CH628823A5 - Process for encapsulation of a material in a semipermeable membrane - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Einkapseln eines Materials, insbesondere zum Einkapseln von labilen biologischen Substanzen, wie Enzymen und Hämoglobin, in einer semipermeablen Membran, die das eingekapselte Material zurückhält, wobei aber kleinere Moleküle frei durch die Membran hindurchtreten können, um mit dem eingekapselten Material zu reagieren, und Reaktionsprodukte auszutreten vermögen.

Die Mikroeinkapselungstechnologie hat sich in den letzten Jahren schnell ausgebreitet und viele Anwendungen gefunden. Es wurden mit verschiedenem Erfolg Versuche unternommen, biologisch aktive Substanzen, wie Hämoglobin, Kohlensäureanhydrase, Urease, Asparaginase, Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamatoxaloacetattransaminase (GOT), chemisch aktive Materialien, wie Ionenaustauscherharze und Aktivkohle, und verschiedene andere Enzyme und chemisch aktive Substanzen einzukapseln. Es hat sich bereits gezeigt, dass Mikrokapseln dieser Art z.B. in künstliche Nieren und fixierten Enzymsystemen sehr nützlich sind und auf einer Anzahl anderer Gebiete vielversprechend sind. Zum Beispiel offenbart die USA-Patentschrift Nr. 3 522 345 nicht thrombogene Mikrokapseln, die, wenn sie um Enzyme oder Entgiftungsmittel herum gebildet sind und in einen ausserhalb des Körpers gelegenen Shunt gebracht werden, dazu verwendet werden können, Sauerstoff, Arzneimittel, en-zymatische Substanzen u.dgl. in gesteuerten Mengen in den Blutstrom einzuführen.

In «Artificial Cells» von Thomas M. S. Chang (Charles C. Thomas, Publisher; Springfield, 111. 1972) wird ein Verfahren zum Einkapseln von biologisch aktiven Materialien in eine semipermeable Membran geoffenbart. Das Verfahren besteht darin, dass man das einzukapselnde Material und ein Monomer in Wasser löst und eine Emulsion bildet, bei der das Wasser die diskontinuierliche (disperse) Phase darstellt. Wenn ein zweites Monomer, das mit dem ersten zu polyme-risieren vermag, in der Dispergensphase der Emulsion gelöst

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wird, tritt an der Grenzfläche der beiden Phasen eine Polymerisation ein und wird eine Membran um die Tröpfchen der Lösung, die im typischen Falle kolloidale Grösse haben, herum gebildet.

Dieses Verfahren hat Nachteile und Beschränkungen, die seine potentiell breiten Anwendungsmöglichkeiten und seinen wirtschaftlichen Erfolg beeinträchtigen. Da viele biologisch aktive Substanzen, z.B. Enzyme, extrem labil sind, führen die zur Polymerisation erforderlichen, verhältnismässig scharfen Reaktionsbedingungen oft zu einer sehr geringen Ausbeute an brauchbarem eingekapseltem Material. Selbst das Einkapseln von verhältnismässig robusten Enzymen, wie Urease, ergibt Ausbeuten, die bestenfalls zwischen 35 und 40% liegen. Bei einer oder mehreren Stufen des Verfahrens wird ein grosser Teil des eingekapselten Materials denaturiert.

Die USA-Patentschrift Nr. 3 522 346 bezieht sich auf Mikrokapseln mit gesteuerter Permeabilität. Das in dieser Patentschrift geoffenbarte Verfahren besteht darin, dass man wässrige Zubereitungen in Membranen mit gesteuerter Grösse, Dicke und Permeabilität einkapselt. Tröpfchen einer wässrigen Zubereitung werden in einem organischen flüssigen Medium, das mit der Zubereitung nicht mischbar ist, dispergiert, worauf man eine in dem organischen flüssigen Medium lösliche Komponente, die mit einer Komponente der hydrophilen Zubereitung zu reagieren vermag, zu der dadurch erzeugten Dispersion zusetzt, um durch Grenzflächen-koazervierung, Grenzflächenpolymerisation oder Grenzflächenkondensation auf der Oberfläche der Tröpfchen eine makromolekulare Membran zu bilden. Im typischen Falle wird ein Polymer, ein Kondensationsprodukt oder eine Komponente davon zu der organischen Flüssigkeit gegeben und die Membran um die Tröpfchen herum gebildet, und zwar durch Umsetzung des Polymers, des Kondensationsproduktes oder der Komponente mit einer Komponente der dispergierten Tröpfchen, welch letztere Komponente ein Fällungsmittel, ein Kondensations- oder Polymerisationskatalysator oder eine Komponente des Endproduktes der Kondensation sein kann. Die wirksame Porengrösse der Einkapselungsmembran ist nicht nur eine Funktion der Membranzusammensetzung, sondern auch eine Funktion der Dicke der Membran und wird entsprechend der beabsichtigten Verwendung der Kapseln gewählt. Durch geeignete Wahl der Arbeitsbedingungen kann die Porengrösse variiert werden, aber die Reaktionsbedingungen, die zur Gewährleistung genügend starker, aber selektiv permeabler Membranen erforderlich sind, lassen sich auf jeden Fall schwer regeln und sind in manchen Fällen unbekannt. Das Verfahren ergibt auch Kapseln, die im allgemeinen Membranen mit unberechenbarer Gleichmässigkeit und Porosität ergeben, von denen viele für den beabsichtigten Zweck unbrauchbar sind.

Die Erfindung ermöglicht es, um eine grosse Vielzahl von Enzymen, anderen labilen biologischen Materialien und chemisch aktiven Substanzen im aktiven Zustand einzukapseln, wobei eine höhere Ausbeute an brauchbarer Substanz, die auf diese Weise eingekapselt ist, erhalten werden kann. Es können z. B. sehr feste semipermeable Membranen um eine grosse Anzahl von labilen biologischen Materialien hergestellt werden. So können enzymhaltige Mikrokapseln mit gleichmässigerem Semipermeabilitätsgrad erhalten werden, d.h. Kapseln mit gleichmässigen Wandungen ohne poröse Defekte, die eine Porengrösse in einem solchen Bereich haben, dass das eingekapselte Material nicht aus dem Inneren der Kapsel entweichen kann, aber doch leicht mit Substanzen in der Umgebung, in die die Kapseln gebracht werden, reagieren kann. Auch kann eine grosse Vielzahl von chemisch aktiven Substanzen in einer semipermeablen Membran mit hoher Qualität eingekapselt werden, wobei man eine Vielzahl von verschiedenen Polymersystemen und verschiedenen Grenzflächenpolymerisationsmethoden anwenden kann. Die variablen Parameter des Verfahrens können so gewählt werden, dass sie zu der speziellen, einzukapselnden Substanz passen, um die Beschaffenheit der Kapselmembran zu variieren und die Ausbeute an brauchbarem eingekapseltem Material zu maximieren. Das erfindungsgemässe Verfahren kann z. B. zum Einkapseln von Hämoglobin in hoher Konzentration in einer für Sauerstoff, Kohlendioxyd und andere kleine Moleküle permeablen Kapsel angewandt werden. Die Porengrösse der Kapselmembran kann bei Anwendung einer grossen Vielzahl von Einkapselungsme-thoden in verbessertem Ausmass gesteuert werden. So können feste semipermeable Mikrokapseln mit Membranen mit Porengrössen innerhalb einer Anzahl von Grössenbereichen erhalten werden; diese Mikrokapseln sind daher selektiv permeabel für Moleküle mit kleineren Dimensionen als der Obergrenze des gewählten Bereiches.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Anspruch 1 definiert und umfasst einen zweistufigen Polymerisations-prozess unter Verwendung von mindestens zwei polymeri-sierbaren Monomeren, von denen das erste in einem ersten Lösungsmittel, das aus hydrophilen Lösungsmitteln und/ oder Wasser gewählt ist, und das zweite in einem hydrophoben Lösungsmittel löslich ist. Zuerst wird eine Lösung in dem ersten Lösungsmittel, vorzugsweise Wasser, hergestellt, indem man das einzukapselnde Material zusammen mit dem ersten Monomer in dem ersten Lösungsmittel löst. Da viele Monomerlösungen einen pH-Wert haben, der viele labile biologische Substanzen denaturieren würde, ist es oft vorteilhaft, die Monomerlösung auf einen pH im Bereich zwischen 5 und 9 zu puffern, ehe eine solche labile biologische Substanz zugesetzt wird.

Dann wird ein hydrophobes Lösungsmittel zugesetzt, das die folgenden Eigenschaften hat. Erstens muss die Löslichkeit des zweiten Monomers, das für die Polymerisation verwendet wird, in dieser hydrophoben organischen Flüssigkeit sehr hoch sein. Zweitens muss das hydrophobe Lösungsmittel ein geringes Lösungsvermögen für das erste Monomer haben. Drittens ist es vorteilhaft, wenn das erste Lösungsmittel mit dem hydrophoben Lösungsmittel eine gute Emulsion bildet.

Das gebildete zweiphasige System wird emulgiert, wobei das erste Lösungsmittel die diskontinuierliche (disperse) Phase darstellt. Die Emulgierung kann nach beliebigen wohlbekannten Methoden erfolgen, gewöhnlich mit Hilfe eines Emulgators. Von der Grösse der erzeugten Tröpfchen hängt die Grösse der gebildeten Mikrokapseln ab.

Das zweite Monomer wird zu der Emulsion zugesetzt, und zwar vorzugsweise, wenn der gewünschte Grössenbe-reich der Tröpfchen erreicht worden ist; an der Phasengrenzfläche tritt nun Polymerisation (d.h. Kondensation oder Po-lyaddition) ein. Weil das erste Monomer, das in erster Linie in der diskontinuierlichen (dispersen) Phase gelöst ist, in der kontinuierlichen, hydrophoben organischen Phase etwas löslich ist, tritt dabei eine gewisse Diffusion des ersten Monomers in die kontinuierliche Phase (das Dispergens) ein. Die Kapselmembran bildet sich beim Fortschreiten der Polymerisation über diese Grenzflächenzone hinweg. Die sich bildende Membran behindert die weitere Diffusion des ersten Monomers in das Dispergens, wobei die Membraneigenschaften sehr von der detaillierten Reihenfolge der zufälligen Zusammenstösse zwischen den Monomeren abhängen.

Die in diesem Zeitpunkt erzeugten Membranen sind sehr permeabel und makroporös, wobei brauchbare semipermeable Membranen nur unter ausserordentlichen Bedingungen, die sich schwierig zu regeln lassen, entstehen. Es wird

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angenommen, dass das Problem von dem Vorhandensein von Defekten in den Membranen herrührt, welche Defekte dazu führen, dass makroporöse Löcher durch die Membran vorhanden sind, nachdem die Reaktion abgebrochen worden ist und die Kapseln gewaschen werden. Nach dem Stande der Technik kann dies nur dadurch verhindert werden, dass man die Polymerisation (d.h. Kondensation oder Poly-addition) so lange fortsetzt, dass diese grossen Defekte beseitigt werden, wodurch gleichzeitig die kleineren Poren verschlossen werden. Es wird somit angenommen, dass sich annehmbare Kapseln nur innerhalb eines schmalen Bereiches von Polymerisationsbedingungen ergeben, in welchem Bereich die Defekte geschlossen und die kleineren Poren noch olfen sind.

Es wurde jedoch folgendes festgestellt: Wenn man solche rohen Mikrokapseln von dem Dispergens abtrennt, in einer Flüssigkeit, in der das zweite Monomer sehr leicht löslich ist und das erste Monomer weniger löslich ist als in dem hydrophoben Lösungsmittel, suspendiert und dann eine zweite Portion des zweiten Monomers zugibt, tritt die gleiche Polymerisationsreaktion wie in der ersten Stufe, aber mit einer viel geringeren Geschwindigkeit über einer viel schmaleren Grenzflächenzone, die nur in den Hohlräumen der rohen Kapselmembrane liegt, ein. Dies führt dazu, dass die makroporösen Defekte in der Kapselwandung geflickt, die Porengrösse verringert und die Membranen verstärkt und für das einzukapselnde Material undurchlässig gemacht werden.

Es wird angenommen, dass diese zweite Polymerisationsreaktion selektiv Brücken über die grösseren Poren bildet, wo das erste Monomer mehr zu dem Dispergens diffundiert, und dass dieses Flicken praktisch ohne signifikante Zunahme der Dicke der Kapselwandung eintritt. Im Gegensatz dazu erhöht sich bei fortgesetzter Verwendung des ersten Lösungsmittels die Wandungsdicke, wodurch die Permeabilität des grössten Teils der Membran wegen der Abdichtung der Defekte abnimmt.

Es wurde gefunden, dass das erfindungsgemässe Verfahren bei einer grossen Anzahl von bekannten Einkapselungs-verfahren anwendbar ist, wobei semipermeable Kapseln gebildet werden und die Porengrösse dieser Kapseln geregelt werden kann.

Gemäss einer anderen Ausführungsform des erfindungs-gemässen Polymerisationsverfahrens ist es möglich, ein zweites Monomer zu wählen, das bei herkömmlichen Methoden labile biologische Materialien, die eingekapselt werden sollen, schnell denaturieren würde. Diese Denaturierung kann aber vermieden werden, indem man die relative Konzentration der gelösten Stoffe in dem Dispergens und der dispersen Phase steuert, so dass die Konzentration des zweiten Monomers in der dispersen Phase auf niedrigeren als den optimalen Werten gehalten wird und die gelösten Substanzen in der dispersen Phase eine hohe Konzentration aufweisen. In dieser Situation wird die Diffusion des zweiten Monomers in die disperse Phase gehemmt und die Denaturierung des labilen biologischen Materials auf den Mindestwert herabgesetzt, aber es wird eine makroporöse, schlecht geformte und deutlich unbefriedigende Kapselmembran erzeugt. In der zweiten Polymerisationsstufe kann jedoch die Konzentration des zweiten Monomers in dem Dispergens der zweiten Suspension bedenkenlos erhöht werden (da das eingekapselte Material jetzt durch die rohe Kapselmembran geschützt ist), um die Kapselmembranen zu verstärken und sie semipermeabel zu machen.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das zweite Monomer in der ersten Polymerisationsstufe zu der Emulsion gegeben, und zwar nicht auf einmal, um die Polymerisation einzuleiten, sondern in Bruchteilen in regelmässigen Zeitabständen während der gesamten Dauer der

Polymerisation. Durch diese Methode bleibt die Konzentration des zweiten Monomers an der Grenzfläche zu allen Zeitpunkten während der Bildung der ersten groben Membran auf einem konstanteren optimalen Wert und hemmt somit die Diffusion des zweiten Monomers in die disperse Phase und erhöht die Ausbeute an brauchbarem labilem biologischem Material. Dieses Verfahren ist auch ziemlich brauchbar für Systeme, bei denen die Hydrolyse des gewählten zweiten Monomers mit der Polymerisation konkurriert.

In einer wichtigen Ausführungsform ist das erste Monomer ein Polyamin, vorzugsweise ein Diamin, und das zweite Monomer ein Disäurehalogenid; das erste hydrophobe Lösungsmittel ist eine Lösung von Cyclohexan und Chloroform, die vorzugsweise 80% Cyclohexan und 20% Chloroform enthält; und in der zweiten Suspension ist die hydrophobe Flüssigkeit reines Cyclohexan. Diamine sind in der Regel in Cyclohexan im wesentlichen unlöslich und in Chloroform etwas löslich.

Es wurde gefunden, dass beim Einkapseln von Hämoglobin eine Hämoglobinlösung mit Konzentrationen von bis zu 30 g pro dl hergestellt werden kann, wenn die roten Blutkörperchen durch Einwirkung von hypertonischer Salzlösung (die grössenordnungsmässig 1,5 Gew.-% Salz enthält) entwässert werden, wobei die hohe Salzkonzentration die Diffusion von Wassermolekülen in die disperse Phase hemmt, wo sie mit Molekülen des zweiten Monomers reagieren und diese unbrauchbar machen würden.

Da es wohlbekannt ist, dass viele labile biologische Materialien in stark sauren oder basischen Umgebungen schnell denaturieren, wird der pH-Wert der unmittelbaren Umgebung des einzukapselnden Materials vorzugsweise in allen Stufen des neuen Einkapselungsverfahrens mindestens im Bereich von 5 bis 9 gehalten. Wenn ein Diamin als erstes Monomer verwendet wird, kann dies erreicht werden, indem man Kohlendioxyd durch die Diaminlösung perlen lässt, ehe sie dem labilen biologischen Material zugesetzt wird. Die Diaminlösung, die im allgemeinen einen pH-Wert in der Grössenordnung von 11,5 hat, wird dadurch in Diamin-carbonat übergeführt, das gewöhnlich pH-Wert von etwa 8,6 bis 8,7 hat. Wenn diese Lösung mit Kohlendioxyd gesättigt ist und unter 100% Kohlendioxydgas aufbewahrt wird, kann diese Lösung auf einen pH-Wert von etwa 8,4 gebracht werden.

Im Gegensatz dazu wurde nach dem Stand der Technik das schwache Puffersystem Natriumbicarbonat/Natrium-carbonat verwendet, d.h. die Salze einer starken Base und einer schwachen Säure, während in der oben beschriebenen Ausführungsform die schwache Säure selbst verwendet wird. Der resultierende pH-Wert der bekannten, gepufferten Di-amin-Hämolysatlösung beträgt 11.

Ein prinzipieller Vorteil des vorliegenden Verfahrens beim Einkapseln von biologisch und/oder chemisch aktiven Materialien unter Bildung von festen oder pseudofesten «Reaktoren» besteht darin, dass die Materialien in der Masse eingekapselt werden, ohne dass eine direkte Konkurrenz um zur Verfügung stehende Bindungsstellen mit Verunreinigungen eintritt. Somit können hochaktive Kapseln aus verhältnismässig schlecht gereinigten Materialien hergestellt werden. Ausserdem werden die aktiven Materialien gegen Angriff durch Mikroorganismen geschützt, welch letztere oft für die Inaktivierung oder Hemmung derartiger «Reaktorkomponenten» verantwortlich sind.

Eine erste Ausführungsform der Erfindung beruht auf einer neuen Abänderung des wohlbekannten Verfahrens zur Mikroeinkapselung, das allgemein als Grenzflächenpolymerisation bezeichnet wird. Es werden zwei miteinander nicht mischbare Lösungsmittel gewählt, von denen das eine hydrophob und das andere hydrophil oder vorzugsweise

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Wasser ist. Das einzukapselnde Material und ein erstes Monomer werden in dem Wasser gelöst, die beiden Lösungsmittel werden gemischt, worauf die Mischung emulgiert wird, wobei das hydrophobe Lösungsmittel das Dispergens darstellt. Die Grösse der kolloidalen Tröpfchen bestimmt die Grösse der zu erzeugenden Mikrokapseln. Das Emulgieren kann nach beliebigen wohlbekannten Emulgierungsverfah-ren erfolgen, wie beispielsweise unter Verwendung eines Mischers, und wird gewöhnlich unter Zusatz eines Emulgators ausgeführt. Da die Grösse der nach irgendeinem gegebenen Verfahren erzeugten Tröpfchen innerhalb eines spezifischen Bereiches variiert, kann ein Filter verwendet werden, um in jedem gegebenen Ansatz die erzeugten zu grossen Kapseln abzutrennen, so dass die Unterschiede des Kapseldurchmessers auf den Mindestwert herabgesetzt werden. Eine detailliertere Beschreibung der Methode zum Variieren der Kap-selgrösse finden sich in Thomas M. S. Chang, «Artificial Cells», Kapitel 2.

Wenn Tröpfchen von genügender Grösse erzeugt worden sind, wird in die Suspension ein zweites Monomer eingeführt, das mit dem ersten Monomer durch Polykondensa-tion oder Polyaddition ein Polymer zu bilden vermag. Die Polymerisation tritt lediglich an der Grenzfläche des zwei-phasigen Systems ein. Offensichtlich muss das zweite Monomer aus denjenigen Monomeren gewählt werden, die in den gewählten Lösungsmitteln die oben definierte Löslichkeit aufweisen.

Wenn die Ausbeute an in den Kapseln eingeschlossenem, brauchbarem biologischem Material maximiert werden soll, müssen die Reaktionsbedingungen sorgfältig geregelt werden, so dass das im allgemeinen empfindliche Material während der Polymerisation nicht in signifikantem Ausmass denaturiert wird. Es wurde dabei festgestellt, dass ein für die Erzielung einer hohen Ausbeute an brauchbarem eingekapseltem Material höchst entscheidender Faktor der pH-Wert der dispersen Phase ist. Um die Denaturierung von labilem Material zu vermeiden, kann der pH-Wert zu allen Zeiten während des Verfahrens gesteuert werden, und zwar im allgemeinen im Bereich von 5 bis 9. Die Lösungsmittel, insbesondere das hydrophile Lösungsmittel, das das einzukapselnde Material löst, können dabei aus Lösungsmitteln gewählt werden, die das einzukapselnde Material nicht schnell denaturieren. Diese Auswahl ist für den Fachmann ein leichtes. Um eine richtige Dispergierung und Trennung zu erleichtern, unterscheiden sich die beiden Lösungsmittel zweckmässig etwas in ihren spezifischen Gewichten.

Polymerisationen, die nur in einem Medium eintreten, dessen pH-Wert für die spezielle chemisch aktive Substanz, die eingekapselt werden soll, ungeeignet ist, werden zweckmässig nicht für diese Substanz angewandt. Viele Monomere aber, die in Lösung einen natürlichen pH-Wert haben, der die meisten labilen biologischen Materialien zu denaturieren vermag, können auf einen Wert innerhalb des oben angegebenen pH-Bereiches gepuffert werden, ohne dass ihre Aktivität ungünstig beeinflusst wird. Andere Monomere können ohne Pufferung verwendet werden, was von ihrem natürlichen pH-Wert und der Art des einzukapselnden Materials abhängt. Für stark alkalische Monomere ist das Leiten von Kohlendioxydgas durch die Lösung ein bevorzugtes Verfahren, um den pH-Wert innerhalb des nicht denaturierend wirkenden Bereiches einzustellen.

Es wurde gefunden, dass erfindungsgemäss eine viel festere Kapselmembran mit weniger Defekten und einem minimalen Polymerisationsgrad erzeugt werden kann. In dieser Hinsicht wurde festgestellt, dass die nach dem oben beschriebenen bekannten einstufigen Verfahren erzeugten Kapselmembranen oft makroporös und ungleichmässig sind, und dass ihre Festigkeit und Dicke beträchtlich variieren. Wenn die Polymerisation an der Grenzfläche des emul-gierten Systems jedoch durch Entfernung des hydrophoben Lösungsmittels abgebrochen wird und die Kapseln danach in einer Flüssigkeit mit geringerem Lösungsvermögen für das erste Monomer suspendiert werden, tritt bei Zugabe einer zusätzlichen Menge des zweiten Monomers zu der zweiten Suspension eine weitere Polymerisation ein, wobei die Membranen verstärkt werden und die grösseren Poren der Membranen bevorzugt ausgefüllt werden, so dass der makroporöse Zustand vermieden wird. Das Verfahren liefert somit durch Anwendung einer zweiten, minimalen Polymerisation eine semipermeable Membrane von hoher Qualität, wobei die zweite Polymerisation den maximalen zusätzlichen Vorteil hat, die Defekte der Membrane auszufüllen.

Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens ermöglichen die Regelung der Festigkeit, Dicke und Porosität der Membranen in einem verbesserten Ausmass. Wenn das hydrophobe Lösungsmittel, das das Dispergens der Emulsion bildet, so gewählt wird, dass das erste Monomer darin schwer löslich ist, difundiert aus den Tröpfchen geringfügig Monomer in das Dispergens. Dies führt zu einer verhältnismässig dicken Phasengrenzfläche und einer gleichfalls dicken und gewöhnlich porösen Membrane, die überall dort gebildet wird, wo die beiden Monomere miteinander in Berührung kommen. Je grösser die Löslichkeit des ersten Monomers in dem Dispergens ist, desto makroporöser ist im allgemeinen die erzeugte Membrane. Wenn anderseits das erste Monomer in dem hydrophoben Dispergens viel weniger löslich ist, ist die Grenzfläche zwischen den Phasen scharf, und es ergibt sich eine dünne, dichte und gewöhnlich mikroporöse Membrane. Die teilweise gebildeten Kapseln werden wieder in eine Flüssigkeit suspendiert, die von dem Lösungsmittel, das bei der ersten Polymerisation als disperse Phase verwendet wurde, verschieden ist und ein anderes Lösungsvermögen für das erste Monomer hat. Wenn in der ersten Polymerisation eine makroporöse Membrane erzeugt worden ist, kann in der zweiten Polymerisation ein Lösungsmittel verwendet werden, in dem das erste Monomer im wesentlichen unlöslich ist, was zu einer Härtung der Membranen führt. Es wird angenommen, dass die beiden Monomere sich bei der zweiten Polymerisationsstufe nur innerhalb der schwachen Stellen der bis zu diesem Zeitpunkt erzeugten mangelhaften Membrane treffen, d.h. dort, wo eine bevorzugte Diffusion des ersten Monomers zum Lösungsmittel stattfindet. Somit wird dort mehr Polymer gebildet, um die grösseren Poren auszufüllen.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Konzentrationen der Monomere in ihren betreffenden Lösungsmitteln gesteuert werden, wodurch ein weiterer Vorteil erzielt wird. Wenn z.B. das zweite Monomer, das in dem hydrophoben Dispergens der Emulsion gelöst ist, die Eigenschaft hat, das einzukapselnde Material zu denaturieren, kann das in der dispersen Phase gelöste erste Monomer mit einer hohen Konzentration in bezug auf das zweite Monomer eingeführt werden, und zwar mit einem Verhältnis der Grössenordnung von 100 zu 1, um jegliche Migration des denaturierenden Monomers in die Tröpfchen der Lösung während der ersten Polymerisation zu verhindern. Durch dieses Verfahren wird oft eine sehr poröse Mikrokap-sel erzeugt, aber in der zweiten Polymerisationsstufe kann die Konzentration des zweiten Monomers unbedenklich erhöht werden, und falls ein geeignetes Lösungsmittel verwendet wird, werden die Kapseln wie oben erläutert durch selektive Brückenbildung über die grösseren Poren mit einer dünneren Membrane verfestigt und mikroporös gemacht, ohne dass das eingekapselte Material ernstlich beeinträchtigt wird.

Es wurde gefunden, dass gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Konzentration von eingekap5

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seltem Hämoglobin signifikant erhöht werden kann, wenn die zur Herstellung von Hämoglobinhämolysat verwendeten Blutkörperchen gründlich in hypertonischer Salzlösung gewaschen werden. Ausserdem trägt die relativ hohe Salzkonzentration in der wässrigen dispersen Phase der Emulsion zur Grenzflächenpolymerisation des ersten Monomers bei, indem sie die Löslichkeit von Wasser in der organischen Phase, die das zweite Monomer enthält, das im typischen Falle unter der Einwirkung von Wasser schnell zersetzt wird, beschränkt. Es wird angenommen, dass die Reaktionsprodukte einer solchen Hydrolyse des zweiten Monomers zu den Mängeln der Membrane beitragen, wenn sie in der Trennungsstufe nicht entfernt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Rote Blutkörperchen aus verfallenem menschlichem Blutbank-Gesamtblut wurden abgetrennt und dann zweimal in dem Doppelten ihres Volumens an hypertonischer Salzlösung (1,5 g/dl) gewaschen, wobei man in einer gekühlten Zentrifuge bei 2800 x g 5 Minuten lang zentrifugierte. Hypertonische Salzlösung wurde verwendet, um Wasser aus den Blutkörperchen zu entfernen, damit nach der Lyse der Blutkörperchen die höchstmögliche Konzentration an Hämoglobin erzeugt wurde. Es wurde ein drittes Mal 15 Minuten lang bei 2800 x g zentrifugiert, um die Blutkörperchen zusammenzupressen. So viel Salzlösung wie möglich wurde aus den zusammengepressten Blutkörperchen entfernt, die dann durch kräftiges Schütteln mit 1 ml wasserfreiem Äther auf 10 ml zusammengepresste Blutkörperchen lysiert wurden. Das erhaltene Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 1000 x g zentrifugiert, worauf die Bruchstücke der Blutkörperchen und der Äther, die nach oben steigen, entfernt wurden. Die Hämoglobinkonzentration wurde überprüft, indem man das Absorptionsvermögen von 10 |il des Hämolysates in 4,0 ml isotonischer Salzlösung bei der Wellenlänge 540 nm mass. Die Absorptionsvermögenswerte von allen richtig hergestellten Hämolysatlösungen lagen zwischen 0,7 und 0,8, was einer Konzentration von mehr als 28 bis 32 g/dl entspricht. Bei Hämoglobinkonzentrationen von mehr als 30 g/dl trat beim Aufbewahren bei Kühlschranktemperatur (4°C) Kristallisation und Ausfallung des Hämoglobins ein. Das Hämolysat konnte mindestens 1 Woche lang verwendet werden, wenn es gekühlt wurde.

Hexandiamincarbonatlösung wurde hergestellt, indem man Kohlendioxyd in eine 3molare Lösung von 1,6-Hexan-diamin (Eastman Kodak Co.) perlen liess, bis der pH-Wert 8,5 erreichte. Dazu waren etwa 15 g Kohlendioxyd auf 100 ml Lösung erforderlich.

Eine Lösung von technischer 4,4'-Diaminobiphenyl-2,2'-disulfonsäure (DBDSA, Eastman Kodak Co.) wurde hergestellt, indem man annähernd 50 g DBDSA zu 800 ml entionisiertem Wasser, die 50 ml 6molares Natriumhydroxyd enthielten, gab. Die Lösung wurde filtriert, um alle restlichen Feststoffe zu entfernen, und die DBDSA durch Zugabe von 70 ml 50volumprozentiger Salzsäure ausgefällt. Nachdem die Kristalle sich abgesetzt hatten, wurde möglichst viel der purpurfarbenen Flüssigkeit abgegossen; dann wurden 500 ml 10volumprozentige Salzsäure zugesetzt. Die Kristalle wurden mittels eines Büchner-Trichters isoliert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, dann zweimal mit Aceton gewaschen und getrocknet. Das Produkt bestand aus weissen oder blassrosa Kristallen und wurde in einer braunen Flasche vor Licht geschützt aufbewahrt. Diese Verbindung wurde verwendet, um ein Membrancopolymerisat herzustellen, das zur Verhinderung des Zusammenballens eine negative Ladung hatte.

10 ml Hämolysatlösung, die 30 g/dl Hämoglobin enthielten, wurden mit 10 ml 3molarer Hexandiamincarbonatlösung, die 2,88 g DBDSA enthielt, gemischt. Diese beiden gemischten Monomere stellten in diesem Beispiel den ersten Reaktionsteilnehmer dar. Die wässrige Lösung wurde dann zu 125 ml vorgekühlter hydrophober organischer Flüssigkeit gegeben, die aus 100 ml eines Gemisches von 20% Chloroform und 80% Cyclohexan und 25 ml des Emulgators SPAN-85 (Sorbitontrioleat) hergestellt war.

Das Emulgieren wurde dann in einem vorgekühlten Mischer begonnen und 1 bis 2 Minuten lang fortgesetzt.

Terephthaloylchlorid, das zweite Monomer, musste vorher gereinigt werden. Heisses (nahezu siedendes) Cyclohexan wurde mit praktisch reinem Terephthaloylchlorid (Estman Kodak Co.) gesättigt und die Lösung schnell filtriert. Die klare Flüssigkeit wurde gesammelt, worauf man sie in einem geschlossenen Behälter abkühlen und kristallisieren liess. Die Kristalle wurden isoliert, wobei sie möglichst wenig der Atmosphäre ausgesetzt wurden, und im Vakuum getrocknet, da diese Verbindung mit atmosphärischer Feuchtigkeit reagiert. Die Vorratslösung von Terephthaloylchlorid wurde hergestellt, indem man 10,15 g gereinigtes Terephthaloylchlorid in 25 ml einer Mischung von 20 Vol.-% Chloroform und 80 Vol.-% Cyclohexan löste. Es wurde eine 0,5molare Lösung erhalten. Diese Lösung sollte in einem dicht verschlossenen Behälter aufbewahrt werden und kann mindestens 1 Monat lang verwendet werden, bis die Bildung eines Niederschlages beginnt.

3 ml der 0,5molaren Terephthaloylchloridlösung in einer Mischung von 20% Chloroform und 80% Cyclohexan wurden dann zu der Emulsion gegeben, während man mit geringer Geschwindigkeit mischte. Das eigentliche Konzentrationsverhältnis von Diamin zu Disäurehalogenid betrug 128 : 1, obgleich eine gewisse Abweichung geduldet werden kann. Nach Ablauf von 3 Minuten war die erste Polymerisationsreaktion beendet, und die Suspension wurde 15 bis 20 Sekunden lang bei 400 bis 500 x g zentrifugiert. Die überstehende organische Flüssigkeit wurde dann durch Ansaugen entfernt.

Die Kapseln wurden darauf in einer zweiten Flüssigkeit suspendiert, die aus 100 ml Cyclohexan und 10 ml Sorbitan-trioleat bestand. Unter langsamem Mischen wurden 7 ml einer 0,5molaren Lösung von Terephthaloylchlorid in 20% Chloroform und 80% Cyclohexan zugegeben. Diese hydrophobe Flüssigkeit enthält nur 1,0 bis 1,5% Chloroform gegenüber 20% in der ersten organischen Stufe. Der verringerte Chloroformgehalt verringert die Löslichkeit des Diamins in dem Lösungsmittel, so dass eine dünnere Membrane hergestellt und Löcher in der ursprünglichen gröberen Membrane geflickt werden. Das Verhältnis von Diaminkonzentration zu Disäurehalogenidkonzentration betrug 50: 1. Es wurde 3 Minuten lang weitergerührt, wonach die Reaktion durch Zugabe von 30 ml 50%igem TWEEN-20 (Sorbitanmonolaurat), das mit 0,3molarem Natrium-bicarbonat neutral gepuffert war, abgeschreckt wurde.

Es ist festzuhalten, dass die Hämoglobin-Enzym-Hämolysatlösung in keinem Zeitpunkt einem pH-Wert von weniger als 5 oder mehr als 9 ausgesetzt war. Die Hexan-diaminlösung hatte einen natürlichen pH-Wert von 11,5 und nach dem Mischen mit Hämoglobin einen pH-Wert von etwa 11. Durch das Durchperlenlassen von Kohlendioxyd werden Kohlensäure und Hexandiamincarbonat gebildet. Das Kohlendioxyd wirkt als Puffer und wird gegenüber Natriumsalzen von schwachen Säuren bevorzugt. Vor dem Puffern hatte das verwendete Sorbitanmonolaurat einen typischen pH-Wert von annähernd 4,5. Wenn das Hämoglobin und die Enzyme längere Zeit dieser sauren Umgebung ausgesetzt wären, würden sie denaturiert werden. Dies kann ver6

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mieden werden, indem man das Sorbitanmonolaurat auf einen pH-Wert in der Nähe von 7 puffert. Das Sorbitanmonolaurat hat den Zweck, die Übertragung der Mikrokapseln in ein wässriges Medium, wie Salzlösung, zu erleichtern (siehe Artificial Cells, Kapitel 2). Es sei daraufhingewiesen, dass das Sorbitanmonolaurat in dieser Stufe dazu neigt, langsam mit dem Terephthaloylchlorid zu reagieren, wobei ein klebriger Polymerüberzug entsteht, und ausserdem die Mikrokapseln zu schrumpfen. Ein besseres alternatives Verfahren besteht darin, möglichst viel des Lösungsmittels durch Zentrifugieren zu entfernen und dann die obige Zugabe von TWEEN-20 und anschliessende Abtrennung auszuführen.

Die nach diesem Verfahren erzeugten Mikrokapseln ermöglichten kein Auslaugen von Enzymen oder Hämoglobin. Die Halbwertszeiten (t 1 /2) für gelöste Substanzen mit verschiedenen Molekulargewichten sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Permeabilität von Mikrokapseln - Halbwertszeiten

Substanz Molekular- 11/2 ± SEM (Sek.)

gewicht

Glycerin

92

1,75 + 0,1

Diacetonalkohol

116

2,5 +0,2

Glucose

180

4,9 +0,1

Saccharose

342

10,6 +0,2

Trisa

121

2,8 +0,1

Bicineb

163

6,1 +0,3

CAPS0

221

8,0 +0,5

Pipesd

302

13,0 ±0,5

a Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 8 b N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-glycin, pH 8 c Cyclohexylaminopropansulfonsäure, pH 8 d Piperazin-N,N'-bis-2-äthansulfonsäure), pH 8 SEM = Standardfehler des Mittelwertes

Die Aktivität von vier Enzymen, nämlich Lactat-dehydrogenase (LDH), Glutamatoxaloacetattransaminase (GOT), Urease und ß-Glucuronidase, wurde vor und nach der Einkapselung gemessen. LDH und GOT wurden natürlich in dem Hämolysat von roten Blutkörperchen gefunden. Urease und ß-Glucuronidase wurden dem Hämolysat in Form von gefriergetrocknetem, teilweise gereinigtem Enzym, das im Handel erhältlich ist, zugesetzt. Die Ergebnisse der Vergleiche für LDH, GOT und Urease sind in Tabelle II angegeben. Die Aktivität wurde in internationalen Einheiten (IU) pro Liter der Probe unter den Bedingungen der Testreaktion bestimmt. Die für ß-Glucuronidase bestimmten Ausbeuten lagen gleichmässig über 50%.

Tabelle II

Enzym Aktivität Erhaltengebliebene

(IU/1)±SEM Aktivität* (%)

LDH 4120 + 90 55

GOT 1 200+80 66

Urease 234 000 + 8 000 68

J Die Enzymaktivität der Mikrokapseln, geteilt durch die Enzymaktivität des Hämolysates, das zur Herstellung der Mikrokapseln verwendet wurde (% Ausbeute).

SEM = Standardfehler des Mittelwertes.

Tabelle III zeigt einen Vergleich der prozentualen Sättigung mit Sauerstoff in Hämolysatlösung, die zur Herstellung von Mikrokapseln mit eingekapseltem Hämoglobin verwendet worden war, bei verschiedenen Sauerstoffdrük-ken.

Tabelle III

Sauerstoffdruck Prozentuale Sättigung

Hämolysat- Eingekapseltes hämoglobin Hämoglobin

5

7%

5%

10

21%

10%

15

46%

20%

20

62%

32%

25 .

74%

45%

30

82%

58%

35

89%

68%

40

92%

74%

50

97%

83%

60

99%

89%

70

99% +

92%

80

99% +

94%

90

99% +

96%

100

99% +

97%

110

99% +

98%

120

99% +

99%

Tabelle IV zeigt die Wirkung des Variierens der Menge des Säurehalogenids in der dispersen Phase jeder Polymerisation auf die Porosität der in einer Testreihe hergestellten Mikrokapseln, wobei die Porosität indirekt gemessen wird, indem man beobachtet, ob das eingekapselte Material durch die Membrane austrat oder nicht. Wie die Tabelle deutlich zeigt, ist die Konzentration des zweiten Monomers in jeder Polymerisationsstufe sehr wesentlich für eine gute Kapselbildung. Der Fachmann wird wenig Schwierigkeiten haben, das bei anderen Polymerisationssystemen zu verwendende optimale Konzentrationsverhältnis zu bestimmen. Die Kapseln von Tabelle IV wurden nach dem oben umrissenen Verfahren hergestellt, ausgenommen dass die Emulgierung in SPAN 85 allein ausgeführt wurde, ehe das gemischte organische Lösungsmittel zugesetzt wurde. Die Resultate von anderen Varianten des Verfahrens sind qualitativ ähnlich.

Tabelle IV

Mit 10 ml Hämolysat und verschiedenen Mengen 0,5molarem Terephthalatchlorid hergestellte Mikrokapseln

Erste

Zweite

Zustand der

Reaktion

Reaktion

Kapsel

Terephthaloyl

Terephthaloyl

chlorid chlorid

1

2 ml

4 ml

Sehr undicht

2

2 ml

8 ml

Sehr undicht

3

3 ml

7 ml

Nicht undicht

4

3 ml

7 ml

Nicht undicht

5

4 ml

7 ml

Nicht undicht

6

4,5 ml

7,5 ml

Mässig undicht

7

4,5 ml

7,5 ml

Mässig undicht

8

5 ml

8 ml

Sehr undicht

9

5,5 ml

8 ml

Sehr undicht

Die aus dem organischen Lösungsmittel nach der ersten Reaktion abgetrennten Mikrokapseln waren rot, was zeigte, dass wenig oder keine Denaturierung eingetreten war, aber undicht und schlecht geformt. Durch Erhöhen der Terephthaloylchloridkonzentration unter diesen Bedingungen wurden Mikrokapseln erzeugt, die braun waren, was die Denaturierung von Hämoglobin anzeigte, und undicht. Das

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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60

65

628 823

Verlängern der Reaktionszeit der ersten Reaktion auf bis zu

5 Minuten hatte wenig offensichtliche Wirkung auf die Mikrokapseln, aber beim Verlängern der Reaktionszeit der zweiten Reaktion auf mehr als 5 Minuten wurden die Mikrokapseln braun, was die Denaturierung von Hämoglobin anzeigte. Bei Verringerung der Reaktionszeiten beider Reaktionen auf 1 Minute oder mehr ergab undichte Mikrokapseln. Beim Vorhandensein von kleinen Mengen Äthanol, die gewöhnlich als Stabilisator für das Chloroform verwendet werden, kann es erforderlich sein, die optimalen Volumen neu einzustellen. Um die grösste Wiederholbarkeit und die zuverlässigste Kapselbildung zu erzielen, sollte das Äthanol entfernt werden. Das in Tabelle IV verwendete Chloroform enthielt etwas Äthanol. Bei Extraktion des Äthanols beträgt das optimale Volumen für die zweite Reaktion im typischen Falle 3 bis 4 ml statt 7 ml. Wenn man die in der Trennungsstufe verwendete Menge TWEEN-20 verringert, ergibt sich eine schlechte Trennung der Mikrokapseln von den organischen Lösungsmitteln. Mikrokapseln, die man übermässig lange (länger als 30 Minuten) in TWEEN-20 beliess, färbten sich braun. Mikrokapseln, die in ungepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 5,5 aufbewahrt wurden, wurden nach mehreren Tagen braun, während diejenigen, die in einer auf pH = 7,4 gepufferten Lösung aufbewahrt wurden, monatelang rot blieben.

Die weitere Untersuchung der in diesem Beispiel hergestellten Kapseln zeigt, dass sie ein Verhältnis R von Wandungsvolumen VWandung zu Kapselvolumen VKapsel in der Grössenordnung von 0,028 haben. Wenn t die Wandungsdicke und D der Durchmesser sind, so ergibt sich das Verhältnis von Wandungsvolumen zu Kapselvolumen durch folgende Gleichung:

Vwandung 7lD2t 6t R - - —

VKapsel 7C/6D3 D

Die Kapseln hatten eine durchschnittliche Wandungsdicke t von 700 A oder 0,07 (i und einen durchschnittlichen Durchmesser D von 15 \i. Demgemäss ist R ungefähr

6 x 0,07/15 oder 0,028. Wenn gegeben ist, dass Nylon eine Dichte von annähernd 1 hat, würden pro ml der erzeugten Kapseln 28 mg Nylon erforderlich sein, um die festen Membranen zu bilden. Die Gesamtmenge an vorhandenem Diamin, die aus der angewandten Konzentration berechnet werden kann, beträgt 1,5 mMol/ml oder 174 mg/ml. Da die Nylonwandung zu 46% aus Diamin besteht, wären 12,9 mg Diamin oder etwa 7,5% der Gesamtmenge erforderlich, um eine feste Nylonwandung zu bilden. Da aber das Säurechlorid der die Reaktion begrenzende Bestandteil ist und das Verhältnis von Diamin zu Disäurechlorid höchstens 50 : 1 betrug, liegt die obere Grenze für das erzeugte Nylon in der Grössenordnung von 2,0% des gesamten Diamins. Dies deutet daraufhin, dass die erzeugten Membranen höchstwahrscheinlich schwammähnlich mit einer offenzelligen Struktur sind.

Diese Kapseln waren undurchlässig für Hämoglobin (Molekulargewicht ungefähr 68 000) aber durchlässig für Insulin (Molekulargewicht ungefähr 12 000, Halbwertzeit zwischen 2 und 3 Minuten). Ein Vergleich der Halbwertszeit für Insulin mit den Halbwertszeiten für niedermolekulare Substanzen, wie sie in Tabelle I angegeben sind, zeigt eine nicht lineare Beziehung. Es wird angenommen, dass diese Erscheinung durch die sterischen Eigenschaften oder den Ladungszustand der Insulinmoleküle verursacht ist.

Beispiel 2

Das Verfahren war gleich wie in Beispiel 1, aber das Di-

amin-DBDSA in der Hämolysatlösung wurde durch eine Lösung ersetzt, die aus 1 Teil 1 molarer 4,4'-Diaminostilben-2,2'-disulfonsäure (Pfaltz and Bauer, Inc.) in isotonischer Phosphatpufferlösung vom pH = 7,4+10 Teilen 3molarem Hexandiamincarbonat bestand, das zu einem gleichen Volumen Hämolysat gegeben wurde. Die erzeugten Kapseln zeigten ähnliche Eigenschaften wie diejenigen von Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren ist mit den folgenden Ausnahmen gleich wie in Beispiel 1: in die Hämolysatlösung wird kein DBDSA eingeführt, und die in den beiden Polymerisationsstufen verwendete Menge des Säurechlorids, d.h. 0,35 ml Säurechlorid pro ml Hämolysat-Diamin-LÖsung, ist gleich. Das Säureha-logenid wird im Verlauf jeder Polymerisation in Abständen von 30 Sekunden in gleichen Teilmengen zugesetzt und nicht alles auf einmal zu Beginn der Polymerisation. Durch dieses Verfahren wird die lokale Konzentration des Säurechlorids gering gehalten und eine Membrane von hoher Qualität erzeugt. Die prozentuale Enzymausbeute ist vergleichbar mit derjenigen in Beispiel 1.

Beispiel 4

Kapseln wurden unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens mit Terephthaloylchlorid und Hexandiamin, das 2,5-Diaminobenzolsulfonsäure enthielt, hergestellt, wobei aber 2,5-Diaminobenzolsulfonsäure anstelle von DBDSA zu dem Hexandiamin gegeben wurde. Die erzeugten Kapseln zeigten ähnliche Eigenschaften wie diejenigen von Beispiel 1.

Beispiel 5

Mikrokapseln aus Sebacoylchlorid und Hexandiamincarbonat wurden nach dem Verfahren von Beispiel 1 erzeugt, wobei aber das Terephthaloylchlorid durch Sebacoylchlorid ersetzt und kein DBDSA verwendet wurde. Dieses Verfahren lieferte Mikrokapseln mit ähnlichen Eigenschaften wie die Mikrokapseln von Beispiel 1.

Beispiel 6

Kapseln aus Sebacoylchlorid und Lysin wurden nach der in Beispiel 5 angegebenen Methode hergestellt, wobei aber 3molares Lysin oder eine Lösung, die aus gleichen Volumenmengen 3molarem Hexandiamincarbonat und 3molarem Lysin bestand, anstelle des 3molaren Hexandiamincarbonats verwendet wurde. Einige wenige Mikrokapseln, die nach dieser Methode hergestellt waren, waren undicht und unbefriedigend. Andere zeigten ähnliche Eigenschaften wie die in Beispiel 1 erzeugten.

Beispiel 7

1,5 ml 30%iges Rinderalbumin werden zusammen mit 0,4 ml 36%igem Kaliumchlorid und 0,1 ml 2,9molarem Tetraäthylenpentamin (vorher mit Salzsäure auf pH = 9,5 eingestellt) zu 1 ml der DBDSA-Hexandiamincarbonat-Lö-sung von Beispiel 1 gegeben. 4,0 ml SPAN 85 und 10 ml des Hexan-Chloroform-Lösungsmittels von Beispiel 1 werden dann zu der Mischung gegeben, worauf in 1 bis 2 Minuten durch kräftiges Rühren unter Verwendung eines Magnetrüh-rers eine Emulsion erzeugt wird. 0,4 ml Terephthaloyl-chloridlösung (0,5molar in dem Hexan-Chloroform-Lösungsmittel von Beispiel 1) werden alle 30 Sekunden in Portionen von 0,1 ml zugegeben, worauf man während der nächsten 6 Minuten jede Minute zusätzliche 0,1 ml der Lösung zugibt.

Nach dem Zentrifugieren zur Abtrennung der Kapseln wird die überstehende Flüssigkeit verworfen, und die rohen Mikrokapseln werden in Cyclohexan, das 5% SPAN 85 enthält, erneut suspendiert. 0,7 ml Terephthaloylchlorid werden

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

628 823

zugesetzt, worauf die Suspension 3 Minuten lang gerührt wird. Nach Phasentrennung durch. Zentrifugieren werden die Mikrokapseln einmal in reinem Cyclohexan gewaschen und wie in Beispiel 1 einer endgültigen Wasch- und Gewinnungsbehandlung unterworfen.

Labile biologische Materialien, einschliesslich Enzyme, können je nach Wunsch in der Albuminlösung gelöst werden. Das Tetraäthylenpentamin trägt dazu bei, das Polymer unter Bildung fester, semipermeabler Membranen mit gleichmässiger Porengrösse zu vernetzen.

Obgleich die vorstehenden Beispiele auf Polykondensa-tionssysteme beschränkt sind, die ein Disäurehalogenid und ein Diamin enthalten, um ein Polyamidpolymer oder -copo-lymer zu erzeugen, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass das 2stufige Polymerisationsverfahren und andere Lehren dieser Beschreibung bei vielen anderen bekannten Ein-kapselungsverfahren brauchbar sind. Durch kluge Wahl der Lösungsmittel entsprechend den Lehren dieser Beschreibung, so dass sie für spezielle Polymersysteme und die speziellen einzukapselnden Materialien geeignet sind, wird es für den Fachmann ein leichtes sein, Kapselmembranen mit hoher Qualität zu erzeugen, z. B. aus Polyester aus einem Po-lyol und einer Disäure (HOOC-R-COOH) oder einem Di-5 säurehalogenid (ClOC-R-COCl), aus anderen Polyamiden aus einem Diamin (H2N-R-NH2) und einer Disäure aus Polyharnstoff aus einem Diamin und einem Diisocyanat, aus Polycarbonat aus einem Diol und einem Säurehalogenid, aus Polysulfonamid aus einem multifunktionellen Sulfonyl-io halogenid und einem Diamin sowie aus vernetztem Protein, aus Polyphthalamid und anderen wohlbekannten Polykon-densationsprodukten.

Einkapselungsverfahren unter Anwendung von Poly-additionsreaktionen, wie sie beispielsweise in der USA-Pa-15 tentschrift Nr. 3 864 275 geoffenbart sind, liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Der Fachmann wird wenig Schwierigkeiten dabei haben, das oben geoffenbarte Verfahren auf Systeme unter Verwendung polyfunktioneller Amine und z.B. Epichlorhydrin oder Epoxygruppen enthaltender Poly-20 ester anzuwenden.

Claims (19)

1. 628 823

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zum Einkapseln eines Materials in einer semipermeablen Membran, die durch eine Grenzflächenpolymerisationsreaktion synthetisiert ist, wobei man das einzukapselnde Material in einem ersten Lösungsmittel löst, das aus Wasser, hydrophilen Lösungsmitteln und Gemischen davon gewählt ist, ein erstes Monomer in dem ersten Lösungsmittel löst, dem ersten Lösungsmittel ein hydrophobes Lösungsmittel zusetzt, in dem das erste Monomer wenig löslich ist, das dadurch erzeugte zweiphasige System emulgiert, wobei das erste Lösungsmittel die disperse Phase in der Emulsion darstellt, der Emulsion ein zweites Monomer zusetzt, das mit dem ersten Monomer ein Polymer zu bilden vermag und in dem hydrophoben Lösungsmittel sehr leicht löslich ist, so dass sich um die Bestandteile der dispersen Phase an der Grenzfläche der Phasen eine sehr permeable, makroporöse Kapselmembran bildet, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polymerisationsreaktion abbricht, indem man das hydrophobe Lösungsmittel von der Emulsion abtrennt, die Kapseln wieder in einer Flüssigkeit suspendiert, in der das zweite Monomer sehr leicht löslich ist, während das erste Monomer in dieser Flüssigkeit weniger löslich ist als in dem hydrophoben Lösungsmittel, eine zweite Portion des zweiten Monomers zu der zweiten Suspension gibt, um eine weitere Polymerisation an den Kapselmembranen herbeizuführen, so dass sie verstärkt werden und für das einzukapselnde Material undurchlässig gemacht werden, und die Polymerisation abbricht.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man dem System vor dem Emulgieren einen Emulgator zusetzt und vorzugsweise auch der Flüssigkeit einen Emulgator zusetzt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als erstes Lösungsmittel Wasser verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als hydrophobes Lösungsmittel eine Lösung von Cyclohexan und Chloroform verwendet, die vorzugsweise 80% Cyclohexan und 20% Chloroform enthält.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Flüssigkeit Cyclohexan verwendet.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Monomer ein Polyamin ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Monomer ein Disäurehalogenid ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweites Monomer Sebacoylchlorid, Terephthaloylchlorid oder Mischungen davon verwendet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Disäurehalogenid ein Disäurechlorid verwendet.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polyamin 1,6-Hexandiamin, Lysin, 4,4'-Diamino-2,2'-diphenyldisulfonsäure, 4,4'-Diamino-stilben-2,2'-disulfonsäure, 2,5-Diaminobenzolsulfonsäure, Tetraäthylenpentamin oder Mischungen davon verwendet.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Konzentration des Polyamins in dem ersten Lösungsmittel zu der Konzentration des Disäu-rechlorids in dem hydrophoben Lösungsmittel in der Grös-senordnung von 100 : 1 liegt, wobei das Verhältnis der Konzentration des Polyamins in dem ersten Lösungsmittel zu der Konzentration des Disäurechlorids in der Flüssigkeit in der zweiten Suspension vorzugsweise geringer als 60 :1 ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die verwendete Gesamtmenge des Säurechlorids in Bruchteilen in regelmässigen Zeitabständen im Verlauf der Polymerisation zugibt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert der Phase, die das einzukapselnde Material enthält, zwischen 5 und 9 hält.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als einzukapselndes Material eine labile biologische Substanz verwendet.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als biologische Substanz Hämoglobin verwendet, wie es erhältlich ist, wenn man aus roten Blutkörperchen Wasser entfernt, indem man die Blutkörperchen hypertonischer Salzlösung aussetzt, die grössenordnungsmässig 1,5 Gew.-% Salz enthält, so dass Hämoglobinkonzentrationen bis zu 30 g/dl erzielt werden können.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als biologische Substanz ein Enzym, vorzugsweise Lactatdehydrogenase, Glutamatoxaloacetat-transaminase, Urease oder ß-Glucuronidase, verwendet.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grenzflächenpolymerisationsreaktion eine Polykondensationsreaktion ist.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grenzflächenpolymerisationsreaktion eine Polyadditionsreaktion ist.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man der Emulsion ein polyfunktionelles Monomer zusetzt, das das aus dem ersten Monomer und dem zweiten Monomer gebildete Polymer zu vernetzen vermag.