HU180783B - Process for preparing alpha down 1 and asn up 2 analogues of thymosin - Google Patents

Process for preparing alpha down 1 and asn up 2 analogues of thymosin Download PDF

Info

Publication number
HU180783B
HU180783B HU78HO2067A HUHO002067A HU180783B HU 180783 B HU180783 B HU 180783B HU 78HO2067 A HU78HO2067 A HU 78HO2067A HU HO002067 A HUHO002067 A HU HO002067A HU 180783 B HU180783 B HU 180783B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
obzl
glu
bzl
ala
lys
Prior art date
Application number
HU78HO2067A
Other languages
English (en)
Inventor
Su-Sun Wang
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05/871,563 external-priority patent/US4116951A/en
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HU180783B publication Critical patent/HU180783B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A timozin ctj 28 aminosav-maradékból álló, hőstabil, nagymértékben savas polipeptid, amely az alábbi képletnek felel meg: H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH.
A találmány tárgya új eljárás timozin a, és (Asn2)-analógja előállítására.
Ezt az erős immúnfokozó hatással rendelkező pepiidet Goldstein és munkatársai ioncserés kromatográfiával és gélszüréssel különítették el timozinfrakció 5-ből [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 725—729 (1977)].
A találmány tárgya eljárás timozin aj és (Asn2)-timozin aj előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy valamely (I) általános képletü védett oktakozapeptid H3C-CO-Ser(R1)-X-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R1)-Glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)- (I) -Lys(R5)-Glu(0R4)-Val-Val-Glu(0R4)-Glu(0R4)-Ala-Glu(0R4)-Asn-0R6 — ahol
X Asn vagy Asp(0R2) csoportot jelent,
R1 a szerint-maradék hidroxil-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent,
R2, R4 és R6 karboxil-csoportra felvihető szokásos védőcsoportot jelent,
R3 a treonin hidroxil-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent, és
R5 a lizin-maradék ω-amino-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent — védőcsoportjait lehasítjuk.
R1 például benzil-, acetil-, benzoil-, terc-butil-, tritil-, 4-bróm-benzil-, 2,6-diklór-benzil- vagy benziloxikarbonilcsoportot (előnyösen bcnzil-csoportot) jelenthet. Az R2, R4 és Rö helyén álló csoportok közül példaként a következőket soroljuk fel: aril-csoportok, előnyösen fenil-csoport vagy rövidszénláncú alkil-csoporttal, halogénatommal, nitrocsoporttal, merkapto-csoporttal vagy szubsztituált merkapto-csoporttal (így metiltio-csoporttal) helyettesített fenilcsoport; aralkil-csoportok, így benzil-csoport vagy metoxicsoporttal, halogénatommal vagy nitro-csoporttal szubsztituált benzil-csoport; rövidszénláncú alkil-csoportok, így metil-, etil-, terc-butil- és terc-amil-csoport; szubsztituált rövidszénláncú alkil-csoportok, így 2-halogén-etil-, β,β-dimetilamino-etil- és cianometil-csoport; benzhidril-csoport és fenacil-csoport (különösen előnyösen benzil-csoport). R3 például benzil-, acetil-, benzoil-, terc-butil-, tritil-, 2,6-diklór-benzil-, 4-bróm-benzil- vagy benziloxikarbonil-csoportot (előnyösen benzil-csoportot) jelenthet. R5 például a következő csoportokat jelentheti: benziloxikarbonil-csoport; az aromás gyűrűn adott esetben szubsztituenst hordozó benziloxikarbonil-csoport, így 4-klór-, 2-bróm-, 4-bróm-, 2,4-diklór-, 4-nitro-, 4-metoxi-, 3,5-dimetoxi-, 4-metil-, 2,4,6-trimetil-, 4-fenilazo-, 4-(4-metoxi-fenilazo)-, 2-(N,N-dimetil-karbamido)- és 2-nitro-4,5-dimetoxi-benziloxikarbonil-csoport; uretán-típusú védöcsoportok, így 4-toluolszulfonil-etoxikarbonil-csoport, 9-fluorenilmetiloxikarbonil-csoport és hasonló, bázissal lehasítható csoportok; 5-benzizoxazolil-metilénoxikarbonil-csoport, metiltio- és metilszulfonil-etiloxikarbonil-csoport, izonikotiniloxikarbonil-csoport, halogén-etoxikarbonil-csoportok, diizopropilmetoxikarbonil-csoport,
-1180^83 benzhidriloxikarbonil-csoport, izobomiloxikarbonil-csoport, dinitro-difenil-metoxikarbonil-csoport, terc-butoxikarbonil csoport, terc-amiloxikarbonil-csoport, adamantiloxikarbonilcsoport, ciklopentiloxikarbonil-csoport, metil-ciklobutiloxikarbonil-csoport, metil-ciklohexiloxikarbonil-csoport, 2-arilizopropoxikarbonil-csoportok [igy 2-(p-bifenilil)-izopropoxikarbonil- és 2-(4-piridil)-izopropoxikarbonil-csoport] és hasonló nitrogéntartalmú uretán-csoportok; acil-csoportok, így formil-, trifluoracetil-, ftaloil-, benzolszulfonil-, acetoacetil-, klóracetil-, 2-nitro-benzoil- és 4-toluolszulfonil-csoport; szulfenil-csoportok, így benzolszulfenil-, o-nitro-fenilszulfenil- és hasonló szulfenil-csoportok; továbbá aril-rövidszénláncú alkil-csoportok, így difenilmetil- és trifenilmetil-csoport. R5 előnyösen benziloxikarbonil-csoportot jelenthet.
Az (I) általános képletü védett oktakozapeptidek védőcsoportjait önmagukban ismert módszerekkel hasíthatjuk le; így például ezeket a vegyületeket vízmentes savval (például hidrogénfluoriddal) kezelhetjük, célszerűen anizol jelenlétében.
Az (I) általános képletü védett oktakozapeptideket a találmány értelmében úgy állíthatjuk elő, hogy a (II) általános képletü védett tetradekapeptideket
H3C-CO-Ser(R')-X-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R1)-Ser(R')-Glu(OR4)-Ile- (II) -Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R5)-OR7 (III) általános képletü védett tetradekapeptidekkel kondenzáljuk
H-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5 )-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)- (III) -Glu(0R4)-Ala-Glu(0R4)-Asn-0R6 — ahol X, R1, R2, R3, R4, R5 és R6 jelentése a fenti, és R7 hidrogénatomot vagy aktiváló csoportot jelent.
A fenti kapcsolási reakciót az oldatfázisú peptid-szintézis jól ismert módszereivel hajthatjuk végre. Eljárhatunk például úgy, hogy a terminális amino-csoportot hordozó tetradekapeptidet 1-hidroxi-benztriazollal (HOBT) és diciklohexilkarbodiimiddel (DCC) reagáltatjuk, és az így kapott aktivált észtert kapcsoljuk a terminális karboxil-csoportot hordozó tetradekapeptiddel.
A védett tetradekapeptideket önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő.
Az X helyén Asp(OBzl) csoportot tartalmazó (III) általános képletü, karboxil-végcsoportot tartalmazó védett tetradekapeptidet például a következőképpen alakítjuk ki:
A szintézis első lépésében H-Glu(OBzl)-OH-t Boc-Ala-OSu-val kapcsolunk, majd a kapott, Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH képletü védett dipeptid-fragmenst a DCC[HOSu módszer szerint (lásd Wünsch és Drees: Chem. Bér. 99, 110/1966)] HC1 · H-Asn-OBzl-el kondenzáljuk. Az aszparaginsav-benzilészter-hidrokloridot Boc-ASn-OBzl-ből állítjuk elő; ezt az utóbbi vegyületet a kereskedelemben kapható BocAsn-OH céziumsója és benzilbromid kondenzációjával alakítjuk ki. A Boc védőcsoport lehasitása során a védett vegyületet vízmentes tetrahidrofuránban 30 percig 4 n sósavoldattal kezeljük.
Ezután H-Glu(OBzl)-OH és Boc-Glu(OBzl)-OSu reakciójával Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzI)-OH-t állítunk elő átlátszó, színtelen olaj formájában. A kapott vegyületet DCC/HOSu közvetítésével végrehajtott fragmens-kondenzációban HC1 · H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzI-el reagáltatjuk (az utóbbi reagenst Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-ből állítjuk elő, tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal végzett kezeléssel). A kondenzáció során tiszta, kristályos anyag formájában jó hozammal kapjuk a Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletü védett pentapeptidet.
z
A Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletü védett oktapeptid szintézise során először a reagensként felhasználandó, Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH képletü védett tripeptidet állítjuk elő. A védett tripeptid előállításának első lépésében Boc-Val-OSu-t szabad valinnal reagáltatunk, a kapott Boc-Val-Val-OH képletü termék védőcsoportját tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal lehasítjuk, majd a védőcsoportmentes terméket Boc-Glu(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. Ekkor a kívánt tripeptidhez jutunk, amelyet kristályos ciklohexilaminsója [BocGlu(OBzl)-Val-Val-OH · CHA] formájában különítünk el. A ciklohexilaminsóból felszabadítjuk a savat, majd a szabad savat HOSu jelenlétében, DCC felhasználásával HC1 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-hez kapcsoljuk. Ezt az utóbbi reagenst Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl tetrahidrofurános közegben végzett sósavas kezelésével alakítjuk ki. A kapcsolási reakcióban kialakult, Boc-Glu(OBzi)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletü védett oktapeptidet tisztítás után amorf, szilárd anyag formájában különítjük el. A védett oktapeptid védőcsoportjait hidrogenolízissel és azt követő trifluorecetsavas kezeléssel ismert módon lehasítjuk, és a képződött Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn képletü szabad oktapeptidet ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat és papír-elektroforézis szerint egységes terméket kapunk.
A következő müveletsorozatban a Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletü védett undekapeptidet alakítjuk ki. A szintézis első lépésében Boc-Lys (Z)-OSu és H-Lys(Z)-OH reakciójával Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t állítunk elő, majd ezt a dipeptidet tetrahidrofuránban 4 n sósavoldattal kezeljük. A képződött HC1 · H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t Boc-Glu(OBzI)-OSu-val reagáltatjuk, majd a kapott Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH képletü tripeptidet Weygand és munkatársai módszerével [Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966)] DCC/HOSu eleggyel aktiváljuk. A kialakult, Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu képletü aktív tripeptid-észtert magában a képződési reakcióelegyben H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl trifluoracetát-sójával reagáltatjuk (ezt a reagenst a megfelelő, védett oktapeptid és trifluorecetsav 30 perces reakciójával alakítjuk ki). A reakcióelegyhez kis mennyiségű bázist adunk. Termékként Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletü védett undekapeptidet kapunk. A kapott védett undekapeptid védőcsoportjait vízmentes hidrogénfluoriddal végzett kezeléssel hasíthatjuk le. A képződött, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn képletü szabad undekapeptid ioncserés oszlopkromatográfiás tisztítás után papir-elektroforézis szerint egységes termék.
A szintézis végső műveletsorozatában a kívánt védett tetradekapeptidet alakítjuk ki a fentihez hasonló módszerrel. Boc-Leu-OSu és H-Lys(Z)-OH kapcsolásával Boc-Leu-Lys(Z)-OH-t állítunk elő. A kapott vegyület N“-Boc-csoportját tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal végzett kezeléssel lehasitjuk, és az így kapott vegyületet Boc-Asp(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. Tiszta, kristályos szilárd anyagként Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH képletü védett tripeptidet kapunk. Ezt a vegyületet Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSu képletü aktív észterévé alakítjuk, majd az aktív észtert H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl trifluoracetát-sójával (a megfelelő védett undekapeptid és trifluorecetsav reakciójá
-2180783 val kapott termék) kondenzáljuk. A kívánt Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-GIu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-Obzl képletű védett tetradekapeptidet jó hozammal kapjuk. A termék vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint homogén. Ha a kapott védett vegyületet vízmentes hidrogénfluoriddal kezeljük, majd a terméket ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk, a megfelelő, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-GluGlu-Ala-Glu-Asn képletű szabad tetradekapeptidhez jutunk.
Hasonló módszerekkel alakítjuk ki a H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű, védett amino-végcsoportot tartalmazó tetradekapeptidet egy acetil-tetrapeptid-fragmens, egy hexapeptid és egy további tetrapeptid összekapcsolásával. A reakciókat a peptid-szintézisben szokásos, ismert módon hajthatjuk végre. Az acetilamino-végcsoportot hordozó tetrapeptid előállítása során H3CCO-Ser(Bzl)-OH-céziumsó és benzilbromid reakciójával HjC-CO-Ser(Bzl)-OBzl-t állítunk elő, majd ezt a vegyületet hidrazinolizisnek vetjük alá. A H3C-CO-Ser(Bzl)-NHNH2 képletű tiszta, kristályos, szilárd hidrazin-származékot jó hozammal kapjuk. Egy külön műveletben a Boc-Ala-Ala-OH képletű dipeptid védőcsoportjának lehasításával HC1 · H-Ala-Ala-OH-t állítunk elő, és ezt a dipeptidet Boc-Asp(OBzl)-OSu-val kapcsoljuk. A képződött Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH képletű védett tripeptidet diciklohexilaminsója formájában különítjük el. Ezután az amino-védőcsoportot lehasítjuk, és a kapott terméket Honzl és Rudinger módszerével [Collection Czech. Chem. Commun. 26. 2333 (1961)] a H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 képletű hidrazin-származékkal kondenzáljuk. A képződött, H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH képletű, részlegesen védett tetrapeptidet DCC és HOBT jelenlétében ekvivalens mennyiségű hidrazinnal reagáltatjuk. Ekkor a kívánt tetrapeptid szintézisében közbenső termékként felhasználható, H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 képletű vegyülethez jutunk.
A Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser((Bzl)Glu(OBzl)-HNNH2 képletű védett hexapeptidet a C-terminális aminosavból kiindulva, lépésenkénti lánchosszabbítással állítjuk elő. Az első műveleti lépésben H-Glu(OBzl)-OH és Boc-Ser(Bzl)-OSu kapcsolásával a Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH képletű védett dipeptidet alakítjuk ki, majd e vegyület Boc-csoportját lehasítjuk, és a kapott terméket Boc-Ser(Bzl)-OSu-val reagáltatjuk. Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-GIu(OBzl)-OH képletű védett tripeptidet kapunk. A vegyület amino-védőcsoportját lehasitjuk, majd a képződött HC1 H-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH képletű sót Boc-Thr(Bzl)-OSu-val reagáltatjuk. Az így kapott Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH képletű védett tetrapeptid Boc-csoportját tetrahidrofurános közegben végzett sósavas kezeléssel lehasítjuk, és a képződött vegyületet Boc-Asp-(OBzI)-OSu-val reagáltatjuk. Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH képletű védett pentapeptidet kapunk. E vegyület Boc-csoportját sósavas kezeléssel lehasítjuk, majd a kapott HC1 · H-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH képletű sót Boc-Val-OSu-val kapcsoljuk. Tiszta, kristályos termék formájában
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl) OH-t kapunk.
Ezután a kapott hexapeptid terminális glutaminsav-részéhez kapcsolódó α-karboxil-csoportot specifikus reakcióval, DCC kapcsolószer alkalmazásával, HOBT jelenlétében hidrazid-csoporttá alakítjuk. Reagensként ekvivalens mennyiségű hidrazint használunk fel. A Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(BzI)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2 képletű védett hexa peptid-hidrazidot tiszta, kristályos, szilárd anyag formájában, megfelelő hozammal kapjuk.
A Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tetrapeptidet a fentihez hasonló lépésenkénti szintézissel, Anderson és munkatársai módszerével [J. Am. Chem. Soc. 86. 1839 (1964)] alakítjuk ki. Boc-Thr(Bzl)-OSu és H-Lys(Z)-OH reakciójával olajos termék formájában Boc-Thr (Bzl)-Lys(Z)-OH képletű dipeptidet állítunk elő, majd az ct-amino-csoporthoz kapcsolódó védőcsoportot lehasítjuk, és a kapott vegyületet Boc-Thr(Bzl)-OSu-val reagáltatjuk. Kristályos szilárd anyag formájában Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tripeptidet kapunk. E vegyület Boc-csoportját lehasítjuk, majd a kapott, HC1 · H-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű sót Boc-Ile-OSu-val reagáltatjuk. A képződött, Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tetrapeptidet szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Tiszta, kristályos terméket kapunk.
Ezután a fenti tetrapeptid-fragmens amino-végcsoportjához kapcsolódó védőcsopőrtot lehasitjuk, majd a kapott vegyületet azid-módszerrel a fentiek szerint előállított, Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2 képletű védett hexapeptiddel kapcsoljuk. A Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett dekapeptidet jó hozammal kapjuk.
A kapott dekapeptid Boc-csoportját trifluorecetsavval lehasitjuk, majd a kapott vegyületet azid-módszerrel a korábban ismertetett módon kialakított, védett amino-végcsoportot tartalmazó, Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 képletű védett tetrapeptiddel kapcsoljuk. E lépésben a H3C-Co-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tetradekapeptidhez jutunk.
Az (I) általános képletű vegyület kialakítása során a fenti acetil-tetradekapeptidet DCC-vel és HOBT-vel aktiváljuk, majd a kapott aktív észtert TFA · H-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-lel reagáltatjuk (az utóbbi reagenst a megfelelő, védett tetradekapeptid és trifluorecetsav reakciójával alakítjuk ki). Termékként H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képletű, védett acetil-oktakozapeptidet kapunk. E vegyületet vízmentes hidrogénfluoriddal reagáltatva az összes védőcsoportot lehasitjuk, és a kapott pepiidet ioncserés kromatográfiával tisztítjuk. Timozan-cq-et kapunk.
Hasonló eljárással állítjuk elő a H3C-CO-Ser(Bzl)- Asp(OBzl)- Alá-Ala-Val-Asp(OBz 1 )-Thr(Bz 1 )-Ser-(Bz 1 )-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzi)-Lys(Z)-OH képletű védett tetradekapeptidből a megfelelő, H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH képletű szabad tetradekapeptidet.
Az [Asn2]-timozin-a1-et a timozin-a1-hez hasonló szintézissel alakítjuk ki. A szintézisben felhasznált közbenső termékek — a H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 képletű, acetilamino-végcsoportot hordozó tetrapeptid-hidrazid kivételével — megegyeznek a korábban felsoroltakkal. A H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 képletű vegyületet a következőképpen állítjuk elő:
Boc-Ala-Ala-OH-ból Boc-Ala-Ala-OBzl-t állítunk elő, majd e vegyület Boc-csoportját sósavas kezeléssel szelektí
-3180783 ven lehasítjuk. A kapott, HC1 H-AIa-Ala-OBzl képletü dipeptidészter-sót König és Geiger módszerével [Chem. Bér. 103,788 (1970)] Boc-Asn-OH-val kapcsoljuk, majd a képződött, Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl képletü védett tripeptid-észter Boc-csoportját tetrahidrofurános közegben végzett sósavas kezeléssel lehasítjuk. Az így kapott HC1 · H-Asn-Ala-Ala-OBzl képletü sót a DCC/HOBT módszer szerint H3C-CO-Ser(Bzl)-OII · DCHA-val kondenzáljuk, végül a képződött H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl képletü védett tetrapeptidet hidrazinolízisnek vetjük alá. A kívánt H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 képletü hidrazidot jó hozammal kapjuk.
A fenti hidrazid és a TFA H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-GIu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletü védett dekapeptid fragmenskondenzációjával a H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-AIa-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletü védett tetradekapeptidet állítjuk elő. Ezt a vegyületet ezután a fent ismertetett, védőcsoportmentes C-terminális aminosavrészt tartalmazó tetradekapeptid trifluorecetsavas sójával kapcsoljuk, és így védett [Asn2]-timozin-aj-et állítunk elő. A kapott vegyület összes védőcsoportját vízmentes hidrogénfluoriddal végzett kezeléssel lehasítjuk, majd a vegyületet ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Végtermékként [Asn2]-timozin-a1-et kapunk. A H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletü védett tetradekapeptid védőcsoportjait ugyanezzel a módszerrel távolíthatjuk el; ekkor a H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH képletü acetilezett tetradekapeptidhez jutunk.
Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a fenti szintézisben közbenső termékként képződött peptidek számos képviselője a T-sejtek szabályozását, differenciálódását és funkcióját befolyásoló aktivitással rendelkezik. Ezek a peptidek a következők:
Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn,
H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys és
H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys.
A timozin-a/Ct. [Asn2]-timozin-a1-et, illetve az előzőekben felsorolt új okta-, undeka- és tetradekapeptideket, valamint e vegyületek gyógyászatilag alkalmazható sóit parenterális úton (így intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris adagolással) juttathatjuk be a kezelendő melegvérű emlősök szervezetébe. Ezek a vegyületek körülbelül 1—100 mg/testsúly kg-os napi intravénás dózisban adagolva erős immúnfokozó aktivitással rendelkeznek. A szükséges napi dózis nyilvánvalóan a kezelendő rendellenességtől, a rendellenesség súlyosságától és a kezelés időtartamától függően változik. Gyógyászati felhasználás szempontjából alkalmas dózisegységeknek bizonyultak az 1 mg liofilizált timozin-a^et, [Asn2]-timozin-a1-et, illetve a fent felsorolt peptid-fragmenseket tartalmazó készítmények, amelyekhez felhasználás előtt steril vizet vagy fiziológiás sóoldatot kevernek.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A leírásban és az igénypontokban alkalmazott rövidítések jelentése a követke ző: Boc = terc-butoxikarbonil-csoport, Bzl = benzil-csoport, DCC = diciklohexil-karbodiimid, DMF=dimetilformamid, THF=tetrahidrofurán, HOSu= N-hidroxi-szukcinimid, Triton B = trimetil-benzil-ammóniumhidroxid 40%-os metanolos oldata, NMM = N-metil-morfolin, CHA = ciklohexilamin, DCHA = diciklohexilamin, Z = benziloxikarbonil-csoport, DMSO = dimetilszulfoxid, TFA = trifluorecetsav, Et3N = trietilamin, HOBT = 1-hidroxi-benzotriazol.
Megjegyezzük, hogy a timozin-α] és [Asn2]-timozin-aI szintézisét speciális védöcsoportok alkalmazása kapcsán ismertetjük; szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a konkrétan megnevezett védőcsoportok helyett egyéb, azokkal egyenértékű védőcsoportok is felhasználhatók.
1. példa
A) műveletsor:
a) 11,0 g (47,5 mmól) Boc-Asn-OH 200 ml metanollal készített oldatához 20 ml vizet adunk. Az oldat pH-ját 20%-os vizes Cs2CO3-oldattal 7,0-ra állítjuk (ehhez körülbelül 55 ml oldatra van szükség). Az elegyet szárazra pároljuk, és a maradékról 45 C°-on 2 x 120 ml dimeiilformamidot párolunk le. A kapott fehér, szilárd anyaghoz 8,9 g (52 mmól) benzilbromidot és 120 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet 6 órán át keverjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot nagymennyiségű vízzel kezeljük. A termék azonnal megszilárdul. A terméket leszűrjük, etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, végül bepároljuk, és a kapott szilárd anyagot etilacetát és petroléter elegyéböl kristályosítjuk. 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 120—122 C°,[otg= - 17,29° (c= 1, DMF).
13,7 g (42,4 mmól) Boc-Asn-OBzl-t 80 ml tetrahidrofuránban oldunk, és az oldathoz 500 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Az elegyet 45 percig állni hagyjuk; ezalatt az elegyből a termék egy része kiválik. Az elegyhez 1000 ml étert adunk. Az éter hatására azonnal kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, éterrel mossuk, és vákuumban, szemcsés nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 10,3 g (94%) HCI H-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 122—126 C°, [ctg= +6,82°.
b) 7,0 g (29,5 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmozsárban finomra aprítunk, majd az őrölt anyaghoz 8,88 g (32,3 mmól) Boc-Ala-OSu-t, 250 ml dimetilformamidot és 6 ml NMM-t adunk, és az elegyet 48 órán át keverjük. A reakcióelegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a reakció során az elegyhez további kis mennyiségű NMM-t is adunk. Az oldószert lepároljuk, és a maradékot 300 ml etilacetát és 500 ml víz és 2 ml 10%-os vizes sósavoldat elegye között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. A maradékot kevés éterben felvesszük, és az elegyhez nagy térfogatú petrolétert adunk. Fehér, amorf, vékonyrétegkromatográfiásan egységes szilárd anyagot kapunk. Az így kapott ll,0g (91,5%) Boc-AlaGlu(OBzl)-OH 84—88 C°-on olvad; [ag=8,08° (c = 1, DMF).
10,4 g (25,4 mmól) Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH-t, 6,56 g (24,5 mmól) HCI · H-Asn-OBzl-t és 5,9 g (50,8 mmól) HOSu-t 250 ml 0 C°-os dimetilformamidban oldunk, és az oldathoz 5,7 g (27,6 mmól) DCC-t, majd közvetlenül ezután 3,5 ml Et3N-t adunk. Az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 40 órán át 25 C°-on keverjük; ezalatt az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez időről időre kis mennyiségű Et3N-t adunk. A képződött oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. Az olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A kapott nyers terméket kloroformban felvesszük, a kloroformos oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd betőményítjük. A kivált kis mennyiségű szilárd anyagot (amely szennyezésként jelentős mennyiségű diciklohexil-karbamidot tartalmaz) kiszűrjük, és a szűrletet petroléterrel kezeljük. Kristályos termék formájában 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 102—105 C°, [a]“=12,5° (c=l, DMF).
c) 4,74 g (20 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmoisárban eldörzsölünk, majd dimetilformamidos közegben, keverés közben 0,7 g (20 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val és 3,6 ml NMM-el kezeljük. A képződött oldatot sziruppá bepároljuk, és a maradékot vízzel kezeljük. A kapott olajos csapadékot etilacetátban felvesszük, az oldatot egymás után 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A maradékként kapott 14,03 g átlátszó olajat petroléterrel fedjük, és a rendszert állni hagyjuk. Olajos termékként 10,2 g (90,0%) Boc-Glu(Obzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint egységes. [a]^5=—7,59° (c= 1, DMF).
d) 28,2 g (46 mmól) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 1 órán át 1,1 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a kapott olajos maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot nagy mennyiségű éterrel kezelve megszilárdítjuk. Az így kapott szilárd HC1 · H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, 25,6 g (46 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH, 10,6 g (92 mmól) HOSu, 10,9 g (53 mmól) DCC és 540 ml dimetilformamid elegyét 1 órán át 0 C°-on, majd 48 órán át 25 C°-on keverjük. Az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez időről időre Et3N-t adunk (összesen körülbelül 16 ml Et3N-t adagolunk be). A kivált oldhatatlan melléktermékeket leszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott nyers terméket kloroformban oldjuk, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, végül szárazra pároljuk. A maradékot petroléteres kezeléssel megszilárdítjuk, majd izopropanolból átkristályosítjuk. 28,9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 169— 175 C°, [a]2 D 5= - 11,78° (c= 1, DMF).
3,9 g (3,48 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 15 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk; ezalatt az elegyből kevés kristályos termék válik ki. Az elegyhez 210 ml étert adunk, a kivált szilárd anyagot elkülönítjük, éterrel mossuk, majd metanol és éter elegyéből kristályosítjuk. 2,58 g (75,1%) HC1 · H-Glu(OBzI)-GIu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 148—151 C°, [ct]£= -3,65° (c= 1, DMF).
e) 12,6g (40 mmól) Boc-Val-OSu-t 250 ml dimetilformamidban, 2 ml Et3N jelenlétében 4,68 g (40 mmól) H-Val-OH-val kondenzálunk. A reakciót 96 órán át végezzük; ezalatt az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség szerint további mennyiségű Et3N-t adunk. A kivált oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet 45 C°-on szárazra pároljuk. A maradékot éter és híg (körülbelül 1%-os) vizes kénsavoldat között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, nátrium szulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A habszerű üveg formájában kapott maradékot éter és petroléter elegyéből kristályosítjuk. 12,2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH-t kapunk; op.: 155—158 C°, [αξ5= + 1,10° (c=l, DMF).
40,5 g (128 mmól) Boc-Val-Val-OH-t 60 percig 1,8 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a maradékot éterrel kezeljük. Fehér, amorf porként 34,5 g HC1 H-Val-Val-OH-t kapunk. Ezt a vegyületet 1 liter dimetilformamidban, 54 ml Et3N jelenlétében 24 órán át 55,6 g (128 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szürletet szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 1,5 liter etilacetátban felvesszük, és az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal kétszer, majd vízzel háromszor mossuk. A szerves fázist nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. Átlátszó, színtelen, nem kristályosodó olajat kapunk. Ezt az anyagot 3,2 liter éterben oldjuk, és az oldathoz 7,5-es pH-érték eléréséig CHA-t (17 ml) adunk. A kivált szilárd sót leszűrjük és metanol és éter elegyéből átkristályositjuk. 58,9 g (72,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH CHA-t kapunk; op.: 158— 160 C°, [α]ρ = 33,4Γ (c=l, metanol).
1,69 g (2,66 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH CHA-t választótölcsérben 40 ml víz és 40 ml etilacetát keverékében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 4 ml 1 mólos vizes kénsavoldatot adunk, és alaposan összerázzuk. A szilárd anyag feloldódik. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel többször mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott 1,45 g olajos maradékot, azaz a szabad tripeptidet 15 ml dimetilformamidban, 0,612 g (5,32 mmól) HOSu, 0,3 ml (2,66 mmól) NMM és 0,63 g (3,06 mmól) DCC jelenlétében 2,58 g (2,61 mmól) HC1 · H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-el kondenzáljuk. A reakciót 1 órán át 0 C°-on, majd 60 órán át 25 C°-on végezzük; az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség esetén további mennyiségű NMM-t adunk. A kivált oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet 45 C°-on szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A nyers, szilárd terméket 50 ml dimetilformamidban oldjuk, és 300 ml metanollal kicsapjuk. 2,25 g (58,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 277—280 C°, [α]θ = -12,43° (c= 1, DMF).
0,72 g (0,49 mmól), a fentiek szerint kapott terméket 40 ml dimetilformamid, 30 ml metanol és 2 ml víz elegyében, 0,5 g 5%-os palládium/báriumszulfát katalizátor jelenlétében, 3,4 atmoszféra nyomáson 3 órán át hidrogénezünk. Az elegyet szűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 30 percig 5 ml TFA-val kezeljük, az elegyet bepároljuk, és az igy kapott maradékot éterrel többször eldörzsöijük. A képződött fehér, szilárd anyagot 20 ml vízben felveszszük, és az elegyet fagyasztva szárítjuk. A kapott 0-,47 g súlyú nyers terméket Bio-Rad AG1-X 2 gyantával (erősen bázikus polisztirol-gyanta) töltött és ammóniumacetátpufferoldattal (ammóniával pH = 8,l-re lúgosított 2%-os vizes ecetsav-oldat) egyensúlyba hozott, 3 x 32 cm méretű gyantaoszlopra visszük fel. Az oszlopot rendre 200—200 ml 0,025 mólos ammóniumacetát-oldattal (pH = 5,5), 0,025 mólos ecetsav-oldattal, 0,05 mólos ecetsav-oldattal, 0,1 mólos ecetsav-oldattal, 0,25 mólos ecetsav-oldattal, 0,5 mólos ecetsav-oldattal, 0,75 mólos ecetsav-oldattal, végül 1 mólos ecetsav-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 12 ml-es frakciókba
-5180783 gyűjtjük, és minden egyes frakciót vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek vetünk alá. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat (azaz a 225—229. frakciót) egyesítjük és kétszer fagyasztva szárítjuk. 0,223 g (48,1%) tiszta Glu-Val-Val-Glu-Glu-AIa-Glu-Asn-t kapunk, amely papír-elektroforézis és vékonyrétegkromatográfiás elemzés szerint egységes.
f) 15 g (39,5 mmól) Boc-Lys(Z)-OH, 5,8 g (50,5 mmól) HOSu, 8,66 g (42 mmól) DCC és 250 ml tetrahidrofurán elegyét 3 órán át keverjük. A kivált oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott
24,2 g szirupszerű maradékhoz 150 ml izopropanolt és 150 ml petrolétert adunk. 21 g olajos, nem kristályosodó terméket kapunk. Az így kapott nyers Boc-Lys(Z)-OSu-t 72 órán át 250 ml dimetilformamidban, 5,5 ml Et3N jelenlétében 10,6 g (38 mmól) H-Lys(Z)-OH-val kondenzáljuk. A reakcióelegyet keverjük, és az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időnként Et3N-t adunk. Az oldatból kiszűrjük a kis mennyiségű oldhatatlan anyagot, és a szűrletet 45 C°-on szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 1 liter 5%-os vizes ecetsav-oldattal kezeljük. A kivált terméket etilacetáttal kivonjuk. A szerves fázist vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, bepároljuk, és az olajos maradékot 10 ml DCHA-t tartalmazó 300 ml etilacetáttal elegyítjük. A kapott kristályos sót metanolból és éterből átkristályosítjuk. 22,7 g (72,5%) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH DCHA-t kapunk; op.: 160—162C°, [a]“= -2,21° (c = 1, metanol).
g (12,14 mmól) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-DCHA-t 1 liter etilacetát és 1 liter 0,1 n vizes kénsavoldat között megoszlatunk. A szerves fázist vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Az így kapott 7,9 g Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t 30 percig frissen készített, 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. Az oldószert és a sav fölöslegét 30 C°-on lepároljuk, és a maradékról két ízben tetrahidrofuránt párolunk le. A kapott maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk. A kivált HC1 H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t leszűrjük és éterrel többször mossuk. A kapott 6,7 g fehér, porszerű anyagot 70 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldatot jégfürdön hütjük, és 1,63 ml Et3N-t, majd 5,54 g (12,76 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-t adunk hozzá. Az elegyet 1 órán át 0 C°-on, majd 24 órán át 25 C°-on keverjük; ezalatt az elegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával 7,5-ön tartjuk. A reakcióelegyet kevés ecetsavval pH = 3,5 értékre savanyítjuk, és az oldószert lepároljuk. A kapott maradékot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. A kapott, félig megszilárdult maradékot éterrel eldörzsöljük, majd etilacetátból átkristályosítjuk. 7,26 g (69,5%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 153—155 C”, [a]25=-2,71° (c=l, THF).
g) 1,7 g (1,16 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 24 ml trifiuorecetsavval kezelünk. A sav fölöslegét 30 C°-on lepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A kapott porszerű anyagot éterrel és petroléterrel alaposan mossuk, és vákuumban nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 1,71 g trifluoracetát-sót kapunk. 0,998 g (1,16 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, 0,16 g (1,4 mmól) HOSu, 0,274 g (1,33 mmól) DCC és 15tml dimetilformamid elegyét 3 órán át 0C°-on keverjük. A kapott oldathoz, amely Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu-t tartalmaz, 1,71 g CF3COOH H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t és 0,2 ml Et3N-t adunk. Az elegyhez 15 ml dimetilformamidot és még néhány csepp Et3N-t adunk, és a kapott elegyet napig 25 C°-on keverjük. Gélszerű, félig szilárd anyag képződik. Az elegyet ecetsavval megsavanyitjuk és vízzel kezeljük. A kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, egymás után vízzel, metanollal és éterrel mossuk. A kapott 2,25 g nyers terméket (op.: 310—313 C°) dimetilformamidban oldjuk, majd metanollal kicsapjuk. 1,75 g (68,3%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 314— 316 C°, [a]^ = 13,68“ (c=l, DMSO). A termék vékonyrétegkromatográfiás elemzés alapján egységes.
0,5 g (0,226 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl>Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 2 ml trifluorecetsavban oldunk, az oldathoz 15 ml hidrogénfluoridot adunk, és az elegyet 15 percig 0 C°on keverjük. A sav fölöslegét 0 C°-on lepároljuk. A maradékot 5%-os vizes ecetsav-oldatban oldjuk, az oldatot éterrel háromszor mossuk, kis térfogatra bepároljuk, és a maradékot fagyasztva szárítjuk. 0,34 g nyers terméket kapunk. A nyers terméket a korábban ismertetett módon ioncserés oszlopkrdmatográfiával tisztítjuk. 0,13 g (42,1%) tiszta Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t kapunk; [α]θ= -85,65° (c = 1, víz).
h) 4,0 g (12,2 mmól) Boc-Leu-OSu-t 75 ml dimetilformamidban, 1,7 ml Et3N jelenlétében 48 órán át 3,42 g (12,2 mmól) H-Lys(Z)-OH-val kondenzálunk. A reakcióelegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával 7,5 értéken tartjuk. Az oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szürletet szárazra pároljuk. A kapott üvegszerű, habos anyagot 200 ml éterben oldjuk, és az oldathoz 3 ml DCHA-t adunk. A kivált kristályos anyagot leszűrjük, éterrel mossuk, majd metanolból és éterből átkristályosítjuk. 5,7 g (69,5%) Boc-Leu-Lys(Z)-OH · DCHA-t kapunk; op.: 140—142 C°, [a]& = -7,20° (c= 1, metanol).
2,97 g (4,4 mmól) Boc-Leu-Lys(Z)-OH DCHA-t etilacetát és 0,1 n vizes kénsavoldat között megoszlatunk, majd a szabad savat elkülönítjük. A kapott 2,2 g színtelen, olajos anyagot 30 percig 40 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. A sav fölöslegét és az oldószert 30 C°-on lepároljuk, és a maradékot éterrel kezeljük. A kapott olajos anyagot éterben oldjuk, és az oldatot bepároljuk. Ezt a műveletet még kétszer megismételjük. A kapott maradékhoz 1,85 g (4,4 mmól) Boc-Asp(OBzl)-OSu-t és 1,85 ml Et3N-t adunk, és az elegyet éjszakán át keverjük. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk. Az olajos maradékot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és ismét szárazra pároljuk. A kapott nyers terméket etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 1,52 g (49,6%) tiszta Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 109—111 C°, [αξ5= - 16,14° (c=l, DMF).
1,2 g (0,545 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 35 ml trifluorecetsavval kezelünk. A sav fölöslegét gyors ütemben lepároljuk, és a maradékot éterrel többször eldörzsöljük. Fehér, porszerű anyagként
1,2 g undekapeptid-TFA-sót kapunk. Ezt a vegyületet 5 ml dimetilformamid és 2 ml dimetilszulfoxid elegyében oldjuk, és Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSu-val reagáltatjuk. A reagens előállítása során 0,381 g (0,545 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH, 0,126g (1,1 mmól) HOSu, 0,124g (0,599 mmól) DCC és 3 ml dimetilformamid elegyét 3 órán át 0 C°-on keverjük; a kapott elegyet közvetlenül felhasznál-6180783 juk a reakcióhoz. Az aktív tripeptid-észtert és az undekapeptidet tartalmazó elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 3 napig 25 C°-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időről időre Et3N-t adunk. A képződött kocsonyás anyagot 5%-os vizes ecetsavval eldörzsöljük. A kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd az így kapott 1,28 g nyers terméket (op.: 325—326 C°) 10 ml dimetilformamid és 5 ml dimetilszulfoxid elegyéből 230 ml metanollal kicsapjuk. 1,22 g (80,2%) tiszta Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu-(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 326 327 C°, M2 d 5=- 15,71° (c=l, DMF/DMSO).
1,128 g (0,404 mmól), a fentiek szerint előállított terméket 7 ml anizolban 15 percig 0 C°-on 25 ml vízmentes hidrogénfluoriddal reagáltatunk. A sav fölöslegét 0 C°-on lepároljuk, és a kapott maradékot éter és víz között megoszlatjuk. A vizes fázist éterrel kétszer mossuk, eredeti térfogatának felére bepároljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 0,69 g nyers terméket kapunk. A nyers terméket az oktapeptid tisztításánál ismertetett módon kromatografáljuk. A 101— 120. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 0,25 g terméket kapunk, amely csekély mennyiségű szennyezöanyagot is tartalmaz. A terméket ugyanazon az oszlopon ismét kromatografáljuk. 0,155 g (22%) tiszta Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t kapunk, amely papirelektroforézis alapján egységes. [α]θ = -86,27° (c= 1, 0,1 n HC1).
B. műveletsor:
a) 18,6 g (95,4 mmól) H-Ser(Bzl)-OH 45 ml Triton B-vel készített oldatát szárazra pároljuk. A maradékhoz IQOml dimetilformamidot adunk, és az elegyet bepároljuk. Ezt a műveletet megismételjük. Ezután a maradékhoz 16,9g (95,4 mmól) AcOSu-t és 150 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet 20 órán át keverjük. Az enyhén lúgos kémhatás biztosítása érdekében az elegyhez időről időre NMM-t adunk. Az oldószert lepároljuk, a terméket etilacetáttal extraháljuk, és az oldatot kevés 10%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel mossuk. A termék vízben oldódik, ezért csak kis mennyiségű vizet használhatunk fel. Az oldatot nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Átlátszó, nem kristályosodó olaj formájában 14,5 g Ac-Ser(Bzl)-OH-t kapunk. A terméket 300 ml metanol és 30 ml víz elegyében oldjuk, az oldathoz 7,0 pH-érték eléréséig 20%-os Cs2CO3-oIdatot adunk, majd az elegyet bepároljuk. A kapott szilárd sóról kétszer dimetilformamidot párolunk le, majd 15,4g (91 mmól) benzilbromidot és 250 ml dimetilformamidot adunk hozzá, és az elegyet 18 órán át keverjük. Az oldószert lepároljuk, a maradékot 600 ml vízzel elegyítjük, és a kivált olajos anyagot etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szirupszerű anyag képződéséig bepároljuk. A szirupszerű maradék oltókristállyal kezelve azonnal kristályosodik. A terméket etilacetátból és petroléterből átkristályosítjuk. 10,42 g (32,2%) H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl-t kapunk; op.: 89—91 C°.
2,2 g (6,73 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl 75 ml etanollal készített oldatához 5 ml hidrazint adunk, és az elegyet éjszakán át enyhén keverjük. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és a terméket kevés etanolból és éterből átkristályosítjuk. 1,40 g (82,8%) H3C-CO
-Ser(Bzl)-HNNH2-t kapunk; op.: 128—130 C°, [α]“+5,80° (c = 1, metanol).
b) 3,57 g (40 mmól) L-alanin 18,8 ml Triton B-vel készített oldatát szárazra pároljuk, és az olajos maradékról 2 x 30 ml dimetilformamidot párolunk le. A kapott sóhoz 11,45 g Boc-Ala-Osu-t (40 mmól), 40 ml dimetilformamidot és 4 ml NMM-t adunk, és az elegyet 20 órán át keverjük. Az oldószert eltávolítjuk, a maradékot 100 ml 10%-os vizes ecetsav-oldatban felvesszük, és a terméket 4 x 100 ml etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot kevés vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, kis térfogatra bepároljuk, és a maradékhoz zavarosodásig petrolétert adunk. Az elegyet éjszakán át hűtőszekrényben tároljuk. Kristályos anyagként 8,2 g (76,3%) Boc-Ala-Ala-OH válik ki; op.: 115 —118C’.
36,2 g (139 mmól) Boc-Ala-Ala-OH-t 30 percig 3 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az elegyet bepároljuk, és a maradékot a szokásos módon feldolgozzuk. Az olajos anyagot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. 9,1 g (33,3%) HCL H-Ala-Ala-OH-t kapunk; op.: 209—211 C°.
2,36 g (12 mmól) HC1 · H-Ala-Ala-OH 20 ml dimetilformamiddal készített oldatát jégfürdőn hűtjük, és az oldathoz 1,68 ml (12 mmól) Et3N-t, majd 12 mmól Boc-Asp(OBzl)-OSu-t adunk. Az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd éjszakán át 25 C°-on enyhén keverjük; ezalatt az elegyhez a 8,0 körüli pH-érték biztosítására kis részletekben 12 mmól Et3N-t adunk. Végül az elegyhez néhány ml ecetsavat adunk, és a savas elegyet szárazra pároljuk. A kapott terméket etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott 6g olajos maradékot etilacetátban oldjuk, és az oldat pH-ját DCHA-val 8,0-ra állítjuk. A kivált kristályos sót izopropanolból és petroléterből átkristályosítjuk. 5,1 g (65,7%) Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH DCHA-t kapunk; op.: 138— 141 C°, [a]/,5 = 13,33° (c= 1, metanol).
3,5 g (5,4 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH DCHA-t 500 ml etilacetát és 10 ml 10%-os vizes kénsavoldatot tartalmazó 350 ml víz között megoszlatunk. A vizes fázist 250 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Üvegszerű, szilárd maradékként 2,5 g Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t kapunk. Ezt az anyagot 30 percig 200 ml frissen készített 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. Az elegyet 32 C°-on sziruppá bepároljuk, és a maradékról kétszer tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk. Az így kapott 1,93 g (4,83 mmól) HC1 · H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t a következő lépésben azid-módszer szerint H3C-CO-Ser(Bzl)-N3-dal kapcsoljuk. A reagens előállítása során 1,24 g (4,9 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 25 ml dimetilformamiddal készített, -25 C°-os oldatához 7,42 ml 3,3 n tetrahidrofurános sósavoldatot (24,5 mmól) és 0,99 ml (7,35 mmól) izoamilnitritet adunk, és az elegyet 30 percig - 30 C°-on keverjük. Az így kapott oldatot - 35 C°-ra hűtjük, 4,1 ml Et3N-t adunk hozzá, majd beadagoljuk a fentiek szerint előállított 1,93 g, fehér, porszerű, szilárd HC1 · H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t. Az elegyet 30 percig - 20 C°-on, majd 2 napig 4 C°-on keverjük. Ezalatt az elegyhez az enyhén lúgos kémhatás biztosítására kevés Et3N-t adunk. A reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk, és a kapott kristályos anyagot tetrahidrofuránból és petroléterből átkristályositjuk. 1,85 g (65,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-
-7180783
-Asp(OBzI)-Ala-Ala-OH-t kapunk; op.: 167—170 C°, [a]'*5= —18,91° (c= 1, DMSO).
0,825 g (1,41 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH 4 ml dimetilformamiddal készített oldatát jégfürdőn 0 C°-ra hűtjük. Az oldathoz 54,3 mg (1,69 mmól) hidrazint, majd 0,475 g (3,10 mmól) HOBT H2O-t és 0,32 g (1,55 mmól) DCC-t adunk, az elegy pH-ját NMM-mel 7,5re állítjuk, és a reakcióelegyet 2 órán át 0C°-on, végül 17 órán át 25 C°-on keverjük. Ezalatt a reakcióelegy begélesedik. A gélszerű elegyet metanollal hígítjuk, a kivált szilárd anyagot vákuumszürőn kiszűrjük, metanollal, éterrel és petroléterrel alaposan mossuk, és a kapott, 229—232 C°-on olvadó terméket dimetilformamidból metanollal kicsapjuk. 0,51 g (61,0%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2-t kapunk; op.: 230—232 C°, [«]“= - 17,94° (c= 1, DMSO).
c) 39,4 g (166 mmól) H-Glu(OBzl)-OH, 65,0 g (166 mmól) Boc-Ser(Bzl)-OSu, 900 ml dimetilformamid és 2,3 ml (165 mmól) Et3N elegyét éjszakán át keverjük. Az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez ezalatt szükség esetén kevés Et3N-t adunk. A kapott átlátszó oldatot szárazra pároljuk, és az olajos maradékot 1,5 liter etilacetát és 2 liter 5%-os vizes ecetsav-oldat között megoszlatjuk. A szerves fázist vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott 90,0 g átlátszó, olajos maradékot 3 liter éterben felvesszük, és az oldathoz 25 ml ciklohexilamint adunk. A kivált szilárd anyagot metanolból és éterből átkristályosítjuk. 76,2 g (74,8%) Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH CHA-t kapunk; op.: 154—156,5 C°, Md = +6,32° (c= 1, metanol).
1,5 liter víz és 1,5 liter etilacetát keverékében 76,2 g (124 mmól) Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH CHA-t szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz pH~2,5 érték eléréséig 10%-os vizes kénsavoldatot adunk. Ekkor a szilárd anyag feloldódik. A szabad dipeptid-karbonsavat tartalmazó szerves fázist elválasztjuk, vízzel kétszer mossuk, szárítjuk, és szárazra pároljuk. A 68,5 g súlyú átlátszó, olajos maradékot 45 percig 3 liter frissen készített 4,1 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük, majd az elegyet olajos maradékká bepároljuk. A maradékról kétszer tetrahidrofuránt párolunk le. Az igy kapott HC1 H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t 500 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldatot 0 C°-ra hűtjük, és 48,66 g (124 mmól) Boc-Ser(Bzl)-OSu-t és közvetlenül ezután 27 ml Et3N-t adunk hozzá. Az elegyet éjszakán át 25 C°-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időről időre Et3N-t adunk. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Az olajos maradékot etilacetátban felvesszük, az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. A terméket etilacetát és petroléter elegyéböl kristályosítjuk. 71,8 g (83,7%) Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk; op.: 112—113 C°, [αξ5= + 17,91° (c=l, THF).
71,6 g (104 mmól) Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t 45 percig 2,7 liter frissen készített 3,9 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az elegyet szárazra pároljuk, és a maradékról két ízben tetrahidrofuránt párolunk le. A kapott 59,3 g szilárd maradékot (op.: 161—165 C°) elkülönítjük, éterrel mossuk, majd 500 ml dimetilformamidot,
38,2 g (94 mmól) Boc-Thr(Bzl)-OSu-t és 25 mi Et3N-t adunk hozzá, és az elegyet 1 órán át 0 C°-on, végül 15 órán át 25 C°-on keverjük. Ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez több részletben összesen 14,5 ml Et3N-t adunk. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Az olajos maradékot 1,5 liter etilacetátban oldjuk, az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott szilárd anyagot etilacetátból és petroléterből átkristályosítjuk. 64,8 g (78,1%) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk; op.: 115—118 C°, [α]θ = + 11,64° (c = 1, DMSO).
54,5 g (67,1 mmól) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t 1,5 liter 4,1 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk, és az elegyet a szokásos módon feldolgozzuk. Fehér, porszerű anyagként 46,3 g (56,6 mmól) HC1 · H-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk. Ehhez a termékhez 500 ml dimetilformamidot, 23,7 g (56 mmól) Boc-Asp(OBzl)-OSu-t és 16 ml Et3N-t adunk, és 2 órán át 0C°-on keverjük. Ezután az elegyet 15 órán át 2'5C°-on keverjük, és ezalatt összesen 7,4 ml Et3N-t adunk hozzá. Az elegyet a szokásos módon feldolgozzuk, és a terméket diklórmetánból és petroléterböl átkristályosítjuk. 50,35 g (82,7%) Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk; op.: Hl—113C°, [αξ5= +7,21° (c= 1, DMSO).
50,0 g (46 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH védőcsoportjait 4,15 n tetrahidrofurános sósavoldattal végzett kezeléssel lehasítjuk, és a reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk. A kapott 45,4 g fehér, szilárd anyagot 1,5 liter tetrahidrofuránban oldjuk, az oldathoz 7 liter étert adunk, és az elegyet éjszakán át 0 C°-on tartjuk. Fehér, porszerű, szilárd anyagként 44,0 g HC1 H-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk; op.: 179—184 C°. 43,7 g (42,7 mmól) így kapott terméket 500 ml dimetilformamidban oldunk, az oldatot 0 C°-ra hűtjük, és 15,4 g (49 mmól) Boc-Val-OSu-t és 10 ml Et3N-t adunk hozzá. Az elegyet 15 órán át keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez több részletben összesen 7,9 ml Et3N-t adunk. Az oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot diklórmetánban oldjuk, az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és 0,5 liter végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk, és az elegyet éjszakán át állni hagyjuk.. A kivált kristályos terméket tetrahidrofuránból és izopropanolból átkristályosítjuk. 26,3 g (51,4%) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk; op.: 174—177C°, [a]^5 = +0,84° (c = 1, THF).
13,0 g (10,94 mmól) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH 50 ml dimetilformamiddal készített, 0 C°-os oldatához 0,421 g (13,14 mmól) hidrazint, 3,688 g (24,1 mmól) HOBT-t és 2,48 g (12,04 mmól) DCC-t adunk. A reakcióelegy pH-ját NMM-al 7,5-re állítjuk, és az elegyet 18 órán át keverjük. Az oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szürletet szárazra pároljuk. A maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk, és a kapott anyagot dimetilformamidból és izopropanolból kristályosítjuk. 8,7 g (66,4%) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2-t kapunk; op.: 215—218 C°, [a]2 D 5 = +7,62° (c = 1, DMSO).
d) 14,0 g (24,5 mmól) Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 30 percig 500 ml 4,0 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az elegyet szárazra pároljuk, és a maradékról két ízben friss
-8180783 tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, majd szárítjuk. Az így kapott 11,4 g (21,6 mmól) dipeptid-hidrokloridot 140 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldathoz 0 C°-on 8,8 g (21,6 mmól) Boc-Thr(Bzl)-OSu-t és 3,5 ml Et3N-t adunk, cs az elegyet 24 órán át 25 C°-on keverjük. Ezalatt az elegyhez az enyhén lúgos kémhatás fenntartására néhány csepp EtjN-t adunk. Az elegyet 5 ml ecetsavval megsavanyítjuk, majd nagy mennyiségű vízzel hígítjuk. A kivált nyers, szilárd terméket elkülönítjük, etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd bepároljuk. Az üvegszerű, szilárd maradékot etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 13,8 g (83,7%) Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 110 112 C°, [α]θ = + 19,45° (c= 1, etilacetát).
41,5 g (54 mmól) Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 25 percig 500 ml frissen készített 3,55 n tetrahidrofurános sósavoldattal reagáltatunk. Az elegyet szirupszerü maradékká bepároljuk, és a maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és éterrel mossuk. A kapott 37,4 g nyers tripeptidhidrokloridot 500 ml dimetilformamidban oldjuk, és az oldathoz 0 C°-on 17,4 g (53 mmól) Boc-Ile-OSu-t, majd 16 ml Et3N-t adunk. Az elegyet éjszakán át 25 C’-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez részletekben összesen 6,2 ml Et3N-t adunk. A kapott elegyet szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Az olajos maradékot etilacetáttal extraháljuk, a szerves oldatot 5%-os vizes ecetsavoldattal és vízzel mossuk, nátriumázulfát fölött szárítjuk, majd bepároljuk. A sárgás, olajos maradékot etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 39,6 g nyers szilárd terméket kapunk (op.: 140—142 C°), amely kis mennyiségben számos szennyezőanyagot tartalmaz. A terméket 70—230mesh szemcseméretű szilikagéllel töltött, 4,7 x 67 cm méretű oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként 95 : 5 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használunk. Az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan elemezzük. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és az olajos maradékot kloroformból és petroléterből kristályosítjuk. 19,1 g (41,2%) Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 144—146 C°, [a]= — +2,40° (c= 1, kloroform).
0,439 g (0,496 mmól) Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 30 percig 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk, és a reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk. 0,39 g HC1 · H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk. 0,59 g (0,492 mmól) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2-t 6 ml dimetilformamidban oldunk, az oldathoz -25 C°-on 0,57 ml 4,3 n tetrahidrofurános sósavoldatot (2,46 mmól) adunk, és az elegyhez azonnal 0,1 ml (0,74 mmól) izoamilnitritet adunk. A reakcióelegyet 30 percig - 20 C° és — 25 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd -35C°-ra hűtjük, és 0,42 ml Et3N-t és 0,39 g, a fentiek szerint előállított HC1 H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t adunk hozzá. Az elegyet 30 percig —20C°-on, majd 48 órán át 4C°-on keverjük; ezalatt az elegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával körülbelül 7,5 értéken tartjuk. A kapott elegyet 250 ml 5%-os vizes ecetsavoldattal hígítjuk. A kivált szilárd anyagot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd vákuumban szemcsés nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 0,82 g nyers terméket kapunk; op.: 244—254 C°. A nyers terméket dimetilformamidban oldjuk, és metanollal kicsapjuk. 0,698 g (81,7%) Boc
-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ue-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 268—271 C°.
0,408 g (0,68 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 10 ml dimetilformamiddal készített, -20 C°-os szuszpenziójához 0,627 ml frissen készített 5,43 n tetrahidrofurános sósavoldatot (3,4 mmól), majd 1,39 ml 10%os dimetilformamidos izoamilnitrit-oldatot (1,03 mmól) adunk. Az elegyet 30 percig keverjük, majd —30 C°-ra hütjük, és 0,476 ml (3,4 mmól) Et3N-t és 1,334 g (0,68 mmól) TFA · H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t adunk hozzá. Az elegyet 30 percig —20 C°-on, majd 5 napig 4 C°-on keverjük; ezalatt az enyhén lúgos kémhatás fenntartására és a gélképződés megakadályozására az elegyhez Et3N-t és DMSO-t adunk. A reakcióelegyet 300 ml 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált szilárd csapadékot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, és szárítjuk. 1,49 g 296 —299 C”-on olvadó anyagot kapunk. A terméket dimetilszulfoxidban oldjuk, és metanollal kicsapjuk. 1,40 g (85,37%) H3C-CO-Scr(Bzl)-Asp(OBzl)-AIa-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; [αξ5= +6,37° (c=l, DMSO).
1,35 g (0,558 mmól), a fentiek szerint kapott tetradekapeptid, 0,188 g (1,23 mmól) HOBT H2O, 15 ml dimetilformamid és 15 ml dimetilszulfoxid elegyét néhány percig keverjük. Az elegyet jégfürdőn lehűtjük, 0,126 g (0,614 mmól) DCC-t adunk hozzá, és ugyanezen a hőmérsékleten további 24 órán át keverjük.
Egy külön reakcióedényben 4,0 g (1,43 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 25 percig 40 ml trifluorecetsawal reagáltatunk, és a kapott tetradekapeptid-trifluoracetátot nagy mennyiségű éterrel gyorsan kicsapjuk. A kivált szilárd anyagot leszűrjük és éterrel alaposan mossuk. Fehér, porszerű anyagként a C-terminális tetradekapeptid trifluorecetsavas sóját kapjuk; hozam: 3,74 g. A korábban ismertetett módon, dimetilformamid és dimetilszulfoxid elegyében kialakított aminoterminális tetradekapeptid aktív észteréhez 1,567 g (0,5583 mmól), az előzőek szerint kapott tetradekapeptidtrifluoracetátot adunk. Az elegy pH-ját néhány csepp NMM-el 7,5 és 8,0 közötti értékre állítjuk, és a reakcióelegyet 1 órán át 0 C°-on, majd 5 napig 25 C°-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet 1,5 liter 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált csapadékot vízzel, metanollal, dimetilformamiddal, metanollal, végül éterrel alaposan mossuk. 2,21 g
H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; a termék 300 C°-nál magasabb hőmérsékleten olvad.
2,21 g (0,435 mmól), a fentiek szerint kapott védett oktakozapeptidet 8 ml trifluorecetsav és 4 ml anizol elegyében oldjuk, az oldathoz vízmentes hidrogénfluoridot adunk, és az elegyet 30 percig 0 C°-on keverjük. Az elegyet vákuumban 0C°-on bepároljuk, és a szilárd maradékot 200 ml vízben oldjuk. Az oldatot éterrel kétszer mossuk, eredeti térfogatának felére bepároljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. A kapott 1,1 g nyers terméket tisztítás céljából 3 x 80 cm méretű Sephadex G—10 oszlopon (eluálószer: 0,2 mólos ecetsav-oldat), majd 3 x 75 cm méretű DEAE-Sephadex oszlopon bocsátjuk át; eluálószerként növekvő koncent9
-9180783 rációjú ammóniumacetát-oldatokat (pH 7,0, 0,025 mól, 0,25 mól), majd híg vizes ecetsav-oldatot használunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Amorf, fehér por formájában 0,281 g H3C-CO-Ser-Asp-Ala-AIa-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t (timozin a]3) kapunk.
A fenti szintézissel előállított tennék akrilamid-gélen végzett izoelektromos fókuszálás során a szarvasmarhathymusból elkülönített, természetes timozin a,-gyei azonosan vándorol [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 725 (1977)].
2. példa
7,23 g (27,8 mmól) Boc-Ala-Ala-OH 200 ml metanol és 20 ml víz elegyével készített oldatához pH = 7,0 eléréséig 20%-os vizes Cs2CO3-oldatot (kb. 30 ml) adunk, és a kapott, semleges kémhatású oldatot szárazra pároljuk. A maradékról 2x150 ml dimetilformamidot párolunk le. A kapott kocsonyás anyaghoz 120 ml dimetilformamidot és 7,2 g (42 mmól) benzilbromidot adunk, és az elegyet 15 órán át keverjük. Az oldószert lepároljuk, és a maradékhoz 500 ml vizet adunk. Az olaj formájában kivált tennék állás közben lassan megszilárdul. A terméket 400 ml etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és sziruppá bepároljuk. A szirupszerű maradók pctroléteres kezelés hatására kristályosodni kezd. A terméket etilacetátból és petroléterből átkristályosítjuk. 7,2 g (73,8%) Boc-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 71—73 C°.
6,0 g (17,15 mmól) Boc-Ala-Ala-OBzl-t 30 percig 380 ml frissen készített 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a szirupszerű maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. A maradék éteres kezelés hatására azonnal megszilárdul. A terméket metanolból és éterből átkristályosítjuk. 4,30 g (76,4%) HCI H-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; [«]“= - 38,86° (c = 1, metanol).
4,25 g (14,83 mmól)HCl H-Ala-Ala-OBzl 60 mldimetilformamiddal készített, 0C°-os oldatához 3,45 g (14,83 mmól) Boc-Asn-OH-t, 4,02 g (28,6 mmól) HOBT-t, 2 ml NMM-t és 3,37 g (16,35 mmól) DCC-t adunk, és az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 20 órán át 25 C°-on keverjük. Az enyhén lúgos kémhatás fenntartására az elegyhez időről időre NMM-t adunk. A kivált oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szürletet szárazra pároljuk. Az olajos maradék vizes kezelés hatására azonnal megszilárdul. A szilárd anyagot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd a kristályosodás megindulásáig bepároljuk. A koncentrátumhoz azonos térfogatú petrolétert adunk, és az elegyet éjszakán át állni hagyjuk. A nyers terméket tetrahidrofuránból és petroléterből átkristályosítjuk. 5,2 g (75,6%) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 153—155 C°, [a]^=-55,61’ (c = 1, metanol).
2,2 g (4,75 mmól) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl-t 30 percig 220 ml 4,0 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. A sav fölöslegét és az oldószert lepároljuk, és a maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradék éteres kezelés hatására megszilárdul. A szilárd anyagot friss éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott fehér, porszerű hidrokloridot (1,85 g) 40 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldathoz 0C°-on 1,97 g (4,75 mmól) H3C-CO-
-Ser(Bzl)-OH DCHA-t adunk, és az elegyet 30 percig 0 C°on keverjük. Ekkor megindul a diciklohexilamin-hidroklorid kiválása. Az elegyhez 1,19 g HOBT-t és 1,08 g (5,23 mmól) DCC-t adunk, néhány csepp NMM-el pH = 7,5 értékre lúgosítjuk, és 2 órán át 0C°-on, majd éjszakán át 25 C°-on keverjük. Az oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Enyhén színezett, szilárd maradékot kapunk. A maradékot vízzel és etilacetáttal alaposan mossuk, és a cserszínű, porszerű anyagot 40 ml dimetilformamidból és 500 ml izopropanolból kristályosítjuk.
1,57 g (56,9%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl-t kapunk; op.: 213—215C°, [a£5=-23,ll° (c= 1, DMSO).
1,57 g (2,69 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl 20 ml dimetilformamiddal készített oldatához 2 ml hidrazint adunk, és az elegyet 18 órán át keverjük. A kivált szilárd anyagot leszűrjük, és dimetilformamiddal, etanollal és éterrel alaposan mossuk. 1,22 g (89,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-AIa-Ala-HNNH2-t kapunk; op.: 262—264 C°, [a]” =-26,7° (c= 1, DMSO).
0,698 g (0,358 mmól) Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t 30 percig 10 ml trifluorecetsavval kezelünk, és a peptidsót éterrel kicsapjuk. A sót vákuumszűrőn leszűrjük, éterrel mossuk, és szárítjuk. 0,652 g (0,333 mmól) trifluorecetsavas sót kapunk.
Egy külön reakcióedényben 0,17 g (0,335 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2-t 7 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz -20C°-on 0,27 ml 6,18 n tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Az elegyhez 0,68 ml 10%-os dimetilformamidos izoamilnitritoldatot adunk, és a kapott oldatot 30 percig ugyanezen a hőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet — 30 C°-ra hűtjük, és 0,234 ml (1,67 mmól) Et3N-t, majd 0,652 g, a fentiek szerint előállított dekapeptid-trifluoracetátot adunk hozzá. Az elegyet - 20 C°-on 3 ml dimetilszulfoxiddal hígítjuk, és néhány csepp Et3N-al pH = 7,5-re lúgosítjuk. A reakcióelegyet 30 percig — 20 C°-on, majd 5 napig 4 C°-on keverjük. Ezalatt az enyhén lúgos kémhatás fenntartására és a gélesedés megakadályozására 5 ml dimetilszulfoxidot és Et3N-t adunk. A kapott oldatot 250 ml 5%-os vizes ecetsav-oldatba öntjük. A kivált fehér csapadékot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd szárítjuk. A kapott 0,702 g nyers terméket (op.: 290—291 C°) dimetilszulfoxidos oldatából metanollal újból kicsapjuk. 0,348 g (42,0%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 296—298 C° (bomlás), [a]” =+3,77° (c=l, DMSO).
0,866 g (0,373 mmól), a fentiek szerint kapott termék, 0,126 g (0,82 mmól) HOBT · H2O, 8 ml dimetilszulfoxid és 6 ml dimetilformamid elegyét jéghűtés közben keverjük. Az elegyhez 0,085 g (0,411 mmól) DCC-t adunk, és 24 órán át 0 C°-on keverjük. Ezután az elegyhez 1,05 g (0,373 mmól), az 1. példa B. műveletsorozatának d) lépése szerint előállított tetradekapeptid-trifluoracetátot és 2 ml dimetilszulfoxidot adunk. Az elegyet néhány csepp NMM-el pH = 7,5—8,0 értékre lúgosítjuk, és 1 órán át 0 C°-on, majd 5 napig 25 C°-on keverjük. A reakcióelegyet az 1. példa B. műveletsorozatának d) lépésében közöltek szerint dolgozzuk fel. 1,5775 g védett oktakozapeptidet, azaz H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-10180783
-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl-t kapunk.
1,57 g (0,32 mmól), a fentiek szerint kapott védett oktakozapeptidet 10 ml trifluorecetsav és 3 ml anizol elegyében oldunk. Az oldathoz 45 ml hidrogénfluoridot adunk, az elegyet 30 percig 0 C°-on keverjük, majd az 1. példa B. műveletsorozatának d) lépésében közöltek szerint feldolgozzuk. A Sephadex G—10 és DEAE-Sephadex oszlopon végzett kromatografálás után fehér, amorf termékként 0,283 g H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t [(Asn2)-timozin-a1-et] kapunk. A termék akrilamid-gélen végzett izoelektromos fókuszálás során a természetes timozin a ,-nél kissé kevésbé savas jellegű anyagnak megfelelően mozdul el, ami jó összhangban van a szerkezeti eltéréssel.

Claims (3)

  1. Szabadalmi igénypontok i
    1. Eljárás timozin a] és (Asn2)-timozin otj előállítására azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletű védett oktakozapeptid
    H3C-CO-Ser(R')-X-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-SeríR'j-SerCR'j-Glu/ORÖ-Ile-Thr/Rh-Thr/R3)-Lys(R5)-Asp(OR2)-Leu-Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)- (I) -LysíR^-GluCOríj-Val-Val-GluCOR^-GluCOR4)-AIa-Glu(OR4)-Asn-OR6 — ahol
    X Asn vagy Asp(OR2) csoportot jelent,
    R' a szerin-maradék hidroxil-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent,
    R2, R4 és RfJ karboxil-csoportra felvihető szokásos védőcsoportot jelent,
    R3 a treonin-maradék hidroxil-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent, és
    R5 a lizin-maradék ω-amino-csoportjára felvihető szokásos védőcsoportot jelent — védőcsoportjait lehasítjuk. (Elsőbbség: 1978. január 23.)
  2. 2. Eljárás timozin a, és (Asn2)-timozin a, előállítására azzal jellemezve, hogy
    a) timozin «! előállítása esetén, valamely (la) általános képletű védett oktakozapeptid
    H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)- (la) -Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(Bzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl
    - ahol Bzl benzil-csoportot és Z benziloxikarbonil-csoportot jelent — védőcsoportjait lehasitjuk; vagy
    b) (Asn2)-timozin a! előállítása esetén, valamely (Ib) képletű védett oktakozapeptid
    H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu- . -Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Va]-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl — ahol Bzl benzil-csoportot és Z benziloxikarbonil-csoportot jelent — védőcsoportjait lehasítjuk. (Elsőbbség: 1977. április 22.)
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja timozin a, vagy (Asn2)-timozin u, előállítására, azzal jellemezve, hogy a védőcsoportokat vízmentes hidrogénfluoriddal hasítjuk le. (Elsőbbség: 1977. április 22.)
HU78HO2067A 1977-04-22 1978-04-21 Process for preparing alpha down 1 and asn up 2 analogues of thymosin HU180783B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78989877A 1977-04-22 1977-04-22
US05/871,563 US4116951A (en) 1977-04-22 1978-01-23 [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU180783B true HU180783B (en) 1983-04-29

Family

ID=27120967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU78HO2067A HU180783B (en) 1977-04-22 1978-04-21 Process for preparing alpha down 1 and asn up 2 analogues of thymosin

Country Status (18)

Country Link
JP (1) JPS53137914A (hu)
AT (1) AT364470B (hu)
CA (1) CA1113088A (hu)
CH (3) CH641152A5 (hu)
DE (1) DE2817082A1 (hu)
DK (1) DK147918C (hu)
ES (1) ES469016A1 (hu)
FI (1) FI781241A (hu)
FR (2) FR2401134A1 (hu)
GB (1) GB1590668A (hu)
GR (1) GR71886B (hu)
HU (1) HU180783B (hu)
IT (1) IT1113134B (hu)
LU (1) LU79488A1 (hu)
NL (1) NL7804364A (hu)
NO (2) NO781404L (hu)
PT (1) PT67937B (hu)
SE (1) SE447262B (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4116951A (en) * 1977-04-22 1978-09-26 Hoffmann-La Roche Inc. [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof
DE2919592A1 (de) * 1979-05-15 1981-01-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon
EP0033384B1 (de) * 1980-01-18 1984-02-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunstimulierender Wirkung, und Thymosin-alpha-1-Fragmente
US4339427A (en) * 1980-04-14 1982-07-13 Hoffmann-La Roche Inc. Radioimmunoassay of thymosinα
EP0056594B1 (de) * 1981-01-14 1984-09-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung und Thymosin-alpha-1-Fragmente
CN1058500C (zh) * 1993-02-03 2000-11-15 施塞克龙药品公司 胸腺素α－1衍生物
US6262230B1 (en) * 1994-01-28 2001-07-17 Sciclone Pharmaceuticals Inc. Analogs of thymosin α1

Also Published As

Publication number Publication date
FR2401134B1 (hu) 1983-09-30
DE2817082A1 (de) 1978-11-02
FI781241A (fi) 1978-10-23
FR2405926A1 (fr) 1979-05-11
DK169478A (da) 1978-10-23
GB1590668A (en) 1981-06-03
PT67937A (en) 1978-05-01
FR2405926B1 (hu) 1983-09-09
NO148924B (no) 1983-10-03
SE7804612L (sv) 1978-12-20
NL7804364A (nl) 1978-10-24
PT67937B (en) 1980-04-07
IT1113134B (it) 1986-01-20
LU79488A1 (de) 1979-05-25
DK147918B (da) 1985-01-07
SE447262B (sv) 1986-11-03
CH641152A5 (en) 1984-02-15
CH641153A5 (en) 1984-02-15
FR2401134A1 (fr) 1979-03-23
JPS53137914A (en) 1978-12-01
GR71886B (hu) 1983-08-04
NO148924C (no) 1984-01-11
DK147918C (da) 1985-08-19
AT364470B (de) 1981-10-27
CH640218A5 (en) 1983-12-30
NO781404L (no) 1978-10-24
ATA286178A (de) 1981-03-15
IT7822629A0 (it) 1978-04-21
NO821608L (no) 1978-10-24
ES469016A1 (es) 1980-01-01
CA1113088A (en) 1981-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4116951A (en) [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof
US4148788A (en) Synthesis of thymosin α1
IL93422A (en) History of glycine, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
CA2038848C (en) Hydantoin derivatives
EP0144103B1 (en) Methods and compositions for preparation of H-ARG-X-Z-Y-TYR-R
US6080837A (en) Synthesis of VIP analog
HU180783B (en) Process for preparing alpha down 1 and asn up 2 analogues of thymosin
US5508382A (en) Peptides and processes for producing cyclic peptides
EP0171315B1 (fr) Procédé de synthèse du hGRF (Somatocrinine) en phase liquide et peptides intermédiaires
US5091366A (en) Peptides having ANF activity
GB1590645A (en) Process for preparing hentriacontapeptide having activity in reducing blood calcium levels
EP0181121A2 (en) Novel polypeptide and process for producing the same
HU192206B (en) Process for preparing novel peptides
EP0056274B1 (en) Indole derivatives and a method for production of peptides
US4474765A (en) Biologically active peptides
US5252705A (en) Peptide derivatives
EP0292256A2 (en) Peptides having ANF activity
CA1123428A (en) PROCESS FOR THE PREPARATION OF THYMOSIN .alpha..SUB.1 AND AN ANALOGUE
KR840000054B1 (ko) 티모신 α₁의 제조방법
Wang et al. [Asn 2]-thymosin α 1 and analogs thereof
EP0298474A2 (en) Novel calcitonin derivative and salt thereof
VIDENOV et al. Studios on the Total Synthesis of an A7, B7-Dicarbainsulin. III. Assembly of Segments and Generation of Biological Activity
STOEV et al. Synthesis and properties of [A19-(p-fluorophenylalanine)] insulin
CA1339631C (en) Process and intermediates for grf peptide
Katsoyannis et al. Insulin peptides. XVIII. Synthesis of a partially protected heneicosapeptide containing the C-terminal sequence of the B chain of insulin