KR100540212B1

KR100540212B1 - 계면활성효소, 계면활성효소 합성방법 및 고정화된 효소 제조방법

Info

Publication number: KR100540212B1
Application number: KR1020020020609A
Authority: KR
Inventors: 이무렬
Original assignee: 주식회사 엔지뱅크
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2002-04-16
Publication date: 2006-01-16
Also published as: KR20030082076A

Abstract

본 발명은 전체적으로 친수성(hydrophilic)인 효소(enzyme) 표면에 소수성(hydrophobic)인 폴리머(polymer)를 결합시켜서 양친매성(amphiphilic)인 계면활성효소(surface-active enzyme, 일명, 효소계면활성제)를 합성하고 그것들의 계면(interfacial region)으로의 흡착 및 반응 특성을 여러 분야에 응용한 것에 관한 것이다.

Description

계면활성효소, 계면활성효소 합성방법 및 고정화된 효소 제조방법{Surface-active enzyme, synthetic method thereof and producing method of supported enzyme}

도 1은 계면활성효소를 합성하는 기본적인 합성 모식도이다.

도 2는 계면활성효소 합성의 세가지 방법 개요도이다.

도 3은 역미셀 속에서 계면활성효소 합성의 모식도이다.

도 4는 수중유 에멀젼 속에서 계면활성효소 합성의 모식도이다.

도 5는 유중수 에멀젼 속에서 계면활성효소 합성의 모식도이다.

도 6은 계면활성효소에 의한 계면반응의 모식도이다.

도 7은 폴리페놀 합성 모식도이다.

도 8은 시간에 따른 폴리페놀을 가진 계면활성 퍼옥사다아제 미셀의 크기 변화를 나타내는 그래프이다(반응시간; ●0 hr, ○ 0.5 hr, ▼2.5 hr, ▽ 24 hr).

도 9는 아민기로 수식된 실리콘 기판 상에 효소를 고정시키는 방법 모식도이다.

본 발명은 친수성인 효소의 표면을 소수성 산무수물 폴리머로 부분적으로 모사하여 소수성을 부여하여 양친매성인 계면활성효소를 합성하고, 그 계면활성효소가 가진 계면활성제로서의 특성과 촉매로서의 특성을 여러 분야에 응용하는 것에 관한 것이다.

효소란 단백질의 일종으로 반응의 자유에너지를 감소시켜서 반응 속도를 증가시키는 촉매로서의 역할을 수행한다. 효소의 표면은 친수성을 띠며 주로 물속에서 기질(substrate) 간의 반응을 촉매하는데 이용되어져 왔다. 그러나 이들 효소의 표면을 모사하여 부분적으로 소수성을 부여한 다음, 모사된 효소를 계면으로 농축시켜서 촉매로 사용한 예는 아직 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 친수성인 효소의 표면을 소수성인 고분자로 모사하여 계면 농축성을 가진 계면활성효소를 합성하고, 이들의 계면 특성을 이용하여 친수성 및 소수성 기질간의 반응을 촉매하거나 분자량이 높은 고분자 물질을 합성하는데 있다.

효소는 식물, 동물, 미생물 등으로부터 얻어지는 단백질의 일종으로 기질 간의 반응 속도를 증가시키는 촉매로서의 작용을 가지고 있다. 효소는 크게 나누어 산화환원 효소(oxidoreductases), 트랜스페라아제(transferases), 가수분해효소 (hydrolases), 리아제(lyases), 아이소머라아제(isomerases), 리가아제(ligases)로 분류할 수 있으며, 위치선택성(chemoselectivity), 입체선택성(regioselectivity), 광학선택성(enantioselectivity)을 가지는 생촉매(biocatalyst)이다. 일반적으로 유기 합성에 사용되는 촉매와는 달리 효소는 상온 상압의 온화한 반응조건에서 촉매로서의 작용을 수행할 수 있다. 효소는 아미노산이 아미드 결합으로 연결된 폴리펩타이드의 일종으로 표면에 -COOH, -OH, -NH₂ 등과 같은 친수성 그룹들이 다량 존재하기 때문에 전체적으로 볼 때 친수성의 성질을 띤다. 그러므로 효소는 물에 잘 녹으며 주로 수용액 속에서 친수성 기질 간의 반응을 촉매하는데 사용되어 왔다.

최근에는 이러한 효소의 표면을 전부 계면활성제로 코팅하여 소수성으로 만들어 유기용매에 효소를 녹인 다음, 소수성 기질 간의 반응을 촉매하는 데도 이용되어 왔다. 지금까지 효소를 유기용매에 녹이기 위해서 계면활성제 이외에도 지방산, 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등이 사용되어 왔다. 특히, PEG는 미국 FDA에서 승인한 무독성 물질로서 물과 극성 유기 용매에 동시에 녹는 성질을 가지고 있다. 따라서 수용액 상에서 효소의 표면을 PEG로 수식한 다음, 동결 건조하여 극성이 강한 유기용매 속에 효소를 녹이기 위해서 주로 사용되어 왔다.

그러나 PEG 자체가 친수성이 강한 폴리머이며, 효소 표면에 존재하는 대부분의 친수성 그룹들을 모사시켜 버리기 때문에 양친매성 성질을 가지지 못해서 계면에 농축되는 계면활성효소로서의 성질을 보이지는 못했다. 특히 일반적인 고분자 계면활성제와 마찬가지의 특징을 가진 계면활성효소를 합성하는 응용 연구는 알려진 바가 없다.

본 발명의 기술적인 과제는 친수성인 효소와 소수성인 폴리머를 결합시키고, 그 모사된 효소를 효율적으로 계면에 농축시켜서 촉매로서의 작용을 가지도록 하는데 있다.

일반적으로 효소가 계면에 농축되면 표면 불활성화(surface denaturation)되어서 효소로서의 활성을 잃어버리게 되는 경우가 많다. 그러므로 효소를 계면으로 농축시킬 때 실활되는 것을 막기 위해서 적절한 폴리머를 선정하는 것이 무엇보다도 중요하다. 또한 친수성인 효소와 소수성인 폴리머를 결합시키기 위해서는 두 물질이 접촉되는 계면의 면적을 넓혀서 반응을 시킬 필요가 있다.

효소는 물에만 잘 녹고 폴리머는 유기용매에만 잘 녹기 때문에 양쪽을 원활히 접촉시키면서 반응시키기 위해서 아래와 같은 역미셀(reverse micelle), 수중유(Oil in Water; O/W) 에멀젼, 유중수(Water in Oil; W/O) 에멀젼 속에서 계면 활성 효소의 합성 반응을 진행시켰다. 먼저 역미셀법은 유기용매 속에서 계면활성제를 이용하여 역미셀을 만든 다음, 효소를 역미셀 속에 넣어서 유기용매 속의 폴리머와 반응시켰다. O/W 에멀젼법은 물에 녹지 않는 유기용매 속에 폴리머를 녹인 다음, 효소를 포함한 다량의 완충 용액과 O/W 에멀젼으로 분산을 시키면서 반응을 진행시켰다. 마지막으로 W/O 에멀젼법은 다량의 유기용매에 폴리머를 녹인 다음, 효소를 포함한 소량의 완충 용액과 W/O 에멀젼으로 분산시키면서 반응을 진행 시켰다.

각각의 반응 조건에 대해서 여러 가지 유기용매를 사용하여 효소의 활성 및 표면 모사 정도를 살펴 보았다. 그리고 효소로서 리파아제(lipase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 라이소자임(lysozyme) 등이 사용되었고, 폴리머로는 소수성 산무수물 폴리머가 바람직한데, 더욱 바람직하기로는 알킬기를 가진 폴리말레인산 무수물(polymaleic anhydride)인, PMA-TD(polymaleic anhydride-alt-1-tetradecene, C₁₄), PMA-OD(polymaleic anhydride-alt-1-octadenene, C₁₈), PMA-OL(polymaleic anhydride-alt-α-olefin, C₂₆)과 프로필렌 산화물(propylene oxide)을 가진 PPO-MA(polypropyleneoxide-maleic anhydride) 코폴리머가 각각 사용되었다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예, 시험예, 적용예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예, 시험예, 적용예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 : 계면활성 효소 합성법 >

1. 역미셀 합성법

이소옥탄(isooctane) 또는 헥산(hexane)을 용매로 하여 역미셀을 만들기 위 해서 각각 80mM의 sodium bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate(AOT), TOMAC(trioctyl methyl ammonium chloride)를 주요 계면활성제로 하여 음이온성 및 양이온성의 역미셀을 만들었으며, 보조 계면활성제(co-surfactant)로는 20mM의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트(polyoxyethylene sorbitan trioleate (Tween 85))가 사용되었다. 0.1M 인산 완충용액(pH 6)에 리파아제, 퍼옥시다아제, 라이소자임, 프로테아제(protease)를 각각 투입하여 녹인 다음에 계면활성제가 들어 있는 용매 속에 투입하여 역미셀을 형성시켰다. 다음으로 용매 속에 PMA-TD, PMA-OD, PMA-OL, PPO-MA를 각각 녹인 다음에 역미셀 용액 속에 투입하여 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 부가적으로 곁가지(side chain)를 반응시킬 필요가 있을 때에는 추가적으로 알킬 아민(alkyl amine, C₆, C₁₂, C₁₈)을 용매 속에 투입하였다. 침전물을 원심분리하여 회수하였으며, 정제를 위해서 MWCO(molecular weight cut off) 8000의 분리막이 사용되었다.

2. O/W 에멀젼 합성법

DMF(N,N-dimethyl formamide), 아세톤, 메틸아세테이트(methyl acetate), THF(tetrahydrofuran), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 피리딘, 다이에틸에테르(diethyl ether), 부틸 아세테이트(n-butyl acetate), 클로로포름, 톨루엔, 펜탄(n-pentane), 헥산(n-hexane), 헵탄(n-heptane), 이소옥탄(isooctane), 노말옥탄(n-octane) 등을 용매로 하여 PMA-TD, PMA-OD, PMA- OL, PPO-MA 등의 폴리머를 녹였다. 다음으로 효소(리파아제, 퍼옥시다아제, 라이소자임, 프로테아제 등)를 pH를 달리한 각각의 완충용액에 녹인 다음에 폴리머를 녹인 용매와 섞어서 O/W 에멀젼을 형성하면서 0℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 동결 건조하여 계면활성 효소 샘플을 얻었으며, 미반응 폴리머는 부틸 아세테이트와 헥산의 혼합용매를 넣고 교반하여 용매 추출로 제거하였다.

3. W/O 에멀젼 합성법

O/W 에멀젼 합성법에서와 마찬가지의 용매 속에 PMA-TD, PMA-OD, PMA-OL, PPO-MA 등의 폴리머를 녹인 다음 효소(리파아제, 퍼옥시다아제, 라이소자임, 프로테아제 등)가 녹아 있는 완충용액과 섞어서 W/O 에멀젼을 형성시키면서 0℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 동결 건조하여 계면활성 효소 샘플을 얻었으며 미반응 폴리머는 용매 추출을 통해서 제거시켰다.

< 시험예 1 : 계면활성효소 합성의 확인 및 효소 활성 측정 >

1. TNBS법에 의한 효소 표면의 아민기의 분석

계면활성효소가 합성되었는지 확인하기 위해서 폴리머의 모사에 의한 효소 표면의 아민기의 감소를 TNBS법으로 분석하였다. 먼저, 0.1 wt%의 TNBS(2,4,6-trinitrobenzene-1-sulfonate, sodum salt) 용액 1㎖, 0.01M Na₂SO₃ 용액 1㎖, 효소용액 1㎖, 0.05M Borax-NaOH 완충용액(pH 9.3) 4㎖를 섞은 다음 37℃에서 1시간동 안 반응시켰다. 다음으로 420nm에서 흡광도를 측정하여 효소 표면의 아민기의 양을 확인하였다. 계면활성효소의 폴리머에 의한 모사율은 모사하지 않은 효소를 대조군으로 하여 비교하여 구했다.

2. 계면 활성 퍼옥시다아제(Surface-active peroxidase)의 활성 분석

퍼옥시다아제를 폴리머와 결합시켜서 계면 활성 퍼옥시다아제를 합성한 다음, 화학적 모사에 의한 효소의 영향을 UV 분석에 의해서 확인하였다. 활성 측정을 위한 기질로는 페놀(phenol)과 AAP(4-aminoantipyrine)가 사용되었다. 먼저 20mM 페놀 1000㎕, 0.1M 인산 완충용액(pH 7) 500㎕, 48 mM 4-AAP 100㎕, 계면활성효소 용액 200㎕에 2mM H₂O₂ 200㎕를 섞었다. 반응은 25℃에서 1시간 동안 진행되었으며, 510nm에서 UV 흡광계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하여 활성을 계산하였다.

3. 계면 활성 리파아제의 활성 분석

리파아제를 폴리머와 결합시켜서 계면 활성 리파아제(surface-active lipase)를 합성한 다음, 화학적 모사에 의한 효소의 활성의 변화를 알아보기 위해서 올리브 오일의 가수분해 반응을 진행시켰다. 먼저 1g 올리브 오일을 5㎖ 인산 완충 용액(pH 6)에 분산시킨 0.1 M CaCl₂ 1㎖와 효소 용액 1㎖를 넣고 37℃에서 2시간동안 가수분해 반응을 진행시켰다. 반응 후 생성된 지방산은 0.05M KOH로 적정하여 구하였다.

4. 계면 활성 라이소자임(Surface-active lysozyme)의 활성 분석

라이소자임을 폴리머와 결합시켜서 계면 활성 라이소자임을 합성한 다음, 화학적 모사에 의한 효소의 영향을 UV 분석에 의해서 확인하였다. 활성 측정을 위해서 0.2M 아세테이트 완충용액(pH 4.6)에 각각 에틸렌 글라이콜 키틴(ethylene glycol chitin)과 라이소자임을 녹인 다음에 기질 용액과 효소 용액으로 사용하였다. 먼저 0.05% 에틸렌 글라이콜 키틴 용액 1㎖와 효소 용액 1㎖를 섞은 다음, 1시간동안 25℃에서 반응시켰다. 그 후, 0.5 g/ℓ칼슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide)와 0.5 M/ℓ탄산나트륨(sodium carbonate)을 포함한 발색 용액 2㎖를 넣고 100℃ 물 중탕에서 15분간 끓였다. 엷어진 색깔은 420nm에서 UV 흡광계로 흡광도를 측정하였으며, 이로부터 활성을 계산하였다.

합성된 계면활성효소의 효소 표면에 존재하는 아민기의 모사율은 사용된 유기 용매의 종류에 따라서 각기 달랐다. 또한 폴리머로 모사하지 않은 효소의 활성을 100%로 볼 때 약간씩 감소하는 현상을 보였다. 그러나 n-부틸 아세테이트를 유기용매로 사용하여 합성한 경우에는 원래의 효소와 거의 같은 활성을 보였다. 효소 표면의 아민기의 모사율을 볼 때 폴리머들이 효소에 공유결합된 것으로 판단되며, 계면활성효소가 원래의 효소와 별다른 활성의 차이를 보이지 않으므로 계면에서 안정하게 촉매로서 작용하고 있음을 알 수 있었다.

< 적용예 1 : 계면반응 촉매로서의 작용 >

계면활성효소에 의한 계면에서의 촉매 반응은 크게 극성 기질의 유기용매 속의 합성 반응(폴리락트산의 합성), 극성 기질의 수용액 중에서의 합성 반응(폴리페놀의 합성), 비극성 기질의 수용액 중에서의 가수분해 반응(NPB의 가수분해), 극성 기질과 비극성 기질 간의 합성 반응(에스테르 합성)으로 나누어 진행되었다.

1. 폴리락트산(polylactic acid)의 합성

유기 용매 5㎖에 계면 활성 리파아제(surface-active lipase)를 넣고 초음파 (80W)를 10분간 조사하여 잘 분산시켰다. 이 용액에 락트산(L-lactic acid)을 150 ㎕ 넣고 200rpm으로 교반하면서 일정시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 동결건조시켜서 유기 용매를 제거하였으며, THF로 생성물을 용해시켰다. 용해되지 않는 계면 활성 리파아제는 0.45㎛ 막으로 제거시켰으며, GPC로 분석하여 분자량을 확인하였다.

결과에 의하면 계면 활성 리파아제가 극성 기질인 락트산을 유기용매 속에서 좀더 비극성인 폴리락트산(polylactic acid)으로 합성할 때 좀더 높은 분자량까지 합성하는 것으로 보아 매우 유용하다는 것을 알 수 있었다.

2. 폴리페놀(polyphenol)의 합성

계면 활성 퍼옥시다아제(Surface-active peroxidase) 0.5㎖와 20 mM 페놀 2 mL, 0.1 M 인산 완충용액 (pH 7) 1㎖를 섞은 다음 2 mM H₂O₂ 0.5㎖를 첨가하였다. 반응은 25℃에서 24시간동안 진행되었으며 침전물을 분리하여 건조한 다음 HPLC로 분자량을 측정하였다.

결과에 의하면 극성 기질인 페놀이 수용액 중의 계면 활성 퍼옥시다아제 미셀 속에서 좀더 비극성인 폴리페놀로 합성될 때 퍼옥시다아제만 사용했을 때보다 높은 분자량까지 합성할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

3. NPB의 가수분해

탄소 체인의 수가 4, 8, 12개이며 비극성 기질인 NPB(p-nitrophenyl butyrate), NPC(p-nitrophenyl caprylate), NPL(p-nitrophenyl laurate)를 계면 활성 리파아제(surface-active lipase)로 가수분해하였다. 먼저 계면활성효소를 5 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8) 5㎖에 녹인 다음, 각각 아세토니트릴에 녹인 100 mM NPB, NPC, NPL을 50㎕씩 투입하였다. 반응은 30℃에서 1시간 동안 진행되었으며 400nm에서 UV 흡광계로 흡광도를 측정하였다.

결과에 의하면 비극성 기질인 NPB, NPC, NPL은 수용액 중의 계면 활성 리파아제 미셀 속에 포접되기 때문에 투명하게 녹아 들어가며, 리파아제만 사용했을 때 보다 3배 이상 높은 가수분해 반응성을 보이는 것을 알 수 있었다.

4. 에스테르 합성 반응

계면 활성 리파아제로 글리세롤과 올레인산 간에 에스테르 합성 반응을 진행시켰다. 먼저 4g 글리세롤에 0.4㎖ 인산 완충 용액 (pH 8)을 넣은 다음 각각 0.1g 올레인산과 효소 용액 0.5㎖를 넣었다. 합성 반응은 30℃에서 24시간동안 진행되었다. 반응 후 없어진 올레인산의 양은 0.05 M KOH로 적정하여 구하였다.

결과에 의하면 극성 기질인 글리세롤과 비극성 기질인 올레인산 사이에 계면 활성 리파아제가 농축되기 때문에 에스테르 합성 반응시 리파아제만 사용했을 때 보다 높은 반응 효율을 보였다.

< 적용예 2 : 고상 지지체 위로의 효소의 고정화법으로 응용 >

계면활성효소의 합성에 사용된 PMA-TD, PMA-OD, PMA-OL, PPO-MA 등의 소수성 산무수물 폴리머는 소수성 폴리머로서 물보다는 유기용매에 더 잘 녹는다. 따라서 이들을 고체면에 코팅한 다음, 여러 가지 효소들을 고정화시키는 데 응용할 수 있다.

1. PMA-TD, PMA-OD, PMA-OL, PPO-MA를 이용한 효소의 고정화

먼저 위의 폴리머들을 DMF(N,N-dimethyl formamide), 아세톤, 메틸아세테이트(methyl acetate), THF(tetrahydrofuran), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 피리딘, 다이에틸에테르(diethyl ether), 부틸 아세테이트(n-butyl acetate), 클로로포름, 톨루엔, 펜탄(n-pentane), 헥산(n-hexane), 헵탄(n-heptane), 이소옥탄(isooctane), 노말옥탄(n-octane) 등과 같은 유기 용매에 녹인 다음 유리, 실리콘, 플라스틱과 같은 고체 면에 스핀 코팅하여 균일한 고분자 박막을 형성시켰다. 유기용매의 제거를 위한 건조 과정은 80℃에서 1시간 또는 진공 용기 안에서 2시간동안 진행되었다. 다음으로 효소(리파아제, 퍼옥시다아제, 라이소자임, 프로테아제 등)가 녹아 있는 완충용액 속에 폴리머를 코팅한 시료를 담궈서 100rpm으로 교반하면서 0℃에서 12시간 동안 반응시켜 효소를 시료 표면에 고정화시켰다.

결과에 의하면, 아민기로 수식된 실리콘 기판인 경우에는 건조과정을 통해서 폴리머들이 단단하게 화학적으로 결합되며 관능기인 산 무수물(acid anhydride)들이 바깥쪽으로 배향됨을 알 수 있었다. 그리고 5% PMA-OL로 코팅한 가로, 세로 각각 1cm인 실리콘 기판의 표면에 고정화되는 퍼옥시다아제의 양은 약 6㎍ 정도로 균일하게 고정화되었다. 또한 효소의 활성도 80% 이상으로 매우 높게 나타났다.

본 발명에서는 효소의 표면을 폴리머로 모사하여 계면활성을 가진 효소를 합성하였으며, 그들을 이용하여 계면에서의 여러 가지 반응을 살펴보았다. 또한 이러한 반응 특성을 이용하여 상품성이 우수한 제품을 만들 수 있었다.

또한, 본 발명의 계면활성효소를 이용하여 극성 기질의 유기용매 속의 합성 반응, 극성 기질의 수용액 중에서의 합성 반응, 비극성 기질의 수용액 중에서의 가수분해 반응, 극성 기질과 비극성 기질 간의 합성 반응시의 촉매로 응용할 수 있다.

Claims

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효소를 수용액상에 용해시키고, PMA-TD(polymaleic anhydride-alt-1-tetradecene), PMA-OD(polymaleic anhydride-alt-1-octadenene), PMA-OL(polymaleic anhydride-alt-α-olefin) 및 PPO-MA(polypropyleneoxide-maleic anhydride) 코폴리머로 이루어지는 그룹 중 선택된 소수성 산무수물 폴리머을 유기용매에 용해시켜 역미셀법, O/W 에멀젼법 또는 W/O 에멀젼법으로 효소의 아민기에 상기 소수성 산무수물 폴리머를 반응시켜 계면활성효소를 합성하는 방법.
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효소 표면의 아민기가 PMA-TD(polymaleic anhydride-alt-1-tetradecene), PMA-OD(polymaleic anhydride-alt-1-octadenene), PMA-OL(polymaleic anhydride-alt-α-olefin) 및 PPO-MA(polypropyleneoxide-maleic anhydride) 코폴리머로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 소수성 산무수물 폴리머에 결합된 것을 특징으로 하는 계면활성효소.
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아민기를 갖는 유리, 실리콘 또는 플라스틱 중 선택된 고상지지체에 PMA-TD(polymaleic anhydride-alt-1-tetradecene), PMA-OD(polymaleic anhydride-alt-1-octadenene), PMA-OL(polymaleic anhydride-alt-α-olefin) 및 PPO-MA(polypropyleneoxide-maleic anhydride) 코폴리머로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 소수성 산무수물 폴리머를 코팅하고 효소의 아민기를 결합시키는 것을 특징으로 하는 효소의 고정화 방법.