Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Erizomycin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Erizomycin, das zur Hemmung des Wachstums verschiedener Mikroorganismen, z. B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, oder Streptococcus faecalis, verwendet werden kann. Die Herstellung des Antibiotikums erfolgt erfindungsgemäss, indem ein erizomycinproduzierender Mikroorganismus, vorzugsweise Streptomyces griseus var. erizensis in einem wässrigen Nährmedium, das vorzugsweise eine Quelle an assimilierbaren Kohlenhydraten und an assimilierbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis das Medium eine beträchtliche antimikrobielle Wirksamkeit erhalten hat und indem Erizomycin aus dem Medium isoliert wird.
Erizomycin ist eine basische Substanz, die im Stande ist, das Wachstum gewisser Organismen, vor allem gram-positiver und gram-negativer Bakterien, insbesondere das Wachstum von Bakterien, z. B. von Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus oder Streptococcus viridans zu hemmen, und sie kann allein oder in Kombination mit anderen antibakteriellen Mitteln zur Verhinderung des Wachstums, bzw. zur Verminderung der Zahl solcher Organismen, in verschiedenen Umgebungen dienen. Erizomycin kann beispielsweise als ein bIkonservierungsmittel verwendet werden, beispielsweise als bakteriostatisches Mittel zur Hemmung des Wachstums von Proteus vulgaris, der dafür bekannt ist, dass er das Verderben von Schneidölen verursacht.
Ausserdem ist es in Waschflüssigkeiten für sanitäre Zwecke nützlich, beispielsweise zum Waschen der Hände und zur Reinigung von Geräten, Fussböden oder Möbeln in verunreinigten Räumen oder Laboratorien; es ist ausserdem als industrielles Konservierungsmittel nützlich, z. B. als bakteriostatisches Spülmittel für gereinigte Kleidungsstücke und zur Imprägnierung von Papieren und Geweben; ausserdem ist es nützlich zur Unterdrückung des Wachstums empfindlicher Organismen in Platten-Verfahren und anderen mikrobiologi- schen Medien. Es kann ausserdem als Futterzusatz zur Förderung des Wachstums von Tieren, z. B. von Säugetieren, Vögeln, Fischen und Reptilien, verwendet werden.
Zu der Beschreibung gehören zwei Zeichnungen, von denen Fig. 1 das Infrarotabsorptionsspektrum des Erizomycins bedeutet und Fig. 2 das Papierchromatogramm der antimikrobiellen Wirksamkeit von Erizomycin gegenüber Mycobacterium avium 5 Ä bedeutet.
Mycobacterium avium 5 i ist die Aktivität des bekannten Mycobacterium avium, und die Konzentration ist durch 5 Ä (5 microliter) ausgedrückt.
Chemische und physlkaEsche EigensOaften des Erizomycins
Elementaranalyse für C27Hs2N4o8: Bei.: C 59,99 H 5,96 N 10,37 0 23,68
Gef.: C 59,97 H 6,05 N 10,46 0 22,88
Molekulargewicht: 540 (Masserspektrometer).
Ultraviolettspektrum: Erizomyciln hat das folgende UVAbsorptionsspek- trum:
In Äthanollösung: X max. (in mll) a
221 (sh) 42,01
255 (sh) 9,45
262 8,56 # max. (in m ) a
269 7,52
303 16,38 # 350 0,32 Optische Drehung: [a]D25 = -82 (c = 1,35, in Äthanol) Löslichkeit:
Bei Zimmertemperatur:
Die ungefähren Löslichkeiten (in mg/ml) sind die folgenden:
Wasser: < 1
95 % Äthanol: > 10 Äthylacetat: > 10
Aceton: > 10
Methylenchlorid: > 100
Benzol: # 2 Skellysolve B :
< 1 n-Butanol: # 5 Schmelzpunkt: 2142170 C Infrarotspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Erizomycins in Mineralöl ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt.
Erizomycin zeigt bei den folgenden Wellenlängen (Angaben in cm-1) Absorptionsbanden:
3445 (M) 1572 (M) 1325 (M)
3460 (S) 1540 (M) 1314 (S)
3440 (S) 1522 (S) 1300 (S)
3200 (W) 1505 (M) 1293 (S)
3060 (W) 1472 (M) 1278 (M)
2950 (S) (Öl) 1465 (M) 1272 (W)
2920 (S) (Öl) 1458 (M) (Öl) 1247 (S)
2850 (S) (Öl) 1447 (S) 1225 (S)
2730 (W) 1420 (M) 1195 (M)
2620 (W) 1388 (M) 1191(M)
1725 (S) 1384 (M) 1152 (S)
1655 (S) 1376 (M) (Öl) 1145 (S)
1645(S) 1360(M) 1130(M)
1620 (W) 1355 (M) 1097 (M)
1600 (M) 1338 (S) 1087 (S)
1069 (S) 952 (W) 808 (W)
1062 (S) 932 (W) 802 (M) 1047(W) 911(M) 772(M)
1035 (W) 888 (W) 720 (M)
1024 (W) 885 (W) 706 (M)
1012 (W) 867 (W) 698 (M)
992 (W) 850 (W) 670 (W)
973 (W) 835 (W) 662(M)
960 (W) 822 (W)
In KBr zeigt das Erizomycin <RTI
ID=2.14> Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen (Angaben in cm-1):
3485 (W) 1595 (M) 1248 (S)
3420 (W) 1575 (M) 1224 (S)
3370 (M) 1540 (M) 1190 (M)
3210 (W) 1538 (S) 1150 (S)
3035 (M) 1515 (S) 1132 (S)
2980 (M) 1477 (M) 1085(S)
2940(M) 1465 (M) 1068 (S)
2880 (M) 1458 (S) 1050(M)
2760 (W) 1448 (S) 1025 (M)
2630 (W) 1424 (M) 1015 (W)
1725 (S) 1380(M) 995(W)
1679 (S) 1358 (M) 965 (W) 1655 (S) 1320 (S) 930 (W)
1645 (S) 1290 (S) 907 (W)
890 (W)
876 (W)
835 (W)
810 (M)
780 (M)
755 (M)
717 (M)
660 (M)
Die Bandenintensitäten werden mit S , M , bzw W bezeichnet und werden annähernd in Beziehung zur Hintergrundabsorption in der Nähe der Banden angegeben.
Eine S -Bande ist eine Bande von gleicher Grössenordnung der Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum; M -Banden haben eine Intensität zwischen einem Drittel und zwei Dritteln der stärksten Bande und W -Banden haben eine Intensität von weniger als einem Drittel der stärksten Bande. Diese Schätzungen sind auf der Basis einer prozentualen Durchlässigkeitsskala gemacht.
Papierchromatogramm
Erizomycin zeigt ein charakteristisches Papierchromatogramm, das in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt ist, wobei die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet wurden: I. 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 h.
II. 1 Butanol, Wasser (84:16) plus 0,25% p-Toluolsul fonsäure, 16 h.
III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1), 16 h.
IV. 20/0 Piperidin (v/v) in 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 h.
V. 1-Butanol, Wasser (4:96), 5 h.
VI. 1-Butanol, Wasser (4:96) plus 0,250/0 p-Toluolsulfonsäure, 5 h.
Antitumor-Aktivität des Erizomycins
Erizomycin ist wirksam gegenüber KB-Zellen (menschliche Epidermis.-Krebs-Zellen) in Gewebekulturen. Die ID50 ist 4,4,ag/ml an Erizomycin.
Antibakterielle Wirksamkeit von Erizomycin
Röhrchen-Verdünnungstest Test-Mikroorganismus Minimale Inhibitions
Konzentration in Fg/ml.
Escherichia coli 125 Klebsiella pneumoniae 125 Proteus vulgaris 250 Salmonella paratyphi 250 Salmonella pullorum 62,5 Salmonella typhimurium 125 Streptococous faecalis 125 Str'eptoocuus hemolyticus 250 Streptococcus viridans 250 Staphylococcus aureus 250
Die Röhrchen-Verdünnungstestmethode wurde mit BHI-Medium (Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, Difco, Detroit, Michigan, USA) ausgeführt. Die Teströhrchen (13 mm X 100 mm) wurden auf übliche Weise hergestellt, wie bei E. E. Snell, Vitamin Methods, Vol. 1, Academic Press, Inc., New York 1950, Seite 327, beschrieben. Testorganismen, die 18 Stunden bei 370 C bebrütet waren, wurden zur Beimpfung des Testmedi ums verwendet. Die Bestimmungen wurden nach 17 Stunden gemessen.
Der Mikroorganismus
Der vorzugsweise im erfindungsgemässen Verfahren für die Herstellung von Erizomycin verwendete Actinomycetenstamm ist Streptomyces griseus var. erizensis var. nova. Eine seiner Stammeseigenschaften ist die Produktion von Erizomycin. Eine Ablegerkultur des lebenden Organismus kann von der Sammlung der North Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U. 5. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, bezogen werden. Seine Hinterlegungsnummer ist NRRL 3242.
Strepomyces griseus var. erizensis wurde mit Streptomyces griseus Waksman # 4, 4, ATCC 10 137 verglichen. Beide Mikroorganismus-Kulturen zeigten cremefarbenes bis creme-olivfarbenes Luftwachstum; gewundene Sporophoren; glattwandige Sporen und wuchsen am besten bei 24 bis 280 C. Streptomyces griseus var. erizensis zeichnet sich gegenüber Streptomyces griseus durch die Produktion des Antibiotikums Erizomycin und durch Farbunterschiede, die in den nachfolgenden Tabellen für Ektachrom-, Kultur- und Farbcharakteristika angegeben sind, aus.
Streptomyces griseus var. erizensis und Streptomyces griseus Waksman # 4, ATCC 10 137 werden in den folgenden Tabellen verglichen:
Tabelle 1 - Aussehen auf Ektachrom
Tabelle II - mikroskopische Merkmale
Tabelle III- Kulturmerkmale
Tabelle IV - Wachstum auf Kohlenstoffv & in- dungen in synthetischem Medium
Tabelle V - Farbmerkmale
Tabelle I
Aussehen von S. griseus var. erizensis und S. griseus
ATCC 10137 auf Ektachrome * Agar-Medium S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 Bennett's rötlich-weiss cremerötlich Oberfläche gelb gelbbraun Rückseite Czapek's Saccharose rötlich-weiss röich-weiss Oberfläche farblos farblos Rückseite
Tabelle I (Fortsetzung) Agar-Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Maltose-Trypton rötlich-weiss rötlich Oberfläche braun rötlich-braun Rückseite Pepton-Eisen etwas weiss kein Oberfläche gelbbraun Luftwachstum Rückseite gelbbraun Agar-Medium S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 0,1 % Tyrosin etwas weiss etwas weiss Oberfläche blassgelb blassgelb Rückseite CaseinStärke rötlich-weiss rötlich-weiss Oberfläche rötlich-braun rötlich-braun Rückseite * Dietz, A., < Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomycete Classification,7 Annais of the New York Academy of Sciences, 60: 152-154, 1954.
Tabelle II
Mikroskopische Merkmale von S. griseus var. erizensis und S. gnsrrs, ATCC 10137
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 Licht-Mikroskop Sporophoren lang, gewunden Sporophoren gerade bis gewunden Electronen Mikroskop Direkt Sporen glatt, rechteckig Sporen glatt, wurstähnlich Kohlenstoff abdruck Sporen gefurcht mit grosser Sporen gefurcht mit grosser
Oberflächenzeichnung Oberflächenzeichnung
Einige Sporen mit dunklem, mittlerem Fleck und dunklem mittlerem Fleck
Tabelle 711
Kulturmerkmale von S. grisens var. erizensis und S. griseus, ATCC 10137 Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Pepton-Eisen-Agar Oberfläche weiss etwas weiss Rückseite gelb gelb Sonst Melanin - Melanin- Kalzium-Malat-Agar Oberfläche etwas weiss creme Rückseite cremerötlich weiss Sonst blassrötl. Pigment kein Pigment
Malat aufgelöst Malat aufgelöst Glucose-Asparagin-Agar Oberfläche ziemlich rötl.-weiss creme Rückseite creme gelb Sonst etw. gelbes Pigment gelb es Pigment
Tabelle III (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Magermilch-Agar Oberfläche sehr schwach weiss kein Luftwachstuin Rückseite gelbbraun gelbbraun Sonst gelbbraun gelbbraun
Kasein aufgelöst Casein aufgelöst Tyrosin-Agar Oberfläche creme weiss Rückseite gelbbraun gelbbraun Pigment gelbbraun gelbbraun
Tyrosin aufgelöst Tyrosin aufgelöst Xanthiin-Agar Oberfläche creme etwas weiss Rückseite gelb gelb Sonst blassgelbes Pigment biassgelbes Pigment
Xanthin aufgelöst Xantiia aufgelöst Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Oberfläche creme creme Rückseite olivebraun gelbbraun Sonst blassgelbes Pigment blassgelbes Pigment Casein-Stärke-Agar Oberfläche olive-creme creme Rückseite rötlich rötlich-braun Sonst etw. rötliches Pigment etw.
rötliches Pigment
Stärke hydrolysiert Stärke hydrolysiert Bennett's 180 C Oberfläche cremeolive cremeweiss
Rückseite gelb olive
Pigment kein Pigment etwas olive 240 Oberfläche cremeolive cremebraun
Rückseite olivebraun gelbbraun
Pigment kein Pigment etwas gelb 28 C Oberfläche cremeolive cremebraun
Rückseite olive gelbbraun
Pigment etwas olive etwas gelb 37 C Oberfläche kein Luftwachstum sehr schwach creme verschwommen
Rückseite gering farblos gelbbraun
Pigment kein Pigment etwas gelb 55 C kein Wachstum kein Wachstum
Tabelle III (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Czapek's Saccharose Agar 18 0 Oberfläche etwas cremeolive etwas cremeolive
Rückseite creme creme 24 C Oberfläche etwas creme verschwommen etwas creme verschwommen
Rückseite weiss creme 2800 Oberfläche creme cremeolive
Rückseite creme cremeolive 370 C Oberfläche kein Luftwachstum kein Luftwachstum
Rückseite farblos farblos 55 C kein Wachstum kein Wachstum Maltose-Trypton-Agar 180 COberfläche creme cremeolive
Rückseite olive olive
Pigment kein etwas olive 240 0 Oberfläche creme creme
Rückseite olivebraun gelbbraun
Pigment kein etwas gelb 2800 Oberfläche cremeolive creme
Rückseite olive gelbbraun
Pigment etwas olive etwas gelb 37 C Oberfläche kein Luftwachstum kein
Luftwachstum
Rückseite farblos gelbbraun
Pigment kein gelbbraun 550 C kein Wachstum kein Wachstum Einfache Gelatine vollständige Verflüssiguug vollständige Verflüssigang Nährgelatine vollständige Verflüssigung volLständige Verflüssigung Synthetische Nitratbrühe etwas farblos farbloses Oberflächenhäutchen und vegetatives Wachstum am Grund flockiges Wachstum am Grunde
Nitrate reduziert zu Nitriten Nitrate nicht zu Nitriten reduziert Nährnitratbrüüe starkes weisses Luftwachstum an der weisses Luftwachstum an der
Oberfläche Häutchen Oberfläche Häutchen Tabelle lll (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137
Geringes Wachstum am Grunde kompaktes vegetatives Wachstum am Grunde
Nitrate reduziert zu Nitriten Nitrate reduziert zu Nitriten Lackmusmilch weisses Luftwachstum an blauem etwas weisses Luftwachstum
Oberflächenring an blauem Oberflächenring teilweise Peptonisierung pH 7,9 vollständige Peptonisierung pH 7,9
Tabelle IV Wachstum von S. griseus var. erizensis und S. griseus ATCC 10137 auf Kohlenstoffverbindungen in syntheti schem Medium (J. Bact. 56: 107-114, 1948)
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137
Kontrolle (-) (-)
1. D-Xylose + +
2. L-Arabinose + (+)
3. Rhamnose (-)(+)(-)* (-)
4. D-Fructose + + 5. OGalactose + +
6. D-Glucose + +
7. D-Mannose + +
8. Maltose + + 9. Saccharose (-) (-) 10.
Lactose + + 11. Cciioblose + + 12. Raffinose (-) (-) 13. Dextrin + + 14. Inulin (-)- (-) 15. lösliche Stärke + + 16. Glycenn + +
Tabelle IV (Fortsetzung)
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 17. Dulcit (+) (-) (-) (-) 18. Mannit (-)++ + 19. D-Sorbit +(-)(-) (-) 20. Inosit (-)(-)(+) (-) 21. Salicin (-) - - (-) 22. Phenol (-)-- 23. Kresol - 24. Na-Formiat (-)-- 25. Na-Oxalat (-)-(-) 26. Na-Tartrat (-)-(-) 27. Na-Salicylat (-)-- 28. Na-Acetat + (+) + 29. Na-Citrat + (+) + 30.
Na-Succinat + + + = gutes Wachstum (+) = mässiges Wachstum (-) = geringes Wachstum - = kein Wachstum * Streuung der Ergebnisse bei verschiedenen Versuchen. Tabelle V Farbmerkmale von S. griseus var. erizensis und S.griseus, ATCC 10137 Agar-Medium Color Harmony Manual 3rd Ed., 1948 N.B.S.
Circular 533, 1955 S. griseus S. griseus, S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 var. erizensis ATCC 10137 Bennett's Oberfläche 1-1/2db(g) ledern 2db(g) elfenbein 89 gm blassgelb 89 gm blassgelb, 90 g gräulich-gelb, 121 m blassgelbgrün, Rückseite 2gc(g) bambus chamois 3ng(g) gelb-ahorn 90 gm gräulichgelb 77 m mittel gelblichbraun Czapek's Saccharose Oberfläche 2cb(m) elfenbeinweiss 2cb(m) elfenbeinweiss - Rückseite 2 db(g) elfenbein 2db(g) elfenbein - Maltose Tryptone Oberfläche 2ba(m & g) perlmuschelweiss 2cb(m) elfenbeinweiss 92 gm gelblichweiss 92 m gelblichweiss, 93 gelblichgrau Rückseite 2ie(g) hell senfbraun 3ng(g) gelb-ahorn 91 gm dunkel graugelb, 77 m mittelgelblichbraun 94 g hell oliv-braun, 106 g hell oliv
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass ein erizornycinproduzierender Organismus unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium gezüchtet wird, bis das Medium eine beträchtliche antimikrobielle Aktivität erhalten hat, und dass das Erizomycin aus dem Nährmedium isoliert wird.
Es versteht sich auch, dass für die Herstellung begrenzter Mengen Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden können. Der Organismus wird in einem wässrigen Nährmedium, das vor allem eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlenhydrat und gewöhnlich eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweissartiges Material, enthält, gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind unter anderem Glucose, Sandzucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Galactose, Dextrin, Melasse und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind unter anderem Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Soyabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreashydrolysat von Casein, Schlempe, Fischmehl, tierische Eiweissflüssigkeiten, Fleisch und Knochenabfälle und ähnliche.
Eine Kombination dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kann vorteilhafterweise verwendet werden. Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und ähnliche, brauchen der Fermentation nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte Ingredienzien als Bestandteile des Mediums verwendet werden.
Die Produktion der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung kann bei jeder beliebigen Temperatur, die zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus bewirkt, z. B. zwischen zirka 18 und 400 C und vorzugsweise zwischen zirka 25 und 300 C, durchgeführt werden. Für gewöhnlich wird die beste Produktion der Verbindung innerhalb von zirka zwei bis zehn Tagen erzielt. Normalerweise bleibt das Medium während der Fermentation annähernd neutral oder schwach alkalisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den eventuell vorhandenen Puffersubstanzen ab und teilweise von dem Ausgangs-pH-Wert des Kulturmediums, welches vor der Sterilisierung vorteilhafterweise auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt wird.
Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, ist es vorteilhaft, die vegetative Form anstelle der Sporenform des Mikroorganismus für die Beimpfung zu verwenden, um eine ausgeprägte Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene unrationelle Ausnützung der Apparatur zu verhindern. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein vegetatives; Inoculum in einer Nährbni- henkultur herzustellen, indem diese Kultur mit einer aliquoten Menge einer Boden- oder Schrägkultur beimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum bereitet ist, wird es gewöhnlich aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt.
Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, wie es für die Produktion der neuen Verbindung verwendet wird, oder es kann verschieden davon sein, so lange es nur so beschaffen ist, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erzielt wird.
Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung ist eine basische Verbindung mit der Summenformel C27H32N405. Bei Zimmertemperatur zeigt Erizomycin die folgenden Löslichkeiten: ungefähr weniger als 1 mg/ml in Wasser; > 10 mg/ml in 95 /o Äthanol; > 10 mg/ml in Äthylacetat; > lOmg/ml in Aceton; > 100 mg/ml in Chloroform; ca. 2 mg/ml in Benzol; < 1 mg/ml in Skellysolve B (Petroläther oder n-Hexan); und ca.
5 mg/ml in n-Butanol.
Eine Vielzahl von Verfahren kann zur Isolierung und Reinigung von Erizomycin verwendet werden, beispielsweise Solventextraktion, Flüssig-flüssig-Verteilung in einer Craig-Apparatur, Verwendung von Adsorbentien und Chromatographiesäulen. Solventextraktionsverfahren werden für gewerbliche Produktion bevorzugt, da sie weniger Zeit verbrauchen und weniger teuer sind und höhere Ausbeuten damit erzielt werden können.
In einem bevorzugten Isolierungsverfahren werden zuerst nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe (oder durch Zentrifugieren), das Myzel und ungelöste Feststoffe von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Die filtrierte (oder zentrifugierte) Brühe kann mit einem Lösungsmittel, vorzugsweise Athylacetat, für Erizomycin extrahiert werden. Der Äthylacetatextrakt, der das Erizomycin enthält, wird gewöhnlich mit einem Zehntel Volumen Wasser gewaschen, dann kann der Äthylacetatextrakt unter vermindertem Druck zu einem trockenen Rohprodukt des Erizomycins eingedampft werden. Dieses Präparat kann in Umgebungen, in denen höhere Reinheit des Antibiotikums nicht erforderlich ist, verwendet werden.
Weitere Reinigung dieses Erizomycinpräparates kann durch Auflösen des Rohprodukts in einer minimalen Menge eines Lösungsmittels für Erizomycin (vorzugsweise Athylacetat) und Zugabe der 10flachen Menge an Cyclohexan erfolgen. Der Niederschlag, der sich bildet, wird in der Regel durch Filtration gesammelt und in Äthylacetat aufgelöst. Das Cyclohexanfiltrat wird üblicherweise verworfen. Das Äthylacetat, das das Erizomycin enthält, kann filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden.
Das trockene Erizomycin enthaltende Präparat wird dann gewöhnlich in einem Lösungsmittel für Erizomycin (vorzugsweise in Methylenchlorid) aufgelöst, und die Lösung wird filtriert. Das Filtrat kann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden und ergibt ein verhältnismässig reines Erizomycinpräparat.
Kristallines Erizomycin kann erhalten werden, indem dieses verhältnismässig reine Erizomycinpräparat der Verteilungschromatographie an gepuffertem Kieselgur unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Toluol Propylenglycol unterworfen wird. Kristallines Erizomycin, das aus den Chromatographiefraktionen erhalten wurde, kann aus Äthanol umkristallisiert werden und ergibt ein hochreines kristallines Erizomycinpräparat.
Wegen der basischen Natur des Erizomycins kann das aus der Fermentationsbrühe durch Athylacetat-ex- traktion ursprünglich erhaltene Rohprodukt gereinigt werden, indem die aktive Substanz bei einem pH von zirka 2 bis 3 in Wasser extrahiert wird, indem der pH-Wert auf 9 bis 10 eingestellt wird und indem dann Rückextraktion in Äthylacetat oder ein anderes Lösungsmittel, in dem Erizomycin löslich ist, erfolgt.
Nach Entfernung des Lösungsmittels kann der Rückstand durch Kristallisation, Gegenstromverteilung oder Chromatographie, wie oben beschrieben wurde, weiter gereinigt werden.
Wahlweise kann die neue, erfindungsgemäss erhältliche Verbindung auch durch Adsorption an Kationenaustauscherharzen aus der filtrierten Brühe isoliert werden. Es können sowohl Carbonsäure- als auch Sulfonsäureharze verwendet werden. Geeignete Carbonsäure harze sind unter anderem die Polyacrylsäureharze, die durch Copolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol, beispielsweise nach dem Verfahren, das auf Seite 87 von Kunin, Ion Exchange Resins, 2nd Edition (1958), John Wiley and Sons, Inc. angegeben wird, erhalten werden. Carbonsäurekationenaustauschharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Amberlite IRC-50 und Zeokarb 226 vertrieben. Geeignete Sulfonsäureharze sind unter anderem sulfonierte Polystyrolharze, die mit Divinylbenzol vernetzt sind und die nach dem auf Seite 84 des zitierten Werkes von Kunin beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
Sulfonierte Kationaustauschharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Dowex-50 , Amberlite IR-120 , Nalcite HCR , Chempro C-20 , Permutit Q und Zeokarb 225 in den Handel gebracht.
Das Antibiotikum wird gewöhnlich mit einer Säure, vorzugsweise bei einem pH-Wert niedriger als der pKa Wert des verwendeten Kationenaustauschharzes, von dem Harz eluiert. Zufriedenstellende Erg & nisse können bei einem pH-Wert von zirka 1 bis 6 erhalten werden.
Das Eluat wird in der Regel mit einer Base, z. B. Natriumhydroxyd, oder einem stark basischen Anionenaustauschharz, auf einen pH-Wert von zirka 7,5 bis 8,5 eingestellt, und das Antibiotikum kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert werden. [Für diesen Zweck geeignete Anionenaustauschharze werden durch Chiormethylierung nach dem von Kunin (siehe obiges Zitat, Seiten 88 und 89) angegebenen Verfahren von Polystyrol, das gewünschtenfalls mit Divinylbenzol, welches nach dem von Kunin (siehe obiges Zitat, Seite 84) angegebenen Verfahrens hergestellt wurde, vernetzt ist, und Quaternisierung mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin nach dem von Kunin (vgl. obiges Zitat Seite 97) angegebenen Verfahren hergestellt.
Anionenaustauschharze dieses Typs werden unter den Bezeichnungen Dowex-2 , Dowex-20 , Amberlite IRA 400 , Duolite A-102 und Permutit S-1 in den Handel gebracht.]
Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung kann aus den erhaltenen Brühen und anderen wässrigen Lösungen auch durch Adsorption an einem oberflächenaktiven Adsorbens, zum Beispiel Florisil (ein synthetisches Silikat des in US Patentschrift 2 393 625 beschriebenen Typs, verkauft von der Floridin Gesellschaft), Entfärbungskohle oder Entfärbungsharzen, und Elution des adsorbierten Materials mit einem Lösung mittel isoliert werden. Jedes beliebige der oben erwähnten Lösungsmittel kann verwendet werden. Ein geeignetes Entfärbungsharz ist Permutit DR (US Patentschrift 2 702 263).
Die neue erfindungsgemässe Verbindung kann auch durch aufeinanderfolgendeOberführungen aus dem protonisierten in den nicht-protonisierten Zustand und umgekehrt gereinigt werden, insbesondere in Kombination mit anderen Arten von Behandlungen, z. B. Solventextraktionen und Waschungen, Chromatographie und fraktionierte Flüssig-flüssig-Extraktion. Auf diese Weise können Salze des Erizomycins dazu verwendet werden, das Antibiotikum zu isolieren oder zu reinigen. Das Antibiotikum kann beispielsweise in ein unlösliches Salz, z. B. das Picrat, überführt werden, welches dann Reinigungsverfahren unterworfen wird und anschliessend zur Regenerierung der freien Base des Antibiotikums mit Alkali behandelt wird. Oder das Antibiotikum kann in ein wasserlösliches Salz, z.
B. das Hydrochlorid oder Sulfat, umgewandelt werden, und die wässrige Lösung des Salzes kann mit verschiedenen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden, bevor die freie Base des Antibiotikums durch Behandlung der so extrahierten sauren Lösung mit Alkali regeneriert wird.
Salze des Erizomycins können für die gleichen biologischen Zwecke wie die freie Base verwendet werden, oder sie können zur Reinigung des Antibiotikums wie oben beschrieben verwendet werden.
Spezifische saure Salze können durch Neutralisierung der freien Base mit der geeigneten Säure bis zu einem pH-Wert von weniger als ca. 7,5 und vorzugsweise bis zu einem pH-Wert von ca. 2 bis 6, hergestellt werden. Für diesen Zweck geeignete Säuren sind unter anderen Salz-, Schwefe!-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Pamoe-, Chol-, Palmitin-, Schleim-, Kampfer-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, 3-Phenylsalicyl-, 5-Phenylsalicyl-, 3-Methylglutar-, Orthosulfobenzoe-, Cyclohexansulfamin-, Cyclopentanpropion-, 1,2 Cyclohexandicarbon-, 4-Cyclohexancarbon-, Octadecenylbernstein-, Octenylbernstein, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianth-, Reinecke-, Dimethyldithiocarbamin-, Sorbin-, Monochloressig-, Undecylen-, 4'-Hydroxyazobenzol-4-sulfon-, Octadecylschwefel-, Pikrin-, Benzoe-,
Zimtsäure und ähnliche Säuren.
Erizomycin, die neue erfindungsgernäss erhältliche Verbindung ist gegenüber Escherichin coli wirksam und kann infolge seiner antibakteriellen Wirksamkeit gegenüber diesem Mikroorganismus zur Reduktion, Hemmung und Ausrottung von Schleimprodukten in Papierfabriken verwendet werden. Es kann auch dazu verwendet werden, das Leben von Kulturen von Trichomonas foetus, Trichomonas hominis und Trichomonas vaginalis zu verlängern, indem es diese von Escherichia-coli-Verunreinigung befreit.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens beschrieben. Alle Prozentangaben betreffen Gewichtsprozent und alle Lösungsmittelverhältnisse betreffen Volumenangaben, falls nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
A. Fermentation
Eine Bodenkultur von Streptomyces griseus var.
erizensis, NRRL 3242 wurde dazu verwendet, 500-ml Erlenmeyer-Kolben, die je 100 ml steriles Medium enthielten zu beimpfen; das Keim-Medium enthielt die folgenden Ingredientien: Glucosemonhydrat 25 g Pharmamedia * 25 g
Leitungswasser q. s. ad. 1 Liter * Pharmamedia ist ein technisch reines Baumwollsamenmehl hergestellt von der Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas, USA.
Der pH-Wert des Keimmediums betrug vor der Sterilisation 7,2. Das Keiminoculum wurde drei Tage lang bei 28 C auf einer Gump-Schüttelmaschine mit 250 Upm bebrütet.
Das wie oben hergestellte Keiminoculum wurde zur Beimpfung von 500-ml-Erlmeyer-Kolben, die je 100 ml steriles Fermentationsmedium enthielten, ver wendet; das Fermentationsmedium enthielt die folgenden Ingredientien:
Saccharose 20 g Soyabohnenmehl 20 g
Calciumcarbonat 5 g
Leitungswasser q. s. ad. 1 Liter
Die Fermentationskolben wurden mit 5 ml Keiminoculum pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums betrug vor der Sterilisierung 7,2. Der Fermentationskolben wurden 5 Tage lang bei einer Temperatur von 280 C auf einer Gump-Rotationsschüttelmaschine, die mit 250 Upm arbeitete, bebrütet. Das Maximum der Produktion des Antibiotikums bei einer Kolbenfermentation wird im allgemeinen nach 2 bis 3 Tagen erreicht, danach fällt der Titer des Antibiotikums allmählich ab.
In einer typischen Schüttelflaschenfermentation betrug die Erizomycinkonzentration nach einem Tag 9 Bioeinheiten pro ml; nach 2 Tagen 11 Bioeinheiten pro ml und nach 3 Tagen Fermentationszeit 10 Bioeinheiten Erizomycin pro ml. Die Bestimmung wurde mit einem Agarplattentest gegen den Mikroorganismus Bacillus cereus durchgeführt. Die Bestimmung gegen Bacillus cereus wird auf einem Agar, der mit Phosphatpuffer pH 7,4 auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert wurde, ausgeführt. Ein Einheitsvolumen (0,08 ml) der Lösung, die die zu bestimmende Substanz enthält, wird auf eine 12,7-mm-Papierscheibe gebracht, die dann auf eine Agarplatte gelegt wird, die mit dem Testorganismus beimpft ist. Die Agarplatte wird dann 16 bis 18 Stunden lang bei 320 C bebrütet.
Eine Bioeinheit (BE) wird als die Konzentration des Antibiotikums, die eine 20 mm Inhibierungszone unter Standard-test-bedingungen ergibt, definiert, definiert in der US-Patentschrift Nr. 3 359 165. Wenn z. B. eine Fermentationsbrühe im Verhältnis 1:100 verdünnt werden muss, um eine 20 mm Inhibierungszone zu ergeben, dann ist die Wirksamkeit dieser Brühe 100 BE/ml.
B. Extraktion.
Die gesamte Brühe (3450 ml) einer Erizomycin Fermentation, wie sie oben beschrieben wurde, mit 4,4 Bioeinheiten pro ml Erizomycin, wurde unter Zusatz von Kieselgur filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einem Zehntel des Volumens an Wasser gewaschen.
Die filtrierte Brühe wurde mit dem Waschwasser vereinigt (3410 ml) mit 3,8 BE/ml mit einem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert. Der Athylacetatextrakt wurde mit einem Zehntel des Volumens an Wasser gewaschen. Der gewaschene Athylacetatextrakt wurde dann unter vermindertem Druck eingedampft und ergab ein trockenes Rohprodukt (350 mg) von Erizomycin mit einem Gehalt von 32,8cg/mg Erizomycin bestimmt nach der B.-cereus-Methode.
C. Reinigung
Ein rohes Erizomycinpräparat (704 g mit einem Gehalt von 53,ug/mg nach der B.-cereus-Methode), erhalten nach dem oben beschriebenen Verfahren, wurde in einer möglichst kleinen Menge Äthylacetat gelöst und unter gutem Durchmischen zu dem zehnfachen Volumen Cyclohexan gegeben. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Filtration gesammelt und in ungefähr 2100 ml Athylacetat gelöst. Das Cyclohexanfiltrat wurde verworfen. Die Äthylacetatlösung, die das Erizomycin enthielt, wurde filtriert, und die Feststoffe wurden verworfen. Das Filtrat wurde dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von weniger als 400 C zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand des Äthylacetatextraktes wurde in 420 ml Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde filtriert.
Die Feststoffe wurden verworfen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein verhältnismässig reines, trockenes Präparat von Erizomycin erhalten wurde, das 146 g wog und einen Gehalt von 200,ug/mg, nach der B.-cereus-Methode bestimmt, aufwies.
Weitere Reinigung des Erizomycinpräparates wurde mit Hilfe einer Verteilungschromatographiesäule durchgeführt, die auf folgende Weise hergestellt wurde: Zu einem rollenden flüssigen Brei von 120 g gepuffertem Kieselgur in halbgesättigtem Toluol wurden 40 ml Propylenglykol gegeben. Das Rühren wurde ca.
10 Minuten fortgesetzt, um ein gutes Durchmischen zu erreichen. Die Mischung wurde in eine Glassäule von 2,54 cm Durchmesser gegossen und bei einem Luftdruck von 0,28 kg/cm2 gepackt. Die gepackte Säule wurde mit einer Schicht von 6 mm Seesand bedeckt.
[Das oben verwendete halbgesättigte Toluol wurde wie folgt hergestellt: unter gutem Vermischen wurden 4 ml Propylenglykol zu 3,79 1 Toluol gegeben. Das ergab eine ungefähr halbgesättigte Lösung, die als bewegliche Phase für die Verteilungschromatographiesäule verwendet wurde. Das in der Verteilungschromatographiesäule verwendete gepufferte Kieselgur wurde wie folgt hergestellt: Zu 100 g Kieselgur, wurden unter gutem Durchmischen 100 ml einer Lösung von KH2PO4 in Wasser (27,2 g/l) und 100 ml einer Lösung von Na2HPO4 in Wasser (28,4 g/l) gegeben. Die Mischung wurde dann bei 120"C sorgfältig getrocknet.]
2,2 g eines Erizomycinpräparates, das nach der oben beschriebenen Methylenchloridextraktionsmethode hergestellt worden war, wurden unter ständigem Rühren und Erhitzen auf dem Dampfbad in 7,3 ml Propylengylcol gelöst.
Diese Lösung wurde mit 15g gepuffertem Kieselgur gemischt und mit einer möglichst kleinen Menge halbgesättigtem Toluol angerieben und auf den Kopf der Verteilungschromatographiesäule gegeben. Eine Schicht von 6 mm Seesand wurde auf den Kopf der Säule gegeben. Die Säule wurde mit halbgesättigtem Toluol bei einer Fliessgeschwindigkeit von ca. 2 ml/min. eluiert. 20-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen 26 bis 44 wurden vereinigt, zur Entfernung des Glykols mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; Ausbeute 698 mg. Dieses Material wurde aus ca. 10 ml Äthanol umkristallisiert; Ausbeute 343 mg kristallines Erizomycin mit einem Gehalt von 420,ug/mg nach der B.-cereus-Methode.
Beispiel 2
Erizomycinhydrochlorid
Ein Gramm Erizomycin, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, wird in 20 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird filtriert, und Salzsäuregas wird in die Lösung eingeleitet. Der sich bildende Nieder schlag von Erizomycinhydrochlorid wird abfiltriert und getrocknet.
Erizomycin hat fungizide Wirksamkeit, die durch einen Standard-Agar-Verdünnungs-Platten-Test bestimmt wurde. Es zeigt gute Wirksamkeit gegen Nocardia steroides und geringe Wirksamkeit gegenüber Histoplasma capsulatum. Nocardia asteroides, der Nocardiosis verursacht, wurde aus dem Boden und aus Laboratoriumsluft isoliert. Demzufolge kann Erizomycin dazu verwendet werden, Böden, die mit Nocardia asteroides infiziert sind, zu behandeln. Histoplasma capsulatum, der Histoplasmosis verursacht, wurde aus Lagerkellern und Hühnerställen isoliert. Demzufolge kann Erizomycin zur Behandlung solcher Umgebungen verwendet werden, wenn sie mit Histoplasma capsulatum infiziert sind.