et^N for at bevare et svagt basisk reaktionsmiljø (i alt ca. 16 ml Et^N). De dannede uopløselige biprodukter frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed. Det rå produkt opløses i chloroform, vaskes tre gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed. Produktet størkner ved behandling med petroleumsether. Ved omkrystallisation af isopropanol fås 28,9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, smeltepunkt 169 - 175°C, [a]J5 = -11,78° (c = 1, DMF).
3,9 g (3,48 millimol) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn--OBzl behandles med 15 ml 4N HCl i THF i 30 minutter. Der begynder at dannes noget krystallinsk produkt. Der tilsættes 210 ml ether, og det udfældede faste stof opsamles og vaskes med ether. Det rå materiale krystalliseres af methanol og ether. Udbytte: 2,58 g (75,1%) HCl.Η-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, smeltepunkt 148 -151°C, [a]p5 = -3,65° (c = 1, DMF).
12,6 g (40 millimol) Boc-Val-OSu og 4,68 g (40 millimol) H-Val-OH kondenseres i 250 ml DMF i 96 timer i nærværelse af 2 ml Et^N.
Der tilsættes mere Et^N, når det er nødvendigt for at holde reaktionsmiljøet svagt basisk. Det tilbageværende uopløselige materiale frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed (45°C). Remanensen deles mellem ether og fortyndet svovlsyre (ca. 1%), og den organiske fase vaskes tre gange med vand, tørres over natriumsulfat og ind 147918 dampes til et skumagtigt glas. Produktet krystalliseres af ether og petroleumsether. Udbytte: 12,2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH, smeltepunkt 155 - 158°C, [a]£5 = +1,10° (c = 1, DMF).
40,5 g (128 millimol) Boc-Val-Val-OH behandles med 1,8 liter 4N HCl i THF i 60 minutter. Ved inddampning til fjernelse af overskydende syre og opløsningsmiddel efterfulgt af behandling med ether fås 34,5 g HCl.H-Val-Val-OH i form af et hvidt amorft pulver. Det behandles med 55,6 g (128 millimol) Boc-Glu(OBzl)-OSu i 1 liter DMF i 24 timer i nærværelse af 54 ml Et^N. Reaktionsblandingen filtreres til fjernelse af noget uopløseligt materiale, og filtratet inddampes til tørhed. Det som remanens vundne olieagtige materiale optages i 1,5 liter ethylacetat og vaskes to gange med 5%'s eddikesyre og derpå tre gange med vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed, hvorved fås en farveløs klar olie, som ikke krystalliserer. Den opløses således i 3,2 liter ether og behandles med 17 ml CHA, indtil blandingens pH-værdi er 7,5.
Det vundne faste salt opsamles og omkrystalliseres af methanol og ether. Udbytte: 58,9 g (72,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH.CHA, smeltepunkt 158 - 160°C, [a]^ = 33,41° (c = 1, methanol).
1,69 g (2,66 millimol) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH.CHA suspenderes i 40 ml vand og 40 ml ethylacetat i en skilletragt efter tilsætning af 4 ml 1M svovlsyre. Efter kraftig omrystning opløses det faste stof, og den organiske fase vaskes adskillige gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til 1,45 g olie. Det således vundne fri tripeptid kondenseres derpå med 2,58 g (2,61 millimol) HCl.H-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl i 15 ml DMF i nærværelse af 0,612 g (5,32 millimol) HOSu, 0,3 ml (2,66 millimol) NMM og 0,63 g (3,06 millimol) DCC i 1 time ved 0°C og i 60 timer ved 25°C.
Der tilsættes mere NMM, når det er nødvendigt for at opretholde et svagt basisk reaktionsmiljø. Et dannet uopløseligt biprodukt frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed (45°C). Det som remanens vundne olieagtige materiale størkner ved behandling med vand. Det rå faste stof opløses i 50 ml DMF og udfældes med 300 ml methanol. Udbytte: 2,25 g (58,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, smeltepunkt 277 - 280°C, [a]^ = -12,43° (c = 1, DMF).
10 147918 1,7 g (1/16 millimol) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl behandles med 24 ml TFA i 30 minutter.
Efter afdampning af en overskydende syre (30°C) tritureres remanensen med ether. Det vundne pulver vaskes grundigt med ether og petroleumsether og tørres over natriumhydroxid i vakuum, hvorved fås 1,71 g af trifluoracetatsaltet af octapeptidet. Den aktive ester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu dannes derpå in situ ved at omrøre 0,998 g (1,16 millimol) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lyz(Z)-OH, 0,16 g (1,4 millimol) HOSu og 0,274 g (1,33 millimol) DCC i 15 ml DMF ved 0°C i 3 timer. Til denne opløsning, som indeholder den aktive tripeptidester, sættes 1,71 g af octapeptidsaltet CF3COOH.H--Glu (OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl sammen med 0,2 ml Et^N. Der tilsættes endnu nogle få dråber Et^N og 15 ml DMF, og blandingen omrøres i 3 dage ved 25°C. Der dannes et gelatinøst halvfast stof. Det syrnes med eddikesyre og behandles med vand. Det udfældede hvide faste stof opsamles og vaskes med vand, methanol og ether, hvorved fås 2,25 g råt produkt, som smelter ved 310 r 313°C. Det opløses i DMF og udfældes med methanol. Udbytte: 1,75 g (68,3%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, smeltepunkt 314 - 316°C, [a]p5 = 13,68° (c = 1, DMSO), homogent på TLC.
0,5 g (0,226 millimol) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val--Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl opløses i 2 ml TFA og omrøres sammen med 15 ml HF ved 0°C i 15 minutter. Efter afdampning af overskydende syre (0°C) opløses remanensen i 5%?s vandig eddikesyre, vaskes tre gange med ether, inddampes til et mindre volumen og lyofiliseres, hvorved fås 0,34 g af et råt produkt. Det chromatograferes på en 3 x 32 cm søjle af stærkt basisk polystyrenharpiks (Bio-Rad AGl-x 2) ækvilibreret med ammoniumacetat-puffer med pH-værdi 8,1 (2% eddikesyre giver pH-værdi 8,1 sammen med ammoniak). Søjlen elueres successivt med 200 ml's portioner 0,025 M ammoniumacetat med pH-værdi 5,5, 0,025 M eddikesyre, 0,05 M eddikesyre, 0,1 M eddikesyre, 0,25 M eddikesyre, 0,5 M eddikesyre, 0,75 M eddikesyre og 1 M eddikesyre. Der opsamles fraktioner på 12 ml, og eluatet fra hvert reagensglas måles ved TLC. De fraktioner, som indeholder det ønskede materiale, forenes og lyofiliseres to gange, hvorved fås 0,13 g (42,1%) rent H-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH, [a]^5 = -85,65° (c = 1, H2<0) .
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78989877A | 1977-04-22 | 1977-04-22 | |
| US78989877 | 1977-04-22 | ||
| US87156378 | 1978-01-23 | ||
| US05/871,563 US4116951A (en) | 1977-04-22 | 1978-01-23 | [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK169478A DK169478A (da) | 1978-10-23 |
| DK147918B true DK147918B (da) | 1985-01-07 |
| DK147918C DK147918C (da) | 1985-08-19 |
Family
ID=27120967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK169478A DK147918C (da) | 1977-04-22 | 1978-04-18 | Analogifremgangsmaade til fremstilling af thymosin alfa1 (18 - 28) eller farmaceutisk acceptable salte deraf |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS53137914A (da) |
| AT (1) | AT364470B (da) |
| CA (1) | CA1113088A (da) |
| CH (3) | CH641152A5 (da) |
| DE (1) | DE2817082A1 (da) |
| DK (1) | DK147918C (da) |
| ES (1) | ES469016A1 (da) |
| FI (1) | FI781241A (da) |
| FR (2) | FR2401134A1 (da) |
| GB (1) | GB1590668A (da) |
| GR (1) | GR71886B (da) |
| HU (1) | HU180783B (da) |
| IT (1) | IT1113134B (da) |
| LU (1) | LU79488A1 (da) |
| NL (1) | NL7804364A (da) |
| NO (2) | NO781404L (da) |
| PT (1) | PT67937B (da) |
| SE (1) | SE447262B (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4116951A (en) * | 1977-04-22 | 1978-09-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof |
| DE2919592A1 (de) * | 1979-05-15 | 1981-01-15 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon |
| EP0033384B1 (de) * | 1980-01-18 | 1984-02-15 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunstimulierender Wirkung, und Thymosin-alpha-1-Fragmente |
| US4339427A (en) * | 1980-04-14 | 1982-07-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Radioimmunoassay of thymosinα |
| EP0056594B1 (de) * | 1981-01-14 | 1984-09-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung und Thymosin-alpha-1-Fragmente |
| CN1058500C (zh) * | 1993-02-03 | 2000-11-15 | 施塞克龙药品公司 | 胸腺素α－1衍生物 |
| US6262230B1 (en) * | 1994-01-28 | 2001-07-17 | Sciclone Pharmaceuticals Inc. | Analogs of thymosin α1 |
-
1978
- 1978-04-17 CH CH408878A patent/CH641152A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-04-18 DK DK169478A patent/DK147918C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-04-19 DE DE19782817082 patent/DE2817082A1/de not_active Ceased
- 1978-04-20 FR FR7811686A patent/FR2401134A1/fr active Granted
- 1978-04-20 GR GR56036A patent/GR71886B/el unknown
- 1978-04-21 AT AT0286178A patent/AT364470B/de not_active IP Right Cessation
- 1978-04-21 IT IT22629/78A patent/IT1113134B/it active
- 1978-04-21 HU HU78HO2067A patent/HU180783B/hu unknown
- 1978-04-21 PT PT67937A patent/PT67937B/pt unknown
- 1978-04-21 CA CA301,643A patent/CA1113088A/en not_active Expired
- 1978-04-21 FI FI781241A patent/FI781241A/fi not_active Application Discontinuation
- 1978-04-21 NO NO781404A patent/NO781404L/no unknown
- 1978-04-21 SE SE7804612A patent/SE447262B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-04-21 GB GB1574/78A patent/GB1590668A/en not_active Expired
- 1978-04-21 JP JP4673978A patent/JPS53137914A/ja active Pending
- 1978-04-21 LU LU79488A patent/LU79488A1/de unknown
- 1978-04-21 ES ES469016A patent/ES469016A1/es not_active Expired
- 1978-04-24 NL NL7804364A patent/NL7804364A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-12-15 FR FR7835404A patent/FR2405926A1/fr active Granted
-
1982
- 1982-05-13 NO NO821608A patent/NO148924C/no unknown
- 1982-11-05 CH CH644982A patent/CH640218A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-11-05 CH CH645082A patent/CH641153A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT7822629A0 (it) | 1978-04-21 |
| NL7804364A (nl) | 1978-10-24 |
| SE447262B (sv) | 1986-11-03 |
| FR2405926A1 (fr) | 1979-05-11 |
| FR2401134A1 (fr) | 1979-03-23 |
| PT67937B (en) | 1980-04-07 |
| FR2405926B1 (da) | 1983-09-09 |
| NO821608L (no) | 1978-10-24 |
| ES469016A1 (es) | 1980-01-01 |
| GB1590668A (en) | 1981-06-03 |
| NO148924C (no) | 1984-01-11 |
| DK169478A (da) | 1978-10-23 |
| ATA286178A (de) | 1981-03-15 |
| CA1113088A (en) | 1981-11-24 |
| DE2817082A1 (de) | 1978-11-02 |
| JPS53137914A (en) | 1978-12-01 |
| CH641152A5 (en) | 1984-02-15 |
| IT1113134B (it) | 1986-01-20 |
| FI781241A (fi) | 1978-10-23 |
| PT67937A (en) | 1978-05-01 |
| GR71886B (da) | 1983-08-04 |
| FR2401134B1 (da) | 1983-09-30 |
| CH640218A5 (en) | 1983-12-30 |
| AT364470B (de) | 1981-10-27 |
| NO148924B (no) | 1983-10-03 |
| NO781404L (no) | 1978-10-24 |
| CH641153A5 (en) | 1984-02-15 |
| HU180783B (en) | 1983-04-29 |
| SE7804612L (sv) | 1978-12-20 |
| DK147918C (da) | 1985-08-19 |
| LU79488A1 (de) | 1979-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| GB1590669A (en) | Peptides | |
| US4148788A (en) | Synthesis of thymosin α1 | |
| EP1000051B1 (en) | Carbamyloxy compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by vla-4 | |
| US7229970B2 (en) | Carbamyloxy compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by VLA-4 | |
| PT93245B (pt) | Processo para a preparacao de novos derivados de glicina e de composicoes farmaceuticas que os contem | |
| AU8585198A (en) | Benzyl compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by vla-4 | |
| JPH01125398A (ja) | アミノ酸誘導体およびその製法 | |
| EP1001971A1 (en) | Dipeptide and related compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by vla-4 | |
| KR100197329B1 (ko) | 히단토인 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 | |
| US3345354A (en) | Intermediate in the synthesis of alpha1-24 acth | |
| SE447389B (sv) | Nya tripeptider, som inverkar pa det centrala nervsystemet | |
| DK147918B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af thymosin alfa1 (18 - 28) eller farmaceutisk acceptable salte deraf | |
| WO2000002903A1 (en) | Cs-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same | |
| US3856770A (en) | Psychopharmacologically active tetra-, penta-, hexa-, and heptapeptides | |
| US6586602B2 (en) | Benzyl compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by VLA-4 | |
| AU605212B2 (en) | Renin-inhibitors III | |
| CA2017552A1 (en) | Amino-substituted heterocycles as renin inhibitors | |
| US3801561A (en) | Derivatives of salmon thyrocalcitonin | |
| US4238390A (en) | Synthesis and biological activity of [D-Thr2, Δ3 Pro5 ]-enkephalinamide | |
| IL34630A (en) | Polypeptides and derivatives thereof,their production and pharmaceutical compositions containing them | |
| KR840000054B1 (ko) | 티모신 α₁의 제조방법 | |
| CA1123428A (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF THYMOSIN .alpha..SUB.1 AND AN ANALOGUE | |
| Wang et al. | [Asn 2]-thymosin α 1 and analogs thereof | |
| JPH0422918B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |