CN115298320A - 蛋白质的交联方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的技术问题在于提供一种新型的蛋白质交联方法。通过使漆酶等氧化还原酶和蛋白质谷氨酰胺酶等蛋白质脱酰胺酶这两者作用于底物蛋白质，从而促进交联反应。

Description

蛋白质的交联方法
技术领域
本发明涉及使用酶的蛋白质的新型交联方法。详细而言，涉及并用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶的蛋白质的交联方法。
背景技术
作为具有通过交联反应而使蛋白质高分子化的可能性的酶，以往，已知有：转谷氨酰胺酶、赖氨酰氧化酶、蛋白质二硫键异构酶、蛋白质二硫键还原酶、巯基氧化酶、脂质氧合酶、多酚氧化酶(酪氨酸酶)、过氧化物酶等(例如参照非专利文献1)。
对于上述酶中的转谷氨酰胺酶而言，利用其的蛋白质交联法被人们所熟知。众所周知，由于发现了来源于微生物的转谷氨酰胺酶价格低廉，并且在反应中不需要存在钙，从而其以食品加工领域为中心被广泛利用(参照专利文献1、非专利文献2)。
但是，基于转谷氨酰胺酶的蛋白质交联反应存在以下问题点。即，转谷氨酰胺酶是蛋白质中的谷氨酰胺残基的γ-羧基与赖氨酸残基的ε-氨基之间发生的酰基转移反应，从而在蛋白质分子内或者分子间形成交联结构的酶，因此根据蛋白质种类，存在由于谷氨酰胺残基或赖氨酸残基的不足而难以成为底物的蛋白质。例如，白蛋白类的蛋白质在天然的状态下不能够成为转谷氨酰胺酶的底物。
这样，以往，作为基于酶的蛋白质的交联法，指出了使用多种酶的可能性，但几乎没有满足供给量、成本、易纯化等的实用性的方法，即使在唯一的可以称为基于来源于微生物的转谷氨酰胺酶的方法中，也根据蛋白质的种类而无法发生交联反应，其用途受到限制。
对此，提出了与转谷氨酰胺酶的反应机理完全不同的基于含有漆酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、纤维素酶等多铜氧化酶的蛋白质的交联法的方案，扩大了在基于转谷氨酰胺酶的蛋白质交联法中受到限制的作为对象的蛋白质的范围，另外，使得具有新的物性、性质的蛋白质凝胶化物的制备方法成为可能(参考专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平6-65280号公报
专利文献2：日本特开平11-276162号公报
非专利文献
非专利文献1：Matheisand Whitaker,J.Food Biochemistry 11,309-327,1987
非专利文献2：日本农艺化学会志69卷10号1301-1308页
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，在如上所述的基于多铜氧化酶的蛋白质的交联法中，由于多铜氧化酶对蛋白质的反应性低，因此存在需要大量的酶、需要长时间的反应时间等问题。
用于解决技术问题的手段
本发明人为了解决上述技术问题进行了深入研究，结果新发现了通过并用对蛋白质进行脱酰胺的酶，使得基于多铜氧化酶等氧化还原酶的蛋白质的交联反应显著提高，从而完成了以下所示的本发明。
[1]一种蛋白质交联方法，其特征在于，使氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质。
[2]根据[1]所述的蛋白质交联方法，其中，氧化还原酶为多铜氧化酶。
[3]根据[2]所述的蛋白质交联方法，其中，多铜氧化酶为漆酶和/或胆红素氧化酶。
[4]根据[2]所述的蛋白质交联方法，其中，多铜氧化酶为漆酶。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的蛋白质交联方法，其中，蛋白质脱酰胺酶是作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基的酶。
[6]根据[5]所述的蛋白质交联方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
[7]一种蛋白质改良剂，其含有氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶。
[8]根据[7]所述的蛋白质改良剂，其中，氧化还原酶为多铜氧化酶。
[9]根据[8]所述的蛋白质改良剂，其中，多铜氧化酶为漆酶和/或胆红素氧化酶。
[10]根据[8]所述的蛋白质改良剂，其中，多铜氧化酶为漆酶。
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶是作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基的酶。
[12]根据[11]所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
[13]一种交联化蛋白质的制备方法，其包括以下工序：
(1)用蛋白质脱酰胺酶处理蛋白质的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理经蛋白质脱酰胺化的蛋白质的工序。
[14]一种交联化蛋白质的制备方法，包括以下工序：
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的蛋白质的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理准备好的蛋白质的工序。
[15]一种交联化蛋白质的制备方法，其包括用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶同时处理蛋白质的工序。
[16]一种食品或药品的制备方法，其包括以下工序：
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的包含蛋白质的食品原料或制药原料的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理准备好的食品原料或制药原料的工序。
[17]一种食品或药品的制备方法，其包括用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶同时处理包含蛋白质的食品原料或制药原料的工序。
附图说明
图1是表示试验例1中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图2是表示试验例2中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图3是表示试验例3中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图4是表示试验例5中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图5是表示试验例6中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图6是表示试验例7中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图7是表示试验例8中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳图谱的图。
图8是表示试验例9中的粘度变化的曲线图。
具体实施方式
1.蛋白质的交联方法
本发明的交联方法的特征在于，使氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质。本发明中所称的氧化还原酶是指通过氧化还原反应交联蛋白质的酶，没有特别限定，例如可以列举以下的酶。
(1)通过氧化蛋白质中的赖氨酸的ε-氨基而产生高反应性的醛，并与其他蛋白质分子的氨基形成席夫碱来交联蛋白质的酶(例如赖氨酰氧化酶)。
(2)通过氧化蛋白质中的半胱氨酸的巯基，并与其他蛋白质分子形成二硫键来交联蛋白质的酶(例如巯基氧化酶)。
(3)通过氧化蛋白质中酪氨酸的羟基而产生高反应性的邻醌，并与其他蛋白质分子的醌或氨基或巯基反应来交联蛋白质的酶(例如酪氨酸酶)。
(4)具有广泛的底物特异性，主要也作用于蛋白质中酪氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基和赖氨酸的ε-氨基，并通过上述(1)至(3)中的任一种机制来交联蛋白质的酶(例如以漆酶为例的多铜氧化酶)。
(5)虽然催化与(4)相同的反应，但在氧化反应中需要过氧化氢作为氧供体的酶(例如过氧化物酶)。
在此，多铜氧化酶是指分子内含有多个铜原子，利用分子氧来氧化多酚、甲氧基苯酚、二胺、胆红素、抗坏血酸等的一组酶。目前已知所含的铜原子数通常为2～8个，但该数字根据分析时的酶制剂的状态、分析方法而存在偏差，因此并不特别限定于此。作为分类为多铜氧化酶的酶，例如，可举出漆酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶和纤维素酶等。
漆酶([EC1.10.3.2])是多铜蛋白质的一种，是邻苯二酚(quinol)、对苯二酚(quinol)或者也经常作用于氨基苯酚或苯二胺中的具有低底物特异性的酶。产生的半醌进一步进行酶反应或非酶反应。作为这样的漆酶的例子，具有来源于漆等植物、或细菌或真菌(Fungi)等微生物的漆酶，作为来源于微生物的漆酶，例如，可举出：来源于Aspergillus、Neurospora、Podospora、Botrytis、Collybia、Fomes、Lentinus、Pleurotus、Pycnoporus、Pyricularia、Trametes、Rhizoctonia、Rigidoporus、Coprinus、Psatyrella、Myceliophtera、Schtalidium、Polyporus、Phlebia、Coriolus属的酶。
胆红素氧化酶(EC1.3.3.5)是多铜蛋白质的一种，主要是作用于胆红素的酶，作为这样的胆红素氧化酶的例子，例如，可举出：来源于Penicillium、Myrothecium、Trachyderma属的酶。
抗坏血酸氧化酶(EC1.10.3.3)是多铜蛋白质的一种，是主要作用于L-抗坏血酸的酶，具有来源于黄瓜、南瓜、西葫芦等植物、细菌或真菌(Fungi)等微生物的酶。
纤维素酶(EC1.16.3.1)是多铜蛋白质的一种，是具有维持生物体中的铜的恒定性、氧化酶活性、胺氧化酶活性的多功能蛋白质，并存在于动物或鸟类的血清中。
本发明所称的蛋白质脱酰胺酶是指催化从蛋白质中游离氨的反应的酶，具体而言，可举出：将蛋白质中的谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基的酶(即蛋白质谷氨酰胺酶)、将天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基的酶(即蛋白质天冬酰胺酶)、以及将蛋白质中的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基的蛋白质脱酰胺酶。作为对蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺的酶，已知例如来源于Chryseobacteriumproteolyticum的蛋白质谷氨酰胺酶(EurJBiochem,268(5),1410,2001,Protein-glutaminase From Chryseobacterium Proteolyticum,anEnzyme That Deamidates Glutaminyl Residuesin Proteins.Purification,Characterization and Gene Cloning,SYamaguchi1,DJJeenes,DBArcher或FrontMicrobiol,9,1975,2018,Complete Genome Sequence and Characterization of aProtein-Glutaminase Producing Strain,Chryseobacterium proteolyticum QSH1265,RuidanQu,XiaoyuZhu,MinTian，YingjieLiu,WenjuanYan,JianYe,HongliangGao,JingHuang)，但不限于此。对于对蛋白质中的天冬酰胺残基进行脱酰胺的酶，可举出：例如WO2015/133590中公开的蛋白质天冬酰胺酶，但不限于此。作为对蛋白质中的精氨酸残基进行脱酰胺化的酶，已知有例如来源于Fusarium graminearum的精氨酸脱亚氨酶。
一般而言，对蛋白质中的谷氨酰胺残基和/或天冬酰胺残基进行脱酰胺化而生成羧基，当蛋白质的负电荷增加，和/或，蛋白质中强碱性的精氨酸残基脱酰胺化而中性化时，其结果是等电点降低，水合力增加。进一步地，由于静电排斥力的增加导致蛋白质之间的相互作用减少，即缔合性降低。这些变化大幅增加了蛋白质的可溶性和水分散性。另外，蛋白质的负电荷的增加使蛋白质的折叠展开，改变了高阶结构，并使埋在分子内部的疏水区暴露在分子表面。因此，脱酰胺化蛋白质具有两亲性而成为理想的表面活性剂，并大幅提高蛋白质的乳化力、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性。这样，蛋白质的脱酰胺化带来蛋白质各种功能特性的改善，显著增加了该蛋白质的用途(例如，Molecular ApproachestoImproving Food Quality and Safety,D.Chatnagar and T.E.Clevel and,eds.,VanNostr and Reinhold,NewYork,1992,p.37)。另外，当对蛋白质中的精氨酸残基进行脱酰胺化时，也使蛋白质的疏水性增加，并使蛋白质的高阶结构发生改变。
因此，并不是拘泥于理论，本发明人新发现了“通过蛋白质脱酰胺酶的作用来促进基于氧化还原酶的蛋白质的交联反应的现象”(参照后述的实施例)。由于蛋白质脱酰胺酶的作用而使蛋白质的折叠展开，高阶结构改变，该结果能够说明：通过将埋在蛋白质的分子内部的以酪氨酸为例的半胱氨酸和赖氨酸等成为氧化还原酶的目标的氨基酸残基暴露在蛋白质的分子表面，使其更容易受到氧化还原酶的作用。
接下来，将更详细地说明本发明中的蛋白质的交联方法。本发明中能够利用的氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶的种类或来源等没有特别限定。关于来源，例如来源于动物、来源于植物或来源于微生物。另外，在来源于微生物的酶的情况下，酶可以是在微生物的菌体内部、菌体外的任一种中蓄积的酶。进一步地，不仅可以使用自然界存在的酶，还可以是通过基因工程方法、细胞工程方法生产的酶。另外，也可以是通过蛋白质工程方法修饰的酶蛋白质。进一步地，虽然优选使用纯化的高纯度的氧化还原酶(例如多铜氧化酶)和蛋白质脱酰胺酶(例如蛋白质谷氨酰胺酶)，但只要能够进行所需的反应，其纯度就没有限制。另外，也可以使用酶制剂作为氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶，在该情况下的酶制剂中，作为酶的稳定剂，可以添加各种盐类、糖类、蛋白质、脂质、表面活性剂等。
本发明的交联方法能够适用于期待交联化的各种蛋白质。作为氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶的底物的蛋白质的起源、性状等没有特别的限制。例如，如果是植物蛋白，则作为其例子，可以举出：来源于大豆(Soybeans)、豌豆(Greenpeas)、小扁豆(Lentils)、鹰嘴豆(Chickpeas)、黑豆(Blackbeans)等豆类的蛋白质，来源于小麦、大麦、燕麦(Oat)、稻米等谷类的蛋白质，来源于杏仁、花生等坚果的蛋白质，来源于大麻种子(Hemp)、奇亚籽种子(Chia)、藜麦(Quinoa)、苋菜(Amaranthus)等种子类的蛋白质。另外，还能够使用来源于蟋蟀等昆虫蛋白质、酵母、丝状菌、被称为蘑菇的菌类的蛋白质、以及来源于螺旋藻等藻类的蛋白质。如果是动物蛋白，则可举出：酪蛋白，β-乳球蛋白等乳蛋白、卵白蛋白等卵蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等肉蛋白、血清白蛋白等血液蛋白、明胶、胶原等肌腱蛋白质。另外，还能够使用基于酸、碱等的化学部分分解蛋白质、基于蛋白酶等的部分酶解的蛋白质、基于各种试剂的化学修饰蛋白质、或者合成肽等作为底物蛋白质。
以上那样的底物蛋白质虽然以包含在溶液、浆料或糊剂等流动性组合物中的状态供于反应，但对流动性组合物中的底物蛋白质的浓度没有特别限定，根据目标蛋白质交联物所期待的性质、状态确定浓度即可。一般而言，如果是低浓度，则可以得到粘性增加的溶液或沉淀物，如果是高浓度，则可以得到凝胶状物，但如果底物蛋白质浓度为1重量％以上，则能够充分得到凝胶化物。另外，作为含有底物蛋白质的流动性组合物，不限于蛋白质的水溶液、水分散液或水分散糊剂的方式的流动性组合物，也可以将这些和油脂构成的乳液的形态的流动性组合物供于反应，另外，也可以在含有底物蛋白质的流动性组合物中，根据需要添加盐类、糖类、蛋白质、香料、保湿剂、着色剂等。
所使用的酶量、反应时间、温度、反应溶液的pH等也没有特别限定。通常，酶量相对于1g蛋白质而言，氧化还原酶为1～1000000U，优选为10～500000U，更优选为100～200000U，蛋白质脱酰胺酶为0.01～100000U，优选为0.1～50000U，更优选为1～10000U。反应温度为5～80℃，优选为20～60℃。反应溶液的pH为2～10，优选为4～8。反应时间为10秒～48小时，优选为10分钟～24小时。通过以上的反应条件，能够得到蛋白质高分子化的交联物或流动性组合物的凝胶状物。这些反应条件可以根据作为目标的蛋白质交联物或流动性组合物的凝胶状物的物性、水分含量而适当选择。另外，最佳的反应条件通过预备实验决定即可。
使用多铜氧化酶作为氧化还原酶时，作为促进反应的中介(介体)，可以添加各种多酚，例如，氢醌(Hydroquinone)、儿茶酚(Catechol)、愈创木酚(Guaiacol)、阿魏酸(Ferulic acid)、香草酸(Vanillic acid)、对香豆酸(p-Coumaric acid)、丁香醛(Syringaldehyde)、对苯二胺(p-Phenylenediamine)等。
在本发明的蛋白质的交联方法中，用蛋白质交联用酶，即氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶来处理底物蛋白质。使酶作用的顺序(即氧化还原酶的处理和蛋白质脱酰胺酶的处理的顺序)没有特别限定，优选用两种酶同时处理，或用蛋白质脱酰胺酶处理后用氧化还原酶处理。为了提高作业效率等的目的出发，更优选同时处理。在用蛋白质脱酰胺酶处理后用氧化还原酶处理的情况下，也可以在蛋白质脱酰胺酶处理后增加使蛋白质脱酰胺酶失活的工序。通过增加失活工序，能够调整蛋白质脱酰胺化量。
2.交联化蛋白质，或包含交联化蛋白质的食品或药品的制备方法
通过使用本发明的交联方法，能够制备交联化蛋白质或包含其的食品或药品。交联化蛋白质的制备方法的一个方式包括以下的工序(1)和(2)。此外，也可以在工序(1)之后增加蛋白质脱酰胺酶的失活工序。
(1)用蛋白质脱酰胺酶处理蛋白质的工序
(2)用氧化还原酶处理经蛋白质脱酰胺化的蛋白质的工序
在另一方式中，进行以下的工序(1)和(2)。
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的蛋白质的工序
(2)用氧化还原酶处理准备好的蛋白质的工序
在另一方式中，通过以下工序(i)制备交联化蛋白。
(i)用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶同时处理蛋白质的工序
另一方面，食品或医药的制备方法的一个方式包括以下的(1)和(2)。
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的包含蛋白质的食品原料或制药原料的工序
(2)用氧化还原酶处理准备好的食品原料或制药原料的工序
在另一方式中，通过以下的工序(i)制备食品或药品。
(i)用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶同时处理包含蛋白质的食品原料或制药原料的工序
3.蛋白质改良剂
本发明还提供能够使用于蛋白质的交联化的蛋白质改良剂。本发明的蛋白质改良剂典型地用于本发明的交联方法或制备方法。本发明的蛋白质改良剂作为有效成分含有作为蛋白质交联用酶的氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶。本发明的蛋白质改良剂能够用作蛋白质交联剂，优选用作包含蛋白质的流动性组合物的增稠剂，更优选用作含蛋白质的流动性组合物的凝胶化剂。氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶的详细情况如上述(1.蛋白质的交联方法一栏)，因此省略其说明。
以下，使用实施例进一步说明本发明。
实施例
在以下的实施例中，漆酶的酶活性测定只要没有特别说明，就以2,2'-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(6)](ABTS、Boehringer Ingelheim社制造)为底物，按照以下记载的方法进行。
<活性测定法>
将ABTS以1.0mg/mL的浓度溶解于25mM柠檬酸缓冲液(pH3.2)中作为底物液。将该3.0mL的底物液放入试管中，在25℃下预热后，添加0.1mL的酶液，搅拌，在25℃下培养，测定1分钟后和3分钟后的405nm的吸光度。将在该条件下在1分钟内使405nm的吸光度增加1.0OD的酶量定义为1单位。
另一方面，蛋白质谷氨酰胺酶的酶活性测定只要没有特别说明，以Z-Gln-Gly为底物，按照以下记载的方法进行。
<活性测定法>
在100μL的含有10mmol/L的Z-Gln-Gly的176mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)中添加10μL的酶溶液，在37℃下培养60分钟后，加入100μL的12％三氯乙酸溶液来停止反应。离心分离(15000rpm、4℃、5分钟)后，如下所述使用F-kitammonia(Boehringer Ingelheim社制造)对上清进行测定(A1)。另外，使用水代替酶溶液，以同样的方式进行测定(A2)。在100μL的F-kitammonia试剂2中加入10μL的上清和190μL的水，在室温下放置5分钟后，使用100μL测定340nm的吸光度(E1)。在剩下的200μL中加入1.0μL的试剂3(谷氨酸脱氢酶)后，再在室温下放置20分钟后，测定剩下的200μL的340nm的吸光度(E2)。以在上述条件下每1分钟游离1μmol的氨的酶量为1单位，按照下式求出。
u/mL＝1.76×[A1(E1-E2)-A2(E1-E2)]
<试验例1>
通过使用来源于鸡蛋的白蛋白(富士胶片和光纯药株式会社制造)的方法，研究基于并用漆酶(LC)和蛋白质谷氨酰胺酶(PG)的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的来源于鸡蛋的白蛋白、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。
结果示于图1和表1。
[表1]
Figure BDA0003842922160000111
如图1所示，在单独使用漆酶时，底物蛋白质交联高分子化未发生。与此相对，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时，能够在泳道3的最上部确认到高分子化至不能够通过聚丙烯酰胺凝胶的网眼的蛋白质的条带，确认了底物蛋白质的交联高分子化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了来源于鸡蛋的白蛋白蛋白质的交联的促进效果。
<试验例2>
通过使用LYZAMINE-S(豌豆蛋白质、ROCKET JAPAN制造)的方法，研究基于并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的LYZAMINE-S、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。
结果示于图2和表2。
[表2]
Figure BDA0003842922160000121
如图2所示，在单独使用漆酶时，底物蛋白质交联高分子化未发生。与此相对，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时，能够确认到高分子化至不能够通过聚丙烯酰胺凝胶的网眼的蛋白质的条带(能够在泳道3的最上部确认的条带)更浓，确认了底物蛋白质的交联高分子化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了豌豆蛋白质的交联的促进效果。
<试验例3>
通过使用来源于大豆的蛋白粉末(富士胶片和光纯药株式会社制造)的方法，研究基于并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的来源于大豆的蛋白粉末、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用同浓度的漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。另外，在将酶添加量(漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶)均减至1/10、1/100的条件下也进行同样的反应。
结果示于图3和表3。
[表3]
Figure BDA0003842922160000131
如图3所示，与单独使用漆酶时相比，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，都能够确认到高分子化至不能够通过聚丙烯酰胺凝胶的网眼的蛋白质的条带(能够在各泳道(泳道5～7)的最上部确认的条带)更浓，确认了交联高分子化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了来源于大豆的蛋白质的交联的促进效果。
<试验例4>
通过使用来源于鸡蛋的白蛋白(富士胶片和光纯药株式会社制造)的方法，研究基于并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的来源于鸡蛋的白蛋白、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时而进行。然后，加入漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。
结果示于表4。
[表4]
泳道 添加酶 交联化
1 未添加酶 无
2 PG→LC 有
另外，在电泳图像中，即使在蛋白质谷氨酰胺酶处理后进行漆酶处理，也能够在泳道2的最上部确认到高分子化至不能够通过聚丙烯酰胺凝胶的网眼的蛋白质的条带，确认了底物蛋白质的交联高分子化。在由单独使用试验例1的漆酶进行处理的时与本试验例的蛋白质谷氨酰胺酶处理后进行漆酶处理时的对比可知，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，无论这些酶的添加顺序如何，均确认到来自鸡蛋的白蛋白蛋白质的交联的促进效果。
<试验例5>
通过使用来源于杏仁的蛋白粉末的方法，研究基于并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的来源于来源于杏仁的蛋白粉末、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。另外，在共同稀释酶添加量(漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶)的条件下也进行同样的反应。
结果示于图4和表5。
[表5]
Figure BDA0003842922160000141
Figure BDA0003842922160000151
如图4所示，与单独使用漆酶时相比，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，均能够新确认到高分子化至约200kDa以上的蛋白质的存在，确认了交联高分子化。(泳道5～7)。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了来源于杏仁的蛋白质的交联的促进效果。
<试验例6>
通过使用来源于鹰嘴豆的蛋白粉末的方法，研究基于并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的来源于鹰嘴豆的蛋白粉末、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，漆酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。另外，在共同稀释酶添加量(漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶)的条件下也进行同样的反应。
结果示于图5和表6。
[表6]
Figure BDA0003842922160000152
如图5所示，与单独使用漆酶时相比，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，都能够确认到高分子化至不能够通过聚丙烯酰胺凝胶的网眼的蛋白质的条带(能够在各泳道(泳道5～7)的最上部确认的条带)更浓，确认了交联高分子化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了来源于鹰嘴豆的蛋白质的交联的促进效果。
<试验例7>
通过使用酪蛋白(Merck Millipore)的方法，研究基于并用胆红素氧化酶(BO)和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的蛋白、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、胆红素氧化酶(制品名：BO”Amano”3、天野Enzyme株式会社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用同浓度的胆红素氧化酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，胆红素氧化酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。另外，在共同稀释酶添加量(胆红素氧化酶和蛋白质谷氨酰胺酶)的条件下也进行同样的反应。
结果示于图6和表7。
[表7]
Figure BDA0003842922160000161
如图6所示，与单独使用胆红素氧化酶时相比，在并用胆红素氧化酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，都能够确认到高分子化的蛋白质的条带比各泳道(泳道5～7)的上部更浓，确认了交联高分子化。即，通过在胆红素氧化酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了酪蛋白蛋白质的交联的促进效果。
<试验例8>
通过使用酪蛋白(Merck Millipore)的方法，研究基于并用酪氨酸酶(TyrA)和蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质交联的促进效果。将5重量％(最终浓度)的蛋白、50mM(最终浓度)钾钠磷酸缓冲液(pH7.0)、酪氨酸酶(TyrA)(制品名：酪氨酸酶from mushroom、Merck社制造)以及蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)混合后，在40℃下用以160rpm振荡24小时使其反应。反应结束后，分取反应液的一部分，供于2～25％聚丙烯酰胺电泳，观察底物蛋白质的分子量增加，判定交联化和以单独使用同浓度的酪氨酸酶时为基准的交联促进效果。酶添加量为每1mg底物蛋白质，酪氨酸酶(最终浓度)为100U，蛋白质谷氨酰胺酶(最终浓度)为500mU。另外，在共同稀释酶添加量(酪氨酸酶和蛋白质谷氨酰胺酶)的条件下也进行同样的反应。
结果示于图7和表8。
[表8]
Figure BDA0003842922160000171
如图7所示，与单独使用酪氨酸酶时相比，在并用酪氨酸酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，都能够确认到高分子化的蛋白质的条带比各泳道(泳道5～6)的上部更浓，和/或能够在各泳道(泳道6～7)的最上部新确认到高分子化的蛋白质的条带，确认了交联高分子化。即，通过在酪氨酸酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了酪蛋白蛋白质的交联的促进效果。
<试验例9>
(酪蛋白溶液和小麦麸质溶液的粘度提高效果的确认)
将包括5％(w/v)酪蛋白溶液或小麦麸质溶液、100mU/mL的蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)、50U/mL的漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)、100mM磷酸缓冲液(pH7.0)的混合物在40℃下处理，通过EMS-1000(京都电子制造株式会社、东京、日本)测定各时间处的粘度。测定时的剪切速度为200s-1，为了维持流动状态，进行30秒的预备测定。在测定中，也将未添加酶的酪蛋白溶液、漆酶(50U/mL)处理和蛋白质谷氨酰胺酶(100mU/mL)处理的酪蛋白溶液作为对照进行测定。
结果示于图8。未添加酶的酪蛋白(或麸质)溶液、单独添加漆酶的酪蛋白(或麸质)溶液、单独添加蛋白质谷氨酰胺酶的酪蛋白(或麸质)溶液的粘度在测定中没有变动。另一方面，在并用了漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的酪蛋白溶液中，浓度依存于反应时间而上升。
另外，在电泳图像中，与单独使用漆酶时相比，在并用漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶时提高了底物蛋白质的交联高分子化的效率，无论是哪种酶浓度，均能够新确认到高分子化至约200kDa以上的蛋白质的存在，确认了交联高分子化。
即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了酪蛋白蛋白质和小麦麸质蛋白质的交联的促进效果。
(酪蛋白溶液的凝胶化研究)
<试验例10>
将包括5％(w/v)酪蛋白溶液、100mU/mL的蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)、50U/mL的漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)、100mM磷酸缓冲液(pH7.0)的混合物加入试管中，在40℃处理24小时后，倾斜试管，确认有无凝胶化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。
结果示于表9。
[表9]
Figure BDA0003842922160000191
如表9所示，未添加酶的酪蛋白溶液、单独添加漆酶的酪蛋白溶液、单独添加蛋白质谷氨酰胺酶的酪蛋白溶液的性状没有变化。另一方面，仅并用了漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的酪蛋白溶液凝胶化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了酪蛋白的交联的促进效果。
(牛奶的凝胶化研究)
<试验例11>
将添加了市售的牛奶、100mU/mL的蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500，天野Enzyme株式会社制造)、50U/mL的漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)、100mM磷酸缓冲液(pH7.0)的混合物加入试管中，在40℃处理24小时后，倾斜试管，确认有无凝胶化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。
结果示于表10。
[表10]
Figure BDA0003842922160000192
如表10所示，未添加酶的牛奶、单独添加漆酶的牛奶、单独添加蛋白质谷氨酰胺酶的牛奶的性状没有变化。另一方面，仅并用了漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的牛奶凝胶化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了乳蛋白质的交联的促进效果。
(小麦麸质的凝胶化研究)
<试验例12>
将包括5％(w/v)小麦麸质溶液、100mU/mL的蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、天野Enzyme株式会社制造)、50U/mL的漆酶(制品名：漆酶Y120、天野Enzyme株式会社制造)、100mM磷酸缓冲液(pH7.0)的混合物加入试管中，在40℃处理24小时后，倾斜试管，确认有无凝胶化和以单独使用漆酶时为基准的交联促进效果。
结果示于表11。
[表11]
Figure BDA0003842922160000201
如表11所示，未添加酶的小麦麸质溶液、单独添加漆酶的小麦麸质溶液、单独添加蛋白质谷氨酰胺酶的小麦麸质溶液的性状没有变化。另一方面，仅并用了漆酶和蛋白质谷氨酰胺酶的小麦麸质溶液凝胶化。即，通过在漆酶中并用蛋白质谷氨酰胺酶，确认了小麦麸质溶液蛋白质的交联的促进效果。
产业上的可利用性
根据本发明的基于酶的蛋白质的交联法，能够大幅促进迄今为止由于反应性低而难以实用化的基于氧化还原酶的蛋白质的交联反应。根据本发明制造的交联、高分子化或凝胶化的蛋白质材料，可应用于例如鱼肉泥、鱼糕、鱼肉/畜肉香肠、豆腐、面食、制糕点/制面包、食品粘合剂、肉片状食品、酸奶、果冻、奶酪、植物原料的替代肉、替代乳制品(替代奶酪、替代乳发酵食品)等食品的加工领域。此外，作为一种新型来源于蛋白质的材料，推测其在包括化妆品、医疗产品、微胶囊材料和固定化酶等的载体等广泛行业中得到应用。由于基于氧化还原酶的交联化的反应机理被认为与经常用于蛋白质的交联化的转谷氨酰胺酶不同，因此也能够期待本发明在制造具有新品质的蛋白质高分子化物或凝胶状物中的使用和应用。
本发明不限于上述发明的实施方式和实施例的说明。本发明还包括在不脱离权利要求书的记载且本领域技术人员容易想到的范围内的各种变形方式。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容，通过援引的方式引用其全部内容。

Claims (17)

1.一种蛋白质交联方法，其特征在于，使氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质交联方法，其中，氧化还原酶为多铜氧化酶。
3.根据权利要求2所述的蛋白质交联方法，其中，多铜氧化酶为漆酶和/或胆红素氧化酶。
4.根据权利要求2所述的蛋白质交联方法，其中，多铜氧化酶为漆酶。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质交联方法，其中，蛋白质脱酰胺酶是作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基的酶。
6.根据权利要求5所述的蛋白质交联方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
7.一种蛋白质改良剂，其含有氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶。
8.根据权利要求7所述的蛋白质改良剂，其中，氧化还原酶为多铜氧化酶。
9.根据权利要求8所述的蛋白质改良剂，其中，多铜氧化酶为漆酶和/或胆红素氧化酶。
10.根据权利要求8所述的蛋白质改良剂，其中，多铜氧化酶为漆酶。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶是作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基的酶。
12.根据权利要求11所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
13.一种交联化蛋白质的制备方法，其包括以下工序：
(1)用蛋白质脱酰胺酶处理蛋白质的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理经蛋白质脱酰胺化的蛋白质的工序。
14.一种交联化蛋白质的制备方法，包括以下工序：
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的蛋白质的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理准备好的蛋白质的工序。
15.一种交联化蛋白质的制备方法，其包括同时用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶处理蛋白质的工序。
16.一种食品或医药品的制备方法，其包括以下工序：
(1)准备用蛋白质脱酰胺酶处理过的包含蛋白质的食品原料或医药原料的工序；以及
(2)用氧化还原酶处理准备好的食品原料或医药原料的工序。
17.一种食品或医药品的制备方法，其包括同时用氧化还原酶和蛋白质脱酰胺酶处理包含蛋白质的食品原料或医药原料的工序。
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