Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych antybiotyków S7481/F-1 o wzorze, przedstawionym na rysunku i S 7481/F-2.Sposobem wedlug wynalazku nowe antybiotyki S7481/F-1 i S7481/F-2 otrzymuje sie, hodujac na lub w pozywce szczep NRRL 5760 z gatunku grzy¬ bów Cylindrocarpon lucidum Booth, po czym nowe antybiotyki wyosabnia sie z brzeczki pofermenta¬ cyjnej w znany sposób przez ekstrakcje i/albo ad¬ sorpcje, a nastepnie oczyszcza chromatograficznie lub na drodze rozdzielania w przeciwpradzie.Stosowany w sposobie wedlug wynalazku nowy szczep Cylindrocarpon lucidum Booth wyosobnio¬ no z próbki gieiby, pobranej w istamie Wdsconsiin w Stanach Zjedn. Amer. i kulture tego szczepu zdeponowano pod numerem NRRL 5760 w Nort¬ hern Research and Development Division w Mi¬ nisterstwie Rolnictwa Stanów Zjedn. Amer. Peoria, Illinois.Glówne cechy nowego szczepu NRRL 5760 Cylin¬ drocarpon lucidum Booth zgadzaja sie z pierwot¬ nym opisem (C. Booth 1966: The Genus Cylindro¬ carpon: Mycological Papers No. 104, 21). Na po¬ zywce z dekstrozy, ziemniaka i agaru szczep NRRL 5760 nie wytwarza chlamidosporów ani zarodni¬ ków mikrokonidialnych, ale nie powstaja równiez komórki zarodników makrokonidialnych, podobne do chlamidosporów. Zarodniki makrokonidialne o ksztalcie bananów, przewaznie podzielone 3 scia¬ nami poprzecznymi, maja wymiary 28—45X4,8—5,7 2 mikrona, a wiec sa znacznie mniejsze od omówio¬ nych w wyzej cytowanym opisie (45—65X6—6,5 mikronów).Dalsza wazna róznica polega na róznej predkos- ci wzrostu, mianowicie podczas, gdy szczep typo¬ wy w ciagu 7 dni tworzy kolonie wielkosci 1—1,5 cm, to w tym samym czasie szczep NRRL 5760 tworzy kolonie 7—8 cm, przy czym na pozywce z ziemniaka, dekstrozy i agaru powstaje prawie wylacznie grzybnia pozywkowa bezbarwna do bra¬ zowej. Konidiofory z fialidami powstaja juz po nie¬ wielu dniach w gestych grupach i peczkach roz¬ galeziaja sie, tworzac pedzle az do spirali i wy¬ twarzaja w ciagu dluzszego czasu makrokonidia, które grupuja sie w postaci sluzowatej masy o bar¬ wie bezowej. v Nowy szczep grzybów NRRL 5760 mozna hodo¬ wac na róznych pózytkowych, zwykle stosowanych do hodowli grzybów. Szczepy te wykorzystuja ja- ko zródlo wegla pozywki, stosowane dla organiz¬ mów, pobierajacych wegiel z obcych zródel, np. sacharoze, glikoze, maltoze, laktoze, skrobie, wy¬ ciag slodowy, a jako zródlo-azotu organiczne i nie¬ organiczne zwiazki, zawierajace azot, takie jak syrop kukurydziany, pepton sojowy, wyciagi droz¬ dzowe i miesne, azotan sodowy, siarczan amono¬ wy, azotan amonowy, aminokwasy itp., jak rów¬ niez wykorzystuja one zwykle sole mineralne i pierwiastki sladowe.Nqwe antybiotyki S7481/F-1 i S 7481/F-2 wy- 925613 twarza sie zgodnie z wynalazkiem w ten sposób ze ciekle srodowisko zaszczepia sie zawiesina ko- nidiaiktych zarodników i grzyfbni szczepuNRRL 51700 i kulture poddaje hodowli w ciagu 9—19 dni, ko¬ rzystnie w ciagu 11 dni, w temperaturze 24—30°C, zwlaszcza 27°C, przy wartosci pH=4,8—8,8, zwlasz¬ cza 8,1. Hodowle prowadzi sie w butlach penicyli¬ nowych jako hodowle powierzchniowa w warun¬ kach aerobowych.Po wytworzeniu mozliwie najwiekszej ilosci an¬ tybiotyków wyosabnia sie je z%brzeczki hodowla¬ nej na drodze ekstrakcji i/lub*adsorpcji znanymi sposobami. % Szczególnie korzystny sposób polega na tym, ze grzybnie otrzymana na drodze hodowli szczepu grzyba NRRL5760, ewentualnie po uprzednim me¬ chanicznym rozdrobnieniu, ekstrahuje sie 90#/o me¬ tanolem, z wyciagu odparowuje metanol i pozosta¬ la anieszaninawodna^kilkalkrotnde ekstrahuje chlor¬ kiem etylenu. Da otrzymanego wyciagu mozna do¬ dac wyciag, otrzymamy przez -ekstrakcje przesaczu kultury za pomoca chlorku etylenu. Mozna tez sto¬ sowac inne rozpuszczalniki organiczne, nie miesza¬ jace sie z woda, takie jak np. chloroform, octan etylu, chlorek metylenu lub octan butylu. Otrzy¬ many roztwór organiczny odparowuje sie do su¬ cha, a pozostalosc odtluszcza na drodze chromato¬ graficznej, np. na zelu krzemionkowym, eluujac chloroformem, zawierajacym maly dodatek meta¬ nolu, np. 98:2, albo przez ekstrahowanie eterem naftowym i metanolem, zawierajacym dodatek wo¬ dy, wystarczajacy do spowodowania rozdzielania sie faz. Przy oczyszczaniu chromatograficznym la¬ czy sie frakcje, dzialajace antybiotycznie na As¬ pergillus niger, odparowuje je do sucha, a pozosta¬ losc chromatografuje w roztworze metanolowym na preparacie Sephadex LH20.Przy oczyszczaniu druga metoda, roztwór w u- wodnionym metanolu, ewentualnie po dodaniu pewnej ilosci wódy, steza* sie tak, aby oddestylo¬ wac glówna ilosc metanolu, po czym wodna faze ekstrahuje sie chlorkiem etylenu lub innym, wy¬ zej wymienionym rozpuszczalnikiem, nie mieszaja¬ cym sie z woda i otrzymany roztwór organiczny odparowuje do sucha, po czym pozostalosc w roz¬ tworze metanolowym chromatografuje sie na Se- phadex LH20. Dalsze rozdzielanie i oczyszczanie obu antybiotyków prowadzi sie przez ponowne chromatografowanie na tlenku glinowym lub zelu krzemionkowym, albo kolejno za pomoca obu tych adsorbentów.Nowe antybiotyki S7481/F-1 i S7481/F-2 maja cenne wlasciwosci chemoterapeu/tyczne i farmako¬ logiczne, totez moga byc stosowane jako srodki lecznicze. Tak np. oba te antybiotyki hamuja roz¬ wój Aspergillus niger', a szczególnie antybiotyk S7481/F-1 cechuje zwiekszanie odpornosci na cho¬ roby. Zarówno S7481/F-1, jak i S7481/F-2 wyka¬ zuja równiez zdolnosc hamowania stanów zapal¬ nych, przy czym nalezy podkreslic, ze dzialanie cytostatyczne obu tych antybiotyków jest nieznacz¬ ne.Zdolnosc antybiotyku S7481/F-1 uodporniania na choroby wykazuja nastepujace próby. a) Próba Jerne'a miejscowej hemolizy w zelu 92561 4 in vitro. Hamowanie otoczek hemolitycznych wy¬ razone w procentach w porównaniu z próbami kon¬ trolnymi przy dawce sródotrzewnowej 2X60 mg/kg wynosi 99Vo, przy dawce doustnej 1X150 mg/kg wynosi 90%, a przy dawce doustnej 3X200 mg/kg wynosi 99,5Vo. Zahamowaniu ulega wytwarzanie przeciwcial immunoglobuliny N, jak równiez im- munoglobuliny G. b) Badanie aglutynacji krwinek (HAT) u myszy.Objete zostaja przeciwciala czerwonych krwinek owczych. Zdolnosc hamowania okresla sie przez wskaznik SI, przy czyni wskaznik ten dla prób kontrolnych przyjmuje sie za 1,00. Przy doustnych dawkach antybiotyku 5X200 mg/kg SI=0,3. c) Próba przeszczepienia skóry u myszy.U myszy, wykazujacych zgodnosc tkanek H-2, przedluzenie okresu zycia przeszczepu skóry po do¬ ustnych dawkach 10X200 mg/kg jest w porówna¬ niu z próba kontrolna niezbyt znaczne, a miano- ao wicie przeszczep zyje o okolo 16 dni dluzej niz w próbach kontrolnych. d) Próba eksperymentalnego alergicznego zapa¬ lenia mózgu (EAE) u szczurów.Sztucznie wywolane uszkodzenia tkanka nerwo- 29 wej, które u zwierzat z prób kontrolnych powodo¬ waly niedoleznosc 8 z 10 zwierzat, po dawkach sródotrzewnowych antybiotyku 13X25 mg/kg nie powoduja niedoleznosci u zadnego ze zwierzat, czyli uzyskuje sie 100e/o ochrone. e) Próba oksazolonowa u myszy.Zmniejszenie opuchliny ucha przyjmuje sie za wskaznik skutecznosci SI. Po dawkach doustnych antybiotyku 6X75 mg/kg wskaznik SI=0,6. f) Próba zmniejszenia liczby krwinek w szpiku kostnym i we krwi.Przy doustiiym podawaniu antybiotyku 6X500 mg/ /kg, co stanowi wysoka dawke, po uplywie 1, 3 i 7 dni od podania ostatniej dawki nie zaobserwowano wyraznego zmniejszenia sie liczby komórek, two- 40 rzacych krew w szpiku kostnym, ani tez zmniej¬ szenia bialych krwinek w krwi.Dzieki swym wlasciwosciom uodporniania na choroby antybiotyk S7481/F-1 moze byc stosowany jako srodek profilaktyczny oraz do leczenia scho- « rzen, bedacych w zwiazku z oslabieniem odpornos¬ ci organizmu.Nowe antybiotyki S7481/F-1 i S7481/F-2 maja równiez zdolnosc hamowania zapalenia stawów.Tak np. podawane szczurom w dawkach okolo 50 50 mg na 1 kg masy ciala w próbie okreslania uta¬ jonego okresu wystepowania zapalenia stawów, prowadzonej z zastosowaniem adjuwantu Freunda, wykazuja silne dzialanie, hamujace obrzeki. Po¬ dobne dzialanie zaobserwowano w próbie leczenia 55 zapalenia stawów z zastosowaniem adjuwantu Fre¬ unda u szczurów, przy dziennych dawkach okolo 50 mg/kg. Dzieki zdolnosci hamowania zapalenia stawów, antybiotyki te mozna stosowac do celów profilaktycznych oraz do leczenia zapalenia stawów 60 i schorzen reumatycznych.Dawki antybiotyków, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, zaleza oczywiscie od rodzaju antybiotyku, sposobu podawania i stanu pacjenta.W badaniach na zwierzetach zadowalajace wyniki * uzyskuje sie zwykle przy dawkach 10—200 mg/kg5 92561 6 masy ciala. Dawki te moga byc w razie potrzeby podzielone na 2—3 czesci, a takze mozna stosowac antybiotyki w postaci preparatów o opóznionym dzialaniu. Dla wiekszych ssaków dzienna dawka wynosi okolo 50—900 mg, Przy podawaniu doust¬ nym pojedyncze dawki moga zawierac np. 25—300 mg nowych antybiotyków oraz stale lub ciekle nos¬ niki. Jako srodki lecznicze antybiotyki te moga byc stosowane same lub w odpowiednich posta¬ ciach razem z farmakologicznie- obojetnymi sub¬ stancjami pomocniczymi.Wynalazek jest zilustrowany w nizej podanych przykladach, które nie ograniczaja jego zakresu.Przyklad I. 10 litrów roztworu pozywki, za¬ wieraj ajcegio w 1 liftnze 30 g sacharozy, 10 g nainokiu kukurydzianego, 3 g NadSTO,, 1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO^HjjO, 0,5 g KQ i 0,01 g FeSO^HjjO, za¬ szczepia sie 100 ml zawiesiny konidialnyich zarodni¬ ków i grzybni szczeipu NRJRL 5760 i poddaje hodo¬ wli w butlach penicylinowych 'o pojemnosci po 700 ml, prowadza chodowie w temperaturze 27°C w ciagu 11 dni.Grzybnie oddzielona z brzeczki hodowlanej eks¬ trahuje sie w urzadzeniu Tun:rax przez rozdrab¬ nianie i mieszanie z 3,5 litrami 90% metanolu, od¬ sacza grzybnie, rozdrabnia i ponownie ekstrahuje tak samo 90tyo metanolem. Polaczone"przesacze od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem w ka¬ pieli o temperaturze 40°C tak dalece, ze pozostala ciecz stanowi glównie wode. Pozostalosc te ekstra¬ huje sie przez wytrzasanie z 6 porcjami chlorku etylenu o takiej samej objetosci, po czym pola¬ czone roztwory w chlorku etylenu oczyszcza sie przez wytrzasanie z woda i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem w kapieli o temperaturze 40°C.Pozostalosc chromatografuje sie na 250 g zelu krzemionkowego (Kieselgel 60 firmy Merck o uziar- niehiu 0,063—0,200 mm), stosujac jako ciecz eluuja- ca chloroform, zawierajacy 2°/o metanolu, przy czym zbiera sie frakcje po 200 ml. Laczy sie frakc¬ je, które w próbie dyfuzji plytkowej dzialaja an- tybiotycznie na Aspergillus niger, odparowuje do sucha w wyzej opisany sposób, pozostalosc roz¬ puszcza w metanolu, chromatografuje na 110 g Sephadex LH 20, eluujac podanym wyzej rozpusz¬ czalnikiem i laczy sie te frakcje o objetosci po ml, które w podanej wyzej próbie sa aktywne wzgledem Aspergillus niger.Próba chromatogramu cienkowarstwowego np. za pomoca zelu krzemionkowego na foliach „Poly- gram" i przy rozwijaniu mieszanina heksanu z acetonem (1:1) wykazuje, ze pozostalosc po od¬ parowaniu metanolu sklada sie glównie z obu no¬ wych antybiotyków S7481/F-1 i S 7481/F-2. Anty¬ biotyki te rozdziela sie i równoczesnie oczyszcza w ten sposób, ze mieszanine te ponownie chroma¬ tografuje sie przy uzyciu 1000-krotnej ilosci zelu krzemionkowego o wyzej podanej jakosci i z za¬ stosowaniem chloroformu, zawierajacego 2% me¬ tanolu.Badanie frakcji eluatu, których objetosc w mili- litrach stanowi polowe masy uzytego zelu krze¬ mionkowego w gramach, wykazuje w chromato- gramie cienkowarstwowym, ze antybiotyk S7481/ /F-l pojawia sie w eluacie jako pierwszy, po czym eluat zawiera mieszanine obu tych antybiotyków, a nastepnie tylko antybiotyk S7481/F-2. Z miesza¬ niny antybiotyków mozna przez powtarzanie pro¬ cesu chromatografowania w takich samych warun¬ kach otrzymac dalsze ilosci poszczególnych anty¬ biotyków.Otrzymamy nowy antybiotyk S7481/F-1 o wzo¬ rze, przedstawionym na rysunku, ma nastepujace cechy. Stanowi on bezpostaciowy bezbarwny pro¬ szek, topniejacy z objawami rozkladu w tempe¬ raturze 137—140°C, [a]20D=-236° (CHC1„ c=0,5). jego widmo w nadfiolecie podano na rysunku, fig. 1, widmo w podczerwieni na rysunku, fig. 2, proto¬ nowe widmo magnetycznego rezonansu jadrowego na rysunku, fig. 3, a dane widma magnetycznego rezonansu jadrowego 13C sa podane w tablicy.Tablica Dane widma magnetycznego rezonansu jadrowego 13C antybiotyku S7481/F-1; 250 mg w 1,5 ml CDCla Bruker H&-90E; Sweep-width 6000 Hz Adres 1260 1264 1293 1299. 1312 1317 1937 1992 2745 2785 3027 3042 3047 3051 3081 3159 3184 3189 3239 3305 3327 3332 3357 3363 3380 3387 3411 3449 3454 3475 3478 3486 3543 3549 3553 3566 3574 3582 3596 | 3607 Czestotliwosc [Hz] 3915.5273 ,3909.6679 3867.1875 3858.3984 3839.3554 3832.0312 2923.8281 2843.2617 1740.2343 1681.6406 1327.1484 1305.1757 1297.8515 1291.9921 1248.0468 1133.7890 1097.1679 1089.8437 1016.6015 919.9218 887.6953 880.3710 843.7500 834.9609 810.0585 799.8046 764.6484 708.9843 701.6601 670.8984 666.5039 654.7851 571.2890 562.5000 556.6406 537.5976 525.8789 514.1601 493.6523 477.5390 6 [ppm] 173.0237 172.7648 170.8876 170.4992 169.6577 169.3341 129.2014 123.6412 76.8994 74.3102 58.6455 57.6745 57.3509 57.0920 55.1501 50.1011 48.4828 48.1592 44.9227 40.6505 39.2264 38.9028 37.2845 36.8961 .7957 .3426 33.7891 31.3294 31.0057 29.6464 29.4522 28.9343 .2447 24.8563 24.5974 23.7559 23.2381 22.7202 21.8140 21.1020 Inten¬ syw¬ nosc 184 192 9L- 215 207 .. 268 . 220 225 165 . 187 223 253 40 * 844 172 566 276 206 158 192 222 167 «0 * 567 304 182 167 518 544 179 310 287 631 843 1000 762 ¦'- 58*- 606 ¦' -• 231 1 36 40 45 50 55 6092561 8 Tablica c.d.Adres 3622 3628 3645 3650 3654 3658 3674 3688 3781 3933 Czestotliwosc [Hz] 455.5664 446.7773 421.8750 414.5507 408.6914 402.8320 379.3945 358.8867 222.6562 0.0000 8 [ppm] .1310 19.7427 18.6422 18.3186 18.0597 17.8007 16.7651 .8588 9.8389 0.0000 Inten¬ syw¬ nosc 165 254 285 314 278 277 224 202 139 111 Zarejestrowane sygnaly CDClji wyzszych pików szumów Widmo masowe tego antybiotyku, uzyskane za pomoca spektrometru masowego typu CEC 21-1108, ze zródlem jonów E.B., przy bezposrednim ukla¬ dzie wprowadzania, przy energii elektronów 70eV, przyspieszeniu jonów 4kV, temperaturze zródla jo¬ nów 290°C, pod cisnieniem 5-10-6 tor, oznaczane metoda dopasowywania pików i przy uzyciu po¬ równawczej substancji „PCR 8" (trójpentadekajfflu- oroheptylo-l,3,5-triazyna, M=1184, 9374) wykazuje: najwyzszy pik masowy m/e=1183,831/±0,004/, co od¬ powiada masie jonu C^H^NnO^, po usunieciu wody z pierwotnej czasteczki C82H111N11012. Anty¬ biotyk ten rozpuszcza sie latwo w najczesciej sto¬ sowanych rozpuszczalnikach organicznych, a prak¬ tycznie nie rozpuszcza sie w eterze naftowym ani w wodzie. Jego zachowanie w chromatogramie cienkowarstwowym (plamy substancji uwidocznio¬ ne parami jodu) jest nastepujace: a) zel krzemionkowy na szklanych plytkach, chlo¬ roform +4% metanolu jako srodek rozwijajacy: Rf=0,52, b) zel krzemionkowy na folii „Polygram", miesza¬ nina heksanu z acetonem 1:1 jako srodek rozwi¬ jajacy: Rf=0,37, a przy uzyciu mieszaniny chloro¬ formu z acetonem 2 :1 jako srodka rozwijajacego Rf=0,34.Analiza elementarna próbki atrzyimanej przez roz¬ puszczenie w benzenie, odparowanie do sucha i su¬ szenie pozostalosci pod silnie obnizonym cisnieniem w temperaturze 100°C w ciagu 5 godzin wykazuje sklad: 61,8% C, 9,4% H, 13,0% N i 15,7% O, co od¬ powiada wzorowi brutto C^HmNuO^. Jezeli anty¬ biotyk S7481/F-1 utrzymuje sie w stanie wrzenia z 6n kwasem solnym w ciagu 20 godzin, to pro¬ dukt hydrolizy zawiera aminokwasy, takie jak ala¬ nina, kwas a-aminomaslowy, N-metyloleucyna, N- -metyloglicyna i walina.Nowy antybiotyk S7481/F-2 ma nastepujace ce¬ chy. Startowi on bezpostaciowy bezbarwny proszek o temperaturze topnienia z objawami rozkladu 127^130°C, [a]20D= -243° (chloroform, c=0,5), jego widmo w nadfiolecie podano na rysunku, fig. 4, wid¬ mo w podczerwieni na rysunku, fig. 5, a protono¬ we widmo magnetycznego rezonansu jadrowego na rysunku, fig. 6. Jego widmo masowe sporzadzone w warunkach podanych wyzej przy omawianiu an¬ tybiotyku S7481/F-1, wykazuje najwyzszy pik ma- 40 45' 50 55 sowy m/c = 1169, 815/±O,O0G/, co odpowiada masie jonu C61H107-N11On, po usunieciu wody z czasteczki pierwotnej C^H^gNuO^. Antybiotyk ten rozpusz¬ cza sie latwo w najczesciej stosowanych rozpu¬ szczalnikach organicznych i jest praktycznie nie¬ rozpuszczalny w eterze naftowym i wodzie. Jego zachowanie sie w chromatogramie cienkowarstwo¬ wym (plamy substancji uwidoczniane parami jodu) jest nastepujace: a) zel krzemionkowy na plytkach szklanych i chlo¬ roform +4% metanolu jako srodek rozwijajacy: Rf =0,46, b) zel krzemionkowy na folii „Polygram", miesza¬ nina heksanu z acetonem 1 :1 jako srodek rozwi¬ jajacy: Rf=0,28, a przy uzyciu mieszaniny chloro¬ formu z acetonem 2 :1 jako srodka rozwijajacego Rf =0,26.Elementarna analiza próbki suszonej w tempera¬ turze 100°C pod silnie obnizonym cisnieniem w cia¬ gu 5 godzin wykazuje sklad: 61,7% C, 9,1% H, 13,1% N i 16,5% O, co odpowiada wzorowi brutto C61H109- Nn012.Stosowana jako produkt wyjsciowy do zaszcze¬ piania zaiwiesine konidialnych zarodników i grzyb¬ ni wytwarza sie z kultury uprzednio wyosobnio¬ nego szczepu NRRL5760, hodowanej w ciagu 10 dni na pozywce agarowej, zawierajacej w 1 litrze g wyciagu slodowego, 20 g agaru i 4 g wyciagu drozdzowego, przy czym reszte stanowi odminerali- zowana woda. Konidialne zarodniki i grzybnie mie¬ sza sie z fizjologicznym roztworem chlorku sodo¬ wego i stosuje do zaszczepienia podanej wyzej po¬ zywki.Przyklad If. 250 litrów roztworu pozywki za¬ wieraj acego w 1 litrze 30 g sacharozy, 10 g namo- ku kukurydzianego, 3 g NaNO,, 1 g K2HP04, 0,5 g MgS04-7H20, 0,5 g KC1 i 0,01 g FeS04-7H20, za¬ szczepia sie 2,5 litra zawiesiny konidialnych zarod¬ ników i grzybni szczepu NRRL 5760 i poddaje ho¬ dowli w butlach penicylinowych o pojemnosci po 700 ml w temperaturze 27°C w ciagu 11 dni.Z brzeczki hodowlanej odwirowuje sie grzybnie, homogenizuje ja w mieszalniku Ultra-Turrax z 80 litrami 90% metanolu, po czym odwirowuje roz¬ twór metanolowy od ciala stalego, które nastepnie ekstrahuje sie w taki sam sposób dwukrotnie 90% metanolem. Polaczone roztwory odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 30— 40°C do objetosci 15 litrów i otrzymany roztwór wodny ekstrahuje 8 razy taka sama objetoscia chlorku etylenu. Kazda porcje wyciagu w chlorku etylenu plucze sie 5 litrami wody, po czym wycia¬ gi laczy i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze 30—40°C. Pozostalosc od¬ tluszcza sie, ekstrahujac eterem naftowym i 90% metanolem w taki sposób, ze najpierw rozpuszcza sie w 2 litrach 90% metanolu i nastepnie wytrzasa z 3 porcjami po 2 litry eteru naftowego o tempe¬ raturze wrzenia 30—35°C, znajdujacymi sie w 3 rozdzielaczach. Nastepnie 3 roztwory w eterze naf¬ towym ekstrahuje sie kolejno 2 litrami 90% meta¬ nolu.Do polaczonych roztworów metanolowych doda¬ je sie 3 litry wody i mieszanine steza pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 30—40°C do9 92961 objetosci 2 litrów. Wodny koncentrat ekstrahuje sie nastepnie przez wytrzasanie z 5 porcjami po 2 litry chlorku etylenu. Roztwory w chlorku ety¬ lenu plucze sie porcjami "wody po 0,5 litra, laczy i pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze —40°C odparowuje do sucha. Pozostalosc chro¬ matografuje sie na 25-krotnej ilosci preparatu Sephadex LH 20, eluujac metanolem. Eluat zbiera sie we frakcjach pp 250 ml i te frakcje, które w próbie dyfuzyjnej na plytkach dzialaja antybio- tycznie na Aspergillus niger, laczy sie i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha w tem¬ peraturze 30—40QC, Pozostalosc chromatografuje sie na 70i-krotnej ilosci obojetnego tlenku glinowego o stopniu ak¬ tywnosci 1, eluujac mieszaninami toluenu z octanom etylu. Z toluenem, zawierajacym 15§/o octanu etylu, otrzymuje "sie pierwsze 10 frakcji, których objetosc w litrach stanowi polowe ilosci adsorbentu w kilo¬ gramach. Najpierw otrzymuje sie frakcje, zawiera¬ jace glówna czesc antybiotyku S7481/F-1, nastep¬ nie frakcje z mieszanina, obu antybiotyków S7481/ /F-l i S7481/F-2. Dalsza ilosc takiej samej mie¬ szaniny otrzymuje sie razem z domieszka substan¬ cji o{cej, jezeli nastepnie eluuje sie mieszanine to¬ luenu- z octanem etylu 1:1. Wykrywanie substan-^ cji we frakcjach eluatu odbywa sie na drodze chro¬ matografii cienkowarstwowej, np. za pomoca zelu krzemionkowego na folii „Polygram", przy uzyciu mieszaniny heksanu z acetonem (1:1) jako eluentu.Z polaczonych frakcji, zawierajacych sam an- tybiotyk S7481/F-1, wyosabnia sie go przez odpa¬ rowanie frakcji w temperaturze 30—40°C pod zmniejszonym cisnieniem do sucha i wysuszeniu pozostalosci pod silnie obnizonym cisnieniu w tem¬ peraturze 50°C. Polaczone frakcje, zawierajace io mieszanine antybiotyków, równiez odparowuje sie w podanych wyzej warunkach i w celu otrzyma¬ nia dodatkowej ilosci antybiotyku S7481/F-1* oraz oddzielnie antybiotyku S7481/F-2 pozostalosc po odparowaniu chromatografuje sie na 1000-krotnej i* ilosci zelu krzemionkowego, eluujac chloroformem, zawierajacym 2F/§ metanolu, jak opisano w przy¬ kladzie I. 3 1, -r-TT-n I » n i I 1 L U 1 1111 lii 11 u 360 TT 180 I I $ A 2 ttJ 0 I I I I MIMU Jl p\-k MHJ\ I I I ! M I P 180 li 90 | | 4 JJr V 1 A, P^A U II 1 ' 1 1 m j ir \i\.J li flfil )\J V rs-/ | 5 i i i i 1 i i i i f—i T 6 +-—ó V1 ó u 1 m v i i i \M \ \ \ o m N- ó 11111111 ii 1 Fig. 6 PL