Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Antibiotika S 74811F-1 (Formel I)
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und S 7481/F-2 und Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 74811F-2, indem man einen Stamm der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum auf oder in einem Nährmedium züchtet, die neuen Antibiotika S 7481/F1 und S 7481/F-2 aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive undloder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum wurde aus einer im Staate Wisconsin, USA gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, all., USA unter der Nummer NRRL 5760 deponiert.
Der neue Stamm NRRL 5760 der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum wächst auf Malzextrakt-Agar bei Temperaturen zwischen 18 und 36 , vorzugsweise bei 27". Die Oberfläche der gewachsenen Kolonien ist bleich braungelb gefärbt, in honigfarben bis braun übergehend. Das gebildete Luftmycel ist weiss und spärlich. Die Rückseite zeigt ein bleiches Weinrot und die Färbung geht mit der Zeit in ein rötliches Braun über. Der Stamm NRRL 5760 der Pilzgattung Cylindrocarpon lucidum entspricht in seiner Morphologie und Physiologie der Beschreibung in CMI Mycological Papers 104, 21(1966).
Der neue Stamm NRRL 5760 lässt sich auf vielartigen Nährböden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwendet dieser Stamm die für die kohlenstoffheterotrophen Organismen üblicherweise verwendeten Nährstoffe, z. B. Saccharose, Glucose, Maltose, Lactose als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Corn steep, Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw.
als Stickstoffquelle sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 kann man in der Weise herstellen, dass man ein flüssiges Nährmedium mit einer Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 beimpft, und die Kultur 9 bis 13 Tage, vorzugsweise 11 Tage bei 27 und einem pH-Wert von 4,4 bis 8,8, vorzugsweise bei pH 8,1 inkubiert wird. Die Züchtung kann vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur erfolgen. Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert ist, wird filtriert und die Antibiotika durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus der Kulturlösung gewonnen.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise erwiesen hat, besteht in der Extraktion des Mycels gegebenenfalls nach vorhergehender mechanischer Zerkleinerung mit 900/cigem Methanol, anschliessendem Abdampfen des Methanols und mehrmaliger Extraktion des resultierenden Gemisches mit Äthylenchlorid. Diesem Extrakt wird der aus dem Kulturfiltrat gewonnene Äthylenchloridextrakt beigefügt. Es können jedoch auch andere organische mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Essigester, Methylenchlorid oder Butylacetat verwendet werden. Die organische Lösung wird eingedampft, der Rückstand chromatographiert, vorzugsweise an Silicagel mit einer Chloroform/Methanollösung (98 : 2), wobei die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt und nochmals mit einer Methanollösung an Sephadex LH-20 chromatographiert werden.
Die Trennung und Reinigung der beiden Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 erfolgt hierauf durch erneutes Chromatographieren an Silicagel.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 zeichnen sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und können daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmen beide Antibiotika das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnen sich aber die beiden neuen Wirkstoffe durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Lokale Hämolyse im Gel in vitro, Jerne-Test:
Die Hemmung der Hämolysenhöfe in O/o gegenüber Kontrollen beträgt bei einer Dosis von 2x60 mg/kg i. p. 990/0, bei einer Dosis von 1x150 mg/kg p. o. 90% und bei einer Dosis von 3x200 mg/kg p. o. 99,5O/o.
b) Hämagglutinationstest (HAT) an der Maus:
Erfasst werden die gegen Schaferzythrozyten gebildeten Antikörper. Die Hemmung wird im suppressiven Index (ski) ausgedrückt, wobei die unbehandelte Kontrolle mit 1,00 angegeben wird; Sl = 0,3 nach p. o. 5x200 mg/kg.
c) Hauttransplantationstest bei der Maus:
Bei H-2 histoinkompatiblen Mäusen wird die Überlebenszeitverlängerung des Hauttransplantates gegenüber unbehan delten Kontrolltieren nach einer Dosis von 7x200 mg/kg p. o. knapp signifikant verlängert.
d) Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) an der Ratte:
Die experimentell hervorgerufenen Nervengewebsschädi gungen, die bei unbehandelten Kontrolltieren 8 von 10 Tie ren lähmten, ergab bei der gleichen Anzahl Versuchstieren, die mit 13x25 mg/kg i. p. behandelt worden sind, einen 1000/eigen Schutz.
e) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver
Index (ski) ausgedrückt; 51 = 0,6 nach 6x75 mg/kg p. o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung können die Verbindungen zur Prophylaxe und Behandlung von
Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen angewandt werden.
Die neuen Antibiotika besitzen ebenfalls eine arthritishemmende Wirkung. So wirken sie z. B. im Freund-Adjuvans-Ar thritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von etwa 50 mg/kg Körpergewicht stark schwellungshemmend.
Aufgrund ihrer arthritishemmenden Wirkung können die Antibiotika zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art des Antibiotikums, der Administratiqn und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei
Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nöti genfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verab reicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg der neuen Anti biotika neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthal ten.
Als Heilmittel können die neuen Antibiotika allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten
Hilfsstoffen verabreicht werden.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1:
10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose,
10 g Corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 0,5 g KCI und 0,01 g FeSO4 7H2O enthält, werden mit 100 ml Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27 inkubiert.
Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird im Turrax durch Zerschlagen und Umrühren mit 3,5 Liter 900/ciges Methanol extrahiert und das durch Abnutschen vom Lösungsmittel getrennte, zerkleinerte Mycel noch zweimal in gleicher Weise mit 900/obigem Methanol behandelt. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei 40 Badtemperatur soweit eingedampft, dass die Flüssigkeit zur Hauptsache nur noch aus Wasser besteht. Das resultierende Gemisch extrahiert man sechsmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid durch Ausschütteln, worauf die vereinigten Äthylenchloridlösungen durch Ausschütteln mit Wasser gereinigt und im Vakuum bei 40 Badtemperatur eingedampft werden.
Den so erhaltenen Rückstand chromatographiert man an 250 g Kieselgel (Kieselgel 60 Merck , Korngrösse 0,063 bis 0,200 mm) unter Verwendung von Chloroform mit einem Zusatz von 2% Methanol als Eluierflüssigkeit, die in 200 ml messenden Fraktionen aufgefangen wird. Die im Platten-Diffusionstest gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen werden vereinigt, in beschriebener Weise zur Trockene verdampft und nach Lösen in Methanol an 110 g Sephadex LH 20 mit dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert, worauf man diejenigen der 20 ml messenden Fraktionen vereinigt, die im gleichen Test wie oben sich gegen Aspergillus niger als antibiotisch aktiv erweisen. Bei der Prüfung im Dünnschichtchromatogramm, z.
B. mittels Kieselgel auf Polygram -Folien und Hexan-Aceton (1:1) als Fliessmittel, zeigt sich, dass der Rückstand der in oben beschriebener Weise eingedampften Methanollösung zur Hauptsache aus den beiden neuen Substanzen S 7481/F-1 und S 7481/F-2 besteht. Sie werden getrennt und gleichzeitig gereinigt, indem man ihr Gemisch unter Verwendung der tausendfachen Menge Kieselgel der oben erwähnten Qualität und von Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, erneut chromatographiert. Die Prüfung der Eluatfraktionen, deren Volumen in Milliliter halb so gross ist wie das Gewicht des Kieselgels in Gramm, im Dünnschichtchromatogramm ergibt, dass die Substanz S 7481/F-1 zuerst im Eluat erscheint, gefolgt von einem Gemisch der beiden und schliesslich von einheitlichem S 7481/F-2.
Aus dem Gemisch können durch Wiederholung der Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weitere Mengen der beiden Substanzen gewonnen werden.
Das neue Antibiotikum S 7481/F-1 hat folgende Eigenschaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 137-140 (Zers.); [a]r2)0 = -236" (CHCl3, c = 0,5); UV: siehe Fig. 1; JR: siehe Fig. 2; Protonen-NMR: siehe Fig. 3.
Löslichkeit: Leicht löslich in den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln, praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser. Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflecken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform +4% Methanol als Fliessmittel: Rf = 0,52.
b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als Fliessmittel: Rf = 0,37; Chloroform/Aceton 2 :1 als Fliessmittel: Rf = 0,34.
Elementaranalyse (Probe in Benzol gelöst, Lösung zur Trockene eingedampft, Rückstand im Hochvakuum 5 Stunden bei 100" getrocknet): Gefunden C 61,8, H 9,4, N 13,0, 0 597ovo.
Die gefundenen Worte stehen in Übereinstimmung mit der Bruttoformel C62Hji1NllOl2.
Im Hydrolysat, das man durch Kochen der Verbindung S 7481/F-1 mit 6 N Salzsäure erhält (20 Stunden), können die Aminosäuren Alanin, a-Aminobuttersäure, N-Methyleucin, N-Methylglycin und Valin nachgewiesen werden.
Das neue Antibiotikum S 7481/F-2 hat folgende Eigenschaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 127-130 (Zers.); [a]D = -243" (Chloroform, c = 0,5); UV: siehe Fig. 4; IR: siehe Fig. 5; Protonen-NMR: siehe Fig. 6.
Löslichkeit: Leicht löslich m den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln; praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser.
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflekken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform + 4% Methanol als Fliessmittel: Rf = 0,46 b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als Fliessmittel: Rf = 0,28; Chloroform/Aceton 2 :1 als Fliessmittel: Rf = 0,26.
Elementaranalyse (Probe 5 Stunden im Hochvakuum bei 100" getrocknet): Gefunden C 61,7, H 9,1, N 13,1, 0 16,5%.
Die gefundenen Werte stehen in Übereinstimmung mit der Bruttoformel C61H100N11O12.
Die als Ausgangsmaterial zur Beimpfung verwendete Konidien- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 5760 hergestellt, welche 10 Tage auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die Konidien und das Mycel werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.
Diese Suspension dient zur Animpfung der oben erwähnten Nährlösung.
Beispiel 2:
250 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose, 10 g Corn steep, 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 0,5 g KCI und 0,01 g FeSO4 - 7H2O enthält, werden mit 2,5 Liter Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27 inkubiert.
Aus der Kulturbrühe wird das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt und im Ultra-Turrax mit 80 Liter 900/obigem Methanol homogenisiert, darauf die methanolische Extraktlösung durch Zentrifugieren vom Feststoff getrennt und der letztere noch zweimal in gleicher Weise mit 900/obigem Methanol extrahiert. Die vereinigten Extraktlösungen werden im Vakuum bei 30 bis 40 auf 15 Liter konzentriert Die verbleibende wässrige Phase extrahiert man achtmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid. Jeder der Äthylenchloridextrakte wird mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die Äthylenchloridlösungen werden nach Vereinigung im Vakuum bei 30 bis 40 eingedampft.
Zur Entfettung wird der Extraktrückstand in der Weise zwischen Petroläther und 900/obigem Methanol verteilt, dass er nach Lösen in 2 Liter 90%igem Methanol nacheinander mit dreimal je 2 Liter Petroläther (Siedepunkt 30 bis 35 ), die sich in drei Schütteltrichtern befinden, geschüttelt wird, worauf die drei Petrolätherphasen hintereinanhiert werden. Zu den vereinigten methanolischen Lösungen gibt man 3 Liter Wasser und konzentriert das Gemisch im Vakuum bei 30 bis 40 auf ein Volumen von 2 Liter. Das wäss- rige Konzentrat extrahiert man durch fünfmaliges Ausschütteln mit je 2 Litern Äthylenchlorid: die Äthylenchloridlösungen werden mit je 0,5 Liter Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum bei 30 bis 40 zur Trockene eingedampft.
Den Rückstand unterwirft man der Chromatographie an der 25fachen Menge Sephadex LH20, wobei Methanol als Elutionsmittel dient. Das Eluat wird in 250 ml messenden Fraktionen aufgefangen; diejenigen von ihnen, die sich im Platten Diffusionstest als gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksam erweisen, werden vereinigt und im Vakuum bei 30 bis 40 zur Trockene eingedampft. Anschliessend chromatographiert man den Rückstand an der 70fachen Menge Aluminiumoxyd (neutral) der Aktivitätsstufe 1, wobei zur Elution Gemische von Toluol und Essigester dienen. Mit Toluol, dem 15% Essigester zugesetzt wurden, erscheint in den ersten zehn Fraktionen (Volumen der Fraktionen: halb so viele Liter wie Adsorbens in kg) zuerst die Hauptmenge der Substanz S 7481/F-1, gefolgt von einem Gemisch von S 7481/F-1 und S 7481/F-2.
Einen weiteren Anteil desselben Gemisches gewinnt man, zusammen mit wenig Fremdsubstanz, beim nachfolgenden Eluieren mit Toluol-Essigester (1:1). Der Nachweis der Substanzen in den Eluatfraktionen erfolgt dabei auf dünnschicht-chromatographischem Wege, z. B. mittels Kieselgel auf Polygram -Folien und Hexan-Aceton (1:1) als Fliessmittel. Aus den vereinigten Fraktionen, welche die Substanz S 7481/F-1 in einheitlicher Form enthalten, wird sie durch Eindampfen im Vakuum bei 30 bis 40 und anschliessendes Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum bei 50 gewonnen. Die vereinigten Eluatfraktionen, welche das Gemisch enthalten, werden unter den gleichen Bedingungen ebenfalls eingedampft.
Zur Gewinnung von weiterem S 7481/F-1 und von einheitlichem S 7481/F-2 wird der Rückstand der Chromatographie an der tausendfachen Menge Kieselgel unterworfen, wobei Chloroform, das 2 /o Methanol enthält, als Elutionsmittel verwendet wird, wie dies, so wie das weitere, in Beispiel 1 beschrieben wurde.